PL81836B1 - - Google Patents

Description

Sposób enzymatycznego wytwarzania L-tryptofanu Przedmiotem wynalazku jest sposób enzyma¬ tycznego wytwarzania L-tryptofanu. Aminokwas ten jest waznym produktem, stosowanym w prze¬ mysle spozywczym, jako dodatek do pasz i pozy¬ wienia o niskiej zawartosci protein, na przyklad maki ziemniaczanej i ogólnie cukrów.Znanych jest szereg sposobów otrzymywania L-tryptofanu droga chemiczna lub fermentacyjna.Sposoby chemiczne prawie nie maja znaczenia z punktu widzenia zastosowan przemyslowych ze wzgledu na niskie wydajnosci, kosztowne surowce i tworzenie racematów. Sposoby fermentacyjne maja równiez istotne wady, mimo szerokich prac nad ulepszeniem.Dobór mikroorganizmów dobrze wytwarzajacych aminokwasy jest bardzo trudny i dlugotrwaly ze. wzgledu na duza niepewnosc istniejaca w tych przypadkach. Odpowiednie mikroorganizmy musza dobrze rozwijac sie w srodowisku o duzym ste¬ zeniu substratu takiego, jak kwas antranilowy lub indol i musza byc odporne na dzialanie tryp- tofanu, powstajacego w wyniku reakcji.Celem wynalazku jest wyeliminowanie nie¬ dogodnosci i wad znanego sposobu fermen¬ tacyjnego.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze indol i seryne kontaktuje sie z enzymem, otrzy¬ manym z takich mikroorganizmów, jak E. Coli, Claviceps, Neurospora, B. Subtilis, Saccaromyces i naniesionym w znany sposób na strukture wlók- 26 2 nista polimeru wlóknotwórczego. Sposób ten mozna takze stosowac do zwiekszania ilosci tryp- tofanu w hydrolizowanych proteinach. Dopro¬ wadza sie wówczas pH do odpowiedniej wartosci, nastepnie do protein dodaje sie zadana ilosc in¬ dolu i kontaktuje z wlóknem, zawierajacym kompleks enzymatyczny. Czesc seryny znajdujacej sie w mieszaninie reakcyjnej ulega wówczas przemianie do tryptdfanu. Enzym zawarty w strukturze wlóknistej mozna latwo wyodrebnic po zakonczeniu reakcji i stosowac go wielokrotnie.Struktury wlókniste, nadajace sie do zastoso¬ wania w sposobie wedlug wynalazku oraz sposób ich wytwarzania przedstawiono we wloskim opisie patentowym nr 836462. Wedlug tego sposobu otrzymuje sie ja z roztworów polimerów wlók- notwórczych, w których rozproszone sa zwiazki enzymatyczne w postaci bardzo drobnych krope¬ lek. Z takiej emulsji mozna przasc na sucho lub na mokro wlókno, zawierajace bardzo male otwory, w których znajduja sie enzymy od¬ dzielone od przestrzeni reakcyjnej bardzo cienka membrana, nie pozwalajaca na dyspersje enzymów w mieszaninie reakcyjnej, a umozliwiajaca wy¬ korzystanie ich aktywnosci katalitycznej.Jako polimer wlóknotwórczy stosuje sie estry¬ fikowana celuloze, jak na przyklad azotan celu¬ lozy, poliolefiny, polimery i kopolimery otrzy¬ mywane z akrylonitrylu, akrylanu, metakrylanów, estrów winylowych, chlorku winylu, chlorku winy- 8183681836 lidenu, styrenu, poliamidy, poliwinylobutyral I i tym podobnych.Enzymy, katalizujace reakcje sprzegania seryny i indolu, otrzymuje sie w znany sposób z mikro¬ organizmów takich, jak E. Coli, Claviceps, Neu- rospora, B. Subtilis, Saccaromyces.Najkorzystniejsze wyniki uzyskuje sie, stosujac w roli katalizatora naniesiony na wlókno z trój¬ octanu celulozy enzym, otrzymany z E. Coli.Enzymy, znajdujace sie w polimerze, dlugo za¬ chowuja aktywnosc. Stwierdzono, ze nie traca one aktywnosci po uplywie 6 miesiecy przy pracy w normalnych warunkach ruchowych. Zmniejsza to zaaggnie, lub~lfaw|t czyni zupelnie nieistotnym ko&zt iotrzymywsnil katalizatora, wplywajac na koszty wytwarzania4 tryptofanu: Pozwala to na stosowanie bardzo czystych zwiazków enzyma¬ tycznych, które sa bardzo dlugo aktywne.Enzymy nie dyfunduja z polimeru do miesza¬ niny reakcyjnej, wskutek czego nie istnieje prob¬ lem ich wyodrebniania, a poreakcyjny roztwór tryptofanu nie zawiera zanieczyszczen utrudnia¬ jacych ekstrakcje, jak to ma miejsce w sposobach fermentacyjnych. W sposobach fermentacyjnych otrzymuje sie stosunkowo duze ilosci innych aminokwasów, przede wszystkim alaniny i wa- liny, a ponadto w srodowisku reakcji znajduje sie szereg zanieczyszczen. Poniewaz enzymy dzia¬ laja tylko na L-seryne, przeto w sposobie wedlug wynalazku jako mieszanine reakcyjna stosuje sie L, D-seryne. Niezuzyta B-seryne wyodrebnia sie z dobra wydajnoscia, racemizuje sposobem che¬ micznym, a. nastepnie zawraca.W sposobie wedlug wynalazku nie jest konie¬ czny szczególnie pracochlonny . dobór i ochrona mikroorganizmów, niezbednych do wytwarzania L-tryptofanu, ani tez prowadzenie reakcji w sro¬ dowisku, zawierajacym pozywki dla tych mikro¬ organizmów. Inna zaleta sposobu wedlug wy¬ nalazku jest mozliwosc pracy systemem ciaglym, co znacznie upraszcza wytwórnie i zmniejsza koszty wytwarzania L-tryptofanu. Wytwarzanie tego aminokwasu sposobem fermentacyjnym wy¬ maga stosowania skomplikowanej aparatury, za¬ pewniajacej dobre mieszanie, napowietrzanie i sterylizacje masy reakcyjnej, oraz dobra kontrole parametrów, wplywajacych na przebieg zjawisk w reaktorze. Sposób wedlug wynalazku wymaga stosowania jednej lub wiecej kolumn stalowych albo kolumn z tworzyw sztucznych oraz pomp.Mozna równiez prowadzic reakcje sposobem periodycznym, kontaktujac substraty z enzymami w ciagu niezbednego okresu czasu, usuwajac i podajac do reaktora nowa porcje substratów.Wlókno z naniesionym enzymem w sposobie we¬ dlug wynalazku stosuje sie wielokrotnie. W pro¬ cesie ciaglym prowadzi sie reakcje katalizowana enzymem, naniesionym na wlókno, ekstrahuje powstaly L-tryptofan znanymi sposobami, na przyklad przez adsorpcje na weglu aktywnym lub zywicy jonowymiennej, lub tez wyodrebnia przez krystalizacje po uprzednim doprowadzeniu do stanu nasycenia.Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Do 70 g komórek E. Coli, hodo¬ wanych na podlozu mineralnym Davisa dodano niewielka ilosc indolu w 140 ml buforu fosfo¬ ranowego o pH=7,8 (0,01 m EDTA i 0,0001 m 5 fosforanu pirydoksalu). Zawiesine poddano obrób¬ ce ultradzwiekami, nastepnie odwirowano, ogrzano w ciagu 3 minut w temperaturze 0°C w roztwo¬ rze siarczanu amonowego o stezeniu, odpowia¬ dajacym 0,3—0,5 stopnia calkowitego nasycenia, 10 rozpuszczono w buforze fosforanowym (0,01 m EDTA, 0,02 m D, L-seryny, 0,0004 m fosforanu piry¬ doksalu i gliceryny w ilosci 30% objetosciowych).Tak otrzymany roztwór zawieral 32 mg protein/ml i 110 jednostek zdolnych do syntetyzowania tryp- 15 tofanu na 1 mg protein. Jako jednostke przyjeto taka ilosc enzymów, która powoduje synteze 0,1 mola L-tryptofanu w temperaturze 25°C w ciagu 30 minut. 20 g trójoctanu celulozy (Fluka A. G., Che- 20 mische Fabrik CH — 9470 Buchs, Szwajcaria) rozpuszczono, mieszajac, w 265 g chlorku metylenu (Carlo Erba SpA, Mediolan, vis Imbonati 24) i do calosci dodano 30 ml roztworu enzymatycznego.W wyniku intensywnego mieszania w tempera- 26 turze 0°C w ciagu 30 minut otrzymano emulsje.Po przelaniu emulsji do niewielkiego zbiornika, utrzymywanego w temperaturze 0°C, przedzono wlókna w atmosferze azotu, a nastepnie koagu- lowano w toluenie w temperaturze pokojowej. 30 Wlókna suszono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia toluenu.Do cylindrycznego reaktora o pojemnosci 2 litrów, zanurzonego w lazni o temperaturze 25°C i obracajacego sie wokól wlasnej osi, wprowa- 39 dzono 10 g wlókna z naniesionym katalizatorem i 1 litr mieszaniny reakcyjnej, zawierajacej 20 mg D, L-seryny w 1 ml, 2 mg fosforanu piry- doksalu/ml w 0,01 m buforze fosforanowym o pH=7,8. Indol w postaci stalej dodawano porcja- 40 mi ze wzgledu na jego mala rozpuszczalnosc.Reakcje prowadzono w ciagu 8 godzin, po czym ciecz usunieto z reaktora, do którego wprowa¬ dzono nastepna porcje mieszaniny reakcyjnej.Cykl ten powtarzano wielokrotnie. Ilosc L-tryp- 45 tofanu w cieczy poreakcyjnej wynosila 7,9 g po pierwszym cyklu, po 150 cyklach zas praktycznie nie ulegla zmianie i wynosila 7,7 g.Przyklad II. Postepujac w sposób analogi¬ czny do opisanego w przykladzie I, otrzymano 50 wlókno z 20 g trójoctanu celulozy z naniesionym enzymem i 40 ml mieszaniny wody z gliceryna, zawierajacej 90 mg protein/ml o aktywnosci wlasciwej 110 jednostek/mg. Wlókna te zawieraly 180 mg protein i mialy aktywnosc 19800 jed- 55 nostek na 1 g trójoctanu celulozy.Stosujac reaktor, opisany w przykladzie I, mie¬ szano 10 g tych wlókien w temperaturze 25°C z 1 litrem mieszaniny reakcyjnej o skladzie po¬ dobnym do opisanego w przykladzie I. Po 8 go- 03 dzinach w roztworze znajdowalo sie 15 g L-tryp¬ tofanu. Otrzymany tryptofan i niepszereagowana seryne zaabsorbowane przy uzyciu zywicy jono¬ wymiennej i wymyto oddzielnie roztworami o róznym pH. Wyodrebniono w ten sposób 98% 66 L-tryptofanu i 90% seryny. Seryne racemizowano81836 chemicznie i wykorzystywano do syntezy L-tryp- tofanu wyzej opisanym sposobem.Przyklad III. Do wytwarzania tryptofanu uzyto aparat skladajacy sre? ze szklanej kolumny o srednicy wewnetrznej 4 cm i dlugosci 50 cm otoczonej plaszczem termostatujacym. Wlot i wy¬ lot z tej kolumny polaczony byl z reaktorem, zaopatrzonym w mieszadlo, przy czym na wlocie zainstalowano pompe perystaltyczna o wydajnosci 0—1000 ml/min. 10 g wlókna, stosowanego w przykladzie II, wprowadzono do kolumny, po czym rozpoczeto cyrkuiowanie z szybkoscia 600 ml/min. 2 litrów mieszaniny reakcyjnej o skladzie takim, jak mieszanina opisana w przykladzie I i II. Indol dodawano do reaktora porcjami, stale mieszajac. Po 8 godzinnym mieszaniu, gdy ste¬ zenie tryptofanu wynosilo 8 mg/ml, usunieto 1 litr mieszaniny, zastepujac je 1 litrem swiezej mie¬ szanki. Mieszanine poreakcyjna zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu wytracenia czesci tryptofanu. Pozostaly roztwór zawrócono do reaktora, doprowadzajac w ten sposób, stop¬ niowo, do calkowitej przemiany L-seryny. Roz¬ twór D-seryny racemizowano sposobem chemicz¬ nym i równiez zawracano. Postepujac w ten spo¬ sób mozna osiagnac stopien przemiany racematu seryn do L-tryptofanu równy okolo 80%.Przyklad IV. 100 g shydrolizowanych pro¬ tein, pochodzacych z mieszaniny kazeiny i krwi wolowej w stosunku wagowym 1:1 i zawieraja¬ cych 5,4 czesci wagowych L-seryny, rozpuszczano w 500 ml 0,1 m buforu fosforanowego, po czym pH calosci doprowadzano do wartosci 7,8. Po podaniu 2 mg fosforanu pirydoksalu roztwór cyrkulowano w aparacie, opisanym w przykladzie III w temperaturze 25°C, az do momentu uzyska¬ nia przemiany 20% L-seryny do L-tryptofanu.Roztwór analizowano za pomoca automatycznego analizatora aminokwasów, stwierdzajac, ze za¬ wartosc L-tryptofanu wynosi 4 mg/ml.Przyklad V. Na rysunku przedstawiono schemat pracujacej w sposób ciagly instalacji do enzymatycznej syntezy L-tryptofanu z indolu i D, L-seryny.Mieszanine reakcyjna przygotowuje sie perio¬ dycznie w zbiorniku 5 otoczonym plaszczem, do którego przewodami 1, 2, 3 i 4 doprowadza sie D, L-seryne, indol, fosforan pirydoksalu i 0,1 m wodny roztwór fosforanu potasowego o pH=7,8.Reagenty miesza sie intensywnie w celu przy¬ spieszenia rozpuszczania. Za pomoca pompy 6 mieszanine reakcyjna podaje sie, przewodem 7, do zbiornika 8, z którego zasilany jest w spo¬ sób ciagly reaktor 12 zawierajacy wlókna z na¬ niesionym enzymem. Wlókna te nie powinny byc zbyt gesto upakowane w reaktorze, aby umozli¬ wic lepsze wykorzystanie aktywnosci katalitycznej enzymów. Zaleca sie takie upakowywanie wlókien, aby gestosc wynosila 10—100 kg wlókien/m3 objetosci reaktora.Oczywiscie szybkosc przemiany L-seryny ma¬ leje w miare przebiegu reakcji. Dlatego tez korzystne jest takie prowadzenie ruchu instalacji, aby osiagnac stopien przemiany 60—70%, wskutek czego unika sie niskich szybkosci reakcji. Nie- przereagowana L, D-seryne zawraca sie do re¬ aktora.Bilans materialowy reaktora na 1 kg enzyma¬ tycznego przedstawia sie nastepujaco. Pompa 5 9 podaje do reaktora 120 g/godz. D, L-seryny, 50,8 g/godz. indolu, 6 mg/godz. fosforanu piry¬ doksalu, 30 kg/godz. wody i 0,3 mola/godz. fosfo¬ ranu potasowego. Z reaktora 12 otrzymano 60 g/godz. D-seryny, 20 g/godz. L-seryny, 78 g/godz. io L-tryptofanu, 6 g/godz. indolu, 30 kg/godz. wody, 6 mg/godz. fosforanu pirydoksalu i 0,3 mola/godz. fosforanu potasowego.Pompa 10 sluzy do wywolywania intensywnej cyrkulacji mieszaniny reakcyjnej w reaktorze 12, 15 homogenizujac mieszanine i utrzymujac niskie stezenie indolu w reaktorze. Natezenie przeplywu wynosi okolo 1 m8/godz. na 1 kg wlókna. Regu¬ lacja pH nie jest konieczna, poniewaz nie zmie¬ nia sie ono zasadniczo podczas przebiegu reakcji. 20 z wodnego roztworu, opuszczajacego reaktor 12 ekstrahuje sie indol inna ciecza, na przyklad toluenem. Operacje te mozna prowadzic przy uzyciu odstojnika z mieszadlem w jednym lub w kilku etapach. Wedlug schematu na rysunku indol 25 ekstrahuje sie W zbiorniku 13 za pomoca toluenu, doprowadzanego przewodem 30. Obie fazy ciekle rozdziela sie nastepnie w separatorze 14, z któ¬ rego przewodem 31 odbiera sie rozpuszczalnik i kieruje do oczyszczenia. Faze wodna, zawfera- M jaca seryne i tryptofan, przesyla sie pompa 15 do separatora 16 w celu wyodrebnienia tryptofanu, co mozna zrealizowac przy uzyciu zywicy jonowy¬ miennej lub wegla aktywnego. W pierwszym przypadku wolny roztwór seryny i tryptofanu 35 przepuszcza sie, na przyklad, przez kolumne wy¬ pelniona Amberlitem IR 118 w formie wodorowej (Rohm and Hass Co., USA), na którym zostaja zaadsorbowane oba zwiazki. Nastepnie kolumne wymywa sie kolejno 0,2 m wodnym roztworem 40 NH4CI, w którym rozpuszcza sie seryna, oraz 0,2 m wodnym roztworem amoniaku, w celu odzyskania tryptofanu.Na schemacie przedstawiono drugi sposób wy¬ odrebniania tryptofanu. Ze zbiornika 14 wodny roz- 45 twór przesyla sie do koliummy 16, wypelnionej weglem aktywnym, na którym adsortouje sie tryp¬ tofan, podczas gdy roztwór zawierajacy cala D-se¬ ryne i nieprzereagowana L-seryne podaje sie prze¬ wodem 17 do reaktora 18. Stosuje sie uklad kolumn 50 pracujacych równolegle w celu zapewnienia ciaglej pracy ukladu adsorpcyjnego. W jednej z kolumn adsorbuje sie tryptofan, w innych wymywa sie zaadsorbowany tryptofan i przemywa wegiel aktywny woda demiineralizowana, podawana do 55 kolumny przewodem 20 i odbierana przewodem 32. Tryptofan wymywa sie mieszanina wody z alkoholem w stosunku wagowym 1:1 (pH = 8), doprowadzana przewodem 18. Przewodem 21 od¬ plywa roztwór tryptofanu, homogenizowany na- ® stepnie w zbiorniku 22. Roztwór ten zawiera sladowe ilosci fosforanu pirydoksalu. Pom¬ pa 23 roztwór przesyla sie do wyparki 24, w któ¬ rej steza sie go pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C, a nastepnie podaje przewodem «5 25 wymiennika ciepla 26 i krystalizatora 27.81836 W krystalizatorze 27 tryptofan wytraca sie, do¬ prowadzajac pH mieszaniny do wartosci 5,9. Tak otrzymana zawiesine odwirowuje sie, zawracajac czesc wody przewodem 28 do zbiornika 22 i usu¬ wajac pozostala czesc w celu unikniecia nagroma¬ dzenia sie zanieczyszczen w obiegu. Wilgotne kry¬ sztaly suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem.Roztwór D, L-seryny, opuszczajacy kolumny 16, racemizuje sie w reaktorze 18 droga podgrzania w wymienniku 29, przesyla sie go do zbiornika 33, ¦z którego pobiera sie go do zbiornika 5 w celu przy¬ gotowania mieszaniny reakcyjnej. Przed wymien¬ nikiem 29 mozna odprowadzac czesc roztworu w celu zmniejszenia ilosci zanieczyszczen w obiegu. 15 8 PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób enzymatycznego wytwarzania L-tryp- tofanu, znamienny tym, ze indol i seryne kontak¬ tuje sie z enzymem, otrzymanym z mikroorga¬ nizmów E. Coli, Claviceps, Neurospora, B. Subti- lis lub Saccaromyces i naniesionym w znany spo¬ sób na strukture wlótonista polimeru wlókno^twór- czego.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie wlókna z estryfikowanej celulozy, azo¬ tanu celulozy, poliolefin, polimerów i kopolimerów akrylonitrylu, akrylanów, metakrylanów, estrów winylowych, chlorku winylu, styrenu i poliamidów.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako wlókna stosuje sie wlókna z trójoctanu celu¬ lozy. ^^ PZG Koszalin D-275. Naklad 110 egz. A-4 Cena 10 zl PL