PL249492B1 - Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia - Google Patents
Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmieniaInfo
- Publication number
- PL249492B1 PL249492B1 PL443588A PL44358823A PL249492B1 PL 249492 B1 PL249492 B1 PL 249492B1 PL 443588 A PL443588 A PL 443588A PL 44358823 A PL44358823 A PL 44358823A PL 249492 B1 PL249492 B1 PL 249492B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- barley
- mutation
- hvd53
- samples
- gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53, przedstawione w wykazie sekwencji: 1) Sekwencja nukleotydowa nr 1, 2) Sekwencja nukleotydowa nr 2. Istotę wynalazku stanowi również sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, polegający na tym, że: a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe; b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu od 20 do 500 ng/µl; c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z użyciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji: 1) Sekwencja nukleotydowa nr 1, 2) Sekwencja nukleotydowa nr 2, osobno dla prób: i. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny (próba A); ii. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny wymieszanego z DNA rośliny nieposiadającej mutacji T4001C, w równych proporcjach w łącznej objętości odpowiadającej próbie A (próba B); iii. DNA wyizolowanego z rośliny nieposiadającej mutacji T4001C (próba kontrolna), z użyciem dowolnego znacznika fluorescencyjnego pozwalającego na znakowanie DNA oraz urządzenia pozwalającego na pomiar przyrastającej intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym; d) oblicza się krzywą topnienia dla każdej z badanej prób A i B, a także dla próby kontrolnej, którą stanowi fragment genu HvD53 jęczmienia amplifikowany zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej z użyciem DNA matrycowego bez mutacji T4001C; e) porównuje się krzywe topnienia otrzymane dla prób A, B oraz próby kontrolnej, analizuje się otrzymane wyniki i identyfikuje się jęczmień: - nieposiadający mutacji — wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, tożsamy z wykresem dla próby kontrolnej, - niosący mutację w stanie heterozygotycznym — wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, o wartościach mniejszych niż dla próby kontrolnej, - niosący mutację w stanie homozygotycznym - wskazują na niego różne wykresy krzywej topnienia dla próby A i B.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu jęczmienia, z wykorzystaniem analizy krzywej topnienia. Opisywana mutacja skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy genu jęczmienia HvD53 (HORVU.MOREX.r3.4HG0354980), kodującego represor strigolaktonów. Wykazano, że mutacja w obrębie tego genu, skutkująca substytucją tyminy na cytozynę w pozycji 4001 sekwencji genomowej (T4001C) prowadzi do zmiany sekwencji kodowanego białka w pozycji 664 z seryny na prolinę (S664P). Opisywana zmiana sekwencji białkowej upośledza działanie funkcji represora D53 co uniemożliwia prawidłowe działanie strigolaktonów i w rezultacie skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Z wykorzystaniem specyficznej pary starterów obejmujących miejsce mutacji oraz analizy krzywej topnienia produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR z wykorzystaniem wspomnianych starterów możliwa jest selekcja osobników jęczmienia pod względem braku bądź wystąpienia mutacji T4001C.
Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych [patrz publikacje nr 1 i 2 w wykazie literatury]. Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne [3, 4, 5]. W 2016 roku zidentyfikowano pierwszego mutanta jęczmienia, który jest niewrażliwy na strigolaktony. Mutant ten, wyprowadzony na drodze chemicznej mutagenezy po traktowaniu azydkiem sodu oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNU), został scharakteryzowany fenotypowo i funkcjonalnie, we wcześniejszych pracach [4]. Scharakteryzowany mutant wykazuje fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych jest formą półkarłową z większą liczbą rozgałęzień pędu. Ta sama strategia została wykorzystana do identyfikacji mutacji w obrębie sekwencji genu HvD53 kodującego represor strigolaktonów. Represor jest cząsteczką degradowaną w odpowiedzi na sygnał niesiony przez strigolakton, co aktywuje kaskadę prowadzącą do zmniejszenia rozkrzewienia rośliny [6]. W przypadku mutacji w obrębie represora, znoszącej jego funkcję, dochodzi do sytuacji gdy kaskada sygnałowa jest konstytutywnie aktywna i prowadzi do zmniejszonego rozkrzewienia części nadziemnej, gdy porównać ją do rośliny bez mutacji. Fenotyp mniejszego rozkrzewienia obserwowany jest wyłącznie w przypadku wystąpienia mutacji w stanie homozygotycznym, stąd podczas przenoszenia jej w nowe tła genetyczne konieczne będzie dokonanie selekcji form heterozygotycznych w pokoleniu F1 i potwierdzenie ko-segregacji fenotypu z mutacją w pokoleniu F2. Zaprezentowana metoda pozwala na identyfikację mutacji T4001C w genie HvD53 u jęczmienia oraz określenie jej stanu homo- bądź heterozygotycznego z wykorzystaniem specyficznej pary starterów oraz analizy krzywej topnienia.
Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO131928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325 A1), bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizmami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (RO131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).
W pracy opisującej mutanta hvd14.d wykazano, że możliwe jest dokonanie selekcji form jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony dzięki zastosowaniu traktowania syntetycznym strigolaktonem GR24. O ile odmiana wyjściowa Sebastian potraktowana roztworem GR24 o koncentracji 10-6 M, wykazuje zmniejszone rozkrzewienie, to efekt ten był niewidoczny u mutanta hvd14.d [4].
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie specyficznych sekwencji starterów pozwalających na amplifikację fragmentu genu HvD53 jęczmienia, obejmującego mutację T4001C oraz metody pozwalającej na identyfikację osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, z wykorzystaniem analizy krzywej topnienia.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmujące miejsce mutacji T4001C, przedstawione w wykazie sekwencji:
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, pozwalający na selekcję badanych roślin pod kątem występowania lub braku mutacji T4001C, w celu identyfikacji mutacji wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, polegający na tym, że:
a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego;
b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu od 20 do 500 ng/μΙ, korzystnie 100 ng/μί;
c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z użyciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji:
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2, osobno dla prób:
i. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny (próba A) ii. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny wymieszanego z DNA rośliny nieposiadającej mutacji T4001C, w równych proporcjach w łącznej objętości odpowiadającej próbie A (próba B) iii. DNA wyizolowanego z rośliny nieposiadającej mutacji T4001C (próba kontrolna, którą stanowi fragment genu HvD53 jęczmienia amplifikowany zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej z użyciem DNA matrycowego bez mutacji T4001C), z użyciem dowolnego znacznika fluorescencyjnego pozwalającego na znakowanie DNA oraz urządzenia pozwalającego na pomiar przyrastającej intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, generując dane do wyliczenia krzywej topnienia;
d) oblicza się krzywą topnienia, z użyciem oprogramowania dla urządzenia wykorzystanego w poprzednim etapie, dla każdej z badanej prób A i B, a także dla próby kontrolnej;
e) porównuje się krzywe topnienia otrzymane dla prób A, B oraz próby kontrolnej, analizuje się otrzymane wyniki i identyfikuje się jęczmień:
- nieposiadający mutacji - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B oraz dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie heterozygotycznym - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, o wartościach temperatury topnienia mniejszych niż dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie homozygotycznym - wskazują na niego różne wykresy krzywej temperatury topnienia dla próby A i B.
Korzystnie, etap amplifikacji fragmentu genu HvD53 przeprowadza się realizując reakcję PCR zgodnie z programem:
i. wstępna denaturacja: 95°C przez 10 minut ii. denaturacja: 95°C przez 10 sekund iii. przyłączanie starterów: 65°C przez 15 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 20 sekund najkorzystniej powtarzając etapy ii-iv 45 razy.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został bliżej w poniższych przykładach wykonania, natomiast na rysunku (Fig. 1) przedstawiono przykładowe krzywe topnienia dla fragmentu genu HvD53. Rysunek przedstawia (A) krzywe topnienia dla prób A roślin, które posiadają lub nie posiadają mutację T4001C oraz (B) krzywe topnienia dla prób B roślin, które posiadają lub nie posiadają mutację T4001C.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań według niniejszego wynalazku możliwe jest przeprowadzenie selekcji roślin jęczmienia pod kątem występowania mutacji w obrębie genu HvD53 oraz określenie czy występuje w stanie homozygotycznym czy heterozygotycznym.
Przykład 1. Sekwencje starterów według wynalazku przedstawione w wykazie sekwencji:
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2.
Z wykorzystaniem tych sekwencji starterów przeprowadzono przykładowy proces amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53, obejmującego mutację T4001C, który przebiegał w etapach opisanych poniżej.
DNA wyizolowano z liści 14-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach szklarniowych (doniczki 13x13x15 cm, wypełnione ziemią ogrodniczą, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 gmol m-2 s-1) z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-1KT).
Otrzymane DNA rozcieńczono wodą do koncentracji 100 ng/μΙ i wykorzystano do reakcji PCR z użyciem mieszaniny reakcyjnej LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, 04707516001) oraz starterów specyficznych dla fragmentu genu HvD53 przedstawionych w wykazie sekwencji:
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2 osobno dla prób:
i. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny (próba A) ii. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny wymieszanego z DNA rośliny niepo- siadającej mutacji T4001C, w równych proporcjach w łącznej objętości odpowiadającej próbie A (próba B) iii. DNA wyizolowanego z rośliny nieposiadającej mutacji (próba kontrolna).
Reakcję PCR prowadzono według programu:
i. wstępna denaturacja: 95°C przez 10 minut ii. denaturacja: 95°C przez 10 sekund iii. przyłączanie starterów: 65°C przez 15 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 20 sekund (etapy ii-iv powtórzone 45 razy) z wykorzystaniem LightCycler® 480 System pozwalającym na monitorowanie liczby kopii amplifikowanego fragmentu w czasie rzeczywistym.
Przykład 2
Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o analizy krzywych topnienia.
Proces identyfikacji prowadzi się na roślinach jęczmienia, które rosły w warunkach szklarniowych (doniczki 13x13x15 cm, wypełnione ziemią ogrodniczą, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1).
Proces przebiega w następujących etapach:
a) izoluje się DNA z liści jęczmienia, z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-1KT);
b) ustala się koncentrację DNA na 100 ng/μΗ
c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 z wykorzystaniem mieszaniny reakcyjnej LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, 04707516001) oraz starterów specyficznych przedstawionych w wykazie sekwencji:
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2 osobno dla prób:
i. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny (próba A) ii. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny wymieszanego z DNA rośliny nieposiadającej mutacji T4001C, w równych proporcjach w łącznej objętości odpowiadającej próbie A (próba B) iii. DNA wyizolowanego z rośliny nieposiadającej mutacji (próba kontrolna, którą stanowi fragment genu HvD53 jęczmienia amplifikowany zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej z użyciem DNA matrycowego bez mutacji T4001C), przy czym reakcję PCR prowadzi się według programu:
i. wstępna denaturacja: 95°C przez 10 minut ii. denaturacja: 95°C przez 10 sekund ii i. przyłączanie starterów: 65°C przez 15 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 20 sekund (etapy ii-iv powtórzone 45 razy), z wykorzystaniem LightCycler® 480 System pozwalającym na monitorowanie liczby kopii amplifikowanego fragmentu w czasie rzeczywistym;
d) z wykorzystaniem oprogramowania LightCycler 480 Software oblicza się krzywą topnienia dla każdej z prób A oraz B, a także dla próby kontrolnej;
e) porównuje się krzywe topnienia otrzymane dla prób A, B oraz próby kontrolnej, analizuje się otrzymane wyniki i identyfikuje się jęczmień:
- nieposiadający mutacji - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, tożsamy z wykresem dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie heterozygotycznym - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, o wartościach mniejszych niż dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie homozygotycznym - wskazują na niego różne wykresy krzywej topnienia dla próby A i B.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych roślin. Osobniki jęczmienia niosące mutację T4001C w genie HvD53 w układzie homozygotycznym będą wykazywały mniejsze rozkrzewienie części nadziemnej w porównaniu do osobników bez mutacji oraz osobników z mutacją w układzie heterozygotycznym.
Przykład 3
Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o analizy krzywych topnienia, prowadzi się jak w przykładzie 2, z tą różnicą, że w etapie b) koncentrację DNA ustala się na poziomie 20 ng/pl.
Przykład 4
Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o analizy krzywych topnienia, prowadzi się jak w przykładzie 2, z tą różnicą, że w etapie b) koncentrację DNA ustala się na poziomie 500 ng/pl.
Literatura:
[1] Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 455(7210), 189-194.
[2] Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature, 455(7210), 195-200.
[3] Marzec M., Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.
[4] Marzec M., Gruszka D., Tylec P., Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.
[5] Marzec M., Muszynska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.
[6] Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.
PL 249492 Β1
Wykaz sekwencji starterów:
<110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia <130> 668 <160> 2 <170> Patcntln vcrsion 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Hordcum vulgarc <400> 1 ctgcagatgt ttgcacaacc c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 2 ctgcgaggtg tgaaggtttc 20
Claims (3)
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
1) Sekwencja nukleotydowa nr 1
1. Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53, przedstawione w wykazie sekwencji:
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2, osobno dla prób:
i. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny (próba A) ii. oryginalnego DNA wyizolowanego z badanej rośliny wymieszanego z DNA rośliny nieposiadającej mutacji T4001C, w równych proporcjach w łącznej objętości odpowiadającej próbie A (próba B) iii. DNA wyizolowanego z rośliny nieposiadającej mutacji T4001C (próba kontrolna, którą stanowi fragment genu HvD53 jęczmienia amplifikowany zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej z użyciem DNA matrycowego bez mutacji T4001C), z użyciem dowolnego znacznika fluorescencyjnego pozwalającego na znakowanie DNA oraz urządzenia pozwalającego na pomiar przyrastającej intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, generując dane do wyliczenia krzywej topnienia;
d) oblicza się krzywą topnienia, z użyciem oprogramowania dla urządzenia wykorzystanego w poprzednim etapie, dla każdej z badanej prób A i B, a także dla próby kontrolnej;
e) porównuje się krzywe topnienia otrzymane dla prób A, B oraz próby kontrolnej, analizuje się otrzymane wyniki i identyfikuje się jęczmień:
- nieposiadający mutacji - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B oraz dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie heterozygotycznym - wskazuje na niego identyczny wykres krzywej topnienia dla próby A i B, o wartościach temperatury topnienia mniejszych niż dla próby kontrolnej,
- niosący mutację w stanie homozygotycznym - wskazują na niego różne wykresy krzywej temperatury topnienia dla próby A i B.
2. Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, pozwalający na selekcję badanych roślin pod kątem występowania lub braku mutacji T4001C, znamienny tym, że:
a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego;
b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu od 20 do 500 ng/pl, korzystnie 100 ng/pl;
c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z użyciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji:
2) Sekwencja nukleotydowa nr 2.
3. Sposób identyfikacji według zastrz. 2 znamienny tym, że etap amplifikacji fragmentu genu HvD53 przeprowadza się realizując reakcję PCR zgodnie z programem:
i. wstępna denaturacja: 95°C przez 10 minut ii. denaturacja: 95°C przez 10 sekund iii. przyłączanie starterów: 65°C przez 15 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 20 sekund, najkorzystniej powtarzając etapy ii-iv 45 razy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL443588A PL249492B1 (pl) | 2023-01-26 | 2023-01-26 | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL443588A PL249492B1 (pl) | 2023-01-26 | 2023-01-26 | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL443588A1 PL443588A1 (pl) | 2024-07-29 |
| PL249492B1 true PL249492B1 (pl) | 2026-04-27 |
Family
ID=91971338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL443588A PL249492B1 (pl) | 2023-01-26 | 2023-01-26 | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL249492B1 (pl) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695478A (zh) * | 2014-12-09 | 2016-06-22 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调节植物株型和产量的基因及其应用 |
| PL437297A1 (pl) * | 2021-03-15 | 2022-09-19 | Uniwersytet Śląski W Katowicach | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony |
-
2023
- 2023-01-26 PL PL443588A patent/PL249492B1/pl unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695478A (zh) * | 2014-12-09 | 2016-06-22 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调节植物株型和产量的基因及其应用 |
| PL437297A1 (pl) * | 2021-03-15 | 2022-09-19 | Uniwersytet Śląski W Katowicach | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HOFINGER B. J. ET AL.: "Theoretical and Applied Genetics, August 2009", "HIGH-RESOLUTION MELTING ANALYSIS OF CDNA-DERIVED PCR AMPLICONS FOR RAPID AND COST-EFFECTIVE IDENTIFICATION OF NOVEL ALLELS IN BARLEY" * |
| MARZEC, M ET AL.: "Physiol Plant 2016 Nov; 158(3):341-355", "IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE HVD14 GENE INVOLVED IN STRIGOLACTONE SIGNALING IN HORDEUM VULGARE" * |
| MARZEC, M., ALQUDAH, A. M.: "Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 795", "KEY HORMONAL COMPONENTS REGULATE AGRONOMICALLY IMPORTANT TRAITS IN BARLEY" * |
| MARZEC, M.: "IBGS 13 13th International Barley Genetics Symposium, July 3rd-7th, 2022 Riga, Latvia, abstract e-book, str. 137", "NEW BARLEY STRIGOLACTONE MUTANTS IDENTIFIED USING TILLING STRATEGY", DOI: publikacja dostępna na stronie https://wheat.pw.usda.gov/GG3/sites/default/files/IBGS_13_2022_Abstracts_E_Book_15_09_2022.pdf * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL443588A1 (pl) | 2024-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Genome-wide association studies reveal the genetic basis of ionomic variation in rice | |
| Agius et al. | Exploring the crop epigenome: a comparison of DNA methylation profiling techniques | |
| Zhou et al. | LaALMT1 mediates malate release from phosphorus‐deficient white lupin root tips and metal root to shoot translocation | |
| Van Norman et al. | BYPASS1 negatively regulates a root-derived signal that controls plant architecture | |
| Beaudry et al. | Evolutionary genomics of plant gametophytic selection | |
| Nguyen et al. | Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development | |
| EP3091076A1 (en) | Polynucleotide responsible of haploid induction in maize plants and related processes | |
| Lei et al. | Nitrogen use efficiency is regulated by interacting proteins relevant to development in wheat | |
| Ihnatowicz et al. | Conserved histidine of metal transporter at NRAMP 1 is crucial for optimal plant growth under manganese deficiency at chilling temperatures | |
| Cao et al. | Roles of MSH2 and MSH6 in cadmium-induced G2/M checkpoint arrest in Arabidopsis roots | |
| PL242227B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony | |
| Hayes et al. | Diversity in boron toxicity tolerance of Australian barley (Hordeum vulgare L.) genotypes | |
| Sarazin et al. | Water-stressed sunflower transcriptome analysis revealed important molecular markers involved in drought stress response and tolerance | |
| You-Xiong et al. | Differential gene expression in sugarcane in response to challenge by fungal pathogen Ustilago scitaminea revealed by cDNA‐AFLP | |
| CN108165653B (zh) | 用于鉴定辣椒熟性的InDel分子标记及其应用 | |
| Yan et al. | Identification of chilling-tolerant genes in maize via bulked segregant analysis sequencing | |
| US20190380295A1 (en) | Targeted modification of maize roots to enhance abiotic stress tolerance | |
| CN112795631B (zh) | 柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用 | |
| Bardaro et al. | Genetic analysis of resistance to Orobanche crenata (Forsk.) in a pea (Pisum sativum L.) low-strigolactone line | |
| Liu et al. | Targeted parallel sequencing of large genetically-defined genomic regions for identifying mutations in Arabidopsis | |
| CN105177162B (zh) | 检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法 | |
| CN112877466A (zh) | 激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因及其引物的应用 | |
| CN107557437A (zh) | 一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对及方法 | |
| PL249294B1 (pl) | Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej | |
| PL249300B1 (pl) | Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej |