Sposób enzymatycznego rozszczepiania laktozy z mleka i jego pochodnych Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycz¬ nego rozszczepiania laktozy zawartej w mleku i jego pochodnych, oraz mleko o mniejszej zawar¬ tosci laktozy, wytworzone tym sposobem.Sposób wedlug wynalazku polega na traktowa¬ niu mleka enzymami nadajacymi sie do rozszcze¬ piania mleka na glikoze i galaktoze: enzym taki, który stanowi zasadniczo galaktozydaza, ma nadane wlasnosci nierozpuszczalnosci przez wlaczenie w nosnik i moze byc ponownie odzyskana po zakon¬ czeniu enzymatycznego procesu..Jak powszechnie wiadomo, korzystne jest otrzy¬ mywanie mleka, w którym laktoza zostala czescio¬ wo zhydrolizowana na glikoze i galaktoze. Istnieja uzasadnienia dietetyczne lepszej tolerancji takiego mleka. Wprowadzenie zhydrolizowainego mleka do karmy zwierzat daje znaczne korzysci wzrostowe i odzywcze.Ponadto wynikaja bardzo wazne wzgledy techno¬ logiczne: przy stezeniu mleka o zawartosci substan¬ cji stalej przewyzszajacej 30%, jest bardzo trudno przechowywac takie mleko wskutek krystalizacji czesci laktozy powodujacej krzepniecie bialka. Ta sama wada wystepuje w przemysle lodów spozyw¬ czych, w którym nie mozna stosowac mleka o wiekszej zawartosci substancji stalej, wskutek 'krys¬ talizacji laktozy, która jest 'trudno trozjpuszezaILna.Dla przezwyciezenia tych trudnosci proponowano Wiele sposobów na przyklad hydrolize laktozy w podwyzszonej temperaturze, traktowanie wymienia¬ czami jonowymi, dodawanie ryboflawiny. Pierwszy sposób wywoluje scinanie bialka, drugi sposób na¬ rusza bilans soli naturalnych mleka, a trzeci zapo¬ biega wytracaniu sie laktozy, lecz polega na uzyciu 6 bardzo drogiej substancji dodatkowej.Dlatego tez polozono nacisk na sposób hydrolizy enzymatycznej. Uzycie enzymów w roztworze zna¬ lazlo szereg zastosowan, lecz dodanie wiekszosci z dostepnych obecnie enzymów nadawalo mleku 10 nieprzyjemny smak. Ponadto pod koniec procesu, dezaktywowano enzymy, które jako pozostalosc skazaly mleko. Poza tym, w procesie bylo konieczne uzycie bardzo duzej ilosci enzymów (2—4% wago¬ wych w stosunku do laktozy, zaleznie od ich aktywnosci), co mialo znaczny wplyw na koszty procesu.Drugim czynnikiem ograniczajacym stosowanie tego sposobu sa komplikacje mikrobiologiczne wy¬ wolane prowadzeniem procesu hydrolizy.Celem wynalazku jest wyeliminowanie wyzej wymienionych wad i opracowanie taniego, maja¬ cego znaczenie przemyslowe sposobu rozszczepiania laktozy zawartej w mleku i jego pochodnych.Cel wynalazku osiagnieto przez opracowanie spo- 25 sobu, w którym stosuje sie enzymy wlaczone do wlókien, wykonanych w znany sposób. Wedlug tej metody mozna ekonomicznie i latwo wytworzyc strukture wlóknista z enzymami wlaczonymi w spo¬ sób pewny i trwaly, so Dzieki rozmieszczeniu powyzszych wlókien w ko¬ li 20 82 74282 742 3 lumnie, mozna traktowac produkt w procesie ciag¬ lym, który latwo da sie zautomatyzowac. Praca ciagla znacznie upraszcza problemy bakteriologicz¬ ne, gdyz mozna stosowac srodki odpowiednie, co bylo niemozliwe w innych sposobach. Wlókna moz¬ na przemywac odpowiednim detergentem. Dla de¬ zynfekcji instalacji, aparatury i wlókien do roz¬ tworu przemywajacego mozna dodac srodka bakte¬ riobójczego.Jako srodki bakteriobójcze stosuje sie czwarto¬ rzedowe sole amoniowe, gdyz wiekszosc tych soli nie dziala szkodliwie na enzymy wlaczone do wlókien.Ponadto niektóre z nich lacza dzialanie srodka bakteriobójczego z dzialaniem detergentu i fakt ten ma bardzo duze znaczenie, gdyz dzialanie bakterio¬ bójcze powyzszych czwartorzedowych soli amonio¬ wych jest w duzym stopniu powstrzymywane po¬ zostalymi substancjami organicznymi.Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest to, ze mleko nie zatrzymuje jakiejkolwiek substancji do¬ datkowej, jak to ma miejsce przy prowadzeniu hydrolizy za pomoca rozpuszczalnych enzyinów, z tego wiec wzgledu nie jest konieczne ogrzewanie dla dezaktywacji enzymów i w zhydrolizowamym mleku nie wystepuje nieprzyjemny zapach.Ponadto istotna zaleta jest zastosowanie enzymów w ciagu dlugiego czasu i zhydrolizowanie bardzo duzej ilosci produktu bez zasaidniczego zmniejsze¬ nia aktywnosci hydrolitycznej enzymów. Próbka wlókna enzymatycznego po przeprowadzeniu kolej¬ nych cykli hydrolizy laktozy w mleku, zachowuje niezmiennie swa aktywnosc w przeciagu 60 dni.Ta sama ilosc wlókna enzymatycznego, umiesz¬ czonego w kolumnie szklanej, w sposób ciagly hydrolizuje laktoze mleka w okresie dluzszym od miesiaca bez jakiegokolwiek zmniejszenia aktyw¬ nosci.Ponadto sposób wlaczania enzymów pozwala wy¬ tworzyc wlókna odznaczajace sie rózna aktywnoscia i jest mozliwe skrócenie czasu zetkniecia traktowa¬ nego produktu z nosnikiem enzymatycznym.Sposób wedlug wynalazku mozna stosowac do mleka pelnego, do mleka czesciowo odtluszczonego i do mleka zageszczonego. Sposób ten nadaje sie równiez do serwatki. Stosowanym enzymem jest galaktozydaza.Wlókno moze byc utworzone z substancji celulo¬ zowej, na przyklad z octanu celulozy lub z synte¬ tycznego polimeru lub kopolimeru, na przyklad z poliamidu, poliakrylonitrylu, poliakrylanów, poli¬ metakrylanów, polichlorku winylu, poliestrów wi¬ nylu, poliwinylobutyralu itp.Bardzo dobre wyniki uzyskano stosujac trójoctan celulozy. Sposób wedlug wynalazku blizej objasnio¬ no na podstawie przykladów, nie stanowiacych ograniczenia wynalazku.Przyklad I. W celu wytworzenia nierozpusz¬ czalnego enzymu w reaktorze rozpuszcza sie mie¬ szajac 24,6 g trójoctanu celulozy (Fluka) w 260 g chlorku metylenu. Poza reaktorem przyrzadza sie roztwór enzymu: 1,43 g fj-galaktozydazy rozpuszcza sie w mieszaninie gliceryny i wody (stosunek obje¬ tosci wynosi 20 :80) i doprowadza objetosc do 50 ml. Nastepnie odwirowuje w chlodzonej (do tem¬ peratury ^10°C) wirówce. Z klarownego roztworu 5 odbiera sie 32 ml i dodaje do roztworu polimeru.Wytwarza sie emulsje za pomoca energicznego mie¬ szania w ciagu 30 minut, prowadzonego w tempe¬ raturze 0°C. Nastepnie emulsje wylewa sie do przedzarki i przedzie w temperaturze 6°C, w atmo- 10 sferze azotu. Krzepniecie wlókna prowadzi sie w temperaturze pokojowej w toluenie i nawija za po¬ moca nawijarM. Nastepnie dla usuniecia toluenu suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu nocy. 15 Przyklad II. Stosuje sie kolumne o dlugosci 400 mm i srednicy wewnetrznej 25 mm. Napelnia sie ja 50 g wlókna enzymatycznego wytworzonego w przykladzie I: wlókno umieszcza sie w sposób 20 przypadkowy i prasuje dla wypelnienia objetosci calkowitej kolumny. Kolumne zaopatruje sie w plaszcz termostatyczny w którym krazy woda o temperaturze 25°C. Ze zbiornika, w którym jest utnzytmywana temperatura +4°C, za pomoca pompy 25 dozujacej doprowadza sie mleko (laktoza=4,9%, lipidy=l,l%). Mleko przechodzi przez wymiennik ciepla, w którym ogrzewa sie do temperatury 25°C i jest wprowadzane od dolu kolumny, przeplywa przez wlókno enzymatyczne, jest odprowadzane ze 30 szczytu kolumny i przechodzi przez wymiennik ciepla, w którym ulega ochlodzeniu do temperatury +4°C. Utrzymuje sie staly przeplyw wynoszacy 150 ml/godzine. Po przejsciu przez kolumne, lak¬ toza doplywajacego mleka ulega zhydrolizowaniu w 53%. 35 40 45 50 55 Przyklad III. Postepuje sie w sposób analo¬ giczny do opisanego w przykladzie II, z ta róznica,, ze zmienia sie natezenie przeplywu (Q). Mierzy sie stopien hydrolizy laktozy mleka odprowadzonego z kolumny.Otrzymuje sie doswiadczalne wyniki przedstawio¬ ne w tablicy 1.Tablica 1 Natezenie przeplywu (Q) ml/godzine 150 300 | 600 1200 3200 Ilosc zhydrolizowanej laktozy % 53.00 28.00 \ 18.20 9.20 2.50 Przyklad IV. Stosuje sie te sama ilosc 50 g wlókna enzymatycznego, umieszczonego w kolumnie ~z przykladu II. Przez wlókno enzymatyczne prze- eo puszcza sie w sposób ciagly mleko (laktoza=4,95%, lipidy=1,1%) mierzy sie stopien hydrolizy laktozy podczas okresów czasu jako funkcji natezenia prze- plywu (Q). Podczas procesu % utrzymuje sie tempe¬ rature 25^C. 65 Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 2. ,82 742 6 Tablica 2 30' 45' 60' 90' 120' 150' 180' 210' | 240' Stopien zhydrolizowania laktozy % Q = 800 ml/godz 11,80 21.50 25,70 33,70 41,00 47,00 52,50 59,00 63,50 Q = 3200 ml/godz 1 10,80 19,10 23,60 35,00 44,50 50,20 55,00 63,00 67,00 1 Przyklad V. Stosuje sie te sama ilosc 50 g wlókna enzymatycznego, umieszczonego w tej sa¬ mej kolumnie i bada sie wplyw temperatury na proces hydrolizy. Ponownie ciagle przepuszcza sie przez kolumne 380 ml mleka, nastepnie mierzy sie stopien hydrolizy po uplywie jednej godziny.Utrzymuje sie stale natezenie przeplywu, które wynosi 3200 ml/h i zmniejsza sie temperature pro¬ cesu.Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 3.Tablica 3 Temperatura °C 15 25 | 35 Stopien hydrolizy laktozy w °/o,po 1 godzinie 17,45 22,80 29,94 | Przyklad VI. Stosuje sie te sama ilosc 50 g wlókna umieszczonego w tej samej kolumnie szkla¬ nej. Przez kolumne w sposób ciagly przepuszcza sie 380 ml czesciowo zbieranego mleka (lipidy= =1,1%). Oznacza sie stopien hydrolizy jako funkcje czasu. Utrzymuje sie stale: natezenie przeplywu i temperature procesu. Dane doswiadczalne umiesz¬ czone w tablicy 4 przedstawiaja zmiane stopnia hy¬ drolizy laktozy w czasie.Tablica 4 Okres czasu (godz) 1 2 3 4 5 6 7 8 Stopien hydrolizy laktozy (%) 20,60 36,30 47,20 56,20 62,40 73,40 79,40 88,00 Przyklad VII. W sposób opisany w przykla¬ dzie I wytwarza sie 1,50 g wlókna enzymatycznego, zawierajacego 75 mg (3-galaktozydazy (BDH) wig wlókna. Wlókno umieszcza sie w sposób przypad¬ kowy w kolumnie szklanej (0=25 mm, h=400 mm).Czesciowo zbierane mleko (lipidy=l,l%, lakto¬ za=4,8%) doprowadza sie przy natezeniu -przeplywu równym 150 ml/godz., i temperaturze 25°C. Po przejsciu przez kolumne stopien hydrolizy laktozy w mleku wynosi 81,4%.Przyklad VIII. Hydrolize prowadzi sie w sposób opisany w przykladzie VII, z ta róznica, ze stosuje sie mleko pelne (lipidy=3,5%, laktoza =.4,85%), stopien hydrolizy laktozy wynosi 76%. 5 Przyklad IX. Hydrolize prowadzi sie w spo¬ sób opisany w przykladzie VII, z ta róznica, ze stosuje sie wylacznie mleko odtlusizczorfe (lipidy— =0,3%, laktoza=5,10%). Stopien hydrolizy laktozy 10 wynosi 78%.Przyklad X. Hydrolize prowadzi sie w spo¬ sób opisany w przykladzie VII, z ta róznica, ze stosuje sie serwatke (laktoza=4,9%) o pH 6,7. Sto- 15 pien hydrolizy laktozy w serwatce wynosi 72%.Przyklad XI. W sposób opisany w przykla¬ dzie I wytwarza sie 50 g wlókna enzymatycznego, zawierajacego 75 mg p-galaktozydazy (wig wlók¬ na). Podczas wytwarzania emulsji, stosunek obje¬ tosci fazy wodnej (ml) do ciezaru polimeru w sta¬ nie suchym (g) wynosi 1,6. Wytworzone wlókno o zwiekszonej porowatosci umieszcza sie w kolum¬ nie (0= 25 mm, h=250 (mm). Kolumne zasila sie mlekiem (lipidy=1,1%), przy natezeniu przeplywu (Q) wynoszacym 300 ml/godzine i termostatycznie utrzymuje sie temperature 25°C. Stopien hydrolizy laktozy mleka opuszczajacego kolumne wynosi 66%. 20 25 35 40 45 50 55 60 Przyklad XII. W kolbie o pojemnosci 150 ml 2 g wlókna enzymatycznego miesza sie z 50 ml cze¬ sciowo odtluszczonego mleka, wstrzasa i termosta¬ tycznie utrzymuje temperature 25°C. Po uplywie 4 godzin mleko oddziela sie od wlókna i oznacza stopien hydrolizy laktozy i zawartosc bakteriolo¬ giczna. Dobrze wycisniete wlókno przemywa sie dokladnie za pomoca odpowiedniego roztworu za¬ wierajacego detergent i srodek bakteriobójczy. Po¬ nownie stosuje sie w takich samych warunkach wlókno odcisniete i wysuszone miedzy dwoma ar¬ kuszami bibuly filtracyjnej. Powtarza sie kolejne cykle robocze i pod koniec kazdego cyklu mierzy sie stopien hydrolizy laktozy i oznacza zawartosc bakteriologiczna mleka. Zbadano kilka czwartorze¬ dowych soli amoniowych, ich wplyw na enzymy i mikroorganizmy (takie jak produkty o nazwach handlowych Fardi 7 (Farmitalia), Straminol (Brac- co), chlorek benzalkonowy i Anfocid (Gianni). Tego 51 (Italian Tego), Steramine H (Formenti), jak równiez kilka innych srodków bakteriobójczych, na przyklad fenol, nadtlenek wodoru, podchloryn, jo¬ doform i antybiotyki.Najlepsze wyniki uzyskano stosujac czwartorze¬ dowe sole amoniowe (uwlaszcza produiktty o nazwach handlowych, Steramine H i Fardi 7).W powyzszym sposobie prowadzonym okresowo, oznaczano aktywnosc enzymu w kolejnych cyklach; Ta sama próbka wlókna enzymatycznego zachowala stala aktywnosc po przeprowadzeniu 80 cykli hy¬ drolizy laktozy mleka.Przyklad XIII. Stosuje sie kolumne o sredni¬ cy wewnetrznej równej 25 mm i wysokosci wyno¬ szacej 400 mm, oraz 50 g wlókna enzymatycznego wytworzonego w sposób opisany w przykladzie I,82 742 8 przy czym wlókno to uzywano w ciagu kilku dni.Po kazdym cyklu roboczym wlókno przemywa sie roztworem wodnym zawierajacym 0,25% zwiazku bakteriobójczego (o nazwie handlowej Steramine H), przy czym przemywanie prowadzi sie w tempe¬ raturze pokojowej. Po przemyciu roztwór ten usu¬ wa sie i do obiegu zamknietego wprowadza sie 500 ml mleika. Natezenie przeplywu wynosi 500 ml/godzine, a temperatura procesu wynosi 25°C.W okreslonych odstepach czasu mierzy sie stopien hydrolizy i oznacza zawartosc mikrobiologiczna mleika.Otrzymano daine przedstawione w tablicy 5.Tablica 5 Okres czasu 60' 95' 120' Stopien hydrolizy laktozy Ilosc mikroorga¬ nizmów w 1 ml 18,8 I 120,000 1 28,4 170,000 33,6 | 300,000 | PL