Uprawniony z patentu: Newport Pharmaceuticals Inc. Newport Beach, Kalifornia (Stany Zjednoczone Ameryki) b Sposób wytwarzania nowych zwiazków kompleksowych inozyny Wynalazek dotyczy nowych zwiazków komplekso¬ wych inozyny charakteryzujacych sie aktywnoscia fizjologiczna i wykazujacych cenne wlasnosci far¬ makologiczne.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków kompleksowych (inozyny, zwlasz¬ cza kompleksów inozyny z pochodnymi dwuaMlo- metanolu oraz ich soli z kwasami.Z publikacja firmy japonskiej Morishita Pnarma- ceutical Co. Dtd. w Osaka, pt. „Inosrin" oraz „Me- taibolic aotivator inosine preparation", jak li innych, znana jest fizjologiczna aktywnosc inozyny.Wiadomo jest, ze rybozyd ten wykazuje zdolnosc oddzialywania na pamiec ssaków wplywajac na u- latwienie procesu ulezenia sie, przy czym wplyw ten jest znacznie mniej zaznaczony u starszych ssaków, a w niektórych przypadkach moze powodowac rów¬ niez i obnizenie zdolnosci uczenia sie.W porównaniu z inozyna, nowe zwiazki komplek¬ sowe inozyny wykazuja o wiele bardziej cenne wlasnosci terapeutyczne, przy czym charakteryzuja sie one równiez poprawieniem uposledzonej zdol¬ nosci uczenia sie jak i powstrzymywania abjawów starzenia sie organizmu, a takze sa równiez cenne w zwalczaniu chorób wirusowych, jak i przydatne jako utwardzacze zywic melaminoformaldehydo- wych lub mocznikowoformaldehydowych.Zwiazki te sa równiez przydatne w leczeniu scho¬ rzen neurotroficznych, jak np. amyotroficznej la- teriosklenozy oraz tych przypadków kiedy dochodzi 10 20 25 30 2 do niedostatecznej syntezy kwasu rybonuklemo- wego o duzym ciezarze czasteczkowym lub bialka w mózgu.Wedlug wynalazku zwiazek kompleksowy inozy¬ ny z pochodnymi dwualkiloaminoetanolu wytwarza sie sposobem polegajacym na tym, ze dwualkiloami- noalkanol o ogólnym wzorze (Ri) (R2) N(CnH2n)OH, w którym Ri i R2 oznaczaja nizsze rodniki alkilo¬ we, takie jak Ci—C4, a symbol n oznacza liczbe calkowita 2—4, poddaje sie reakcji z inozyna w srodowisku wodnym w proporcji molowej jak 1—10 :1 i wytworzony zwiazek kompleksowy ewen¬ tualnie wyodrebnia sie w znany sposób.Jako dwualkiloaminoetanol mozna stosowac sól dwualkiloaminoetanolu z (kwasem farmakologicz¬ nie dopuszczalnym, takim jak np. kwas chlorowo¬ dorowy lub kwas p-aminobenzoesowy, siarkowy, acetylosalicylowy, d-winowy, maleinowy, fumarowy, bursztynowy, cytrynowy, trans-cynamonowy, sali¬ cylowy, metainosulfonowy, octowy, lub .propionowy.Wiekszosc soli tych kwasów z dwualkiioamino- etanolem stanowi zwiazki higroskopijne i dlatego najkorzystniejsza jest sól z kwasem p-acetoami- dobenzoesowym, charakteryzujaca sie znikoma hi- groskopijnoscia.Jako odpowiednie dwualkiloaminoetanole wymie¬ nia sie dwumetyloaminoetanol, dwuetyloaminoeta- nol, dwuetyloaminaizopropanol, metyloetyloamino- etanol, dwumetyloaminopropanol, dwumetyloamino- butanol, dwubutyloaminoetanol, dwupropyloamino- 8096080960 etanol i dwuizopropyloaminoetanol, zwlaszcza dwu- metyloaimimoizopropanol, gdyz zwiazek ten tworzy z inozyna kompleks 1—4: 1 Charakteryzujacy sie wybitnie cennymi wlasnosciami.Dogodny sposób wytwarzania zwiazku komplek- 5 sowego polega na tym, ze dwualkiloaminoetanol miesza sie np. z kwasem p-acetoamidobenzoeso- wym w proporcji molowej jak 1:1, po czym la¬ godnie podgrzewa i wytworzona sól miesza na sucho z inozyna w proporcji molowej jak 1—10:1, 10 zwlaszcza 1—4: 1, po czym mieszanine rozpuszcza w srodowisku wodnym i wytworzony zwiazek kompleksowy ewentualnie wyodrebniona w znany sposób.Zwiazek jkpmplek£5wy mozna równiez wytworzyc 15 przei kolejne rozpuszczanie skladników, tj. roz¬ puszczenie dwualkiloairiinoetanolu, ewentualnie w postpiciiS^:i'^stapnie*wprowadzenie do roztworu inozyny,**w' wyzej podanej proporcji molowej.Stwierdzono równiez, ze dwualkiloaminoetanol 20 o wyzej podanym wzorze ogólnym oraz inozyne mozna wprowadzic w wyzej podanej proporcji mo¬ lowej do organizmu ssaków, w postaci mieszaniny skladników lub oddzielnie i wytworzyc in situ zwiazek kompleksowy farmakologicznie czynny. 25 Zwiazki wedlug wynalazku charakteryzuja sie cennymi wlasnosciami gdyz umozliwiaja: 1) ponowne doprowadzenie uposledzonej zdolnosci uczenia sie jak i pamieci u starych szczurów 30 do stanu mlodego zwierzecia i to zarówno w odniesieniu do trudnych jak i latwych zadan i to podczas okresu calego dnia i nocy; 2) polepszaja u mlodych iszczurów zdolnosc wyucze¬ nie sie bardzo trudnych zadan. 35 Powyzsze wlasnosci nowych zwiazków komplek¬ sowych inozyny zostaly stwierdzone w licznych badaniach, w których jednoczesnie wykazano, dz wlasnosci takich nie wykazuje ani sama inozyna ani same arninoalkohole, przy czym sama inozyna 40 nie tylko, ze nie wykazuje tak wyraznego dzialania jak zwiazki wedlug wynalazku lecz w pewnych okreslonych porach dnia nawet uposledza mozli¬ wosc uczenia sie mlodych zwierzat.Przy stosunku molowym aminoalkoholu do ino- 45 zyny wynoszacym 1 : 1—3 :1 zwiazki wedlug wy¬ nalazku maja wartosc LD50 przewyzszajaca 4000 mg/kg dla szczurów i myszy przy zaaplikowaniu dootrzewnym lufo per os. Przy stosunku aminoal¬ koholu do inozyny wiekszym od 10:1 wystepuje so wyraznie zwiekszenie toksycznosci.Wydaje sie, ze zwiazek kompleksowy inozyny z aminoalkoholami wedlug wynalazku zmienia ino- zynowa przemiane materii w mózgu. Zwiazek kom¬ pleksowy dwumetyloaminoizopropanolu z radio- 55 aktywna inozyna wykazal w mózgu szczura, ze przemiana materii radioaktywnej inozyny ulegla calkowitej zmianie (radioaktywna inozyne uzyto w charakterze znacznika).Podczas gdy inozyna wykazuje pewne okreslone 60 dzialanie dodatnie na zdolnosc pamietania i ucze¬ nia starych ssaków, przykladowo szczurów i my¬ szy, znacznie silniejszym dzialaniem odznaczaja sie zwiazki kompleksowe aminoalkoholi z inozyna, zwlaszcza zwiazek kompleksowy z dwumetyloami- 65 noizopropanolem, przykladowo w stosunku molo¬ wym 1:1.U ssaków (szczurów) mlodych lub w srednim wieku sama inozyna uposledza moznosc uczenia, natomiast zwiazki kompleksowe wedlug wynalazku polepszaja te zdolnosc. Róznica w dzialaniu byla uzalezniona od pory dnia. Wieczorem, zarówno ino¬ zyna jak i zwiazek kompleksowy dwumetyloami- noizopropanolu z inozyna (przy stosunku molowym 1:1) polepszaja zdolnosc uczenia. We wczesnych godzinach rannych lub na poczatku popoludnia tylko zwiazki kompleksowe polepszaja moznosc uczenia.Dzialanie polepszajace zdolnosc uczenia mozna zaobserwowac najlepiej przy zastosowaniu zadania, które sprawia wyTazne trudnosci zwierzetom star¬ szym. Latwe zadania, które moga byc wykonane tak przez mlode jak i przez stare zwierzeta, przy uzyciu samej inozyny wykazuja polepszenie wyni¬ ków uczenia, lub przy stosowaniu wieczorem zwiazków kompleksowych wedlug wynalazku. Przy zadaniach trudniejszych zwiazek kompleksowy w stosunku molowym 1 : 1 zwieksza zdolnosc uczenia równiez podczas dnia, natomiast sama inozyna obniza zdolnosc uczenia.W czasie nocy, gdy zwierzeta (szczury) sa aktyw¬ ne, zwiazek kompleksowy w stosunku molowym 1: 1 znacznie przewyzsza dzialanie samej inozyny, gdyz zarówno dla bardzo trudnych jak równiez srednio trudnych zadan wzrasta zdolnosc uczenia.W godzinach porannych przy zadaniach trudniej¬ szych zwiazek komplefosowy zwieksza zdolnosc u- czenia, podczas gdy w dzialaniu samej inozyny wystepuje obnizenie tej zdolnosci.Fachowcy stwierdzili, odnosnie do polepszania zdolnosci uczenia, ze zaleznosci dla róznych ssaków, np. szczurów sa podobne jak dla czlowieka.Przy uzyciu zwiazku kompleksowego dwumetylo- aminoizopropanolu z inozyna (stosunek molowy 1:1) nie mozna odróznic zdolnosci pamietania i u- czenia wsród mlodych szczurów i starych szczurów, chociaz moznosc uczenia i pamietania szczurów starych przed potraktowaniem byla uposledzona.Uzyskane wyniki sa znacznie wyrazniejsze niz przy stosowaniu dwufenylohydantoiny. Zauwazono równiez, ze zwiazki kompleksowe~inozyny, wedlug wynalazku, o stosunku molowym inozyny do ami¬ noalkoholu wynoszacym przykladowo 1:1—1: 3 po¬ woduja zmiane polirybozomów, w których zwiek¬ sza sie wewnetrzne usieciowanie wiazaniami most¬ ków wodorowych. Zwiazek kompleksowy dziala silniej niz sama inozyna, która równiez wykazuje dzialanie w tym kierunku.Poza tym stwierdzono przy próbach ze szczura¬ mi, ze widmo rybozomowe w mózgu ulega jedynej w swoim rodzaju zmianie w obecnosci zwiazków kompleksowych, np. zwiazku kompleksowego ino¬ zyny z dwumetyloaminoizopropanoilem, w stosunku molowym 1: 1, lecz zmiana ta nie wystepuje przy uzyciu samej inozyny. Powstaja nowe pasma w za¬ kresie malych ciezarów czasteczkowych, które wy¬ kazuja wlasnosci informozomu.Zwiazki kompleksowe wedlug wynalazku, a zwlaszcza zwiazek kompleksowy inozyny z dwu- metyloaminoiizopropanolem wykazuja ponadto silne5 80960 6 dzialanie przeciwwirusowe. Podczas gdy inozyna jest calkiem bezskuteczna przeciw wirusom grypy i wirusem opryszczki. Zwiazek kompleksowy wy¬ kazuje dzialanie zabezpieczajace dla GO—80^/0 zwie¬ rzat (szczurów), przy smierci wszystkich zwierzat porównawczych. Poza tym stwierdzono, ze zwiazki kompleksowe (stosunek molowy aminoailkoholu do inozyny równy 1:1 lub 3:1) mozna zaaplikowac do 12 godzin po zakazeniu wirusem, przy czym infekcja rozpoczyna sie juz po 15 minutach.Przy rozpuszczaniu inozyny i dwumetyloamino- izopropanolu w wodzie i odparowaniu do sucha uzyskuje sie najpierw osad czystej inozyny, a nas¬ tepnie zwiazek kompleksowy jako pozostalosc, cha¬ rakteryzujaca sie odmiennym widmem w podczer¬ wieni. Stosunek molowy aminoalkoholu do inozyny wynosi 3:1.Inozyne i nadmiar chlorowodorku dwumetylo- aminoizopropanolowego miesza sie, po czym stapia i przeprowadza próbe odsublimowanda nadmiaru aminy. Za pomoca sublimacji nie udaje sie od¬ dzielic calkowicie aminy.Przy rozpuszczaniu inozyny i dwumetyloamino¬ izopropanolu w wodzie, w stosunku molowym 1:10 (inozyna do aminoalkoholu) spektroskopia w ultra¬ fiolecie wykazuje widmo wlasciwe, które nie moglo powstac jedynie wskutek addycji. Powstaja nowe pasma w ultrafiolecie: przy dlugosci fali wynosza¬ cej 285 mji i pasma przy 200' m\i.Dowodem, ze chodz o nowe zwiazki sa zalaczone rysunki, na których pokazano widma w podczer¬ wieni trzech zwiazków, fig. 1 przedstawia widmo podczerwieni zwiazku kompleksowego wytworzo¬ nego z 1 M inozyny i 4 M chlorowodorku dwu¬ metyloaminoizopropanolu, po rozpuszczeniu w wo¬ dzie i suszeniu, fig. 2 przedstawia widmo w pod¬ czerwieni inozyny, a fig. 3 widmo w podczerwieni suchej mieszaniny inozyny i hydrochlorku dwume¬ tyloaminoizopropanolu. ...Porównanie krzywych dowodzi, ze zwiazek kom¬ pleksowy (fig. 1) wykazuje inne widmo w podczer¬ wieni, a nie takie jakiego mozna byloby oczekiwac na podstawie poszczególnych skladników. Tak wiec brakuje oczekiwanych pasm dla dlugosci fal po¬ wyzej 11,45 ^ przy 8 \l, 8,1 [i i 8,55 \i (fig. 1), na¬ tomiast pasma te wystepuja na fig. 2 i 3.Przy stosunkach molowych inozyny do amino¬ alkoholu, np, dwumetyloaminoizopropanolu wyno¬ szacych do ponizej 1:10, zaobserwowano róznice w widmie w podczerwieni, spodziewana na podsta¬ wie poszczególnych skladników.Przy dodaniu inozyny i dwumetyloaminoizopro¬ panolu do wody destylowanej wfidmo w podraer- wieni wykazuje istnienie nowych stanów elektro¬ nowych, a zatem potwierdza wytworzenie zwiazku kompleksowego. Tak wiec badano widmo roz¬ tworu wodnego 0,5 M dwumetyloaminoizopropanolu i 0,022 M inozyny, przy wartosci pH 10,0 jako roz¬ twór buforowy stosowano 0,5 M Na2HP04 — KOH, przy czym porównano widmo w podczerwieni roz¬ tworu wie zawierajacego inozyny. Zanika energia w zakresie krótkich dlugosci fal, a w obecnosci inozyny energia ponownie pojawia sie w zakresie fal dluzszych. Temu przesuneciu w strone zakresu dluzszych fal towarzyszylo pojawienie sie nowych pasm przy dlugosci fali okolo 270 mji.Przy wartosci pH 7,2 roztwór wodny 0,5 M dwu¬ metyloaminoizopropanolu i 0,037 M inozyny wyka- 15 zuje podobny przebieg reakcji, tylko nieco po¬ wolniejszy. Przy uzyciu nieznacznych ilosci NaOH dokonano bardzo malych zmian pH roztworu ino¬ zyny, dwumetyloaminoizopropanol miareczkuje sie przy pomocy HC1 do osiagniecia wartosci pH 7,2, 10 przy której dwuaminopropanol wystepuje w postaci chlorowodorku. Nowe pasma zamiast przy dlugosci fali 270 m^i pojawiaja sie psnzy 285 \i.Zarówno przy wartosci pH 10,0 jak i pH 7,2 badano rózne stosunki molowe inozyny do dwu- 15 metyloaminoizopropanolu i stwierdzono jakosciowo podobne wyniki. Uklad badano dalej przy uzyciu 0,5 N roztworu HC1 jak i w nieobecnosci tego kwasu, który dodawano do roztworu inozyny bez dwumetyloaminoizopropanolu, przy czym nie wy- 20 stapily zadne znaczne zmiany w wynikach. Wyka¬ zuje to, ze zaobserwowane róznice widma nie sa funkcja istnienia chlorku lub niecharakterystyaz- nych kationów. Zauwazono, ze w srodowisku wod¬ nym, w alkalicznym, obojetnym i kwasnym dwu- 25 metyloaminoizopropanol i inozyna wytwarzaja lacz¬ nie widmo absorpcyjne w ultrafiolecie, które tak rózni sie od sumy oddzielnie otrzymanych widm poszczególnych skladników, ze nalezy przyjac wy¬ tworzenie zwiazku kompleksowego. 30 Z drugiej strony, przy wzieciu za podstawe przy pomiarach wodnego roztworu inozyny i dwumety¬ loaminoizopropanolu w stosunku molowym 1:10, zauwazono znikniecie pasma w okolicy dlugosci fali okolo 200 mu przy wartosci pH 7. 35 Ponadto oznaczono wspólczynnik dyfuzji inozyny w wodzie. Przy pH o wartosci 10,4 dyfuzja inozyny w wodzie przebiega o okolo 80*/o szybciej niz w przypadku mieszaniny inozyny i dwumetyloamino¬ izopropanolu. Poza tym inozyna dyfunduje szyb- 40 ciej do wodnego roztworu dwumetyloaminoizopro¬ panolu niz do samej wody. Wszystkie powyzej opi¬ sane dane dotyczace dyfuzji i cech spektroskopo¬ wych potwierdzaja kompleksowa budowe wytwa¬ rzanego zwiazku. 45 Nowy zwiazek wytworzony z inozyny i amino¬ alkoholu, np. dwumetyloaminoizopropanolu lub dwu- metyloaminoetanolu, wykazuje wplyw hamujacy na rybonukleaze, czego nie wykazuje pojedynczo za¬ den z obu skladników. Dalej zauwazono, ze za- 50 aplikowanie w postaci sproszkowanej mieszaniny inozyny i hydrochlorku aminoalkoholu, np. hydro¬ chlorku dwumetyloaminoizopropanolu, przy roz¬ puszczeniu w momencie aplikacji, wykazuje takie same dzialanie jak uprzednio przygotowany roztwór 55 wodny. Zatem oba skladniki zwiazku komplekso¬ wego mozna aplikowac albo w postaci uprzednio wytworzonego zwiazku kompleksowego lub wspól¬ nie, a nawet oddzielnie, z zastrzezeniem, ze oba zwiazki maja moznosc polaczenia sie w organizmie. «o Pacjentowi cierpiacemu na amylotroficzna la- terioskleroze .podawano inozyne i dwumetyloami- noetanol albo dwumetyloaminoizopropanol. Oddzie¬ lono przy tym oba skladniki zwiazku komplekso¬ wego lecz zasadniczo podano je równoczesnie. «5 W ciagu roku stosowano czasem zwiazek komplek-80960 8 10 sowy dwumetyloaminoetainiolu, a czasem taki zwia¬ zek dwumetyloaminoizopropanolu.W badaniach przeprowadzonych na ludziach zwiazki podawano codziennie, a czasem trzykrotnie w ciagu tygodnia, przy czym u osobnika o wadze 5 59,0 Kg, otrzymujacego w ciagu wielu miesiecy codzienna dawke zwiazku kompleksowego 80—138 mg/Kg, nie stwierdzono ubocznego toksycznego dzialania tego zwiazku. Inozyne podawano w mleku, a aartinoalkohol w soku pomaranczowym.W przyblizeniu, dwuetyloaminopropanol nie wy¬ kazuje takich samych korzystnych wlasnosci tera¬ peutycznych jak dwuimetyiloairdnodizopiropainol.Zwiazki lub kompleksy wedlug wynalazku moga cofac objawy starzenia u ssaków takich jak szczu- 15 ry, myszy, swinki morskie, primery, psy, koty, konie, bydlo, owce i swinie. Zwiazki kompleksowe np. zwiazek kompleksowy inozyny i dwumetylo¬ aminoizopropanolu moga znalezc zastosowanie w hodowli ssaków gdyz usuwaja uszkodzenia watroby 20 i mózgu i ponadto polepszaja funkcje mózgu.U myszy stwierdzono jednoznaczne dzialanie prze- ciwwirusowe przeciwko winusom RNS (kwas rybo- nukleinowy) i DNS (kwas dezoksyrybonukleinowy) wlacznie z wirusem grypowym typu A, jak rów- M niez szczepem PR oraz szczepem Bethesda oraz przeciw wirusowi opryszczki (Lu). Przy tych -próbach zmieszano ze soba, w wodnym roztworze inozyne i dwumetyloaminoizopropanol, w stosunku molo¬ wym 1:1—1:10, a nastepnie roztwór doprowadzó- 30 no do wartosci pH Ifi za pomoca roztworu kwasu solnego.Roztwór ten aplikowano myszom dootrzewno dwa razy dziennie przy dawce 138 mg/kg lub podawano w wodzie pitnej, tak ze kazde zwierze otrzymalo x dziennie dawke okolo 275 mg/kg przy naturalnym poborze wody.Polaczenie inozyny z dwumetyloami- noizopropanolem zmniejszylo smiertelnosc i przy¬ padki smierci po zakazeniu wirusami grypy lub opryszczki. Natomiast sama inozyna nie byla sku- *° teczna przeciw wirusom opryszczki i wykazala nieznaczne dzialanie przeciw wirusom grypy.Ponizej podano typowe wyniki: Wirus grypy. Dzialanie zwiazku kompleksowego na wirusy grypy. Po donosowej inokulacji wirusów ^ grypowych (szczep A-2 Bethesda) myszom, rozpo¬ czeto traktowanie iw 3 godzinach. Po inekcji do- otrzewnej placeto z sola fizjologiczna nie przezylo zadne z 59 zwierzat, podczas gdy po potraktowaniu zwiazkiem kompleksowym inozyny i dwumetylo- 5° aminoizopropanolu (1:3 moli) trwale przezylo 21 z 30 zwierzat.Wirus opryszczki. Myszy zarazono dozylnie wi¬ rusem opryszczki i po 3 godzinach rozpoczeto tak¬ towanie. Z 59 zwierzat przezylo tylko jedno, nato- 55 miast sposród 30 zwierzat potraktowanych zwiaz¬ kiem kompleksowym inozyny i dwumetyloamino¬ izopropanolu (1:3), przezylo 17 zwierzat.Jak wyzej podano, przy wytwarzaniu zwiazku kompleksowego wedlug wynalazku stosunek ino- so zyny do aminoalkoholu korzystnie wynosi co naj¬ mniej 1:1, a zwlaszcza 1:3 i 1:4. Gdy stosunek ten jest mniejszy od 1:1 i np. wynosi 1:0,5 wówczas zmniejsza sie rozpuszczalnosc zwiazku kompleksowego w wodzie. *5 Nalezy przyjac, ze zwiazki kompleksowe wedlug wynalazku przejawiaja swe dzialanie przez zmiane wewnetrznej struktury biologicznej polimerycznych i bogatych w polimery organelli tak, ze zmniejsza sie ich sklonnosc do tworzenia dodatniej entropii lub statystycznego podzialu.Zmiana ta jest istotna przy starzeni sie, gdyz stwierdzono, ze obfitujace w polimery organelle daza w starzejacej sie tkance do wywolania nie¬ prawidlowej wielkosci dodatniej entropii, to znaczy statystycznego nieuprzadkowania.Zmiany spowodowane zwiazkami kompleksowymi wedlug wynalazku uodporniaja obfitujace w poli¬ mery organelle przez wytworzenie wiazan mostka¬ mi wodorowymi, przeciwdzialajac tym wplywom, które prowadza do zmniejszenia wewnetrznych wiazan, co równoczesnie powoduje zwiekszenie od¬ pornosci na ataki enzymów rozkladowych. Laitwo wytwarza sie zwiazek kompleksowy z p-acetami- dobenzoesanem: aminoalkohol, np. dwumetyloami¬ noizopropanol miesza sie w równoczasteczkowych ilosciach z kwasem p-acetamidobenzoesowym i pod¬ daje lekkiemu podgrzaniu. Wytworzona w ten spo¬ sób sól miesza sie z inozyna w stosunku molowym soli do inozyny, wynoszacym 1: 1—4:1 itd. i po¬ tem mieszanine te rozpuszcza sie w wodzie. Wodny roztwór mozna odparowac do suchej pozostalosci i uzyskac zwiazek kompleksowy w postaci stalej.Stwierdzono, ze zwiazek kompleksowy wytworzony z inozyny, dwumetyloaminoizopropanolu i p-aceta- midobenzoesanu ma zwiekszona rozpuszczalnosc przy wzroscie stosunku molowego od 1:1 do 1:4, lecz przy stosunku tym wynoszacym 1: 5 nie wy¬ stepuje juz dalsze zwiekszenie rozpuszczalnosci.Powyzszy zwiazek ma odczyn obojetny.Otrzymywanie dwumetyloamino-2-piropanolo-p- -a-ceftaimidobenzoesanu. W pokojowej temperaturze wytwarza sie zawiesine 44,75 g/0,25 M kwasu p-ace- tamidobenzoesowego w 125 ml bezwodnego meta¬ nolu i podczas mieszania dodaje sie 36 ml (0,29 M) dwumetyloaminoizopropanolu. Podczas reakcji wy¬ dziela sie cieplo. Po rozpuszczeniu kwasu i chlo¬ dzeniu roztwór saczy sie i wlewa do 400 ml bez¬ wodnego eteru. Natychmiast nastepuje krystalizacja.Bialy, krystaliczny produkt odsaczy sie i trzykrot¬ nie przemywa sie bezwodnym eterem, suszy w tem¬ peraturze pokojowej i przekrystalizowuje ze 100 ml absolutnego metanolu i octanu etylu (stosunek w czesciach molowych 25 i 75). Produkt suszy sie w temperaturze 5l0oC, pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc wynosi 56, 5 g co odpowiada 80% wy¬ dajnosci teoretycznej. Otrzymuje sie produkt o tem¬ peraturze topnienia 147—148°C.Analiza dla C14H2204N2i Obliczono: 59% C, 7,80% H, 9,92% N Znaleziono: 59,4% C, 7,83% H, 10,04% N Sól latwo rozpuszcza sie i jest trwala w szerokim zakresie warunków normalnych, natomiast w tem¬ peraturze okolo 25—30°C powyzej temperatury top¬ nienia ulega rozkladowi. Przy ogrzewaniu w tem¬ peraturze 50°C przy cisnieniu normalnym straty wagowe wynosza po 66 godzinach 0,22%, po 90 godzinach 0,28% i po 172 godzinach #44%.Wplyw dwumetyloaminy -2-propatiolu (DMAIP) i dwumetyloamino-2-propanolo-p-acetamidobenzoe-9 sanu (DMAIPA) na rozpuszczalnosc inozyny w wo¬ dzie jest podana w nizej podanych tablicach I i II.Zaznacza sie uwage, ze 268 mg inozyny rozpuszcza sie w 159 g DMAIP. 80960 10 Inozyna Mol mg 1 208 1 268 1 268 1 268 1 268 1 268 1 268 Tablica DMAIP (Mol mg 0 0 1 103 2 206 3 309 4 412 5 515 6 615 I Objetosc HjO do rozpusz¬ czenia, w ml 16,75 1,10 < 0,44 0,40 0,35 0,40 0,47 Inozyna ,Mol mg 1 0 1 268 1 268 1 268 1 268 1 268 1 268 Tablica II DMAIPA .Mol mg 1 282 1 282 2 564 3 846 4 1128 5 1410 6 1692 Objetosc HjO do rozpusz¬ czenia w ml | 0,14 6,8 3,5 2,8 2,2 2,2 2,2 Wszystkie roztwory podane w tablicy I i II przy¬ gotowano w temperaturze 23°C. Odnosnie do ta¬ beli II zwraca sie uwage, ze dodanie wody powo¬ duje wytracenie malej ilosci kwasu p-acetamido- benzoesowega Stwierdzono, niezwykle cenne i interesujace wlas¬ nosci N,N-dwualkiloakanoloaminowych pochodnych inozyny: pozwalaja one usunac oslabienie zdolnosci uczenia, opanowanie infekcji wirusowych, opano¬ wanie objawów sitarzenia, jak i chorób neuiroitiro- ficznych i innych stanów chorobowych, w których wystepuje w mózgu niedostateczna lub zmieniona synteza kwasu rybon/ukleinowego (RNS) o duzym ciezarze czasteczkowym A bialek.Przede wszystkim stwierdzono, ze zwiazek kom¬ pleksowy inozyny i aminoalkoholu umozliwia cof¬ niecie uposledzenia w zdolnosci uczenia i pamie¬ tania u starych szczurów podczas calego driia i no¬ cy, zarówno przy trudnych jak i latwych zadaniach, powodujac przywrócenie normalnego stanu mlodego zwierzecia. Poza tym zwiazki kompleksowe daja moznosc podwyzszenia zdolnosci mlodych szczurów do nauczenia bardzo trudnych zadan. Dzialanie to jest bardzo zaskakujace, gdyz na ogól ani sama inozyna, ani aminoalkohole nie umozliwiaja tak silnego dzialania jaik ich polaczenie i istotnie przy podawaniu mlodym zwierzetom w okreslonych po¬ rach dnia samej inozyny lub samych aminoalkoholi wystepuje oslabienie zdolnosci uczenia, podczas gdy zaaplikowanie powyzszego polaczenia wplywa na poprawe. Wyrazne róznice w moznosci uczenia sie mlodych i starych szczurów sprawdzono na podsta¬ wie zadan o róznym stopniu trudnosci, które opisal Poty w pismie „Journal of Gerontology, M, 287— —290 (1966). 10 25 30 40 46 50 66 60 Zebrane wyniki badan, podane w tablicy III uwypuklaja dzialanie zwiazków kompleksowych N,N-dwumetyloaminoetanolu i inozyny. Wyniki te uzyskano w godzinach 7—9, oznaczajacych dla szczurów „poczatek dnia", gdyz sa one zwierzetami nocnymi. Wartosci liczbowe podaja skuteczne unik¬ niecie bledów (lub rozwiazanie zadan), przy 90 próbach prowadzonych na szczurach o róznym wie¬ ku, które poddano programowi nauki o dwóch róznych stopniach trudnosci. W ciagu kazdego dnia przeprowadzono 30 prób i to zawsze 2 godziny po zaaplikowaniu albo iniekcji placebo dawki 100 mg/kg zwiazku kompleksowego dwumetyloamino- etanoli i inozyny. Dawke te stosowano przy wszyst¬ kich badaniach.Wyniki wykazuja, ze zarówno u mlodych jak i u starych zwierzat zwiazek kompleksowy zwieksza moznosc uczenia sie oraz, ze ograniczona zdolnosc uczenia sie starszych zwierzat, wyraznie uwydat¬ niajaca sie zwlaszcza przy zadaniach trudnych zostaje ponownie przywrócona do poziomu nor¬ malnych zwierzat mlodych. Przy ocenie tych wy¬ ników analiza wariacyjna za pomoca elektronowej maszyny cyfrowej otrzymano dla róznych trakto- wan zwiekszajacych zdolnosc uczenia sie nastepu¬ jaca kolejnoscia szeregu: zwiazek kompleksowy ino¬ zyny i aminoalkoholu inozyna placebo (p < < 0,001).W tablicy IV podano wyniki badania dzialania inozyny i zwiazku kompleksowego inozyny i N,N- dwumetyloaminoizopropanolu uzyskane odnosnie moznosci uczenia sie szczurów w srednim wieku (13 miesiecy) przy zadaniach trudnych, próby prze¬ prowadzono o godzinie 9 rano, po wyzej podanym programie badan. Zwiazek kompleksowy znacznie zwiekszal zdolnosc uczenia, w wiekszym stopniu niz sama inozyna a inozyna, w tej porze dnia doprowadzala do zmniejszenia zdolnosci uczenia.Wszystkie próby odniesiono do grupy porównawczej traktowanej za pomoca placebo. Odnosnie tych róznic o faktycznych oznakach dzialania inozyny wzgledem zwiazków kompleksowych, dla powyz¬ szych zwierzat przy badaniach o godzinie 9 rano ma znaczenie to, ze mózgi zwierzat traktowanych tymi srodkami prawdopodobnie wykazuja wazne, biochemiczne reakcje o przeciwnych oznakach, to znaczy w obecnosci polirybozomów i frakcji soków komórkowych w mózgach potraktowanych inozyna nastepuje szybszy rozpad kwasu rybonukleinowego (RNS) niz w ukladzie porównawczym, natomiast w obecnosci frakcji w mózgach potraktowamych zwiazkiem kompleksowymi RNS ulega wolniejszemu rozpadowi niz w ukladzie porównawczym.W innej próbie, zarówno o godzinie 9 rano jak i o 9 wieczorem badano dzialanie inozyny i zwiazku kompleksowego dwumetyloaminoizopropanolu i ino¬ zyny na zdolnosc przyswajania i pamietania bardzo latwego zadania. W tym przypadku kontrolowano pamietanie w 10 dni po nauczeni, bez dodatkowego traktowania substancja badana. Ocena badawcza polega na tym, ze przy 10 próbach uzysk sie 7 skutecznych unikniec bledów. Im mniejsza jest ilosc koniecznych prób do osiagniecia tej spraw¬ nosci, tym jest wyzsza inteligencja zwierzecia. Obok tej próby uczenia, badano równiez sponataniczna89960 11 aktywnosc motoryczna podobnych zwierzat przy stosowaniu tych samych traktowan. Uzyskane pray tym wyniki podano w tablicy V. Okazuje sie, ze rano w momencie wysokiej spontanicznej aktyw¬ nosci sennej, zwiazek kompleksowy faktycznie u- trudnia mlodym zwierzetom uczenie sie i zapa¬ mietywanie, natomiast spontaniczna aktywnosc ule¬ ga znacznemu zmniejszeniu. To utrudnienie mozna przypisac w tym przypadku sklonnosci srodka do zmniejszenia spontanicznej aktywnosci lub zwiek¬ szenia sklonnosci do spania, gdyz u gryzoni wyu¬ czenie latwych zadan jest latwo zaklócane wply¬ wami zmniejszajacymi czuwanie. Natomiast u bar¬ dzo starych zwierzat kontrolnych jak i badanych zarówno o 9 rano jak i o 9 wieczorem spontaniczna aktywnosc jest zmniejszona, lecz nie jest juz dalej utrudniana przy uzyciu srodka. W tej grupie wieku zwiazek kompleksowy inozyny i dwumetyloamino- izopropanolu daje znaczna poprawe zarówno zdol¬ nosci uczenia sie jak i pamietania.Ogólnie przyjmuje sie, ze optymalna praca mózgu i innych tkanek nerwowych, zwlaszcza przy pro¬ cesach uczenia sie oraz dostosowywania wymaga syntezy nowego kwasu rybonukleinowego i protein.Starczy mózg syntetyzuje mniejsza ilosc RNS i bia¬ lek o najwiekszym ciezarze czasteczkowym, z tego tez powodu pojawiaja sie stany niedociagniec w pracy ukladu nerwowego, w których byloby szcze¬ gólnie cenne uzycie srodka terapeutycznego aby przyspieszyc synteze RNS i protein o duzym cie¬ zarze czasteczkowym. Przy badaniach polirybozo- mów w gradiencie stezenia sacharozy, zwiazek kompleksowy wedlug wynalazku zwieksza szybkosc syntezy RNS w wiekszym stopniu niz sama ino¬ zyna. Zwiazek kompleksowy inozyny i aminoalko- holu stanowi inhibitor dla enzymu rybonukleazy powodujac rozklad RNS. Natomiast inozyna akty¬ wuje ten enzym i w odniesieniu do prób porów¬ nawczych zwieksza szybkosc powstawania RNS w znacznie mniejszym stopniu niz zwiazek komplek¬ sowy wedlug wynalazku. Ponadto zwiazek kom¬ pleksowy, lecz nie sama inozyna, oddzialuje na zwiekszenie wystepowania waznej substancji o bar¬ dzo malej czasteczce, które niedawno odkryto w mózgu i nazwano informozomem. Substancje te uzyskano metoda ultrawirowan ma wartosc 20— —60 S (jednostki Svedfberga), a wiec jest ona znacz¬ nie lzejsza od monomerów rybozomu. Przyjeto, ze substancja ta wspóldziala przy przesylaniu RNS bedacego nosnikiem informacji z jadra • do cyto- plazmy, gdzie nastepuje polaczenie tego RNS z ry- bozomami. Mechanizm ten ma znaczenie przy o- chronie RNS przenoszacego informacje przed przed¬ wczesnym zniszczeniem przez enzym rybonukleaze.Stwierdzono, ze zwiazek kompleksowy wedlug wy¬ nalazku znacznie zwieksza zawartosc informozomu, zwlaszcza w mózgu starszych zwierzat.W tablicy III uwidoczniono dzialanie inozyny i zwiazku kompleksowego inozyny z dwumetylo- aminoetanolem na zdolnosc nauczenia jednego za¬ dania. Podano srednia ilosc wyników uzyskanych u zwierzat poddanych 90 próbom, w okresie 7—9 godziny wieczorem, przy czym we wszystkich gru¬ pach badanych ilosc zwierzat wynosila po 8. Sto¬ sowano zwiazek kompleksowy 1:1 dwumetyloa- 12 minoetanolu i inozyny, w postaci roztworu wodnego zawierajacego 30 mg kompleksu w 1,0 ml wody. 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60 65 1 Ilosc dni 90 7KH) Tablica III Podawany zwiazek Inozyna Inozyna-dwume- tyloaminoetanol Roztwór soli Inozyna Inozyna-dwume- tyloaminoetanol Roztwór soli Zadanie Wyróznia¬ jace sie unikniecie bledów/ srednia trudnosc 72,8 72,8 68,2 72,1* 74,3* 61,6 Opóznione unikniecie bledów/bar¬ dzo duza trudnosc 34,2 40,6 31,6 32,9* 34,6* 18,9 1 Objasnienia: *) znacznie wieksze niz wartosc srednia dla szczu¬ rów o jednakowym wieku, niz u zwierzat kon¬ trolnych (p<0,01).W wyniku analizy wariacyjnej w celu unikniecia bledów ustalono w 90 próbach aktywnosc szeregu: zwiazek kompleksowy inozyny i dwumetyloamino- etanolu inozyna roztwór soli fizjologicznej p<0,01, gdzie „p" oznacza prawdopodobienstwo jednej mozliwosci.W tablicy IV uwidoczniono dzialanie inozyny i zwiazku kompleksowego inozyny z dwumetylo- aminoizopropanolem przy wyuczaniu zadania. Po¬ dano srednia ilosc wyników dla wszystkich zwie¬ rzat badanych w 9G próbach, prowadzonych o go¬ dzinie 9 rano, przy czym wszystkie grupy liczyly po 6 zwierzat. Inozyne podawano w zastrzykach w dawce 70 mg/Kg wagi ciala, stosujac roztwory zawierajace 20 mg inozyny w 1 ml wody, nato¬ miast zwiazek kompleksowy 1:1 inozyny z dwu¬ metyloaminoizopropanfclem podawano w zastrzy¬ kach w dawce 10Ó mg/Kg wagi ciala. Stosowano roztwór zawierajacy 30 mg inozyny w 1 ml wody.Tablica IV mosc dmd 38(0 Podawany zwiazek Roztwór soli Inozyna Zwiazek kom¬ pleksowy inozyny z dwumetyloa- minoizopropano- lem Zadanie: bardzo trudne (opóznio¬ ne unikanie ble¬ dów) 22 6 28* Objasnienia: *) wyraznie wieksze niz wartosc srednia uzyskana dla szczurów traktowanych inozyna (p < 0,01).W tablicy V uwidoczniono dzialanie zwiazku kompleksowego inozyny z dwumetyloamlnoizopro- panolem na wyuczenie zadania. Podano ilosc prób przeprowadzonych do osiagniecia ustalonej wiel-13 80960 14 kosci aktywnosci w otwartym polu, przy czym wszystkie grupy liczyly po 8 zwierzat. Roztwór w ilosci 8,7 mg/Kg wagi ciala podawano w zastrzy¬ kach o stezeniu 8,7 mg soli w 1 ml wody. Zwiazek kompleksowy 1:1 dwumetyloaminoizopropanolu z inozyna podawano w zastrzykach w ilosci 100 mg/Kg wagi ciala, stosowano roztwór zawierajacy 30 mg zwiazku kompleksowego w 1,0 ml wody. Zwiazki kompleksowe wedlug wynalazku moga byc poda¬ wane ssakom w ilosci 1—1000 mg/Kg wagi ciala.Ilosc dni 60 180 730 Ta Podawany zwiazek Roztwór soli Zwiazek kom¬ pleksowy ino- zyny z dwu- metyloamirao- izopropanolem Roztwór soli Zwiazek kom¬ pleksowy ino- zyny z dwu- metyloamino- iaopropanolam Roztwór soli Zwiazek kom¬ pleksowy ino- zyny z dwu- metyloaimiino- izopiropanolem bli g "ii i 9 21 9 21 9 21 9 21 9 21 9 21 ica V Zadanie Proste unik¬ niecie ble¬ dów wyu¬ czono 14 13 2la) 13 16 15 22a) 15 22b) 20 15*) 14a) zapa¬ mie¬ tano 9 6 14 8 11 8 11 15 17 13 10 7a) Otwarte pole kwa¬ draty prze¬ kroczone 7M 75,6 63,4a) 70,5 114,5 122,8 101,7*) 119,6 41,2 39,6 35,4c) 37,2 Objasnienia: a) oznacza wielkosc znacznie odbiegajaca od sred¬ niej wartosci uzyskanej w grupie zwierzat po¬ traktowanych roztworem soli (zwierzeta byly w tym samym wieku, przy czym badano o tej samej porze p < 0,01). b) oznacza wielkosc znacznie wieksza od sredniej wartosci uzyskanej w grupach zwierzat o innym wieku traktowanych roztworem soli, (p<0,05). c) oznacza wartosc znacznie odbiegajaca od sredniej wartosci uzyskanej w grupach zwierzat o tym samym wieku i traktowanych w tym samym czasie roztworem soli (p < 0,06).Zwiazki komdpeksowe wedlug wynalazku mozna podawac ssakom w dawce 1—1000 mg/Kg wagi io ciala. PL PL