PL78558B1

PL78558B1 - Process for the production of zeaxanthin[us3841967a]

Info

Publication number: PL78558B1
Application number: PL1972158313A
Authority: PL
Original assignee: Nestle Sa Ste Produits
Priority date: 1971-10-27
Filing date: 1972-10-17
Publication date: 1975-06-30
Also published as: JPS4849989A; CA980276A; DE2252364A1; DK133828B; DK133828C; US3841967A; FR2158296A1; IT969896B; BE790289A; FR2158296B1; GB1385274A

Description

Sposób wytwarzania zeaksantyny 2 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zóltego pigmentu, zeaksantyny, czyli 3,3'-dwu- hydroksy-fi-karotenu, na drodze biosyntezy.Zeaksantyne mozna wykorzystac np. jako doda¬ tek do pokarmu kurczat w celu wzmocnienia zól¬ tawego zabarwienia ich skóry lub tez w celu pod¬ kreslenia barwy zóltek jaj. Pigment ten mozna równiez wykorzystac jako srodek barwiacy w prze¬ mysle kosmetycznym.Synteza pigmentów przez niektóre mikroorga¬ nizmy (drobnoustroje), szczególnie pigmentów karo- tenoidowych przez bakterie rodzaju Flavobacter jest procesem znanym. Niemniej jednak przemy¬ slowe wytwarzanie tych pigmentów na drodze bio¬ syntezy zwykle okazywalo sie trudne do przepro¬ wadzenia, a uzyskane wydajnosci zwykle bardzo niskie, wymagajace stosowania wielkich ilosci po¬ zywki hodowlanej, jesli pozadane bylo wytworze¬ nie wiekszych ilosci pigmentu.Stwierdzono, ze mozna uzyskac zwiekszona wy¬ dajnosc zeaksantyny na drodze hodowli drobno¬ ustrojów rodzaju Flavobacter wytwarzajacych ten pigment w warunkach, w których w pozywce ho¬ dowlanej zachowuje sie zasadniczo staly stosunek pomiedzy ilosciami substancji bedacych zródlem wegla i azotu.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zea¬ ksantyny na drodze hodowli drobnoustrojów ro¬ dzaju Flavobacter, w którym drobnoustroje hoduje sie poczatkowo w srodowisku odzywczym az do chwili, w której komórki zaczynaja rosnac i wy¬ twarzac zeaksantyne, po czym hodowle komórek po osiagnieciu przez nie odpowiedniej fazy wzrostu prowadzi sie w temperaturze 22—25°C z odpowied- s nim natlenieniem w wodnym srodowisku odzyw¬ czym, zawierajacym co najmniej jeden weglowo¬ dan w ilosci 15—35 mg/ml, stanowiacy zródlo przyswajalnego wegla, oraz substancje bedaca zródlem azotu aminowego, zawierajace wolne io aminokwasy. Podczas hodowli odpowiednie ilosci substancji bedacych zródlem wegla i aminowego azotu w srodowisku utrzymuje sie w stalym za¬ sadniczo stosunku przez stopniowe dodawanie tych substancji do pozywki hodowlanej. Hodowle pro- is wadzi sie az do zakumulowania w srodowisku od¬ powiedniej ilosci zeaksantyny.Termin „drobnoustroje wytwarzajace zeaksantyne rodzaju Flavobacter" obejmuje bakterie tego typu oraz ich mutanty. Szczególnie korzystnymi sa Fla- 20 vobacter ATCC Nr 21081, Flavobacter ATCC Nr 21588 i Flavobacterium aauatile ATCC Nr 11947.Termin „z odpowiednim natlenieniem" oznacza, ze zawartosc tlenu w pozywce hodowlanej nie jest nizsza od wartosci, przy której zawartosc tlenu 25 staje sie czynnikiem limitujacym szybkosc wzrostu drobnoustroju w pozywce hodowlanej. Natlenienie to mozna uzyskac np. przez energiczne napo¬ wietrzanie i mieszanie pozywki hodowlanej. Wresz¬ cie termin „srodowisko odzywcze" oznacza po- *o zywke hodowlana, zawierajaca odpowiednie sub- 78 5583 78 558 4 stancje przyswajalne, niezbedne dla wzrostu drobnoustroju. Substancje te obejmuja w szczegól¬ nosci zródla wegla i azotu oraz sole mineralne.Srodowisko odzywcze moze takze zawierac ewen¬ tualne dodatki, takie jak witaminy, srodki przy¬ spieszajace wzrost i pierwiastki sladowe, niezbedne dla wzrostu bakterii.Weglowodany, które stanowia zwykle glówne zródlo przyswajalnego wegla obejmuja najkorzy¬ stniej glukoze, laktoze i sacharoze. Zródlem wegla moze byc takze mieszanina dwóch lub wiekszej liczby weglowodanów.Sposród substancji, które moga stanowic glówne zródlo azotu aminowego najkorzystniejszymi sa ekstrakty kukurydziane, ekstrakty drozdzowe, hy¬ drolizaty bialkowe; w szczególnosci produkty otrzy¬ mywane przez kwasowa lub enzymatyczna hydro¬ lize bialek roslinnych, takich jak proteiny soi lub orzeszków ziemnych, i/lub hydrolizaty kazeiny, okreslane mianem „tryptonu". Zródlo azotu amino¬ wego moze takze zawierac substancje wytworzona przez kwasowa lub enzymatyczna hydrolize bio¬ masy odzyskanej jako produkt uboczny w pro¬ cesie biosyntezy pigmentu karotenoidowego, w wy¬ niku karotenoidowego, w wyniku hodowli bakterii rodzaju Flavobacter — zwlaszcza przez hydrolize biomasy z hodowli drobnoustrojów Flavobacter, prowadzonej celem wytwarzania zeaksantyny, po wydzieleniu z niej uzyskanego pigmentu.Prowadzac proces sposobem wedlug wynalazku, do tanku fermentacyjnego zawierajacego srodo- wisiko odzywcze wprowadza sie kulture drobno¬ ustroju rodzaju Flavobacter. Wzrost mikroorga¬ nizmu podtrzymuje sie nastepnie przez zapewnie¬ nie odpowiedniej ilosci tlenu w srodowisku oraz utrzymujac odpowiednia temperature i pH, np. temperature 28—30°C i pH od 6,5 do 8,0, najko¬ rzystniej od 7,0 do 7,5. Szczególnie korzystne jest prowadzenie tego pierwszego etapu hodowli w sro¬ dowisku zawierajacym wiecej niz 35 mg/ml sub¬ stancji bedacej zródlem wegla.Gdy komórki osiagna odpowiedni stopien wzro¬ stu, korzystnie faze wzrostu wykladniczego, jak równiez odpowiedni etap wytwarzania zeaksantyny, wówczas hodowle kontynuuje sie w temperaturze 22—25?C przy ciaglym natlenieniu srodowiska, utrzymujac jednoczesnie zawartosc substancji sta¬ nowiacej zródlo wegla na poziomie 15—35 mg/ml przy jednoczesnym zachowaniu zasadniczo stalego stosunku miedzy ilosciami substancji stanowiacych zródla wegla i azotu. Najdogodniej jest to przepro¬ wadzic przez ciagle dodawanie srodowiska odzyw¬ czego o stalym skladzie, zawierajacego substancje stanowiace zródlo wegla i azotu w odpowiednich ilosciach i stalym stosunku wagowym wegla do azotu, korzystnie w granicach od 1,6:1 do 3,4:1.Przy zastosowaniu korzystnego sposobu postepo¬ wania, obejmujacego prowadzenie pierwszego etapu hodowli w srodowisku zawierajacym wiecej niz 35 mg/ml substancji bedacej zródlem wegla, za¬ wartosc tej substancji spada stopniowo w srodo¬ wisku na skutek zuzywania jej przez drobno¬ ustroje.Zaobserwowano, ze szczególnie korzystne steze¬ nie poczatkowe substancji bedacej zródlem we¬ gla wynosi od 6 do 8% wagowych poniewaz po- . czatek stadium wzrostu i wytwarzania zeaksantyny 5 zbiega sie mniej wiecej z czasem, w jakim za¬ wartosc substancji, bedacej zródlem wegla spada do wartosci 15—35 mg/ml, wymaganej w drugim sta¬ dium hodowli. Inaczej mówiac, przez rozpoczecie pierwszego etapu hodowli w srodowisku zawiera¬ jacym 6—8% wagowych substancji bedacych zród¬ lem wegla, uzyskuje sie stezenie tej substancji odpowiednie dla drugiego etapu w tym samym czasie, jak osiagniecie odpowiedniej fazy wzrostu komórek i wytwarzania zeaksantyny. Tak wiec drugi etap hodowli mozna rozpoczynac bezposred¬ nio po pierwszym, W tym etapie pH pozywki hodowlanej utrzy¬ muje sie w granicach od 6,5 do 8,0, najkorzystniej od 7,0 do 7,5. Wartosc pH mozna regulowac przez dodawanie substancji alkalicznych, takich jak np. wodne roztwory wodorotlenku sodowego, wodoro¬ tlenku potasowego lub wodorotlenku amonowego, badz tez gazowego amoniaku. Dwie ostatnie sub¬ stancje sa szczególnie korzystne, poniewaz stano¬ wia one jednoczesnie zródlo azotu aminowego przyswajalnego przez drobnoustroje.Hodowle kontynuuje sie nastepnie przez okres odpowiedni do otrzymania w pozywce znaczniej¬ szych ilosci zeaksantyny. Hodowle mozna równiez kontynuowac po zaprzestaniu dodawania substancji odzywczych. Srodowisko wówczas bedzie ulegalo zmianom na skutek zuzywania substancji odzyw¬ czych przez drobnoustroje.Wyniki badan eksperymentalnych wykazaly, ze przy prowadzeniu hodowli drobnoustroju w spo¬ sób wedlug wynalazku, wytwarzanie zeaksantyny jest znacznie wieksze niz w przypadku hodowli tych samych mikroorganizmów, prowadzonej w spo¬ sób konwencjonalny.Po zakonczeniu hodowli bulion fermentacyjny mozna zatezyc, a zeaksantyne wyekstrahowac z ko¬ mórek, np. za pomoca polarnych rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton lub etanol, badz tez chlorowanych rozpuszczalników, jak chloro¬ form.Alternatywnie, biomase mozna wydzielic z po¬ zywki hodowlanej, np. na drodze wirowania, de- kantacji lub filtracji. Biomase te mozna nastepnie uzyc np. jako dodatek do pozywienia dla kurczat lub tez mozna poddac ekstrakcji za pomoca polar¬ nych rozpuszczalników organicznych. Szczególnie cenne rezultaty uzyskuje sie przez hodowanie w opisany wyzej sposób mutantów wytworzonych przez dzialanie l-metylo-3-nitro-l-nitrozo-quanidy- ny, oznaczanej dalej jako NTG na bakterie rodzaju Flavobacter, przy zastosowaniu nowej metody wy¬ wolywania mutacji polegajacej na dzialaniu NTG na bakterie w zestalonej pozywce.Mutant wytwarzajacego zeaksantyne drobno¬ ustroju rodzaju Flavobacter mozna uzyskac np. przez rozcienczenie kultury mikroorganizmu w sterylnym roztworze fizjologicznym i zmiesza¬ nie roztworu w odpowiednich ilosciach na szalce Petri'ego z wodnym roztworem NTG. Mozna np. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6078 558 zastosowac taka sama objetosc wodnego roztworu NTG, zawierajacego od 1 do 10 mg tej substancji w 1 ml. Stopiony agar wlewa sie nastepnie do roztworu i starannie miesza. Po zestaleniu sie agaru uzyskane stale srodowisko utrzymuje sie w inkubatorze, np. w temperaturze 25—28°C, az do czasu pojawienia sie kolonii bakterii w zestalo¬ nej pozywce. Kolonie te nastepnie zbiera sie i wie¬ lokrotnie nanosi na stala odzywke.Otrzymany mutant mozna nastepnie poddac jednorazowej lub wielokrotnej obróbce w zestalo¬ nej odzywce, celem wywolania mutacji.Wyniki doswiadczen wykazuja, ze opisany spo¬ sób wywolywania mutacji, prowadzony w zesta¬ lonej odzywce za pomoca mutagenów jak NTG, powoduje powstanie z bakterii typu Flavobacter mutantów, które wytwarzaja w identycznych wa¬ runkach hodowli znacznie wieksze ilosci zeaksan- tyny niz mozna uzyskac od mutantów wytworzo¬ nych konwencjonalnymi metodami z tych samych bakterii i przy uzyciu tej samej substancji wywo¬ lujacej mutacje.Sposób wedlug wynalazku zilustrowano poniz¬ szymi przykladami, w których podane procenty sa procentami wagowymi.Przyklad I. Ze szczepu bakterii rodzaju Fla- vobacter (ATCC Nr 21588) wytworzono kulture, która zaszczepiono w ilosci 5% w wodnym srodo¬ wisku odzywczym w tanku fermentacyjnym. Srodo¬ wisko odzywcze uprzednio wysterylizowano w tem¬ peraturze 120°C przez okres 40 minut i ochlodzono do temperatury 28°C, oraz doprowadzono jego pH za pomoca amoniaku do wartosci pomiedzy 6,9 i 7,1.Srodowisko to mialo nastepujacy sklad: glukoza (oddzielnie sterylizowana w roztworze stezonym) 7,0°/o ekstrakt kukurydziany 1,6% hydrolizat kazeinowy (trypton) 0,8% ekstrakt drozdzowy 1,8% siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% Drobnoustroje hodowano w tanku fermentacyj¬ nym w temperaturze 28°C przy energicznym na¬ powietrzaniu i mieszaniu, utrzymujac stale pH srodowiska w granicach 7,2—7,3 przez automatyczne dodawanie rozcienczonego wodnego roztworu amo¬ niaku.W opisanych warunkach hodowla obejmowala faze inicjacji od 6 do 7 godzin, zas wytwarzanie zeaksantyny rozpoczelo sie po uplywie 14 godzin od rozpoczecia hodowli.Gdy stezenie glukozy w srodowisku fermentacyj¬ nym spadlo stopniowo do wartosci 25 mg/ml, to jest po 24 godzinach od rozpoczecia hodowli, tem¬ perature srodowiska obnizono do 24°C. Jednoczesnie w tanku fermentacyjnym rozpoczeto stopniowe do¬ dawanie substancji odzywczej, uprzednio wystery- lizowanej w oddzielnym zbiorniku, której pH usta¬ lono na 7,2. Substancje te wprowadzano z taka szybkoscia, aby stezenie glukozy w srodowisku pozostawalo zasadniczo stale. Kompozycja odzyw¬ cza miala sklad nastepujacy: 10 15 20 25 glukoza 32% ekstrakt kukurydziany 4,7% hydrolizat kazeinowy (trypton) 4,3% ekstrakt drozdzowy 5,5% woda wodociagowa do 100% Stopniowe dodawanie tej substancji kontynuo¬ wano przez okres 20 godzin, utrzymujac tempera¬ ture srodowiska 24°C. Po calkowitym okresie ho¬ dowli (50 godzin), okreslono zawartosc zeaksantyny w srodowisku fermentacyjnym. W tym celu wy¬ dzielono z substancji odzywczej biomase na drodze wirowania, a zeaksantyne ekstrahowano z komórek za pomoca acetonu. Zawartosc zeaksantyny w roz¬ tworze acetonowym okreslono kolorymetrycznie, porównujac zabarwienie roztworu ze standartowy¬ mi roztworami syntetycznej zeaksantyny w tym sa¬ mym rozpuszczalniku. Stwierdzono, ze zawartosc zeaksantyny w srodowisku fermentacyjnym wyno¬ sila 20 //g/ml.W celach porównawczych ten sam szczep bakterii hodowano metoda konwencjonalna. Zaszczepiono go w ilosci 5% objetosciowych w takiej samej ilosci srodowiska odzywczego. Srodowisko to, uprzednio wysterylizowane i ochlodzone do temperatury 28°C o pH ustalonym miedzy 6,9—7,1 mialo nastepujacy sklad: glukoza 10,0% ekstrakt kukurydziany 1,85% hydrolizat kazeinowy (trypton) 1,25% ekstrakt drozdzowy 2,1% siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% Hodowle prowadzono przy energicznym napo¬ wietrzaniu i mieszaniu, utrzymujac stale pH po¬ miedzy 7,2—7,3. Faza inicjacji hodowli wynosila 8 godzin, zas wytwarzanie zeaksantyny rozpoczelo sie po 15 godzinach hodowli. Temperature srodo¬ wiska doprowadzono do 24°C po 24 godzinnej ho¬ dowli. Po 55 godzinnej hodowli okreslono, w uprzed¬ nio opisany sposób, zawartosc zeaksantyny w sro¬ dowisku fermentacyjnym. Wynosila ona 12 /^g/ml.Przyklad II. Wytworzono kulture szczepu bakterii rodzaju Flavobacter (ATCC Nr 21081) w wodnym srodowisku odzywczym o pH = 6,5, które mialo nastepujacy sklad: glukoza 3,0% ekstrakt drozdzowy 1,0% hydrolizat kazeinowy (trypton) 1,0% siarczan magnezu 0,5% woda wodociagowa do 100% Kulture te, zawierajaca 5 g komórek mikroorga¬ nizmu na 1 litr srodowiska odzywczego rozcien¬ czono nastepnie w stosunku 1:108 (objetosciowo) za pomoca sterylnego roztworu fizjologicznego, za¬ wierajacego 0,9% wagowego chlorku sodu. 1 ml tego roztworu starannie zmieszano na szalce Petri'ego z 1 ml wodnego roztworu, zawierajacego 60 £ mg NTG/ml. 10 ml stopionego agaru dodano do roztworu i oba skladniki starannie wymieszano.Po zestaleniu sie agaru szalke Petri'ego utrzymy¬ wano w temperaturze 25—28°C, az do pojawienia sie kolonii bakterii w zestalonej pozywce to jest 65 przez 2—4 dni. Kolonie te nastepnie usunieto 35 40 45 50 5578 558 z szalki Petri'ego i naniesiono w wielu kolejnych etapach na stala pozywke agarowa, nie zawierajaca NTG.Uzyskany szczep mutanta zaszczepiono nastepnie w ilosci 5% objetosciowych do 100 ml sterylnego srodowiska odzywczego o pH = 6,5, które mialo nastepujacy sklad: glukoza 3,0% ekstrakt drozdzowy 1,0% hydrolizat kazeinowy (trypton) 1,0% siarczan magnezu 0,5% woda wodociagowa do 100% Drobnoustroje te hodowano przy dostepie po¬ wietrza w srodowisku w temperaturze 28°C przez okres 24 godzin, a nastepnie kulture te zaszcze¬ piono powtórnie w 2 1 srodowiska odzywczego o tym samym skladzie. Po 24 godzinnej fermentacji w tych samych warunkach, kulture te zaszczepiono w ilosci 5% objetosciowych w wodnym roztworze srodowiska odzywczego w tanku fermentacyjnym.Srodowisko odzywcze, które uprzednio wysterylizo- wano w temperaturze 120°C przez okres 40 minut, a nastepnie ochlodzono do temperatury 28°C, mialo pH doprowadzone przez dodanie amoniaku do wartosci 6,9—7,1. Srodowisko to mialo nastepujacy sklad: glukoza 7,0% ekstrakt kukurydziany 1,6% hydrolizat kazeinowy (trypton) 0,8% ekstrakt drozdzowy 1,8% siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% Hodowle prowadzono w tanku fermentacyjnym w temperaturze 28°C przy energicznym napowie¬ trzaniu i mieszaniu, automatycznie utrzymujac pH srodowiska pomiedzy 7,2—7,3. Obserwowano wstepna, powolna faze wzrostu przez okres 5 do 6 godzin, zas wytwarzanie zeaksantyny rozpoczelo sie po uplywie 12 godzin od rozpoczecia hodowli.Kiedy stezenie glukozy w srodowisku spadlo stopniowo do wartosci 25 mg/ml, to jest po 22 go¬ dzinach od rozpoczecia hodowli, temperature sro¬ dowiska obnizono do 24°C i do tanku zaczeto do¬ prowadzac w sposób ciagly substancje odzywcza, która uprzednio wysterylizowano i której pH do¬ prowadzono do wartosci 7,2. Szybkosc dodawania tej substancji byla tak dobrana, aby zawartosc glukozy w pozywce hodowlanej pozostawala za¬ sadniczo stala. Substancja ta miala nastepujacy sklad: glukoza 32,0% ekstrakt kukurydziany 4,7% hydrolizat kazeinowy (trypton) 4,3% ekstrakt drozdzowy 5,5% woda wodociagowa do 100% Ciagle dodawanie substancji odzywczej konty¬ nuowano przez okres 20 godzin, utrzymujac srodo¬ wisko w temperaturze 24°C.Po calkowitym okresie hodowli (48 godzin), steze¬ nie glukozy w srodowisku zmniejszono do 5 mg/ml i sposobem opisanym w przykladzie I, okreslono zawartosc zeKksantyny w roztworze. Wynosila ona 335 jug/rril. 15 Przyklad III. Mutant szczepu Flavobacter (ATCC Nr 21081) wytworzono sposobem opisanym w przykladzie II.Szczep mutanta zaszczepiono nastepnie w ilosci 5 4% objetosciowych w tanku fermentacyjnym, za¬ wierajacym wodne srodowisko odzywcze, uprzednio wysterylizowane w temperaturze 1200C przez okres 40 minut i ochlodzone do temperatury 28°C. Sro¬ dowisko odzywcze, którego pH doprowadzono za 10 pomoca amoniaku do wartosci pomiedzy 6,9—7,1, mialo nastepujacy sklad: glukoza 7,0% ekstrakt kukurydziany 1,6% hydrolizat z orzeszków ziemnych 0,7% ekstrakt drozdzowy 2,0% siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% 20 Mikroorganizmy hodowano w tanku fermenta¬ cyjnym w temperaturze 28°C w sposób opisany w przykladzie II.Gdy stezenie glukozy w pozywce hodowlanej osiagnelo wartosc 25 mg/ml, temperature pozywki 25 obnizono do 24°C i rozpoczeto ciagle dodawanie substancji odzywczej, uprzednio wysterylizowanej, której pH doprowadzono do wartosci 7,2. Szybkosc dodawania tej stibstancji utrzymywano taka, aby stezenie glukozy pozostawalo zasadniczo stale. 30 Substancja odzywcza miala nastepujacy sklad: glukoza 32,0% ekstrakt kukurydziany 4,7% hydrolizat z orzeszków ziemnych 3,5% ekstrakt drozdzowy 6,0% 35 wada wodociagowa do 100% Dodawanie substancji odzywczej kontynuowano przez okres 20 godzin w temperaturze 24°C.Po calkowitym okresie hodowli, wynoszacym 51 godzin, stezenie glukozy w srodowisku zmniej¬ szono do 7,5 mg/ml. Stezenie zeaksantyny, okreslane w sposób opisany w przykladzie I, wynosilo 312 fig/ml.Przyklad IV. Kulture Flavobacterium aauatile ATCC Nr 11947 zaszczepiono w ilosci 5% do wod¬ nego srodowiska odzywczego, umieszczonego w tan¬ ku fermentacyjnym. Srodowisko to, uprzednio wy¬ sterylizowane w temperaturze 120°C przez okres 40 min i ochlodzone do temperatury 28°C posia- 50 dalo pH ustalone za pomoca amoniaku w grani- cach 6,9—7,1. Srodowisko odzywcze mialo nastepu¬ jacy sklad: glukoza 7,0% ekstrakt kukurydziany 1,6% 55 hydrolizat kazeinowy (trypton) 0,8% ekstrakt drozdzowy 1,8% siarczan magnezu , 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% 60 Drobnoustroje hodowano w tanku fermentacyj¬ nym w temperaturze 28°C przy energicznym napo¬ wietrzaniu i mieszaniu, utrzymujac stale pH srodo¬ wiska pomiedzy 7,2 i 7,3 przez automatyczne do¬ dawanie rozcienczonego wodnego roztworu amo- 65 niaku. 40 45£»558 9 10 Hodowla . prowadzona w opisanych warunkach obejmowala okres'zstepny £—7 godz. zas wytwa¬ rzanie zeaksantyny -rozpoczelo sie. po \ uplywie 14 godzin od rozpoczecia hodowli.••¦ Gdy stezenie glukozy :w srodowisku fermenta¬ cyjnym zmniejszylo sie .stopniowo - do wartosci 25 !jng/ml,. to. jest po 2 godzinach od rozpoczecia hodowli,^temperature srodowiska, obnizono; do 24QC i rozpoczeto ciagle dodawanie substancji odzywczej uprzednio wysterylizowanej w; oddzielnym zbiorni-r ku, której pH doprowadzono do wartosci 7,2.Szybkosc dodawania substancji odzywczej- utrzy¬ mywano taka, aby zawartosc glukozy w srodowisku pozostawala zasadniczo stala.: Substancja odzywcza miala nastepujacy sklad: .¦:•„¦¦ glukoza- : .: l. : 32,0% ekstrakt kukurydziany ¦¦'.- 4,7% hydrolizat kazeinowy (trypton) - -¦'¦-¦ 4,3% ekstrakt drozdzowy 5*5% woda wodociagowa .* do 100% "• Ciagle dodawanie substancji odzywczej kontynuo¬ wano przez okres 20 godzin, utrzymujac tempera¬ ture srodowiska 24°C. v Po calkowitym czasie hodowli (50 godzin), okres¬ lono zawartosc zeaksantyny w srodowisku fermen¬ tacyjnym metoda chromatografii cienkowarstwowej i spektroskopii w nadfiolecie.Zawartosc zeaksantyny w srodowisku fermenta¬ cyjnym wynosila 16 ^ag/ml.W celach porównawczych ten sam szczep bakterii hodowano metoda konwencjonalna. Zostal oh za¬ szczepiony w ilosci 5% objetosciowych do tej samej ilosci srodowiska odzywczego. Srodowisko uprzednio wysterylizowano i ochlodzono do temepratury 28°C, zas pH srodowiska doprawadzono do wartosci 6,9—7,1. Srodowisko to mialo nastepujacy sklad: glukoza 10,0% ekstrakt kukurydziany 1,85% hydrolizat kazeinowy (trypton) 1,25% ekstrakt drozdzowy 2,1% siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% Hodowle prowadzono przy energicznym napo¬ wietrzaniu i mieszaniu z ciagla regulacja pH " w granicach 7,2—7,3. Zaobserwowano okres wstepny wynoszacy 8 godzin, zas wytwarzanie zeaksantyny rozpoczelo sie po uplywie 15 godzin od rozpocze¬ cia hodowli. Temperature srodowiska obnizono do 24°C po 24 godzinach od rozpoczecia hodowli. Po uplywie 55 godzin od rozpoczecia hodowli okreslo¬ no, w opisany wczesniej sposób, zawartosc zeak¬ santyny w srodowisku fermentacyjnym; wynosila ona 12 uig/ml.Przyklad V. Prowadzono hodowle Flavobac- terium aauatile ATCC Nr 1194 w wodnym srodo¬ wisku odzywczym, którego pH wynosilo 6,5. Srodo¬ wisko to mialo nastepujacy sklad: glukoza 3,0% ekstrakt drozdzowy 1,0% hydrolizat kazeinowy (trypton) 1,0% siarczan magnezu 0,5% woda wodociagowa do 100% -o Kulture te, zawierajaca 5 g komórek droJ?np- u^toeft na 1 litr .srodowiska odzywczego rozcten- azono? -nastepnie^w stosunku ^1:108 (objetosciowo) za pomoca;.ster^Jnego roztworu fizjologicznego, za- 5 wierajacego 0,90/o'.wagQWY;ck chlorku sodowego.Na szalce Petri'ego starannie zmieszano 1 ml te¬ go roztworu;z 1 ml roztworu wodnego.* zawieraja¬ cego 5 mg NTG/ml. Nastepnie dodano 10 ml sto¬ pionego , agaru i agar -wymieszano starannie : z rpz- io tworem, .Pp zestaleniu . sie agaru, szalke Petri'ego utrzymywano w temperaturze 25^-28°|C, az do czasu pojawienia sie, kolonii bakterii w zestalonej pozywce, to. jest. przez 2—4 dni. Kolonie te na¬ stepnie .usunieto z szalki : Petr^ego i naniesiono 15 w szeregu; kolejnych, operacji na.Sitala pozywke agarowa, :pozbawiona . NTG. Wytworzony .szczep mutanta zaszczepiono nastepnie w. ilosci 5%i:pbje- toscioswych:rdo 100 ml sterylnego srodowiska odzyw- czego p pJjT— 6,5, które mialo ^nastepujacy sklad: 20 glukoza ...;¦¦"¦¦ '•3,8,/r ekstrakt drozdzowy 1$% hydrolizat kazeinowy (trypton) .,;¦.-, -1|6%. siarczan magnezu 0,5% woda wodociagowa ,. do 100% 25 Drobnoustroje hodowano przy dostepie tleniu w tym samym srodowisku w temperaturze 28°C przez okres 24r godzin, a nastepnie kulture zaszcze¬ piono do 2 1 srodowiska odzywczego o tym samym skladzie. 30 Po 24 godzinnej fermentacji w tych samych warunkach* te ostatnia kulture zaszczepiono po¬ wtórnie w ilosci 5% objetosciowych w wodnym srodowisku odzywczym, umieszczonym w tanku fermentacyjnym. Srodowisko to uprzednio wy- 35 sterylizowano w temperaturze 120°C przez okres 40 minut i ochlodzono do temperatury 28°C, a jego pH doprowadzono przez dodanie amoniaku do war¬ tosci 6,9—7,1. Srodowisko odzywcze mialo nastepu¬ jacy sklad: 40 glukoza (oddzielnie sterylizowana w roztworze stezonym) 7,0% ekstrakt kukurydziany 1,6% hydrolizat kazeinowy (trypton) 0,8% ekstrakt drozdzowy 1,8% 45 siarczan magnezu 0,5% olej kukurydziany 0,08% woda wodociagowa do 100% Gdy stezenie glukozy w srodowisku spadlo stop- niowo do wartosci 25 mg/ml, to jest po 22 godzi¬ nach od rozpoczecia hodowli, temperature srodo¬ wiska obnizono do 24°C i rozpoczeto ciagle do¬ dawanie substancji odzywczej, która uprzednio wy¬ sterylizowano i której pH doprowadzono do war- 55 tosci 7,2. Substancje odzywcza dodawano z taka szybkoscia, aby stezenie glukozy w srodowisku po¬ zostawalo zasadniczo stale. Substancja odzywcza miala nastepujacy sklad: glukoza 32,0% eo ekstrakt kukurydziany 4,7% hydrolizat kazeinowy (trypton) 4,3% ekstrakt drozdzowy 5,5% woda wodociagowa do 100% Ciagle dodawanie substancji odzywczej konty- 65 nuowano przez okres 20 godzin, utrzymujac tern-78 558 11 12 perature srodowiska 24°C. Po sumarycznym czasie hodowli trwajacym 48 godzin, stezenie glukozy w srodowisku zmniejszono do 5 mg/ml i oznaczono zawartosc zeaksantyny sposobem opisanym w przy¬ kladzie IV. Wynosila ona 40 g/ml. PL PL

Claims

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania zeaksantyny przez hodo¬ wanie drobnoustrojów wytwarzajacych zeaksantyne rodzaju Flavobacter lub jej mutanta, znamienny tym, ze drobnoustrój hoduje sie w srodowisku od¬ zywczym przy pH = 6,5—8,0 do momentu uzyskania komórek w stadium wzrostu i do rozpoczecia wy¬ twarzania zeaksantyny, a nastepnie komórki te hoduje sie dalej, w temperaturze 22—25°C z od¬ powiednim natlenieniem, w wodnym srodowisku odzywczym zawierajacym co najmniej jeden weglo¬ wodan w stezeniu 15—35 mg/ml jako zródlo przy¬ swajalnego wegla, oraz co najmniej jedno zródlo przyswajalnego azotu aminowego, zawierajace wolne aminokwasy, przy czym w czasie hodowli ilosc substancji stanowiacych zródla wegla i azotu utrzymuje sie w stalym stosunku przez ciagle ich dodawanie, a hodowle prowadzi sie do momentu wytworzenia zeaksantyny w odpowiedniej ilosci.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako weglowodan stosuje sie glukoze, laktoze lub sacharoze.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze jako zródlo azotu aminowego stosuje sie co naj- 10 15 20 30 mniej jedna substancje taka jak amoniak, ekstrakt kukurydziany, ekstrakt drozdzowy, hydrolizat bialkowy i hydrolizat biomasy z hodowli mikro¬ organizmów rodzaju Flavobacter.

4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze drobnoustroje hoduje sie najpierw w srodowisku odzywczym zawierajacym wiecej niz 35 mg/ml sub¬ stancji bedacej zródlem przyswajalnego wegla za¬ wierajacej co najmniej jeden weglowodan, na¬ stepnie pozwala sie na zmniejszenie zawartosci weglowodanu do wartosci pomiedzy 15 i 35 mg/ml i kontynuuje sie dalej hodowle w temperaturze 22—25°C.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke hodowlana zawierajaca na po¬ czatku hodowli 6—8% substancji bedacej zródlem przyswajalnego wegla.

6. Sposób wedlug zastrz. 1—5, znamienny tym, ze podczas hodowli dodaje sie sukcesywnie sub¬ stancje bedaca zródlem wegla i azotu we wzajem¬ nym stosunku wagowym 1,6 : 1—3,4 : 1.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie mutant uzyskany w wyniku dzialania 1-metylo-3-nitro-l^nitrozoguanidyny na bakterie rodzaju Flavobacter w zestalonej pozywce.

8. Sposób wedlug zastrz. 1—7, znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie szczep Flavobacter ATCC Nr 21081 lub Flavobacter ATCC Nr 21588.

9. Sposób wedlug zastrz. 1—8, znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie szczep Flavobacterium aauatile ATCC Nr 11947. CZYiELNIA Urzedu Patentowego Mifclil laczrpossi' ej u.isfcj Cena 10 zl R.Z.G. — 118C/75 110 egz. form. A-4 PL PL