SU581872A3 - Способ получени ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием - Google Patents

Claims (2)

1. Осажденные белки отдел ют центри фугированием. Довод т рП фильтра до 4,5-7,0 и подвергают фракционному осаждению соли с целью удалени  сна чала фракции балластных веществ, а затем дл  осаждени  фракции активны веществ. Такое фракционное осаждение провод т аммониевыми сол ми или сол ми щелочных или щелочноземель 1ых ме таллов минеральных кислот, например хлоридом или сульфатом аммони . Если примен ть сульфат аммони , рН 6,5, то фракци  балластных веществ осаждаетс  при концентрации 40%, а актив на  фракци  при концентрации 55% (пр ). При использовании других соле значений рН и температур осаждени  необходимы различные концентрации на сыщени . Активную фракцию выдел ют и маточной жидкости центрифугированием и раствор ют в дистиллированной воде Значение рН раствора довод т до 4-6 Активное вещество осаждаетс  в виде комплекса добавлением примерно 7 вес фенола или производного фенола; можн также примен ть фенолформальдегидные смолы,содержащие свободные фенольные группы. Отделенный комплекс пpo лывaют несколько раз 0,1-0,5%-ным раствором уксусной кислоты в пол рном растворителе с целью разложени  комплекса и растворени  фенола или производног фенола. Комплекс, состо щий из актив ного вещества и фенола или произволного фенола, раствор ют в воде при рИ 7,5-8,5. Значение рН довод т до указанной величины добавлением гидро окиси щелочного металла. Раствор фильтруют под давлением азота через ультрафильтр с такими размерами отверстий , чтобы активное вещество {ферментный состйв) оставапось на фильтре, а фенол или производные фенола проходили через фильтр в раство ренном состо нии. Активное вещество, которое остает с  на фильтре, промывают несколькими порци ми дистиллированной воды или раствора подход щего консерванта с целью удалени  остатков фенола или производного фенола. Ферментный препарат , который оказывает в малых дозах гемостатическое действие, а в больщих дозах - антикоагул нтное дей ствие на кровь человека и других мле копитающих, имеет следующие свойства Обладает тромбиноподобными свойствами эндопептидазы. Он содержит пе тидный компонент и углеводный компонент , причем пептидный компонент вкл чает один или несколько полипептидов с молекул рным весом примерно от 18000 до 55000, определ емым по способу балансировани  с применением ультрацентрифуги. Препарат содержит углевод (caxaj нейтрального характера) в количестве 2-10 вес.% от белкового содержимого, слабо растворим в физиологическом растворе хлористого натри , образует комплексы с фенолом и производными фенола, слабо растворимые или не растворимые в воде. Вызывает коагул цию фибриногена путем избирательного удалени  фибринопептидов А из фибриногена без освобождени  фибринопептидов В. Ферментный препарат обладает тромбиноподобной активностью , соответствующей 30-450 ед. тромбина (Nlfl) на 1 мг белкового содержимого . Расщепл ет метиловый эфир п-толуолсульфониларгинина и желатину, но не расщепл ет метиловый эфир лизина, этиловый эфир фенилаланина ., N -ацетилметионин , N -ацетилтиозин, лейцилглицин и казеин. Препарат не ингибируетс  гепарином, гепариноидами, гирудином , антитромбинами и ингибитром многовалентной пептидазы Кунитца. Он ингибируетс  при концентрации фермента примерно 5 мг на 1 мл до содержани  примерно 95% по отношению к его коагул ции и при активности эстеразы в отношении 2,5x10молей диизопропилфторфосфата при рН 8 в течение 2 час. Он полностью ингибируетс  метиловым эфиром п-толуолсульфониларгинина и полностью ингибируетс  антителами , содержащимис  в сыворотке, не ВОСПРИИМЧИВОЙ к змеиному  ду, он не фиксируетс  и поэтому не инактивируетс  фибрином. Препарат обладает в значительной степени более длительньом временем полуразложени , чем гепарин. Он вызывает образование производного фибрина, который взаимодействует с избытком фибриногена с образованием неполимеризуемого комплекса фибрина с фибриногеном . Он воздействует на фибриноген с образованием фибрина, который обладает физико-химическими свойствами , отличающимис  от свойства фибрина, полученного из тромбина, так как он быстро гидролизуетс  фибринолитическими ферментами, например плазмином, даже в присутствии активированного фактора ХП и ионов кальци  и раство РИМ в 5 М водном растворе мочевины и вызывает in vvieo дефибриногенирование и фибринолиз без побочного геморрагического и тромбоэмболического действи . Ферментные составы можно примен ть в качестве реагента и вспомогательного средства дл  физиологического изучени  свертывани  крови -iaVttro, например , дл  исследовани  превращение фибриногена в фибрин в присутствии гепарина и антитромбинов дл  исследований с фибринопептидами дл  изучени  патологических фибринных ,:груктур , продуктов разложени  фибриногена , фгжтора VI1J и фактора XII . При назначении в умеренных дозах 111 vivQ ферментный состав вызывает уменьшение кровотечени  и времени свертывани  крови у экспериментальных кивотных, а также у больных с нормаль ным или пат(лло1ическим состо нием свертывани  крови . При внутреннем вве дении здоровым люд м в умеренных дозах ферментный препарат вызывает образование растворимых комппексов фибрина с фибриногеном в токе крови, о чем свидетельствуют полокительные пробы на криофибрин и паракоагул цию в плазме, а также KI -терминальный анализ фракций плазмы пациентов. Поэ тому предложенный ферментный состав можно примен ть в качестве кровооста навливающего средства. При назначении нового ферментного состава в повышенных дозах собакам наблюдаетс  быстрое дефибриногенирование , а также св занный с этим фибринолиз и по вление продуктов разложени  фибриногена (ПРФ) в крови. Дефибриногенирование и фибринолиз им ют место без каких-либо симптомов шо ка, без тромбоцитопении и без тромби ческих и геморрагических нарушений. Клинические испытани  больных с тром бозом вен голени или вен сетчатки по казали, что ферментный состав особен но применим дл  лечени , сопровождаю щегос  дефибриногенирующим и фибрино литическим действием. В очищенном состо нии ферментный состав легко растворим в разбавленны растворах солей, но слабо растворим в дистиллированной воде. Его можно осаждать из водных растворов сол ми или органическими растворител ми, c шивающимис  с водой, можно обратимо фиксировать на ионообменных смолах основного характера и можно получить водонерастворимые комплексы с феноло и его производными. Он характеризуетс  высокой термостойкостью и заметной устойчивостью к кислотам. В качестве кровоостанавливающего средства ферментный препарат данного изобретени  можно назначать в суточных дозах, примерно 0,25 /,4 ед. N1H Н 60 кг веса тела. В качестве антикоагул нта дл  кро ви ферментный состав можно примен ть в суточных дозах примерно 7-14 ед. Ы iTrt на 60 кг веса тела. Пример 1.20 г змеиного  да вида Bothrops atvo рс.створ ют в 1000 мл 0,9%-ного раствора хлорист го натри , а затем центрифугируют в течение 10 мин со скоростью ЗОООоб/м Осадок удал ют. Довод т значение рН центрифугата до 3,5 разбавленной уксусной кислотой, нагревают при ЗОС и течение 1 час на вод ной Сане, а затем снова центрифутируют. Остаток удаи ют, довод т значение рН центрифугата до 6,5 едким натром и объем раствора довод т до 1000 мл 0,9%-ным раствором хлористого натри . К этому расгвору добавл ют при перемешивании 670 мл насыщенного раствора сульфата аммони . Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 час, а затем полученный осадок отдел ют центрифугированием. К центрифугату добавл ют еще 552 мл насыщенного сульфата аммони  и через 1 час смесь снова центрифугируют, Центрифугат отбрасывают, осадок раствор ют в 100 мл дистиллированной воды, довод т рП раствора до 5,0 разбавленной уксусной кислотой, к раствору добавл ют 7,7 мл 90%-ного фенола при перемешивании. Смесь выдерживают в течение 15 час при комнатной температуре . Затем осажденный фермент отдел ют центрифугированием. Центрифугат отбрасывают. Осадок прог-ивают дважды по 10 мл воды, насыщенной фенолом , отдел ют центрифугированием и обрабатывают 50 мл этанола, содержащего 1% уксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 1 час, а затем фильтруют через стекл нный ва :уум фильтр . Выделенное вещество пpo «Jвaют несколькими порци ми по 20 мл этанола и высушивают под вакуумом. Получают 2-2,5 г ферментного состава (степень чистоты 1), обладающего тромбиноподобным действием (примерно 10-12 д. на 1 мг сухого вещества). Полученный продукт обладает стойкостью при хранении. Неочищенный фермент обрабатывают 40 мл трис-фосфатного буфера (рН 6,0) и перемешивают в течение 15 мин. Нерастворившуюс  часть удал ют из раствора центрифугированием. Прозрачный центрифугат заливают со скоростью 0,8-1,0 мл/мин в колонну, наполненную 200 мл ДЭАЭ-сефадексом, нейтрализованного трис-фосфатным буфером, а затем элюируют 800 мл того же буферного раствора. Первый элюат отбрасывают . Фермент элюируют 4400 мл трис-фосфатным буфером (0,04 мол ). Активный элюат извлекают и концентрируют на ультрафильтре УМ-10 , (АмиконМ под давлением и призывают до полного отсутстви  солей. Концентрат, не содержащий солей, высушивают под вакуумом над фосфорным ангидридом или подвергают лиофильной сушке. Получают 200-250 мг ферментного состава со степенью чистоты If, обладающего активностью 100-150 ед. N t Н тромбина на 1 мг белкового содержимого . Концентрат, не содержащий солей, затем концентрируют до 5 мл на ультрафильтре . Раствор фильтруют через стекл нный вакуум-фильтр пористостью с целью удалени  каких-либо пылевидных частиц. Прозрачный раствор выдерживают в течение не менее 24 ча в холодильнике при 2°С. Ферментный состав выдел ют в виде пр моугольных кристаллов. Полученные кристаллы выдел ют центрифугированием при , прО1 ивают несколько раз по 0,5 мл дистиг-лированной водой при охлаждени льдом, а затем высушивают над фосфор ным ангидридом. Получеиот 45 мл бесцветного фермента, активность которо го составл ет 150-200 ед. тромбина ( N 1й ) на 1 мг белкового содержимого П р и м е р
2. 2. Колонну загружают Сефадексом G-100. Гель Сефадекса ней трализуют 10%-ным водным раствором уксусной кислоты. 6,26 мг ф.ерментног состава, полученного по примеру 1 (степень чистоты И) раствор ют в О,3 мл 10%-ного водного раствора уксусной кислоты. Раствор заливают че рез колонну. Водный 10%-ный раствор уксусной ксилоты пропускают через ко лонку снизу со скоростью 5,6 мл в 1 час. Образуютс  зоны поглощени  ультра фиолетовых лучей (280 мл). Элюат,Полученный из первой зоны, подвергают лиофильной сушке и получают 4,25 мг ферментного состава с активностью 200-250 ед. ( Nlfl ) тромбина на 1 мг белкового содержимого. Формула изобретени  Способ получени  ферментного препарата , обладающего: (ГемосЛатическим и антикоагулирующим 1ействием, о тли чающийс  тем, что изотонический ВОДНЫЙ раствор  да змеи Botht-epS atrox или  да с аналогичной иммунной реакцией с рН 4,57 ,0 подвергают фракционированию, например , сульфатом аммони , тепловой обработке при ЗО-БО С и РН 3,0-4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выдел ют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой известными приемами.