Pierwszenstwo: 15.YI.1965 Szwajcaria Opublikowano: 30.VIII.1968 56067 KI. 30 h, 2/10 MKP A 61 k Jtffc UKD Wlasciciel patentu: CIBA Societe Anonyme, Bazylea (Szwajcaria) Sposób wytwarzania preparatów adrenokortikotropowych Znany jest sposób przedluzania okresu dzialania peptydów o wlasciwosciach adrenokortikotropo¬ wych polegajacy na tym, ze peptydy przeprowadza sie w kompleksowe zwiazki z metalami, na przy¬ klad kompleksy z wodorotlenkiem cynku, fosfo¬ ranem cynku lub pyrofosforanem cynku. Pewne preparaty kortikotropinowe maja jednak te wade, ze wywoluja alergie.Stwierdzono, ze mozna wydatnie przedluzyc okres adrenokortikotropowego dzialania wspom¬ nianych peptydów i uzyskac ich dobra tolerancje przez organizm, jezeli peptydy te przeprowadza sie w kompleksy z polimerami lub kopolimerami aminokwasów, które zawieraja przewaznie a-ami- nokwasy, takich jak kwas glutaminowy lub kwas asparginowy w odmianie L, D lub DL.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia preparatów adrenokortikotropowych, zawiera¬ jacych peptydy dzialajace adrenokortikotropowo lub sole albo pochodne tych peptydów, wraz z po¬ limerami lub kopolimerami aminokwasów, które zawieraja przewaznie a-aminokwasy.Preparaty te wytwarza sie przez mieszanie pep¬ tydów o dzialaniu adrenokortikotropowym lub soli albo pochodnych tych peptydów z polimerami lub kopolimerami aminokwasów, zawierajacych glów¬ nie rego dodaje sie ewentualnie inne dodatki takie jak srodki konserwujace, sublinrujace lub opózniajace.Jako ewentualne dodatki stosuje sie na przyklad 10 25 30 fizjologicznie dopuszczalne, trudno rozpuszczalne sole metali i/lub wodorotlenki metali, takie jak wodorotlenek cynku, fosforan cynku, pyrofosforan cynku, fosforan glinowy, wodorotlenek glinowy lub fosforan magnezowy, fosforan polifloretyny, zela¬ tyna lub mieszaniny powyzszych substancji.W przypadku dodawania trudno rozpuszczalnych soli metali lub wodorotlenków metali korzystnie jest do mieszaniny peptydu z polimerem dodawac w pierwszej kolejnosci odpowiednia sól rozpusz¬ czalna taka jak na przyklad chlorek cynku, siar¬ czan cynku lub octan cynku, a nastepnie rozpu¬ szczony w wodzie wodorotlenek lub sól metaliczna w ilosci potrzebnej do wytracenia odpowiedniego wodorotlenku lub soli.Jako peptydy o dzialaniu andrenokortikotropo- wym stosuje sie na przyklad: naturalny ACTH (0 i—39-kortikotropina), jak równiez peptydy w lan¬ cuchu aminokwasów krótszym niz lancuch 01—39- -kortikotropinyj Wiadomo, ze z karboksylowego konca natural¬ nego ACTH mozna odszczepic aminokwasy az do 16-tego aminokwasu, a przy tym dzialanie ACTH . nie zostaje calkowicie zniweczone. Mozna równiez poszczególne aminokwasy zastepowac innymi, na przyklad reszty serynowe seryna1 i/lub seryna3 mozna zastepowac glicyna lub alanina, tyrozyne2 fenyloalanina, metionine4 norwalina, leucyna lub kwasem a-aminomaslowym, kwas glutaminowy5 glutamina, alanine17'18 ornityna lub lizyna. Pierw- 5606756067 szy aminokwas, seryna1, moze byc zastapiony przez proline, treonine lub inne aminokwasy, moze nie wystepowac wcale lub moze byc poprzedzony przez inne reszty aminokwasów.Wynalazek dotyczy zwlaszcza wytwarzania pre¬ paratów z takich peptydów, które maja lancuch o 19—28 aminokwasach, zwlaszcza 20—25, liczac od koncowej grupy aminowej P-kortikotropiny i wykazuja ewentualnie nieco inny zestaw amino¬ kwasów niz iP-kortikotropina, zwlaszcza w odnie- - sieniu do jednego lub kilku aminokwasów 1—5,17 * i.i\l8, a przede wszystkim z p^kortikotropiny.Jako sole peptydów o dzialaniu adrenokortiko- tropowym stosuje sie zgodnie z wynalazkiem zwla¬ szcza addycyjne sole z kwasami, znajdujacymi zastosowanie w lecznictwie, takimi, jak kwais sol¬ ny, octowy, siarkowy, kwasy fosforowe i sulfo¬ nowe.Pod pojeciem pochodnych peptydów rozumiec na¬ lezy przede wszystkim amidy, a zwlaszcza amidy niepodstawione.Jako polimery i kopolimery kwasnych amino¬ kwasów stosuje sie glównie polimery kwasu glu¬ taminowego i/lub kwasu asparaginowego i ewen¬ tualnie innych a-aminokwasów, jak glicyna, wali- na i leucyna.Zwiazki te maja w bocznych lancuchach wolne grupy karboksylowe. Koncowa grupa karboksylo¬ wa moze byc ewentualnie podstawiona na przy¬ klad zestryfikowana albo w postaci grupy amido¬ wej nie podstawionej lub podstawionej na przy¬ klad rodnikiem weglowodorowym, zwlaszcza niz¬ szymi rodnikami alkilowymi. Mery moga miec konfiguracje L lub D albo DL. Ciezar czasteczko¬ wy polimerów moze wahac sie w granicach 1000— 100000, na przyklad 5000—50000; a zwlaszcza 1000O—40000. Korzystnie jest stosowac polimery w postaci rozpuszczalnej w wodzie, fizjologicznie do¬ puszczalnej soli, takiej jak na przyklad /sól sodo¬ wa lub amonowa albo sól z zasada organiczna, ta¬ ka jak trójetyloamina, prokaina, dwubenzyloamina lub inne trzeciorzedowe zasady azotowe.Polimery powyzsze sa znane i wytwarza sie je za pomoca znanych sposobów, na przyklad meto¬ da M. Idelson i in., J.Am. Chem. Soc. 80, 4631 (1958), polegajaca na poddaniu reakcji estru y-ben- zylowego bezwodnika kwasu a-karboksyglutami- nowego lub odpowiedniego estru III-rzedowego butylowego w srodowisku dioksanu z amoniakiem lub amina w okreslonym stosunku molowym, na przyklad 100 :1, zaleznie od zadanego jstopnia po¬ limeryzacji. Po ukonczonej polimeryzacji odszcze- pia sie grupy ochronne takie jak na przyklad grupa benzylooksy- przez dzialanie bromowodoru w lodowatym kwasie octowym lub grupa bu- tylooksy- przez dzialanie kwasem trójfluoroocto- wym. Polimery o jednolitej, okreslonej dlugosci lancucha otrzymuje sie stosujac synteze oparta na metodach znanych w chemii peptydów (metoda karbodwuimidowa, azydowa itd.).Preparaty otrzymuje sie w postaci roztworów lub zawiesin. Podaje sie je domiesniowo lub do¬ zylnie.Sposób otrzymywania preparatów ' wedlug wy¬ nalazku wyjasniaja blizej nizej podane przyklady.Przyklad I. 2,0 g kwasu poli-L-glutamino- wego o srednim ciezarze czasteczkowym okolo 5 11000 rozpuszcza sie w okolo 5,7 ml 10% wodoro¬ tlenku ;sodowego tak, aby roztwór wykazywal wartosc pH = 7,4. Do tego roztworu dodaje sie 5,0 mg szesciooctanu ^-^-kortikotrópiny i 0,2 g etylorteciotiosalicylanu sodowego i dopelnia desty- io lowana woda do 10 ml. Roztwór saczy sie steryl¬ nie. Na 1 ml zawiera on: mg mg szesciooctanu ^-^-kortikotropiny 0,5 kwasu poli L-glutaminowego 200,0 15 wodorotlenku sodowego do wartosci pH = 7,4 etylorteciotiosalicylanu sodowego 0,02 mg wody destylowanej do l|o ml 20 Przyklad II. 2,0 g kwasu poli-L-glutami¬ nowego o ciezarze czasteczkowym okolo 11000 rozpuszcza ;sie w okolo 5,7 ml 10% wodorotlenku sodowego tak, aby roztwór wykazywal wartosc pH = 7,4. W roztworze tym rozpuszcza sie 5,0 mg 25 szesciooctanu ^-^kortikotropiny i 0,2 mg etylo¬ rteciotiosalicylanu sodowego. Do otrzymanego roz¬ tworu dodaje sie. 1 ml roztworu chlorku cynku zakwaszonego kwasem solnym do wartosci pH = 2,8 i zawierajacego w 1 ml 5,2 g chlorku 30 cynku. Do roztworu dodaje sie nastepnie tyle wo¬ dorotlenku sodowego, aby uzyskac wartosc pH = 7,8, po czym dopelnia sie destylowana woda do objetosci 10 ml.Przyklad III. 2,0 g kwasu poli-L-glutami- 35 nowego o ciezarze czasteczkowym okolo 11000 roz¬ puszcza sie w okolo 5,7 ml 10% roztworu wodoro¬ tlenku sodowego tak, aby roztwór wykazywal war¬ tosc pH = 7,4. W roztworze tym rozpuszcza sie 5,0 mg szesciooctanu (31—24-kortikotropiny i 0,2 ety- 40 lorteciotiosalicylanu sodowego, a nastepnie dodaje 1 ml roztworu chlorku cynku zakwaszonego kwa¬ sem solnym do wartosci pH = 2,8, zawierajacego w 1 ml 5,2 chlorku cynku oraz 0,85 mg bezwod¬ nego fosforanu dwusodowego. Do roztworu dodaje 45 sie tyle wodorotlenku sodowego, aby uzyskac war¬ tosc pH = 7,8, po czym dopelnia sie destylowana woda do objetosci 10 ml.Przyklad IV. 5 mg kwasu poli-L-glutami- nowego o srednim ciezarze czasteczkowym 39600 50 rozpuszcza sie w 5 ml 0,1 n roztworu wodorotlen¬ ku sodowego, przesacza roztwór i dodaje don roz¬ twór 0,25 mg szesciooctanu (31—24-kortikotropiny, zakwasza kwasem octowym lub kwasem solnym do wartosci pH = 4 i dopelnia woda destylowana 55 do 10 ml. Wytraca sie przy tym silnie rozdrobnio¬ ny kompleks kwasu poli-L-glutaminowego i p1—24- -kortikotropiny. Zawiesina zawiera w 1 m 0,5 mg tego zwiazku kompleksowego.Przyklad V. Postepujac w sposób opisany 60 w przykladzie IV, lecz stqsujac kwas poli-L-glu- taminowy o srednim ciezarze czasteczkowym 11000, sporzadza sie zawiesine, zawierajaca w 1 ml 0,5 mg kwasu poli-L-glutaminowego i 0,25 mg P1—24-kortikotropiny w postaci zwiazku komplekso- 65 wego.56067 5 W sposób opisany w poprzednich przykla¬ dach wytwarza sie preparaty, które jako peptyd o dzialaniu adrenokortikotropowym za- 5. wieraja fl1—l7-kortikotropine p1—"-kortikotmopino- -arg17—amid, P1—18-kortikotropine, P1—18-korti- ' 5 kotropino-arg18-amid, 01—19-kortikotropine, p1—l9- kortikotropino-prol9-amid, glu (NI^)5-?1—19- 6. -kortikotropine, P1—^-kortikotropino-wal^-amid, a- aminobutyrylo4-glu (NH2)5-Pu-20-kortikotropinó- -wal^-araiid, a-aminobutyrylo4^1—^-kortikotropi- 10 no-wal^-amid, p1—21-kortikotropine, Pl—^-kortiko- tropine, P1—^-kortikotropino-tyr^-amid, fe2^1—23- 7. -kortikotropino-tyr^-amid, ala3-P^-23-kortikotropi- no-tyr23-amid, gli1-p1—^-kortikotropino-tyr^-amid, p—^-kortikotropino-tyr^-amid, glu (NIL^-P1-24- -kortikotropine, orn17'18 P1—^-kortikotropine,liz17*18, g P1—24Hkortikotropine, norleu4^1—24-kortikotropine, P1—25-kortikotropino-wal25-amid, norleu4^1—^-kor- tikotropino-wal25-amid, norleu^wal^-P1—25-korti- kotropino-wal25-amid, norwa^-wal25^1—25-kortiko- tropino-wal25-amid, norleuMiz 17»18-wal^-p^-^-kor* tikotropino-wal25-amid, P1—^-kortikotropine, p1—28- -kortikotropine, p1—^-kortikotropine, p1—31-kortiko- tropine, p1—^-kortikotropine lub gli* P1—^-kortiko- tropine. ^ PL