PL80450B1 - Antibiotics from streptomyces mycarofac - iens[CH563454A5] - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania nowego antybiotyku SF-837 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku SF-837.Stwierdzono, ze nowy antybiotyk o dzialaniu sil¬ nie hamujacym rozwój chorobotwórczych bakterii Gram-dodatnich i ropotwórczych bakterii odpor¬ nych na dzialanie znanych antybiotyków powstaje w hodowli nowego drobnoustroju z rodzaju Strep- tomyces i moze byc wyosobniony z brzeczki po- hodowlanej znanymi sposobami. Szczep wytwarza¬ jacy ten antybiotyk wyosobniono z gleby, nazwa¬ no go szczepem Streptomyces mycarofaciens nov. sp. lub szczepem SF-837 i zdeponowano w Ame- 10 rican Type Culture Collection jako ATCC 21454.Szczep ten wykazuje nastepujace cechy mikrobio¬ logiczne: 1) obfita grzybnie powietrzna w postaci otwar¬ tych spirali na glicerynowym agarze Czapka, na agarze skrobiowym; 2) zarodniki o ksztalcie kulistym, owalnym lub eliptycznym, o powierzchni kolczastej (kolce sto¬ sunkowo cienkie i dlugie) i wielkosci 0,5—0,7 na 0,8—1,0 mikronów.W tablicy 1 podano charakterystke drobnoustro¬ ju w róznych pozywkach.Tablica 1 Pozywka 1 Sacharozowy agar Czapka Glicerynowy agar Glukozowo-aisparagi- mowy agar Krain- sky'ego Glukozowo-asparagi- nowy agar Uszin- sky'ego Rozrosty 2 Slabe, bezbarwne lub kremowe Ciemnobrunatne Jasnobrunatne do czer¬ wonawo brunatnych Brunatne z odcieniem czerwonym Grzybnia powietrzna 3 Rzadka, bawelnista, bialawo-szara Biala do kremowej, czesciowo bawelnista o zabarwieniu szarawym Biala z odcieniem rózu Rózowa do lawendowej Rozpuszczalny pigment 4 Brak Brak lub bladorózowy Brak lub slaby brunatno- zólty Jasny brunatny 80 45080 450 cd. tablicy 1 1 1 Jablczan wapniowy Gliceryna-jablczan Syntetyczny agar skrobiowy Agar bulionowy Agar glukozowo- bulionowy Agar glukozowo- peptonowy Agar tyrozynowy Masa ziemniaczana Masa marchwiana Mleko zbierane Jaja Skoagulowana surowica Lóefflera Glukozowy roztwór Czapka Zelatyna (20°C) Pozywka Benneta Pozywka celulozowa 2 Slabe, kremowe Jasnobrunatne Ciemnobrunatne z odcie¬ niem purpurowym Zóltawo-brunatne Geste, brunatne do ciem¬ nobrunatnych Brunatne Czerwonawo-brunatne Geste, brunatne do czar- nawo-brunatnych Brunatne Pierscieniowe rozrosty powierzchniowe, jasno¬ brunatne Bladobrunatne Bladobrunatne Bladobrunatne rozrosty powierzchniowe i denne Kremowe do bladobru- natnych Brunatne do czarnawo- brunatnych Brak 1 3 Brak Rózowa, przechodzaca stopniowo w szarawa (bawelnista) Rózowa o czerwonawym odcieniu, przechodzaca stopniowo w szarawa (bawelnista) Bardzo rzadka, biala Biala do zóltawo-kremo- wej Rzadka, biala Biala Obfita, szarawo-brunatna Biala do kremowej Rzadka, biala Brak Brak Rzadka, biala Brak Rózowa z odcieniem czerwonawym — 4 1 Brak Brak Brak Brak Brak Brak Brak Czarnawy brunatny Brunatny na krancach rozrostów Brak Brak Brak Brak Brak Jasny brunatny — Uwaga: O ile nie zaznaczono inaczej, temperatura inkubacji wyaosila 28°C.Wlasciwosci fizjologiczne drobnoustroju Wytwarzanie siarkowodoru — Wytwarzanie tyrozynazy — Wytwarzanie azotynu + Koagulacja zbieranego mleka + Peptonizacja zbieranego mleka — Hydrolizaskrobi + Skraplanie zelatyny + (slabe) Rozpuszczanie skoagulowanej surowicy Lóefflera — Dzialanie chromogeniczne — Wykorzystanie zródel wegla dodatnie — glukoza, galaktoza, fruktoza, maltoza, laktoza, dekstryna, skrobia, gliceryna, inozyt, mannoza, salicyna, octan so¬ dowy, cytrynian sodowy, bursztynian sodowy; watpliwe — arabinoza i rannoza; ujemne — ksyloza, sacharoza, rafinoza, dulcyt, sorbit, mannit i celuloza.Rozwija sie w temperaturze 15—38°C.Powyzsze charakterystyczne cechy mikrobiolo¬ giczne szczepu, z którego otrzymuje sie antybiotyk SF-837 i nsizywamego w (óMszyim cliagu sizoziepem 15 20 SF-837, mozna podsumowac, jak nastepuje. Koni- dium ma ksztalt spiralny, zarodnik ma powierzch¬ nie kolczasta. Na pozywkach syntetycznych wy¬ stepuja rozrosty o barwie kremowej do czerwo- nawobrunatnej oraz bawelnista grzybnia po¬ wietrzna o barwie szarej. Zasadniczo nie wyste- V puja rozpuszczalne pigmenty, z wyjatkiem ogra¬ niczonej liczby pozywek, w których obserwuje sie pigment jasnobrunatny. Natomiast na pozywkach organicznych obserwuje sie brunatne rozrosty two¬ rzace grzybnie powietrzna o barwie bialej do kre-~ mowej, lecz nie dajace rozpuszczalnego pigmentu.Na pozywce ziemniaczanej wytwarza sie obfita grzybnia powietrzna o barwie szarawo-brunatnej i czarnawy rozpuszczalny pigment.Zgodnie z opisem Waksmana w The Actinomy- cetes tom 2, 1961, powyzsze cechy szczepu SF-837 sa zblizone do cech szeregów fradiae, ruber i fla- vus rodzaju Streptomyces. Ze wzgledu na to, ze szczep SF-837 nie wytwarza melaminy i wytwa¬ rza grzybnie powietrzna o barwie lub odcieniu rózowym, mozna go porównac do szczepów sze¬ regu fradiae, a mianowicie Streptomyces fradiae, Streptomyces luridus, Streptomyces roseus i Strep-80 450 6 tomyces fuscus. Rózni sie on jednak od szeregu fradiae tym, ze wytwarza grzybnie powietrzna o barwie lub odcieniu rózowym, która pojawia sie okresowo w poczatkowym stadium inkubacji i czesto w stadium srodkowym i koncowym prze¬ chodzi w grzybnie bawelnista o barwie szarej, podczas gdy rózowe zabarwienie obserwowane w przypadku fradiae jest bardzo trwale. Ponadto, grzybnia powietrzna Streptomyces fradiae jest pro¬ sta, a wiec rózni sie od spiralnej grzybni szczepu SF-837. Na sacharozowym agarze Czapka Strep¬ tomyces fradiae daja obfita grzybnie powietrzna, a na agarze skrobiowym tworza bezbarwne roz¬ rosty, a wiec wykazuja inne cechy niz szczep SF-837.Szczep SF-837 rózni sie od Streptomyces fuscus i Streptomyces luridus tym, ze Streptomyces fus¬ cus nie tworzy spirali, a Streptomyces luridus tworzy je tylko na pewnej grupie pozywek, pod¬ czas gdy szczep SF-837 wytwarza obfite spirale na wielu pozywkach. Ta ostatnia cecha upodab¬ nia szczep SF-837 do Streptomyces roseus, który jednak wytwarza bezbarwne rozrosty na synte¬ tycznym agarze skrobiowym, natomiast nie wy¬ twarza grzybni powietrznej na pozywce ziemnia¬ czanej.Ze wzgledu na ujemny charakter wobec mela- miny oraz na rozrosty o zabarwieniu lub odcie¬ niu czerwonym, szczep SF-837 jest porównywalny ze Streptomyces albosporeus, Streptomyces ery- thraeus, Streptomyces niveoruber i Streptomyces purpurascens z szeregu ruber.Streptomyces niveoruber rózni sie jednak wy¬ raznie od szczepu SF-837 tym, ze powierzchnia zarodników tego pierwszego jest gladka, podczas gdy powierzchnia zarodników SF-837 jest kolcza¬ sta. Streptomyces albosporeus rózni sie od szcze¬ pu SF-837 tym, ze tworzy zasadniczo proste grzyb¬ nie powietrzne, wytwarza wyraznie czerwone roz¬ rosty na sacharozowym agarze Czapka i na aga¬ rze z gliceryna i jablczanem wapniowym, lecz nie wytwarza grzybni na agarze skrobiowym. Strep¬ tomyces erythraeus rózni sie od SF-837 tym, ze wytwarza czerwone rozrosty na sacharozowym aga¬ rze Czapka i na agarze ziemniaczanym oraz kre¬ mowe rozrosty na agarze glukozowo-asparagino- 15 20 35 40 wym i syntetycznym agarze skrobiowym, na któ¬ rych szczep SF-837 wytwarza rozrosty raczej o od¬ cieniu czerwonym. Streptomyces purpurascens ma kolczasta powierzchnie zarodników jak SF-837, lecz rózni sie od tego ostatniego tym, ze w prze¬ ciwienstwie do niego wytwarza na pozywkach syn¬ tetycznych wyraznie rozpuszczalny pigment o za¬ barwieniu lub odcieniu czerwonym.Dalsze porównanie szczepu SF-837 mozna prze¬ prowadzic ze Streptomyces microflavus i Strepto¬ myces roseoflavus z szeregu flavus. Szczepy te sa zblizone pod pewnymi wzgledami; szczepy z sze¬ regu flavus wytwarzaja jednak zarodniki o glad¬ kiej powierzchni (H. D. Tresner i inni w „Jour¬ nal of Bacteriology" tom 91, str. 1998—2005, rok 1966), podczas gdy powierzchnia ^zarodników SF-837 jest kolczasta.W sumie, wsród znanych gatunków rodzaju Actinomycetes nie ma szczepu o cechach szcze¬ pu SF-837.Antybiotyk SF-837, wytwarzany przez szczep SF-837, jest typowym antybiotykiem makrolido- wym. Wykazuje on szczyt absorpcyjny w nadfio¬ lecie przy dlugosci fali 232 milimikrony, totez mozna go uwazac za zwiazek z tego samego sze¬ regu co leukomycyna, jozamycyna. W zwiazku z tym ponizej porównuje sie mikrobiologiczne wlasciwosci szczepu SF-837 z odpowiednimi wlas¬ ciwosciami drobnoustrojów, z których wytwarza sie powyzsze znane antybiotyki.Z przedstawionego w tablicy 2 porównania mor¬ fologicznych cech szczepu SF-837 i innych szcze¬ pów wynika wyraznie, ze szczep SF-837 rózni sie od leukomycynotwórczego drobnoustroju Strepto¬ myces kitasatoensis, jozamycynotwórczego drobno¬ ustroju Streptomyces narbonensis var. josamyceti¬ cus, spiramycynotwórczego drobnoustroju Strepto¬ myces ambofaciens, miamycynotwórczego drobno¬ ustroju Streptomyces ambofaciens, tercjomycyno- twórczych drobnoustrojów Streptomyces eurocidi- ! cus i Streptomyces albireticuli, karbomycyno — B-twórczego drobnoustroju Streptomyces halstedii, tylozyno- i makrocynotwórczego drobnoustroju Streptomyces fradiae oraz relomycynotwórczego drobnoustroju Streptomyces hygroscopicus.Wytwarzany antybiotyk ' SF-837 Leukomycyna Jozamycyna ' Spiramycyna Miamycyna Tercjomycyna Tercjomycyna Tablica 2 Drobnoustrój Szczep SF-837 Streptomyces kitasatoensis Streptomyces narboensis var. josamyceticus Streptomyces ambofaciens Streptomyces ambofaciens Streptomyces eurocidieus Streptomyces albiretiouli Grzybnia powietrzna spiralna skretna prosta spiralna spiralna skretna skretna Powierzchnia zarodnika kolczasta gladka gladka gladka gladka gladka gladka80 450 8 Szczep SF-837 rózni sie równiez wyraznie od nidamycynotwórczego drobnoustroju Streptorhyces djakartensis (opis patentowy Niemieckiej Repu¬ bliki Federalnej nr 1077 381), tym, ze Streptomy¬ ces djakartensis wytwarza melamine, lecz nie peptonizuje ani nie koaguluje zbieranego mleka.Na podstawie powyzszych porównan i rozwazan stwierdzono nie tylko, ze szczep SF-837 jest no¬ wym drobnoustrojem, z którego otrzymuje sie niku wlewa sie do zakwaszonej wody, zobojetnia lub alkalizuje wodorotlenkiem sodowym, wodoro¬ tlenkiem potasowym itp., przy czym produkt po¬ nownie przechodzi z roztworu wodnego do roz¬ tworu w rozpuszczalniku organicznym. Powtarza¬ jac ten zabieg kilkakrotnie, oczyszcza sie antybio¬ tyk. Roztwór w organicznym rozpuszczalniku od¬ parowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac surowy produkt w postaci prosz- antybiotyki makrolidowe, lecz równiez, ze szczep io ku. Mozna tez wyosabniac antybiotyk z roztworu ten rózni sie od wszystkich znanych szczepów w zakwaszonej wodzie przez odparowywanie ze nawet z punktu widzenia taksonomicznych cech stanu zamrozenia, otrzymujac sól addycyjna anty- wszystkichactinomyces. biotyjcu z kwasem. Jezeli zas roztwór ten zobo- Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze jetn!#:sie lub slabo alkalizuje, wówczas produkt szczep SF-837, to jest szczep Streptomyces my- 15 wyti^a sie w postaci wolnej zasady, carofaciens ATCC 21454 hoduje sie na pozywce Antybiotyk SF-837 ma charakter zasadowy, to- w sposób analogiczny do sposobów znanych. Ja- tez moze byc adsorbowany za pomoca zywicznych ko zródla odzywcze stosuje sie pozywki stosowa- wymieniaczy jonowych takich, jak Amberlite ne zwykle do hodowli Streptomyces. Na przyklad, IRC-50 itp., lub celulozowych wymieniaczy jono- jako zródlo wegla stosuje sie glikoze, skrobie, gli- 2o wych. Otrzymany surowy produkt w postaci prosz- ceryne, dekstryne, sacharoze, melaze itp., a jako ku mozna dalej oczyszczac przez ekstrakcje roz- zródlo azotu — maczke sojowa, kielki pszenicy, puszczalnikami organicznymi takimi, jak benzen, ekstrakt miesny, pepton, wyciag namokowy ku- które rozpuszczaja antybiotyk, umozliwiajac od- kurydzy, rozpuszczalne bialko roslinne, suszone dzielenie zanieczyszczen. Surowy produkt mozna drozdze, siarczan amonowy, azotan sodowy itp. Do 25 tez przemywac takimi rozpuszczalnikami, które pozywki dodaje sie ewentualnie sole nieorganicz- nie rozpuszczaja antybiotyku SF-837, np. eterem ne, takie jak weglan wapniowy, chlorek sodowy, naftowym, ligroina lub n-heksanem, albo dodajac chlorek potasowy, fosforany itp., oraz substancje takie rozpuszczalniki do roztworu antybiotyku organiczne i nieorganiczne, które sprzyjaja wzro- w innym rozpuszczalniku. Mozna równiez rozpusz- stowi szczepu SF-837 i wytwarzaniu antybiotyku 30 czac antybiotyk w organicznym rozpuszczalniku SF-837. ~ takim, jak eter, i roztwór nasycac kwasem orga- Najkorzystniejsza metoda hodowania szczepu nicznym, np. kwasem winowym lub cytrynowym SF-837 podobnie^ jak w przypadku innych pro- rozpuszczonym w eterze, wytracajac sól addycyjna cesów antybiotykotwórczyeh, jest hodowla w sro¬ dowisku cieklym, zwlaszcza hodowla wglebna 35 w warunkach aerobowych. Odpowiednia tempera¬ tura fermentacji wynosi 20—30°C, a zwlaszcza okolo 28°C. W tych warunkach, zarówno w przy¬ padku hodowli wstrzasanej jak i zbiornikowej, zawartosc antybiotyku SF-837 w pozywce osiaga 40 wartosc maksymalna przy koncu okresu 2—5-dnio- wej fermentacji.Wlasciwosci antybiotyku SF-837 mozna badac metoda krazka bibulowego, stosujac pozywke aga¬ rowa, a jako mikroorganizm kontrolny Sarcina 45 lutea. Próba polega na, tym, ze ustala sie zalez¬ nosc pomiedzy logarytmem stezenia w granicach 1—50 mikrogramów/rrtl i srednica kolowego obsza¬ ru, na którym antybiotyk hamuje rozwój mikro¬ organizmu. Zaleznosc ta jest liniowa, a strefa ha- 50 mowania tego rozwoju ma srednice 12—25 mm.Z brzeczki pohodowlanej antybiotyk SF-837 wyo- sabnia sie w ten sposób, ze brzeczke, po odsa¬ czeniu grzybni, ekstrahuje sie niemieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem organicznym takim, jak 55 octan etylu, octan butylu, chloroform, benzen, eter, keton metyloizobutylowy, butanol itp., w srodo¬ wisku obojetnym lub slabo zasadowym. Antybio¬ tyk zawarty w fazie stalej mozna tez ekstrahowac antybiotyku z kwasem.Antybiotyk SF-837 mozna tez oczyszczac metoda chromatografii, stosujac slabokwasowe zywiczne wymieniacze jonowe, wegiel aktywowany, tlenek glinu, zel krzemionkowy itp. Na przyklad, sub¬ stancje czynna adsorbuje sie na zelu krzemion¬ kowym, rozwija mieszanina benzenu z acetonem (4:1) i aktywne frakcje odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac wolny, czysty anty¬ biotyk SF-837 w postaci krystalicznego proszku.Poza tym, antybiotyk SF-837 mozna oczyszczac innymi znanymi sposobami, stosowanymi do oczy¬ szczania antybiotyków makrolidowych.Czysty antybiotyk otrzymany sposobem wedlug wynalazku ma postac krystalicznego proszku o barwie bialej, topniejacego w temperaturze 122—124°C. Jest on dobrze rozpuszczalny w meta¬ nolu, etanolu, acetonie, chloroformie, octanie ety¬ lu, octanie butylu, benzenie, czterochlorku wegla, eterze dwuetylowym i zakwaszonej wodzie, a sla¬ bo rozpuszczalny w eterze naftowym, n-heksanie i w obojetnej wodzie. Jest to substancja zasado¬ wa, której wartosc pKa w 50% etanolu wynosi 6,9.Na rysunku fig. 1 przedstawia wykres widma absorpcyjnego antybiotyku SF-837 w nadfiolecie. ¦ i% _ « zakwaszona woda lub rozpuszczalnikiem miesza- 60 Maksimum absorpcji El'«m =325 wystepuje przy jacym sie z woda, np. metanolem, etanolem, ace- dlugosci fali 232 milimik™nów, a niewielka absor- tonem itp., przy czym proces ekstrakcji mozna prowadzic równiez przed odsaczeniem grzybni, sto¬ sujac rozpuszczalnik niemieszajacy sie z woda.Roztwór antybiotyku w organicznym rozpuszczal- es nego w podczerwieni dla antybiotyku SF-837 pcja E[0/°m =10 wystepuje przy dlugosci fali 280 miliinikronów.Na fig. 2 uwidoczniono krzywa widma absorpcyj- zsX80 450 9 10 w bromku potasowym. Pasma absorpcyjne wyste¬ puja przy nastepujacych dlugosciach fal w cm-1: 3500, 2970, 2930, 1735, 1460, 1408, 1376, 1360, 1330, 1295, 1275, 1190, 1165, 1120, 1082, 1050, 1015, 910, 860, 840, 805, 780, 735 i 680.Fig. 3 przedstawia wykres widma magnetycz¬ nego rezonansu jadrowego " (100 Mc) antybiotyku SF-837 w postaci wolnej zasady w 10% roztworze w chloroformie, zas fig, 4 przedstawia chromato- gramy cienkowarstwowe antybiotyku SF-837 i an¬ tybiotyków pokrewnych na tlenku glinowym.W próbie erytromycynowej z zastosowaniem 50% kwasu siarkowego antybiotyk SF-837 daje zabar¬ wienie brazowe z odcieniem czerwonopurpurowym, a w próbie karbomycynowej z 6n kwasem wolnym, przy ogrzewaniu w temperaturze 80°C w ciagu 3 minut daje zabarwienie czerwonopurpoirowe, a wiec obie te proste daja wyniki dodatnie. Na¬ tomiast próba z ninhydryna i próba z chlorkiem zelazowym daja wyniki ujemne. Skrecalnosc optyczna antybiotyku SF-837 w 1% roztworze w etanolu [a]™ =—67°.Elementarna analiza antybiotyku otrzymanego sposobem wedlug wynalazku wykazuje zawartosc: 60,38%C, 8,35%H, 1,65%N i 29,62%0, natomiast obecnosc siarki, fosforu ani chlorowców nie stwierdzono. Metoda zobojetniania przez miarecz¬ kowanie ciezar czasteczkowy produktu okreslono jako 830. Wartosc Rf metoda chromatografii cien¬ kowarstwowej na zelu krzemionkowym okreslono nastepujaco: 0,67 dla mieszaniny n-butanolu z kwa¬ sem octowym i woda (3:1:1), 0,92 dla acetonu z woda (98 :2), 0,82 dla metanolu, 0,45 dla ben¬ zenu z acetonem (2 :1); zas odpowiednie wartosci przy uzyciu tlenku glinowego wynosza: 0,78 dla octanu etylu, 0,34 dla octanu etylu z benzenem (2 :1), 0,22 dla chloroformu i 0,16 dla octanu bu¬ tylu, przy czym w kazdym przypadku otrzymuje sie pojedyncza plame, co swiadczy o czystosci pro¬ duktu.Podane wyzej wyniki badan swiadcza o tym, ze antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalaz¬ ku nalezy do grupy antybiotyków makrolidowych.W swietle ultrafioletowym wykazuje on absorpcje przy dlugosci fali 232 milimikrony, a wiec moze byc porównywany z antybiotykami z grupy spira- mycyny (I, II, III), z grupy leukomycyny (At do A9 i Bj do B4), z grupy jozamycyny, tercjomycyny (A i B) i miamycyny. Porównania te podano ponizej.Przede wszystkim spiramycyna rózni sie od an¬ tybiotyku SF-837 wartosciami Rf w chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym, jak to uwidoczniono w tablicy 3, a takze wartosciami skrecalnosci optycznej i wartosciamii pKa', które to wartosci dla spiramycyny podano na str. 304— 317 Helvetica Chimica Acta tom 39. Mianowicie spiramycyna I wykazuje [a]D = —96° i pKa' 7,7, spiramycyna II wykazuje [a]D = —80° i pKa' 7,6 zas spiramycyna III [a]D=—79° i pKa' 7,6.Miamycyna, grupa leukomycyny B (Bi—B4) i leu- komycyna A2 róznia sie od antybiotyku SF-837 wytworzonego sposobem wedlug wynalazku tym, ze miamycyna wykazuje zerowa skrecalnosc optyczna [Antibiotios and Chemotherapy, str. 37— 15 20 30 45 50 39 (1957)], leukomycyny Bi, B2, B8 i B4 wykazuja temperatury topnienia odpowiednio 214^215°C, 214r-216°C, 216—217°C i 221—223°C (Japanese Pa¬ tent Publication nr Sho 35 — 18750), zas leuko- mycyna A2 ma wartosc E l0/o = 158 dla szczytu 1 cm absorpcyjnego w nadfiolecie oraz ciezar czastecz¬ kowy 1220—1250 (Japanese Patent Publikation nr Sho 35 — 18750).Tablica 3 Antybiotyk SF-837 spira¬ mycyna Wartosc Rf 1 n-butanol, kwas octowy i woda (3 :1 : 1) 0,67 0,11 aceton i woda- (98 :2) 0,97 0,26 metanol 0,82 0,37 W tablicy 4 podano wartosci Rf dla antybioty¬ ku SF-837, leukomycyn grupy A, jozamycyny i ter- cjomycyn okreslone metoda chromatografii cienko¬ warstwowej na tlenku glinowym, przy rozwijaniu octanem etylu. Wartosc Rf antybiotyku SF-837 wynosi 0,78, podczas gdy odpowiednie wartosci dla leukomycyny Ax (Japanese Patent Publication nr Sho 36—98), leukomycyn A5, A7 i A9 (Journal of Antibiotics, str. 272—278, 1968) sa wyraznie inne.Jozamycyna ma temperature topnienia 130—133°C i [a]D = —70°, leukomycyna A3 topnieje w tempe¬ raturze 120—121°C i ma [a]D = —55,4°, leukomy¬ cyny A4, A6 i A8, tercjomycyna A (temperatura topnienia 202—204°C, [a]D=—44°) i tercjomycyna B (temperatura topnienia 97—99°C, [a]D = —56°) maja wartosc Rf nizsza od odpowiednich wartosci antybiotyku SF-837.Tablica 4 Antybiotyk SF-837 Jozamycyna Leukomycyna Ai Leukomycyna A5 Leukomycyna A7 Leukomycyna A9 Leukomycyna A8 Leukomycyna A4 Leukomycyna A6 Leukomycyna A8 Tercjomycyna A Tercjomycyna B Wartosc Rf 0,78 0,65 0,08 0,05 0,01 0,02 0,65 0,60 0,57 0,53 0,61 0,64 Róznice pomiedzy antybiotykiem SF-837 i wy¬ mienionymi wyzej znanymi antybiotykami wyste- 65 puja wyraznie w chromatogramach cienkowar-80 11 stwowych na tlenku glinu. Chromatogramy te, uwi¬ docznione na fig. 4, przygotowano przez zaplamie- nie roztworów antybiotyków wzdluz poziomu cien¬ kiej plytki tlenku glinowego i nastepnie prowa¬ dzenie chromatografii wstepujacej z zastosowaniem mieszaniny octanu etylu z benzenem (2 :1) jako rozpuszczalnika i wreszcie zabarwienie wytworzo¬ nych plam przez ogrzewanie z 10% kwasem siar¬ kowym w temperaturze 80°C w ciagu 5 minut.Ponadto, leukomycyny A8, A4, A6 i A8 wyka¬ zuja wyraznie pasma absorpcyjne, przy stezeniu 2,22 czesci na milion (100 Mc) na krzywej widma magnetycznego rezonansu jadrowego [Journal of Antibiotics str. 272—278 (1968)], a jozamycyna równiez wykazuje wyrazne pasma absorpcyjne, wlasciwe grupie 0-acetylowej, przy stezeniu 2,17 czesci na milion [Journal of Antibiotics, str. 174— 180 (1957)]. Zjawiska tego nie obserwuje sie w widmie magnetycznego rezonansu jadrowego antybiotyku SF-837, uwidocznionym na fig. 3.Poza tym, acetylowa pochodna antybiotyku SF-837 otrzymuje sie w postaci iglastych kryszta¬ lów o barwie bialej, które po przekrystalizowa- niu z czterochlorkiem wegla topnieja w tempera¬ turze 122—125°C. .Pochodna ta, wysuszona w tem¬ peraturze 100°C w ciagu 5 godzin, stapia sie w temperaturze w poblizu 125°C, nastepnie zestala sie ponownie i ponownie topnieje w temperatu¬ rze 200—206°C z objawami rozkladu.Widmo absorpcyjne tej pochodnej acetylowej wykazuje szczyt absorpcji El0/o =295 przy dlu¬ gosci fali 232 milimikronów, a krzywa widma absorpcyjnego tego zwiazku w tabletce bromku potasu w podczerwieni wykazuje pasma przy na¬ stepujacych dlugosciach fali w cni"1: 3450, 2970, 2930, 1728, 1454, 1368, 1232, 1167, 1122, 1082, 1054, 1024, 1002, 957, 907, 863, 783 i 762. Wartosc Rf po¬ chodnej acetylowej oznaczona metoda chromato¬ grafii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym wynosi 0,8 w przypadku mieszaniny benzenu z acetonem (2 :1) i 0,9 w przypadku octanu etylu.W tablicy 5 podano minimalne stezenie anty-, biotyku SF-837 powodujace zahamowanie rozwo¬ ju róznych mikroorganizmów. Stezenia te ustalo¬ no metoda rozcienczania, stosujac pozywki hodow¬ lane podane w tablicy za pomoca numerów, któ¬ rych znaczenie jest nastepujace: 1 — wyciag ser¬ cowy, 2 — bulion glicerynowy, 3 — pozywka Sabouraud.Tablica 5 Badany mikroorganizm 1 Staphylococcus aureus 209p Staphylococcus aureus 209p resistant to peni- cillin Minimalne stezenia hamujace mikro- gramy/ml 2 0,39 0,78 Pozyw¬ ka 3 1 1 450 12 ad. /tablicy 5 Staphylococcus aureus 209p resistant to strep- tomycin and A-249 sub- stance Staphylococcus aureus 209p resistant to novo- biocin Staphylococcus aureus 209p resistant to actino- mycin Staphylococcus aureus 209p resistant to kana- mycin Staphylococcus aureus Terajima Staphylococcus aureus 193 Staphylococcus aureus 52—54 resistant to tetra- cycline, erythromycin and carbomycin Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus aureus resistant to streptomycin, penicillin and tetracycline Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea Mycobacterium smeg- matis 607 Mycobacterium phlei Escherichia coli Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Shigella dysenteriae Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger Penicillium chrysogenum 2 0,39 3,125 0,39 3,125 0,78 1,56 25 0,39 1,56 0,39 0,05 25 12,5 25 25 25 25 25 25 25 25 25 3 | 3 3 3 3 Z tablicy 5 wynika, ze antybiotyk SF-837 wy¬ kazuje dzialanie antybakteryjne wobec bakterii 50 Gram-dodatnich i bardzo silnie hamuje rozwój ropotwórczych bakterii odpornych na dzialanie zna¬ nych antybiotyków. Stwierdzono równiez, ze dzia¬ lanie to nie ulega zahamowaniu przez surowice.W celu oznaczenia toksycznosci antybiotyku wy- 65 twarzanego sposobem wedlug wynalazku wstrzy¬ kiwano ten antybiotyk myszom w dawkach po 600 mg/kg. Wszystkie zwierzeta poddane próbom przezyly i rozwijaly sie nastepnie normalnie.Wynalazek jest wyjasniony dokladnie w nizej 60 podanych przykladach. Procenty podane w przy¬ kladach, o ile nie zaznaczono inaczej, oznaczaja procenty wagowe.Przyklad I. Szczepem SF-837, to jest szcze¬ pem Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454, za- 65 szczepia sie 60 litrów cieklej pozywki, zawieraja-13 cej 2,5% cukrzonej skrobi, 4% rozpuszczalnego bialka roslinnego, 0,3% chlorku potasowego i 0,3% weglanu wapniowego i majacej wartosc pH=7,0 po czym mieszajac prowadzi sie hodowle w ciagu 35 godzin w kadzi fermentacyjnej w temperatu¬ rze 28°C, z napowietrzeniem. Po odsaczeniu faze pozostala na filtrze, a zawierajaca grzybnie, plu¬ cze sie rozcienczonym kwasem solnym. Przesacz i popluczyny stanowia lacznie 50 litrów cieklej substancji o mocy 150 meg/ml. Przesacz o war¬ tosci pH = 8 ekstrahuje sie 25 litrami octanu ety¬ lu i 22 litry fazy octanowej steza sie pod cisnie¬ niem nizszym od atmosferycznego do objetosci okolo 3 litrów. Otrzymany koncentrat rozciencza sie 1,5 litra wody i po doprowadzeniu wartosci pH do 2,0 przez dodanie 5n kwasu solnego, wy¬ trzasa dokladnie. Faze wodna oddziela sie od fa¬ zy organicznej i ustala wartosc pH wodnego roz¬ tworu na 8 przez dodanie 3n wodorotlenku sodo¬ wego, po czym ekstrahuje 800 ml octanu etylu.Otrzymany ekstrakt wytrzasa sie z 500 ml wod¬ nego roztworu kwasu solnego, w celu przeprowa¬ dzenia substancji aktywnych do tego roztworu, który nastepnie ekstrahuje sie 400 ml eteru ety¬ lowego przy wartosci pH = 8. Po wysuszeniu eks¬ traktu nad bezwodnym siarczanem sodowym i od¬ parowaniu pod cisnieniem nizszym od atmosfe¬ rycznego, otrzymuje sie 16,5 g proszku o barwie jasnozóltej. 12 g tego proszku rozpuszcza sie w 200 ml octa¬ nu etylu, po czym przepuszcza sie roztwór przez kolumne 600 ml sproszkowanego wegla, impreg¬ nowanego uprzednio octanem etylu. Do rozwija¬ nia stosuje sie octan etylu jako rozpuszczalnik.Po zebraniu lacznie 2500 ml aktywnych frakcji eluatu, odparowuje sie calosc do sucha pod cis¬ nieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymujac 5 g bialego proszku. Proszek ten rozpuszcza sie w 10 ml benzenu, po czym odsacza sie substancje nierozpuszczalne, a przesaczony roztwór poddaje sie chromatografii przepuszczajac go przez kolum¬ ne 700 ml zelu krzemionkowego, uprzednio nasy¬ conego benzenem. Do rozwijania adsorbowanych na zelu krzemionkowym substancji aktywnych sto¬ suje sie mieszanine benzenu z acetonem w sto¬ sunku 4 :1 jako rozpuszczalnik. Nastepnie zbiera sie eluat we frakcjach po 20 ml, po czym frakcje 90—380, które daja pojedyncza plame podczas chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glino¬ wym i które tylko na podstawie wartosci Rf moz¬ na uznac za frakcje zawierajace antybiotyk SF-837, laczy sie, otrzymujac lacznie 4000 ml eluatu, któ¬ ry odparowuje sie pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymujac 1,5 g antybiotyku SF-837 w postaci proszku o barwie bialej i o tem¬ peraturze topnienia 122—124°C.Przyklad II. 20 litrów pozywki zawierajacej 3% glukozy, 1% peptonu, 0,5% ekstraktu miesne¬ go, 0,2% chlorku sodowego, 0,3% weglanu wapnio¬ wego i 0,3% oleju sojowego (pH = 7) umieszcza sie w kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 30 litrów i sterylizuje sie przez 20-minutowe ogrzewanie w temperaturze 120°C. Nastepnie na pozywce tej posiewa sie Streptomyces mycarociens ATCC 21454 i hoduje, mieszajac, w ciagu 48 godzin ) 450 14 w temperaturze 28°C z napowietrzeniem. Po od¬ saczeniu sfermentowanego roztworu przy wartosci pH = 6 otrzymuje sie 18 litrów przesaczu o mocy 200 meg/ml. Wartosc pH tego przesaczu dopro- 5 wadza sie do 7 przez wprowadzenie 3n wodoro¬ tlenku sodowego, po czym ekstrahuje sie przesacz 8 litrami octanu butylu. Otrzymany ekstrakt pod¬ daje sie operacjom opisanym w przykladzie I i po chromatografii na kolumnie zelu krzemionkowego, 10 otrzymuje 800 mg czystej substancji SF-837 w po¬ staci bialego proszku o temperaturze topnienia 122—124°C.Przyklad III. W 1000 ml wody zawiesza sie 4.0 g surowego proszku o barwie zóltej, otrzy- 15 manego przez stezenie ekstraktu eterowego z przy¬ kladu I, po czym zakwasza sie do wartosci pH=3,5 przez dodanie 5n kwasu solnego. Nastepnie prze¬ puszcza sie roztwór przez kolumne 100 ml Amber- lite CC-50 (typ H) w celu adsorbowania substancji 20 aktywnych, po czym plucze sie zywice jonitowa 800 ml wody destylowanej i eluuje mieszanina 0,4 kwasu solnego z etanolem w stosunku 1 :2.Aktywne frakcje eluatu stanowia lacznie 180 ml.Wartosc pH tych frakcji doprowadza sie do 6,0 25 przez dodanie 3n wodorotlenku sodowego i steza do 40 ml pod cisnieniem nizszym od atmosferycz¬ nego. Nastepnie alkalizuje sie do wartosci pH=8,0 przez dodanie 3n wodorotlenku sodowego i eks¬ trahuje dwiema porcjami po 50 ml eteru etyló- 30 wego. Polaczone ekstrakty steza sie pod cisnie¬ niem nizszym od atmosferycznego, otrzymujac 2.1 g proszku o barwie jasnozóltej. Produkt ten rozpuszcza sie w 10 ml octanu etylu i poddaje otrzymany roztwór chromatografii, przepuszczajac 35 go przez kolumne 200 ml tlenku glinowego im¬ pregnowanego octanem etylu i stosujac octan ety¬ lu jako rozpuszczalnik. Do 200 ml aktywnych frakcji eluatu dodaje sie 40 ml wody destylowa¬ nej, zakwasza do wartosci pH = 1,8 przez dodanie 40 5n kwasu solnego i calosc wytrzasa sie dokladnie.Nastepnie oddziela sie faze wodna od fazy orga¬ nicznej i alkalizuje roztwór wodny do wartosci pH = 8,5 przez dodanie In wodorotlenku sodowe¬ go. Stracona substancje odsacza sie i rozpuszcza 45 w benzenie, po czym roztwór chromatografuje sie na zelu krzemionkowym, jak w przykladzie I, otrzymujac 300 mg antybiotyku SF-837 w postaci proszku o barwie bialej.Przyklad IV. 200 mg antybiotyku SF-837 50 otrzymanego w sposób opisany w przykladzie II rozpuszcza sie w 10 ml eteru dwuetylowego i do roztworu wkrapla, nasycony roztwór kwasu cytry¬ nowego. Otrzymany osad odsacza sie, uzyskujac 230 mg cytranianu antybiotyku SF-837. Produkt 55 topnieje z objawami rozkladu w temperaturze 162—167°C. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku SF-837, 60 znamienny tym, ze szczep Streptomyces mycaro- faciens ATCC 21454 hoduje sie w warunkach aero- bowych, w pozywce zawierajacej zródla przyswa¬ jalnego azotu i wegla, a nastepnie wyosaibnia z brzeczki pohodowlanej wytworzony antybiotyk 65 SF-837.80 450 400 300f 200 100 m/u «£ 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 3800 3400 3000 2600 2200 1900 1700 1500 1300 1100 900 700 DLUGOSC FALI (cm'') - Fig. 280 450 1 10 9876 54321 ppm Fig. 3 Rf SF837 SF837 SF837 SF837 + *•»¦? Leuko- Leuko- 3oza- Tercjo- mycyna A3 mycyna Ae mycyna mycyna B SFC57 SF|37 SFC37 Leuko- Leuko- Tercjc- mycynaA4 mycyna Ad mycyna A FLg.4 PL