PL249294B1

PL249294B1 - Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej

Info

Publication number: PL249294B1
Application number: PL443587A
Authority: PL
Inventors: Marek Marzec
Original assignee: Univ Slaski W Katowicach
Priority date: 2023-01-26
Filing date: 2023-01-26
Publication date: 2026-03-23
Also published as: PL443587A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, obejmujący następujące etapy: a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego; b) ustala się koncentrację DNA do poziomu od 20 do 500 ng/µl; c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z użyciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji: 1) Sekwencja nukleotydowa nr 1; 2) Sekwencja nukleotydowa nr 2; d) produkt amplifikacji dzieli się na dwie części o takiej samej objętości: próbę A oraz B, po czym do próby B dodaje się, w takiej samej objętości, fragment genu HvD53 amplifikowany w sposób opisany powyżej z wykorzystaniem DNA matrycowego pozbawionego mutacji T4001C; e) formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B; f) przeprowadza się cięcie otrzymanych heterodupleksów dla próby A oraz B wykorzystując endonukleazę Mismatch Endonuclease I; g) przeprowadza się elektroforezę w żelu agarozowym i na podstawie obrazu żelu identyfikuje się jęczmień: nie posiadający mutacji T4001C — na niego wskazuje jeden prążek o długości 1225 pz w próbie A oraz B lub niosący mutację w stanie heterozygotycznym - na niego wskazują trzy prążki o długości 1225 pz, 1000 pz oraz 225 pz w próbach A oraz B lub niosący mutację w stanie homozygotycznym - na niego wskazuje jeden prążek o długości 1000 pz w próbie A i 2 prążki o długości 1000 pz oraz 225 pz w próbie B.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia zlokalizowanej w obrębie genu, z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I. Opisywana mutacja skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy genu jęczmienia HvD53 (HORVU.MOREX.r3.4HG0354980), kodującego represor strigolaktonów. Wykazano, że mutacja w obrębie tego genu, skutkująca substytucją tyminy na cytozynę w pozycji 4001 sekwencji genomowej (T4001C) prowadzi do zmiany sekwencji kodowanego białka w pozycji 664 z seryny na prolinę (S664P). Opisywana zmiana sekwencji białkowej upośledza działanie funkcji represora D53 co uniemożliwia prawidłowe działanie strigolaktonów i w rezultacie skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I możliwe jest zidentyfikowanie wystąpienia takiej mutacji w układzie heterozygotycznym. Ponadto tworząc heterodupleksy pomiędzy produktami amplifikowanymi niezależnie dla różnych osobników możliwa jest selekcja roślin nieposiadających mutacji oraz tych niosących ją w układzie homozygotycznym.

Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych [patrz publikacje nr 1 i 2 w wykazie literatury]. Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne [3, 4, 5]. W 2016 roku zidentyfikowano pierwszego mutanta jęczmienia, który jest niewrażliwy na strigolaktony. Mutant ten, wyprowadzony na drodze chemicznej mutagenezy po traktowaniu azydkiem sodu oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNU), został scharakteryzowany fenotypowo i funkcjonalnie, we wcześniejszych pracach [4]. Scharakteryzowany mutant wykazuje fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych - jest formą półkarłową z większą liczbą rozgałęzień pędu. Ta sama strategia została wykorzystana do identyfikacji mutacji w obrębie sekwencji genu HvD53 kodującego represor strigolaktonów. Represor jest cząsteczką degradowaną w odpowiedzi na sygnał niesiony przez strigolakton, co aktywuje kaskadę prowadzącą do zmniejszenia rozkrzewienia rośliny [6]. W przypadku mutacji w obrębie represora, znoszącej jego funkcję, dochodzi do sytuacji gdy kaskada sygnałowa jest konstytutywnie aktywna i prowadzi do zmniejszonego rozkrzewienia części nadziemnej, gdy porównać ją do rośliny bez mutacji. Fenotyp mniejszego rozkrzewienia obserwowany jest wyłącznie w przypadku wystąpienia mutacji w stanie homozygotycznym, stąd podczas przenoszenia jej w nowe tła genetyczne konieczne będzie dokonanie selekcji form heterozygotycznych w pokoleniu Fi i potwierdzenie ko-segregacji fenotypu z mutacją w pokoleniu F2. Zaprezentowana metoda pozwala na identyfikację mutacji T4001C w genie HvD53 u jęczmienia oraz określenie jej stanu homo- bądź heterozygotycznego z wykorzystaniem specyficznej pary starterów oraz endonukleazy Mismatch Endonuclease I.

Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO131928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325 A1), bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizmami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (RO131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).

W pracy opisującej mutanta hvd14.d wykazano, że możliwe jest dokonanie selekcji form jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony dzięki zastosowaniu traktowania syntetycznym strigolaktonem GR24. O ile odmiana wyjściowa Sebastian potraktowana roztworem GR24 o koncentracji 10^-6 M wykazuje zmniejszone rozkrzewienie, to efekt ten był niewidoczny u mutanta hvd14.d [4].

Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sposobu identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I.

Istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, który charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego;

b) ustala się koncentrację DNA do poziomu od 20 do 500 ng/μl, korzystnie 100 ng/μl;

c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z użyciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji:

1) Sekwencja nukleotydowa nr 1;

2) Sekwencja nukleotydowa nr 2;

d) produkt amplifikacji dzieli się na dwie części o takiej samej objętości: próbę A oraz B, po czym do próby B dodaje się, w takiej samej objętości, fragment genu HvD53 amplifikowany w sposób opisany powyżej z wykorzystaniem DNA matrycowego pozbawionego mutacji T4001C;

e) formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B;

f) przeprowadza się cięcie otrzymanych heterodupleksów dla próby A oraz B wykorzystując endonukleazę Mismatch Endonuclease I;

g) przeprowadza się elektroforezę w żelu agarozowym i na podstawie obrazu żelu identyfikuje się jęczmień:

- nie posiadający mutacji T4001C - na niego wskazuje jeden prążek o długości 1225 pz w próbie A oraz B, lub

- niosący mutację w stanie heterozygotycznym - na niego wskazują 3 prążki o długości 1225 pz, 1000 pz oraz 225 pz w próbach A oraz B, lub

- niosący mutację w stanie homozygotycznym - na niego wskazuje 1 prążek o długości 1225 pz w próbie A i 2 prążki o długości 1000 pz oraz 225 pz w próbie B.

Korzystnie, etap amplifikacji fragmentu genu HvD53 przeprowadza się realizując reakcję PCR zgodnie z programem:

i. wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund

v. denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund viii. denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund xi. końcowa elongacja: 72°C przez 5 min, przy czym najkorzystniej gdy etapy ii-iv powtarza się trzykrotnie, etapy v-vii powtarza się trzykrotnie, natomiast etapy viii-x powtarza się trzydziestosześciokrotnie.

Korzystnie, etap w którym formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B realizuje się w oparciu o program:

i. denaturacja: 95°C przez 3 minuty ii. stopniowe obniżanie temperatury, o wartość 0,3°C co 20 sekund, powtarzając to 70 razy, począwszy od temperatury 70°C.

Przedmiot wynalazku przedstawiony został bliżej w poniższych przykładach wykonania, natomiast na rysunku (Fig. 1) przedstawiono przykładowy obraz elektroforezy dla fragmentu genu HvD53 po cięciu endonukleazą Mismatch Endonuclease I. Rysunek przedstawia efekt cięcia endonukleazą dla osobnika bez mutacji (jeden prążek o długości 1225 pz w próbie A oraz B), osobnika z mutacją w stanie heterozygotycznym (3 prążki o długości 1225 pz, 1000 pz oraz 225 pz w próbach A i B) oraz osobnika z mutacją w stanie homozygotycznym (1 prążek o długości 1225 pz w próbie A i 2 prążki o długości 1000 pz oraz 225 pz w próbie B).

Dzięki zastosowaniu rozwiązań według niniejszego wynalazku możliwe jest przeprowadzenie selekcji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji w obrębie genu HvD53 oraz określenie czy występuje w stanie homozygotycznym czy heterozygotycznym.

Przykład 1. Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, realizowany z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I.

Proces identyfikacji prowadzi się na roślinach jęczmienia, które rosły w warunkach szklarniowych (doniczki 13x13x15 cm, wypełnione ziemią ogrodniczą, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m^-2s^-1).

Proces przebiega w następujących etapach:

a) izoluje się DNA z liści jęczmienia, z użyciem REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-IKT);

b) ustala się koncentrację DNA na 100 ng/μl;

c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 z wykorzystaniem wyizolowanego DNA oraz starterów specyficznych przedstawionych w wykazie sekwencji:

i) Sekwencja nukleotydowa nr 1 ii) Sekwencja nukleotydowa nr 2 w oparciu o program reakcji PCR:

i. wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy ii-iv powtórzone trzykrotnie)

v. denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy v-vii powtórzone trzykrotnie) viii. denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy viii-x powtórzone 36 razy) xi. końcowa elongacja: 72°C przez 5 min

d) produkty reakcji PCR rozdziela się na dwie części o takiej samej objętości: próbę A oraz próbę B, a do próby B dodaje się, w takiej samej objętości, fragment genu HvD53 amplifikowany na DNA matrycowym nie zawierającym mutacji T4001C;

e) formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B w oparciu o program:

i) denaturacja: 95°C przez 3 minuty ii) stopniowe obniżanie temperatury, o wartość 0,3°C co 20 sekund, powtarzając to 70 razy, począwszy od temperatury 70°C;

f) przeprowadza się cięcie otrzymanych heterodupleksów dla próby A oraz B wykorzystując endonukleazę Mismatch Endonuclease I (BioLabs, M0678S);

- niosący mutację w stanie heterozygotycznym - na niego wskazują 3 prążki o długości 1225 pz, 1000 pz oraz 225 pz w próbach A oraz B,

Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych roślin. Rośliny niosące mutację T4001C w genie HvD53 w układzie homozygotycznym będą wykazywały mniejsze rozkrzewienie części nadziemnej w porównaniu do roślin bez mutacji oraz roślin z mutacją w układzie heterozygotycznym.

Przykład 2

Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I, prowadzi się jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że w etapie b) koncentrację DNA ustala się na poziomie 20 ng/μl.

Przykład 3

Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, oraz

PL 249294 Β1 określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, z wykorzystaniem endonukleazy Mismatch Endonuclease I, prowadzi się jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że w etapie b) koncentrację DNA ustala się na poziomie 500 ng/μΙ.

Literatura:

[1] Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Naturę, 455(7210), 189-194.

[2] Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Naturę, 455(7210), 195-200.

[3] Marzec M, Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.

[4] Marzec M, Gruszka D, Tylec P, Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.

[5] Marzec M, Muszyńska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.

[6] Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.

Claims

1) Sekwencja nukleotydowa nr 1

1. Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej, obejmujący następujące etapy:

c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 przeprowadzając reakcję PCR z uży- ciem starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia obejmującego miejsce mutacji T4001C, przedstawionych w wykazie sekwencji:

2. Sposób identyfikacji według zastrz. 1 znamienny tym, że etap amplifikacji fragmentu genu HvD53 przeprowadza się realizując reakcję PCR zgodnie z programem:

2) Sekwencja nukleotydowa nr 2;

e) formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B;

3. Sposób identyfikacji według zastrz. 1 znamienny tym, że etap w którym formuje się heterodupleksy dla próby A oraz B realizuje się w oparciu o program: