SU420187A3 - Способ получения антибиотика - Google Patents

Description

Предлагаетс  способ получени  антибиотика , ранее в патентной литературе не описанный , заключающийс  в том, что культуру Streptomyces micarofaciens SF-837 (АТСС 21454) выращивают в аэробных услови х на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в течение 2-5 дней при температуре 15-38°С до накоилени  антиб.нотика в культуральной жидкостн. Затем культуру отф.ильтровывают и прп рН 7-9 экстрагируют органическим растворителем, не смещивающимс  с водой, например этилацетатом , этиловым эфиром, метилизобутилкетоном , бутилацетатом, хлороформом, бутиловым спиртом. Получеиный экстракт повторно экстрагируют ири рН 2-3 водным раствором кислоты, например сол ной, серной, устанавливают рН 7-9 с помощью щелочи. Полученный экстракт вновь экстрагируют не смешиваюидимс  с водой органическим растворителе .м. Экстракт упаривают в вакууме досуха , раствор ют сырой продукт в этилацетате или бутилацетате, пропускают раствор через колонку с активированным углем и элюируют активные фракции этилацетатом или бутилацетатом . Активные фракции очищают новториой экстракцией и хроматографическпмн методами . Полученное предложенным способом антибиотическое вещество обладает низкой токсичностью. При испытаннц на .мышах

установлено. что аО%-на  смертность через оцределен 1ые промежуткн временн достигалась соответственно при дозе, 3200, 3100, 2900 и 2850. Штамм, используемый в предложенном способе, выделен из образца иочвы, относитс  к Streptomyces micarofaciens иод номером 21454 в соответствии с нормами АТСС и имеет след ющие особенное

на разлнчны .х питательных средах.

Сахарозный агар Чапека. Субстратный мицелий от бесцветного до кремового, рост плохой . Воздушны л 1щелнй скудный хлопкоиоНОДоб Ь 1 беловато-серый. РасТВОр МОГО .мента нет.

Глицериновый агар . Субстратный мицелий темно-коричневый. Воздушный м 1целий от белого до кремового, частично с образованием окрашеиного в серый оттенок, хлопко юдобный. Растворимого Н 1гмента нет или очень .мало слабо-розового цвета.

Глюкозо-аспарагпновый агар Чапека. Субстратны светло-коричневый до красновато-коричневого . Воздушный .мицел Й белый бело-розовый. Растворимого пигмента нет 1ли слабо-коричневато-и елтый.

Глюкозо-аспарагиновый агар УЩННСКОГО. Субстратный мицелий коричневый с красноватым оттенком. Воздушный м щелий розоватый . Растворимый 1игмент светло-кор;1чневыи.

Кальци11-малатный агар. Субстратный л ицелий кремовый, рост слабый. Воздушного мицели  нет. Растворимого пигмента нет.

Глицерин-кальциевый агар. Субстратный мицелий светло-коричневый. Воздушный мицелий розовый, переход щий в сероватый. Растворимого ппгмента нет.

Крахмально-си1птетический агар. Субстратный мицелий тем-но-корич«евый с пуроурным оттепком. Воздушный мицелий розовый со значительным красноватым оттенком, постепенно переход щим ъ сероватый. Растворимого пигмента нет.

Бульонный агар. Субстратный мицелИЙ желто-коричневый. Воздушный мицелий очень скудный, белый. Растворимого пигмента нет.

Глю козо-бульоппый агар. Субстратный мицелий от коричневого до темно-коричневого, рост хороший. Растворимого пигмента нет.

Глюкозо-пептонный агар. Субстратный мицелий коричневый. Воздушный мицелий скудный , белый.

Тирозиновый агар. Субстратный мицелий белый.

На картофельных дольках субстратный мицелий от коричневого до темно-коричневого, рост хороший; воздушный мицелий обильный , серовато-коричневый, растворимый пигмеит темновато-коричневый.

На дольках моркови субстратный мицелий коричневый, воздушный мицелий от белого до кремового; растворимый пигмент коричневый но периферии колонии.

Си тое молоко. Субстратиый мицелий светло-коричневый , рост поверхностный. Воздушный мицелий скудный, белый.

Яйцо. Субстратный мицелий бледно-коричневый , воздушного мицели  пет.

Коагулированна  сыворотка Лсффлера. Субстратный мицелий бледно-коричневый. Воздушного мицели  иет.

Глюкозный раствор Чапека. Субстратный мицелий бледно-коричиевый. Воздушиый мицелий скудный, белый.

Желати} а. Субстратный мицелий от кремового до бледио-коричневого. Воздушно1о мицели  нет.

Среда Беинета. Субстратный мицелий от коричиевого до темно-коричневого. Воздушиый М1шелий розовый с красноватым оттенком.

Предложенным способом иолучено веш,ество , обладающее свойствами антибиотика, которое ингибирует рост граммиоложительных бактерий. Оио включает четыре активные фракцни. Антибиотик раствор етс  в метиловом спирте, этиловом снирте, ацетоне, хлороформе , этилацетате, бутилацетате, подкисленной воде, бензоле, этнловом эфире и четыреххлористом углероде, плохо раствор етс  в петролейном эфире, нормальном гексане и нейтральной воде. Имеет осиовиую реакцию, образует с кислотами соли.

Антнбиотик содержит в молекуле углерод, водород, азот и кислород и вращает плоскость пол ризации влево в этиловом спирте, причем это веиюство про вл ет свойства макролпдных антнбиотиков. I фракци  в свободной основной форме образует белый иорошок с т. нл. 122-124°С, про вл ющий степень рКа 6,9 в 50 %-ном растворе этилового сцир5 та в воде. Элементарный состав, %: С 60,38, Н 8,35, N-1,65 и остальное О, мол. вес 813, что оиределено путем масс-анализа, эмпирическа  формула C4iH67O 5N, при концентрации в этиловом спирте 1 % оптическое враще0 ние «1 - 67°. Максимальна  абсорбционна  снособность лучей ультрафиолетового участка спектра раствора в этиловом спирте при длине .вол.ны 232 нм раВна(Е}Д 325). Вещество в виде пилюль, т. е. в виде свободного основани  в бромистом калии, обладает сиособностью поглощать лучи в инфракрасном участке спектра при следующих волиовых числах, 3500, 2970, 2930, 1731460 , 1408, 1376, 1360, 1330, 1295, 1275, 1190,

0 1165, 1120, 1082, 1050, 1015, 910, 860, 840, 805, 780, 735 и 680. Диацетилпроизводпое продукта образует окрашенные в белый цвет иглы, т. ил. 122-125°С при перекристаллизации из четыреххлористого углерода.

Элемеитариый состав, %: С 60, 35, Н 8,02, К 1,58, а остальное О - 30,05, что соответствует эмпирической формуле C45H7iOi7N,причем максимальна  абсорбционна  способность при 232 нм равна (Ej-.; 295) в ультрафиолетовой области спе(тра в растворе в этиловом снирте. Это нроизводиое характеризуетс  способностью иоглощать излучение в инфракрасной области спектра граиул в бромистом калии при следующих волновых числах, с.н. 3450, 2970, 2930, 1728, 1454, 1368, 1232, 1167, 1122, 1082, 1054, 1024, 1002, 957, 907, 868, 837, 788, 762. И фракци  в виде свободиого основани  иредставл ет собой окрашенный в белый цвет порошкообразный продукт, т. пл. 125-128°С; показатель рКа в 50%-ном растворе этилового спирта в воде 6,8. Элементарный состав, %; С 60,58, Н 8,85, N 1,72, остальное О - 28,85; мол. вес 827; эмпирическа  формула C42H69Oi5N; оптическое вращение а 1 -68° нрн концентрацин 1% в этнловом спирте. Максимальна  абсорбционна  способпость при длине волны 232 нм (Е 320) в ультрафиолетовом участке

0 снектра в растворе этилового спирта. Характеризуетс  абсорбционной способностью излучени  в инфракрасной области снектра и в виде свободного основани  в форме гранул в бромистом калии при следующих волновых

5 числах, 3500, 2970, 2985, 1737, 1460, 1410, 1377, 1360, 1300, 1275, 1190, 1170, 1123, 1082, 1052, 1017, 990, 920, 910, 860, 840, 805, 780, 740 Н 700. Диацетилпроизводиое II фракции образует окрашенные в белый цвет иглы с

0 т. нл. 130-134°С. Элемеитариый состав, %; С 60,68, Н 8,28, N 1,49, а остальное ,60. Эмнирическа  формула С4бН7з017К.

III фракци  в виде свободного основани  иредставл ет собой окрашенный в белый цвет

)5 норошок с т. ил. 122-125°С, в 50%-лом водно-сп 1ртовом растворе рКа равен /,0. Элементарный состав, %; С 60,58, Н 8,23, N 1.87, а остальное 0-29,32; мол. вес 811; эмпирическа  формула C4iH65Oi5N. Оптическое вращение равно а JJ -42° при 1%-ной концентрации в этиловом спирте. Максимальна  абсорбционна  способность при длине волны 280 им равна (Е ,;, 295) при излучении в ультрафиолетовой области спектра в растворе этилового спирта. Поглощает излучение в ипфракраспой области спектра в форме гралул в бромистом калии в виде свободного оснозали  при следующих волновых числах, С.1Г: 3500, 2970, 2930, 1738, 1680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1360, 1300, 1275, 1252, 1190, 1168, 1121, 1088, 1052, 1015, 980, 910, 863, 840, 805, 780. Моноацетильное производное III фракции образует кристаллы, подойные кристаллам речного песка, т. пл. 182-185°С. Элементарный состав, %: С 60,5, Н 7,92, N 1,68, а остальное О-29,84. Эмпнрическа  формула С4зНб7М.

IV фракци  представл ет собой свободное оспова.ние, которое образует порошкообразный продукт, окрашенный в белый цвет, т. лл. 120-122°С, показатель рКа з 50%-ном водном ра-створе этилового спирта равен 7.0. Элементарный состав, %; С 60,82, И 8,52, N 1,73, а остальное О-28,93, молекул рньи: вес 825. Эмпи рическа  фсрмула C.i2H67Oi5N. Оптическое вращение -40° при концентрации 1% в этиловом -спирте. Максимальна  абсорбционна  способиость :1злуче1 и  г ультрафиолетовой области спектра при длине волны 280 им (Е 1 285) в растворе в этиловом спирте. В виде гранул в форме свободного основаии  в бромистом калии характеризуетс  иоглопиющей способностью в инфраKpacHoii области излучени  ири следуюидих волновых числах, слг: 3500, 2970, 2930, 1738, 1680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1,360, 1300, 1276. 1252, 1190, 1170, 1120. 1082, 1052, 1017, 980, 920, 910, 863, 840 и 780.

Моноацстилпроизводное IV фракции образует кристаллы, имеюидае форму круииц речного песка, т. ил. 166-168°С. Элементарный состав, о/с: С 60,85, Н 8,06, N 1,65, а остальное О-29,44. Эмп;1рическа  формула C4.iHG90i6N. Все перечисленные фракции могут быть получены одновременно в ходе проведени  процесса кyльтивиpoвaiпи  П1тамма и характер: .1зу1отс  аналогичными физико-хим-ическими свойствами.

Па ф:ИГ. 1-4 иредставлепы характеристики I-IV фракций.

Пример 1. В 60 л жидкой иитательной среды, содержащей 2,5% осахаренного крахмала , 4% растворимого растительного протеина , 0,3% хлористого кали  и 0,3% углекислого кальци , при рП 7,0 инокулируют штаммом II при посто нном перемешивании культивируют ири 28°С в течение 35 час з услови х непрерывной аэрации. Полученную культуру отфнльтровывают, мицелий промываю:

ВОДНЫМ растворо.м сол ной кислоты. Фильтрат объедин ют с промывной жидкостью, в результате оби1.ее количество полученной жидкой фракции составл ет 50 л (потенци  или сила равна 150 мкг/мл). Далее из фильтрата при рП 8, с помощью 25 л этилацетата экстрагируют активное вещество, далее 22 л этилацетатксй фракции концентрируют до конечного объема, равного приблнз 1тельно 3 л, 3 услови х пониженного давлени . Полученный конпентрат разбавл ют 1,5 л воды, довод т рП среды до 2,0 добавлением 5 н. раствора сол ной кислоты ii тщательно перемеапизают вcтp ixивaниe i. Затем водную фазу отдел ют от орган 1чеСкой фазы, довод т рН ;гэдного раствора до 8,0 добавлением 3 н. раствора гидрата о-киси натри . Далее экстрагируют 800 мл этилацетатов. Полученный этилацетатный экстракт перемешивают встр хиванием с 5GO мл водного раствора сол ной югслоты. в результате чего активные фракции переход т в этот раствор, который затем повторно экстраг; руют с 400 .ил серного эфира при рП 8. Далее эфирный экстракт сушат безводным сульфатом натри  с последующим лонцентрмрованием ири пониженном давлении , в результате получают 16,5 г светло-желт; )го порошК.;образного продукта.

После это;-,) 12 г продукта раствор ют в 200 мл. эти.-ишетата и раствор ироиускают через колонку с 600 мл тонкодисиерсного угл , иредварггельно пропитанного этилацетатом . Элюирхют этилацетатом. после чего акт; виые фра-кцли элюата объедин ют, обп1,ее количество конечной фракции 2500 мл. Затем ее выпаривают досхха в условп х пониженного давлени , получают 5 г отвращенного з белый цвет и.ороикообразного продукта. Далее этот продукт раствор ют в 0 мл бензола и отф1:льтровывают нерастнсри:5И1уюс  чпсть. После этого фильтрат иропускают через хромг:тсграф :чсскую колонку, в KOTOpoii содерЖ1 тс)1 700 мл силикагел , предварительно иропитанного бензолом, с иоследуюп1ей элюпией с помоицпо бензола

и ацетона в соотнашен1Ч 4;1. Полученный

элюат собирают в виде фракгип. солпчество

каждой из ,которых составл ет 20 .i/.г. После

этого активные

фракции Ло 90-380, характеризующиес  только одним п тном в ходе проведени  хроматографнческого анализа в тонком слое окиси алюмини , что соответствует содержанию чистой I фракции, в соответствии с величиной Rf дл  одного п тна, объедии ют, o6niee ко3 .личестБо составл ет 4000 мл. После этого продукт концентрирмот в услови х поииженного давлени , получа  1.5 t окрашенного в белый цвет иорош.кообразного иродукта, т. ил. 122-124°С. В результате а 1ализа устаповле0 но, что он представл ет собой ч 1стый продукт в виде свободного основани .

Пример 2. 20 л питательной среды, сндержаще (%) 3 глюкозы, 1 пептона, 0,5 м сного экстракта, 0,2 хлористого иатри , 0,3 уг5 лекислого кальци  и 0,3 соевого acлa, рП 7.0,

помещают в вибрационный бродильный чан. емкостью 30,0 л, стерилизуют при 120°С 20 мин. Стерилизованную питательную среду .ино,кулируют Streptomyces micarofaciens с последующим культивирова-нием .при иоето н«ом перемешл-вании при 28°С в течение 48 час с одновреме;нной аэрацией. Далее жидкую ферментативную среду фильтруют при рН 6 н получают 18 л фильтрата (сила 200 .икгЛил). рН фильтрата довод т до 7,5, добавл   3 н. раствор гидрата окиси натри , и экстрагируют 8 л бутилацетата. Полученный бутилацетатный экстракт подвергают обра|бот:ке, оиисанной ,в 1примере 1, т. пл. окрашенного в белый цвет конечного порошкообразного продукта 122- 124°С. Выход антибиотика 800 мг.

Пример 3. 4,0 г сырого порошкообразного вещества, окрашенного в желтый цвет, полученного оии;санным в примере 1 способом, суспендируют в 1000 мл воды. Величину рН суспензии довод т до 3,5 добавлением 5 н. раствора сол ной ки-слоты. Раствор пропускают через колонку, содержащую 100 мл продукта Амберлит СС-50 (кокаино-активного типа). Смолу промывают 800 мл дистиллировап .ной воды с последующей элюцией смесью 0,4 н. раствора сол ной кислоты с этиловым спиртом в соотношении 1:2. Объедин ют активные фра;кции элюата, общ,ий объем их составл ет 180 мл. Величину рП элюата довод т до 6,0 добавлением 3 н. раствора гидрата окиси натри  и концентрируют до объема 40 мл в услови х пониженного да1Вле И1Я. Далее величину рП сконцеитр.ированного продукта довод т до 8,0 добавлеиием 3 н. раствора гидрата окиси натри  с иоследующим двойным экстрагированием двум  порци -М-: по 50 мл кажда  этилового эфира. Полученные фракции объедин ют и концентрируют в услови х иониженного давлени . В результате получают 2,1 г окра1щенного в белый цвет порошкообразного продукта, который раствор ют в 10 мл этилацетата. Полученный раствор пропускают через колон.ку, заполненную 200 мл окиси алюмини , предвар1 тельно проиитанной этилапетатом, с последующей элЕоцией этилацетатом. Активные фракции элюата объедин ют. Об1цее количество этого элюата 200 мл. Далее в элюат добавл ют 40 мл дистиллированной воды и довод т рН до 1,8 добавлением 5 н. раствора сол ной кислоты с иоследующим тщательным перемещением путем встр хивани . Далее водную фазу отдел ют, довод т рП до 8,5, добавл   I н. раствор гидрата окиси натри , в результате твердый продукт выпадает в осадок. Осадок отфильтровывают, раствор ют в бензоле, а затем раствор иропускают через колонку с еиликагелем (как описано в нрнмере 1), причем (разделение производ т в соответствии с вариантом осуществлени  иредлагаемого способа . Получают норошок белого цвета. Выход антибиотика 300 мг.

П р и м е р 4. Штамм АТСС 21454 Streptomyces micarofaciens инокулируют в 300 л жидкой

питательиой среды, содержащей (%) 2,0 глюкозы , 1 пептона, 0,5 м сного экстракта, 0,4 кукурузного экстракта, 0,2 хлористого натри , 0,3 углекислого кальци  и 0,2 л рда, при рН 7,0, и культивируют при 28°С в течение 70 час в услови х аэрации.

Культуральную жидкость фильтруют и мицелиальную массу промывают сол ной кислотой. Фильтрат объедин ют с промывными жидкост ми , в реззльтате чего общий объем конечной массысоставл ет 280 л (сила 320 мкг1мл). Далее фильтрат экстрагируют 70 л этилацетата и 71 л полученной этилацетатной фазы концентрируют до 20 л в услови х пониженного давлени . Концентрат разбавл ют 10 л воды, довод т рН до 2,0 добавлением 5 н раствора сол ной кислоты с последующим тщательным перемещнванием путем встр хивани . Далее водную фазу отдел ют, довод т рН до 9,0 добавлением 3 н. раствора гидрата окиси натри  и экстрагируют 4 л этилацетата. Полученный экстракт перемешивают встр хиванием с применением 2 л водного раствора сол ной кислоты . Затем вновь экстрагируют 1 л этилацетата при рН 8,0. После этого экстракт сушат безводным сульфатом натри  с последующим концентрированием в услови х пониженного давлени . Получают 92 г сырого порошкообразного продукта, окрашенного в желтый цвет.

90 г этого продукта раствор ют в 1 л этнлацетата , раствор пропускают через колонку, заполненную 1,5 л угл , пропитанного этилацетатом е последующей элюцией этнлацетатом , после чего активные фракции элюата объедин ют. Получают 5,5 л. Далее объедипеппую фракцию выпаривают до сухого соето ии  в услови х попижеппого давлеии . Получают 55 г порошкообразного продукта белого цвета (сила коиечпого продукта 700 мкг/мг).

Порощкообразный продукт подвергают обработке методом распределени  по принципу противотока, примен   бензол и 0,ЗМ раствор фосфорного буффера (рП 4,40), используют 2,5 л каждого растворител  и нижний подвижHbni слой подвергают дес тикратной обработке методом распределени . Антибиотик распредел етс  но пробиркам или трубкам с первой по третью и сосредотачиваетс  преимущественно во второй пробирке, тогда как больша  часть, т. е. приблизительно 80% остальных фракций - П-IV сосредотачиваютс  в первой пробирке.

После этого содержимое первой пробирки или трубки (2,4 л) концентрируют, получают 7,7 г продукта, окрашенного в белый цвет (сила 720 мкг/мг). После этого продукт раствор ют в 15 мл бензола, нерастворившийс  остаток отфильтровывают, фильтрат пропускают через колонку, заполненную 800 мл силикагел , который предварительно пропитывают бензолом. Активные вещества элюируют смесью бензола с ацетоном в соотношении 4:1. Элюаты объедин ют . Далее те фракции элюата (№ 28-30), которые характеризовались только одним п тном , объедин ют в вакууме. Получают 140 мг порошкообразного продукта, окрашенного в белый цвет, т. пл. 120-122°С. Это IV активна  .фракци  в чистом виде в форме свободного основани .

Далее фракции № 38-57, которые характеризовались образованием трех п тен в ходе проведени  хроматографического анализа в тонком слое окиси алюмини , объедин ют и концентрируют в услови х пониженного дав .лени . Получают 1,1 г порошкообразного продукта белого цвета, который представл ет фракции II и III и незначительное количество I фракции. Фракции № 70-95, которые характеризовались образованием только одного п тна в ходе проведени  хроматографического анализа в тонком слое окиси алюмини  содержали только I фракцию. Затем концентрируют в услови х пониженного давлени  и получают 0,8 г порошкообразного продукта, окрашенного в белый цвет, т. пл. 122-124°С. Он представл ет собой I фракцию в виде свободного основани .

П|ример 5. В 4 мл бензола раствср ют 1 г продукта, окрашенного в белый цвет и содержаш .еео II и 1П активные фракции и значительное количество I фракции. После этого раствор пропускают через колонну, заполненную 100 мл окиси алюмини , пропитанной бензолом, и элюируют смесью этнлацетата с .бензолом в соотношении 1:1. Элюат собирают в виде отдельных фракций, количество каждой из которых составл ет 20 мл. Каждую фракцию подвергают испытанию хроматографическим путем в тонком слое окиси алюмини  с применением в качестве элюата смеси этилацетата с бензолом в соотношении 2:1. После этого те фракции, номера которых наход тс  Б пределах от 30 до 48 и которые характеризуютс  только одним п тном в ходе ироведени : хроматографического анализа в тонком слое окиси алюмини , объедин ют и концентрируют в услови х пониженного давлени  до порошкообразного продукта, окрашенного в белый цвет с т. пл. 122-125°С. Получают IV активпую фракцию в виде свободного основанрт.

После окончани  вымывани  фракции N° 80 с хроматографической колонки смесью этилацетата с бензолом в соотношении 2:1, фракции № 90-125 концентрируют в услови х пониженного давлени . В результате получают 280 мг порошкообразного продукта белого цвета, представл ющего собой 11 активную фракцию. Далее 250 мг этого продукта раствор ют в 3 мл бензола, раствор пропускают через колонку, заполненную 50 Л1л окиси алюмини , предварительно пропитанной бензолом , затем элюируют 300 мл смеси этилацетата с бензолом в соотношении 1:3, после чего замен ют эту смесь смесью этилацетата с бенлом в соотношении 2:1. Элюат собирают в виде отдельных фракций, количество каждой из которых составл ет 5 мл, после чего каждую фракцию испытывают путем хроматографического анализа в тонком слое окиси алюмин:: . Далее ()ракции Ло 3G-47. образуюш,ие только одио п тно в ходе хроматографического анализа в тонком слое, объедин ют и концентрируют в услови х пониженного давлени . Получают 80 мг порошкообразного вещества белого цвета, представл ющего II активную фракцию.

Пример 6. Штамм , который получил наименование Streptomyces mkarofaciens , инокулпруют в 30 л жидкой питательной среды, содержащей (%) 3,0 глюкозы, 5 растворимого растительного белка, 0,2 хлористого кали  и 0,3 углекислого кальци , при рН 7,0. Затем культивируют при 30°С в течение 85 час при посто нной аэрации. Далее ферментативную среду фильтруют, м щелиальную массу нромывают разбавленным раствором сол ной кислоты. Фильтрат объедин ют с промывной жидкостью до объема 28,1 л (сила 300 мкг/мл). Полученный фильтрат при рП 8,4 экстрагируют с 7 л бутилацетата , а полученный экстракт, как описано в примере 4. Получают 15,2 г. После этого в 200 мл бутилацетата раствор ют 15 г сырого иорошкообразного же.ттого продукта, раствор пропускают через колонку, заполненную 400 мл угл , предварительно нропитан«ого бутилацетатом , с последующей элюцией бутплацетатом . Активные фракции элюата объедин ют . Общее количество объединенной ()ракци11 составило 1,8 л. Общую фракцию концентрируют в услови х пониженного давлени  до мл. Далее концентрат разбавл ют 50 мл дистиллированной воды, рП раствора довод т до 2,0 добавлением 6 п. раствора сол ной кислоты, после чего конечную массу перемен ивают встр хиван11См. Затем водную фазу отдел ют, величину рП этого водного раствора довод т до 9,0 добавлением 1 н. раствора гидрата окиси натри , в результате чего выпадает в осадок конечньп продукт. Затем осадок отфильтровывают и высушивают в эксикаторе, в результате получают 6,3 г окрашенного в белый цвет порошкообразного продукта, спла которого 720 мкг/мг.

Порошкообразный белый продукт раствор ют в 12 мл бензола, а нерастворнвшуюс  часть отфильтровывают. Фильтрат пропускают через колопку, заполненную 600 мл силикагсл , нропитапного бензолом с последующей элюписй смесью бензола с ацетоном в соотношении 6:1. Элюат получают в виде отдельных фракций по 20 мл. Активные фракции П-IV вымывают ранее I фракции. После этого каждую из полученных фракций подвергают испытанию путем хроматографического анализа в тонком слое снликагел  с применением в качестве элюата смеси бензола с ацетоном в количественном соотношении 2:1. Фракции 64-82 концентрируют в услови х пониженного давлени , в результате получают 800 мг окрашенного в белый цвет порошкообразного продукта, который включает фракци; II-IV. с незначительным количеством 1 фракц. После этого порошкообразный

И

продукт подвергают обработке путем хроматографического разделени  с iipsiMeneni-ieM колонки , заполненной еиликагслем, способом, описанным в лрпмере 4. Очищенный нродзкт подвергают хроматографической обработке на колонке, занолнеикой ок сью алюмини , как описано з примере 5. Получают 15 мг чпетого продукта 1 фракции з виде ссободпсго основани , 85 мг чистого продукта 1П фракции в виде свободного осиозанп  и 35 мг чистого нродукта IV фракции.

Пример 7. В 10 мл зтилового или серного эфира раствор ют 20 мг I фракции, которую получают сиособом, описаниым в нри.лиере 2, после чего раствор по капл м добавл ют в насыщенный растзор лимонной кислоты. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают . В результате получают 230 мг цитрата продукта - I фракцию, т. пл. от 162 до 167°С (с разложением).

По 200 мг каждого из свободиых основаh;iи фракций И-IV Обрабатывают насыщенным .раствором лимонной кислоть и получают лимоннокЕслые лроизводные дапных фракций. Выход 210, 220 и 190 лгг.

Пример 8. В 20 мл диетнллироваппой воды еуспепдируют 300 м.г фракции, к суспензии добавл ют водный раствор винной кислоты. Полученную смесь иеремегпивают, рП довод т до 4,0. Далее фильтруют, фильтрат сушат при температуре ниже 0°С, получают 340 мг виннокислого продукта в виде окрашенного в белый цвет иорошка, т. пл. 115°С.

Пример 9. В 1,5 мл пиридина раствор ют 300 мг продукта I фракции в виде свободного основани , в раствор добавл ют 1,0 мл уксус12

ного ангидрида. Полученную смесь перемешивают , выдерживают при комнатной температуре в течение 20 гас. Далее смесь выливают 13 смесь воды со льдом, перемешивают. ВьшавИ1ИЙ осадок отфильтровывают и высушивают 3 эксикаторе. Получают 330 мг порошкообраз1 ого продукта белого цвета, который перекрисгаллизовывают из четыреххлориетого углерода . Получают 305 мг диацетильного производиоо фракции I з виде белого игловидiioro продукта, т. пл. 122-125°С. Подобным способом получают фракции в виде свободпых оснований, обраба: ;зСьггоч ;ым количеством уксусного ангидрида в виде его раствора в пиридине и ;л,иацетильиое производное фрак )Ц и и 1 i, моноацетнльное пронзводиое фракции

II, а также моноацетильное производпое фракц 1 IV, представл вшие собой белые кристаллические вещества, выход которых составил соответственно; 310 мг (т. пл. 130--134°С), 295 мг (т. пл. 182-185°С) и 300 лс (т. пл. 166-168°С).

Предмет изобретени 

(йюсоб нолучени  антибиотика, отличающийс  тем, что культуру Streptomyces micarolacic-ns (.-VrCC21454) выращивают ; аэроб1гых услови х па среде, содержащей исгочпшчи углерода, азота и минеральные соли, и течение 2-5 дней прн температуре 15-38°С, извлекают целевой продукт из мицели  и культуральноГ жидкости, очищают и раздел ют известными нриемами и выдел ют в свободном виде, в виде солевой или ацетильных производных .

4000 ддОО 5200 2800 2.00 2000 1800 1600 1200 1000 800 600 дЗОО 5000 260О 2200 1900 t700 15ОО 130О 1WO ЭОО 7ОО

Волновое Ljucno(CM)

О

000 3000 WOO 1800 1600

000 3000 2000 1800

1200 1000 80п

f-no 00

Волнобое число (см} 1риг.2

бОП 0

1600 то 1200 1000 800 Волнодое число (см }

4.J

Во Л И О бое /исло (см )