Opublikowano: 20.IIL1968 54942 KI. 30 h, 6 MKP A 01 h Wspóltwórcy wynalazku: John Vandeputtef Urs F. Nager Wlasciciel patentu: E. R. Sauibb and Sons, Inc., Nowy Jork (Stany Zjed¬ noczone Ameryki) Sposób ekstrahowania nystatyny z grzybni wyodrebnionej z brzeczki fermentacyjnej Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrahowa¬ nia nystatyny z grzybni wyodrebnionej z brzeczki fermentacyjnej.Nystatyna jest antybiotykiem, wytwarzanym przez hodowle Streptomyces noursei w jalowym, cieklym srodowisku odzywczym, zawierajacym przyswajalny wegiel i azot. Znany sposób wyodrebniania nystaty¬ ny polega na tym, ze ze srodowiska odzywczego od¬ dziela sie grzybnie i ekstrahuje ja nizszym alkoho¬ lem lub nizszym alkiloketonem, po czym z wyciagu wyosabnia sie nystatyne. Sposób ten jest jednak dosc skomplikowany, gdyz obejmuje wiele czyn¬ nosci, a wydajnosc produktu zazwyczaj jest mala, gdyz wynosi 35—50% wydajnosci teoretycznej, przy czym otrzymuje sie nystatyne o mocy do okolo 200 jednostek na 1 mg.Sposób wedlug wynalazku nie ma opisanych wad i umozliwia uzyskiwanie nystatyny z wieksza wy¬ dajnoscia i o wyzszej czystosci. Sposób ten polega na ekstrahowaniu nystatyny z wilgotnej od wody grzybni, wyosobnionej z brzeczki fermentacyjnej, zawierajacej nystatyne. Ekstrakcje te prowadzi sie za pomoca nizszego alkanolu, korzystnie metanolu, kwasu organicznego, takiego jak: kwas szczawiowy, malonowy, bursztynowy lub cytrynowy, równiez ko- Tzystnie za pomoca kwasu mineralnego, takiego jak: kwas solny lub kwas siarkowy oraz aminy, takiej jak: pierwszo-, drugo-, lub trzeciorzedowa alkilo- lub hy- droksyalkiloamina z nizszym rodnikiem alkilowym, na przyklad za pomoca metyloaminy, etanoloaminy, 2 dwumetyloaminy, dwuetyloaminy lub metyloetanolo- aminy, najkorzystniej jednak za pomoca trójhydro- ksy- lub trójalkilo-, jak trójmetylo-, trójetylo- lub trójetanoloaminy, przy czym dobiera sie taki stosunek 5 kwasu i aminy, aby otrzymany roztwór byl zasadni¬ czo obojetny i wykazywal wartosc pH okolo 6,0— —6,5, korzystnie 6,0—6,2 i nastepnie wyodrebnia sie nystatyne rozpuszczona w tym roztworze.Poddawana ekstrakcji wyjsciowa grzybnie z anty- jo biotykiem otrzymuje sie przez odsaczenie jej lub odwirowanie z brzeczki fermentacyjnej, korzystnie z uprzednio dodanym pomocniczym materialem fil¬ tracyjnym, na przyklad Hyflo. Przesacz odrzuca sie, a z wyosobnionej, wilgotnej grzybni ekstrahuje sie 15 nystatyne za pomoca ukladu: kwas, amina, alkanol.Kolejnosc dodawania poszczególnych skladników te¬ go ukladu jest wprawdzie dowolna, ale korzystnie jest rozpuszczac nystatyne traktujac grzybnie alka- nolem w obecnosci kwasu. Nadmiar kwasu jest wów- 20 czas zobojetniany amina po rozpuszczeniu nystatyny. _ W przypadku niektórych brzeczek fermentacyj¬ nych stwierdzono nieoczekiwanie, ze jezeli kwas i amine dodaje sie razem w postaci addycyjnej soli aminy z kwasem,, to i wtedy nystatyna jest rozpusz- 25 czana w alkanolu. Taki sposób jest bardzo korzystny, gdyz unika sie ewentualnego rozkladania nystatyny w srodowisku kwasnym. W zwiazku z tym, najko¬ rzystniej jest wedlug wynalazku stosowac jako uklad do ekstrahowania roztwór addycyjnej soli 80 trzeciorzedowej aminy, z kwasem mineralnym, na 5494254942 3 przyklad siarczanu trójetyloaminy lub lepiej siar¬ czanu trójetanoloaminy, w nizszym alkanolu.Ilosc dodawanego alkanolu nie jest zasadniczo ograniczona, jednak w celu calkowitego przeprowa¬ dzenia nystatyny z grzybni do fazy wddno-alkanolo- wej nalezy dodac co najmniej 2 ml alkanolu na 1 g wilgotnej grzybni. Poza tym, w celu unikniecia ko¬ niecznosci usuwania duzych ilosci rozpuszczalnika po etapie ekstrakcji, nie jest wskazane stosowac wiecej niz okolo 2,5 ml alkanolu na 1 g grzybni.Amine stosuje sie korzystnie w ilosci okolo 0,02— —0,05 ml na 1 ml alkanolu. Ilosc kwasu ustala sie tak, aby otrzymac zadane granice wartosci pH, jak wspomniano wyzej. Ilosc wody nie jest czynnikiem decydujacym, ale wskazane jest stosowac nie wie¬ cej iniz c*olo ^^z^IJKJOpdy na 1 ml alkanolu.Pb tfotfeniu- alkarj Ponizsze przyklady objasniaja blizej sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I, Do brzeczki fermentacyjnej, uzys¬ kanej w wyniku fermentacji Streptomyces noursei w wodnej pozywce z maczka sojowa 1 melasa, doda¬ je sie pomocniczego materialu filtracyjnego Hyflo w ilosci 4% wagowo/objetosc brzeczki, po czym od¬ sacza sie mieszanine i wyosabnia grzybnie. 200 g otrzymanej w ten sposób grzybni, zawierajacej nys¬ tatyne w ilosci 120200 jednostek na 1 g, dodaje sie do 1080 ml metanolu i mieszajac energicznie trak¬ tuje 40$-ówym kwasem siarkowym az do uzyskania wartosci pH=3. Miesza sie przy tej wartosci pH w ciagu 7 minut i nastepnie dodaje trójetyloaminy az do uzyskania wartosci pH=6,8. Przy tej wartosci pH miesza sie dalej w ciagu 10 minut, po czym od¬ sacza, przemywa osad na saczku 90$-owym roz¬ tworem wodnym metanolu i odsacza. Przesacz i po¬ pluczyny odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem do objetosci 55 ml i dodaje do 55 ml 40$-owego roztworu wodnego acetonu, ogrzanego uprzednio do temperatury 45—50°C. Nastepnie dodaje sie tyle trójetyloaminy, aby uzyskac pH=6,5 i przy powol¬ nym mieszaniu ogrzewa w ciagu l/2 godziny. Nastep¬ nie chlodzi sie mieszanine do temperatury pokojo¬ wej w ciagu okolo 45 minut i miesza w tej tempe¬ raturze w ciagu 1 godziny. Otrzymany krystaliczny produkt odsacza sie, przemywa 50 ml 40$-oweg© roz¬ tworu wodnego acetonu i nastepnie 100 ml ecetonu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Uzyskany pro¬ dukt zawiera 4500. jednostek nystatyny na 1 mg, a calkowita wydajnosc procesu, w przeliczeniu na nystatyne zawarta w suchej grzybni, wynosi 90$.Przyklad II. 200 g grzybni, otrzymanej w spo¬ sób opisany w przykladzie I i zawierajacej nysta- 15 20 25 30 35 40 45 55 60 65 tyne w ilosci 103200 jednostek na 1 g, dodaje sie do 280 ml alkoholu izopropylowego, a nastepnie 600 ml 50$-owego roztworu wodnego alkoholu izopro¬ pylowego, w celu uzyskania objetosci roztworu 1 litr.Do otrzymanego roztworu, przy silnym mieszaniu dodaje sie 40$-owy roztwór wodny kwasu siarko¬ wego az do uzyskania wartosci pH=*7 i miesza przy tej wartosci pH w ciagu 7 minut. Nastepnie dodaje sie trójetyloaminy do uzyskania wartosci pH=6,8, miesza w ciagu 10 minut i odsacza. Osad przemywa sie 100 ml 60$-owego roztworu wodnego alkoholu izopropylowego i odsacza do sucha. Przesacz i po¬ pluczyny steza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 95 ml i dodaje do 95 ml 80$-owego roz¬ tworu wodnego acetonu. Wartosc pH mieszaniny na¬ stawia sie za pomoca kwasu solnego na 6,5 i ogrze¬ wa mieszanine w ciagu ^4 godziny w temperaturze 45—50°C. Nastepnie chlodzi sie mieszanine do tem¬ peratury pokojowej i w tej temperaturze miesza la¬ godnie w ciagu noc-y. Wytracone krysztaly odsacza sie, przemywa 50 ml acetonu rozcienczonego woda i nastepnie 100 ml acetonu i suszy pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Uzyskuje sie produkt o zawartosci nystatyny w ilosci 4760 jednostek na 1 mg, zas wy¬ dajnosc procesu w przeliczeniu na nystatyne zawarta w suchej grzybni wynosi 98$.Przyklad III. 200 g grzybni, otrzymanej w spo¬ sób opisany w przykladzie I i zawierajacej 103200 jednostek nystatyny na 1 g, miesza sie z 1060 ml bezwodnego etanolu i silnie mieszajac traktuje 40$-owym roztworem wodnym kwasu siarkowego az do uzyskania wartosci pH^. Przy tej wartosci pH miesza sie w ciagu 7 minut i nastepnie dodaje trójetyloaminy az dó uzyskania wartosci pH=6,8.Po 10 minutach mieszania odsacza sie, osad prze¬ mywa 100 ml 80$-owego roztworu wodnego etanolu i odsysa. Przesacz i popluczyny steza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci 55 ml i dodaje do 55 ml 80$-owego roztworu wodnego acetonu, a na¬ stepnie dodaje sie 20$-owego kwasu solnego w celu uzyskania wartosci pH = 6,5. Mieszanine ogrzewa sie w ciagu Vi godziny w temperaturze 45—50°C, chlo¬ dzi do temperatury pokojowej i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 1 godziny. Odsacza sie po¬ wstale krysztaly, przemywa je 50 ml 40$-owego roz¬ tworu wodnego acetonu i 1Ó0 ml acetonu, a nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc pro¬ cesu w przeliczeniu na nystatyne zawarta w suchej grzybni wynosi 82$, a produkt zawiera 4720 jednos¬ tek nystatyny na 1 mg.Przyklad IV. Do 4320 ml metanolu dodaje sie 40 ml trójetyloaminy i dodajac 40$-owy roztwór wodny kwasu siarkowego doprowadza pH mieszani¬ ny do wartosci 6,0. Do tak przygotowanej mieszani¬ ny dodaje sie nastepnie 800 g grzybni, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie I i zawierajacej nystatyne w ilosci 130000 jednostek na Ig. Miesza¬ nine miesza sie silnie w ciagu lA godziny i odsacza, przemywa osad 400 ml 90$-owego roztworu wodnego metanolu i odsysa. Przesacz i popluczyny steza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 220 ml i dodaje do 220 ml 80$-owego roztworu wodnego acetonu, ogrzanego uprzednio do temperatury 45— —50°C. Do mieszaniny dodaje sie nastepnie taka sama objetosc 50$-owego roztworu wodnago acetonu54942 O i 440 ml 80^-owego roztworu acetonu, po czym doda¬ je sie 20^-owego kwasu solnego az do uzyskania wartosci pH = 6,5. Mieszanine utrzymuje sie w tempe¬ raturze 45—50°C w ciagu 1 godziny przy powolnym mieszaniu i nastepnie chlodzi do temperatury poko¬ jowej i w tej temperaturze miesza lagodnie w ciagu nocy. Odsacza sie otrzymane krysztaly, przemywa je 100 ml 40^-owego roztworu wodnego acetonu i 200 ml acetonu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wy¬ dajnosc procesu w przeliczeniu na nystatyne zawarta w suchej grzybni wynosi 92$, a produkt zawiera 4560 jednostek nystatyny na 1 mg.Przyklad V. Do 540 ml metanolu dodaje sie 40 ml 40$-owego roztworu metyloaminy i przez do¬ dawanie 40$-owego roztworu wodnego kwasu siar¬ kowego doprowadza pH mieszaniny do wartosci 6,0.Nastepnie do mieszaniny dodaje sie 200 g grzybni otrzymanej w sposób opisany w przykladzie I i za¬ wierajacej 151000 jednostek nystatyny na 1 g. Mie¬ sza sie energicznie w ciagu V2 godziny i odsacza, przemywajac osad 200 ml 90%-owego roztworu wodnego metanolu, po czym odsacza sie do sucha.Przesacz i popluczyny steza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 65 ml i dodaje do 65 ml 80^-owego roztworu wodnego acetonu, ogrzanego uprzednio do temperatury 45—50°C. Do mieszaniny dodaje sie nastepnie taka sama objetosc 50^-owego roztworu wodnego acetonu, 130 ml 80$-owego roz¬ tworu wodnego acetonu, po czym przez dodawanie metyloaminy doprowadza sie pH mieszaniny do war¬ tosci 6,5. Mieszanine ogrzewa sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 45—50°C przy lagodnym mieszaniu po czym miesza sie w temperaturze pokojowej w cia¬ gu nocy. Powstale krysztaly odsacza sie, przemywa 50 ml 50$-owego roztworu wodnego acetonu i 100 ml acetonu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc procesu w przeliczeniu na nystatyne za¬ warta w suchej grzybni wynosi 92%, a produkt za¬ wiera 4960 jednostek nystatyny na 1 mg.Przyklad VI. 200 g grzybni, otrzymanej w spo¬ sób opisany w przykladzie I i zawierajacej 126200 jednostek nystatyny na 1 g dodaje sie do roztworu siarczanu dwuetyloaminy, otrzymanego przez doda¬ nie 25 ml dwuetyloaminy do 1080 ml metanolu i do¬ prowadzenie pH mieszaniny do wartosci 6,0 za po¬ moca 40%-owego roztworu wodnego kwasu siarko¬ wego. Mieszanine miesza sie intensywnie w ciagu Y2 godziny, odsacza, przemywa osad 200 ml 90^-owe- go roztworu wodnego metanolu i odsacza. Przesacz i popluczyny steza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 55 ml i dodaje do 55 ml 80#-owego roz¬ tworu wodnego acetonu, ogrzanego uprzednio do temperatury 45-50°C. Do mieszaniny dodaje sie na¬ stepnie taka sama objetosc 50$-owego roztworu wod¬ nego acetonu i 110 ml 80#-owego roztworu acetonu, po czym za pomoca dwuetyloaminy doprowadza sie pH mieszaniny do wartosci 6,5. Mieszanine ogrzewa sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 45—50°C la¬ godnie mieszajac, po czym chlodzi sie do tempera- 5 tury pokojowej i w tej temperaturze miesza lagodnie w ciagu nocy. Odsacza sie powstale krysztaly, prze¬ mywa je 50 ml wodnego roztworu acetonu, a nastep¬ nie 100 ml acetonu i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Wydajnosc procesu w przeliczeniu na nysta- 10 tyne zawarta w suchej grzybni wynosi 89$, zas pro¬ dukt zawiera 4200 jednostek nystatyny na 1 mg.Przyklad VII. 100 ml trójetanoloaminy dodaje sie do 2 700 ml metanolu i do roztworu wlewa nas¬ tepnie 40$-owy roztwór wodny kwasu siarkowego 15 az do uzyskania pH=6,0. Do otrzymanej mieszaniny dodaje sie 1 kg grzybni, przygotowanej w sposób opisany w przykladzie I i zawierajacej 130 000 jed¬ nostek nystatyny wig. Miesza sie intensywnie w ciagu ]/2 godziny, odsacza, przemywa osad 500 ml 20 85^-owego roztworu wodnego metanolu i odsacza.Przesacz i popluczyny steza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 325 ml i dodaje do 325 ml 80^-owego roztworu wodnego acetonu, ogrzanego uprzednio do temperatury 45-50°C. Do mieszaniny 25 dodaje sie taka sama objetosc 50^-owego roztworu wodnego acetonu i 650 ml 80^-owego roztworu wod¬ nego acetonu. Przez dodatek 20°/o-owego roztworu wodnego kwasu solnego nastawia sie wartosc pH mieszaniny na 6,5 i ogrzewa mieszanine w tempera- 30 turze 45-50°C, lagodnie mieszajac w ciagu 1 godziny.Nastepnie chlodzi sie mieszanine do temperatury pokojowej i w tej temperaturze miesza lagodnie w ciagu nocy. Odsacza sie powstale krysztaly, prze¬ mywa je 250 ml 50^-owego roztworu wodnego ace- 35 tonu i 500 ml acetonu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc procesu w przeliczeniu na nystatyne zawarta w suchej grzybni wynosi 100$, a produkt zawiera 4750 jednostek nystatyny na 1 mg. 40 PL