PL249299B1

PL249299B1 - Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53 i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu jęczmienia HvD53 wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia

Info

Publication number: PL249299B1
Application number: PL443581A
Authority: PL
Inventors: Marek Marzec; Beata Chmielewska
Original assignee: Univ Slaski W Katowicach
Priority date: 2023-01-26
Filing date: 2023-01-26
Publication date: 2026-03-23
Also published as: PL443581A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53 obejmujące miejsce mutacji T4001C i sposób identyfikacji mutacji w obrębie tego fragmentu z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych. Opisywana mutacja skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy genu Jęczmienia HvD53 (HORVU.MOREX.r3.4HG0354980), kodującego represor strigolaktonów.

Description

Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na amplifikację fragmentu genu jęczmienia HvD53 i sposób identyfikacji mutacji T4001C w obrębie tego fragmentu, z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych. Opisywana mutacja skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy genu jęczmienia HvD53 (HORVU.MOREX.r3.4HG0354980), kodującego represor strigolaktonów. Wykazano, że mutacja w obrębie tego genu, skutkująca substytucją tyminy na cytozynę w pozycji 4001 sekwencji genomowej (T4001C) prowadzi do zmiany sekwencji kodowanego białka w pozycji 664 z seryny na prolinę (S664P). Opisywana zmiana sekwencji białkowej upośledza działanie funkcji represora D53 co uniemożliwia prawidłowe działanie strigolaktonów i w rezultacie skutkuje zmniejszeniem rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia. Ponadto opisywana mutacja prowadzi do zmiany sekwencji na taką, która jest rozpoznawana przez jeden z enzymów restrykcyjnych: PIel. Stąd amplifikowany produkt z mutacją jest rozcinany po zastosowaniu enzymu PIel, natomiast produkt pozbawiony mutacji T4001C nie podlega cięciu. Dzięki temu możliwe jest rozpoznanie roślin niosących mutację T4001C od tych, które tej mutacji są pozbawione.

Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych [patrz publikacje nr 1 i 2 w wykazie literatury]. Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne [3, 4, 5]. W 2016 roku zidentyfikowano pierwszego mutanta jęczmienia, który jest niewrażliwy na strigolaktony. Mutant ten, wyprowadzony na drodze chemicznej mutagenezy po traktowaniu azydkiem sodu oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNU), został scharakteryzowany fenotypowo i funkcjonalnie, we wcześniejszych pracach [4]. Scharakteryzowany mutant wykazuje fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych - jest formą półkarłową z większą liczbą rozgałęzień pędu. Ta sama strategia została wykorzystana do identyfikacji mutacji w obrębie sekwencji genu HvD53 kodującego represor strigolaktonów. Represor jest cząsteczką degradowaną w odpowiedzi na sygnał niesiony przez strigolakton, co aktywuje kaskadę prowadzącą do zmniejszenia rozkrzewienia rośliny [6]. W przypadku mutacji w obrębie represora, znoszącej jego funkcję, dochodzi do sytuacji gdy kaskada sygnałowa jest konstytutywnie aktywna i prowadzi do zmniejszonego rozkrzewienia części nadziemnej, gdy porównać ją do rośliny bez mutacji. Fenotyp mniejszego rozkrzewienia obserwowany jest wyłącznie w przypadku wystąpienia mutacji w stanie homozygotycznym, stąd podczas przenoszenia jej w nowe tła genetyczne konieczne będzie dokonanie selekcji form heterozygotycznych w pokoleniu F1 i potwierdzenie ko-segregacji fenotypu z mutacją w pokoleniu F2. Zaprezentowana metoda pozwala na identyfikację mutacji T4001C w genie HvD53 u jęczmienia oraz określenie jej stanu homo- bądź heterozygotycznego z wykorzystaniem specyficznej pary starterów.

Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO131928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325 A1) bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizmami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (RO131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).

W pracy opisującej mutanta hvdl4.d wykazano, że możliwe jest dokonanie selekcji form jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony dzięki zastosowaniu traktowania syntetycznym strigolaktonem GR24. O ile odmiana wyjściowa Sebastian potraktowana roztworem GR24 o koncentracji 10^-6 M, wykazuje zmniejszone rozkrzewienie, to efekt ten był niewidoczny u mutanta hvdl4.d [4].

Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie specyficznych sekwencji starterów pozwalających na amplifikację fragmentu genu jęczmienia HvD53, obejmującego mutację T4001C oraz metody pozwalającej na identyfikację tej mutacji z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego Plel.

Istotą wynalazku są sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53 obejmujące miejsce mutacji T4001C, przedstawione w wykazie sekwencji:

a) Sekwencja nukleotydowa nr 1

b) Sekwencja nukleotydowa nr 2.

Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu jęczmienia HvD53 wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, który charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) z dowolnej tkanki badanego jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego,

b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu od 20 do 500 ng/μl, korzystnie 100 ng/μlζ

c) prowadzi się amplifikację fragmentu genu jęczmienia HvD53 z użyciem starterów przedstawionych w wykazie sekwencji:

i. Sekwencja nukleotydowa nr 1 ii. Sekwencja nukleotydowa nr 2,

d) przeprowadza się elektroforezę dla produktów reakcji PCR w żelu agarozowym,

e) dokonuje się ekstrakcji prążka o długości 1225 pz z żelu agarozowego i przeprowadza cięcie z użyciem enzymu Piel,

f) przeprowadza się ponowną elektroforezę i na podstawie obrazu żelu agarozowego dokonuje się selekcji roślin pod kątem mutacji T4001C, przy czym jeden prążek o długości 1225 pz oznacza brak mutacji, 3 prążki o długości 1225 pz, 1004 pz oraz 221 pz oznaczają obecność mutacji w stanie heterozygotycznym, a 2 prążki o długości 1004 pz oraz 221 pz oznaczają obecność mutacji w stanie homozygotycznym.

Korzystnie, etap amplifikacji fragmentu genu HvD53 przeprowadza się realizując reakcję PCR zgodnie z programem:

i. Wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. Przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy ii-iv powtórzone trzykrot- nie)

v. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. Przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy v-vii powtórzone trzykrot- nie) viii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. Przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy viii-x powtórzone 36 razy) xi. Końcowa elongacja 72°C przez 5 min

Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania, a na rysunku uwidoczniono przykładowy obraz żelu agarozowego dla fragmentu genu HvD53 po cięciu enzymem Piel. Rysunek przedstawia efekt cięcia enzymem Plel dla rośliny bez mutacji (jeden prążek o długości 1225 pz), rośliny z mutacją w stanie heterozygotycznym (3 prążki o długości 1225 pz, 1004 pz oraz 221 pz) oraz rośliny z mutacją w stanie homozygotycznym (2 prążki o długości 1004 pz oraz 221 pz).

Dzięki zastosowaniu rozwiązań przedstawionych w zgłoszeniu możliwe jest przeprowadzenie selekcji roślin jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie genu jęczmienia HvD53 oraz określenie czy występuje w stanie homozygotycznym czy heterozygotycznym.

Przykład 1

Sekwencje starterów według wynalazku przedstawione w wykazie sekwencji:

a) Sekwencja nukleotydowa nr 1

b) Sekwencja nukleotydowa nr 2.

Z wykorzystaniem tych sekwencji starterów przeprowadzono przykładowy proces amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53, obejmującego mutację T4001C, który przebiegał w etapach opisanych poniżej.

DNA wyizolowano z liści 14-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach szklarniowych (doniczki 13x13x15 cm, wypełnione ziemią ogrodniczą, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m^-2 s^-1) z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR1KT). Otrzymane DNA rozcieńczono wodą do koncentracji 100 ng/μl i wykorzystano do reakcji PCR z użyciem mieszaniny reakcyjnej stanowiącego część kitu REDExtract-N-Amp™ Plant PCR oraz starterów specyficznych dla fragmentu genu HvD53 przedstawionych w wykazie sekwencji:

a) Sekwencja nukleotydowa nr 1

b) Sekwencja nukleotydowa nr 2

Reakcję PCR prowadzono według programu:

i. Wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. Przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy ii-vi powtórzone trzykrotnie) v. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. Przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy v-vii powtórzone trzykrot- nie) viii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. Przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy vii-x powtórzone 36 razy) xi. Końcowa elongacja: 72°C przez 5 min

Przykład 2

Sposób identyfikacji roślin jęczmienia niosących mutację T4001C w genie HvD53 oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o wykorzystanie enzymu Plel.

1. Prowadzi się wzrost roślin jęczmienia w warunkach szklarniowych (doniczki 13x13x15 cm, wypełnione ziemią ogrodniczą, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m^-2 s^-1),

2. Izoluje się DNA z liści jęczmienia, z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-1KT) i ustala koncentrację DNA na poziomie 100 ng/μl,

3. Prowadzi się amplifikację fragmentu genu HvD53 z wykorzystaniem wyizolowanego DNA oraz starterów specyficznych przedstawionych w wykazie sekwencji:

a. Sekwencja nukleotydowa nr 1

b. Sekwencja nukleotydowa nr 2

W oparciu o program reakcji PCR

i. Wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. Przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy ii-iv powtórzone trzykrotnie) v. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. Przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy v-vii powtórzone trzykrot- nie) viii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. Przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy vii-v powtórzone 36 razy) xi. Końcowa elongacja: 72°C przez 5 min

4. Produkty reakcji PCR rozdziela się w żelu agarozowym (1% żel, 40 min, 90 V) i wycina prążki o długości 1225 pz

5. Dokonuje się ekstrakcji DNA z fragmentów żelu przy użyciu QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, 28706X4).

6. Oczyszczone produkty amplifikacji tnie się przy pomocy enzymu Plel (BioLabs, 10141295) oraz rozdziela w żelu agarozowym (1% żel, 40 min, 90 V).

7. Dokonuje się analizy efektu cięcia fragmentu genu HvD53. Przy czym obecność jednego prążka (o długości 1225 pz) oznacza brak mutacji T4001C, obecność dwóch prążków (o długości 1004 pz oraz 221 pz) oznacza występowanie mutacji T4001C w stanie homozygotycznym, a obecność trzech prążków (o długości 1225 pz, 1004 pz oraz 221 pz) oznacza występowanie mutacji w stanie heterozygotycznym.

Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych roślin. Rośliny niosące mutację T4001C w genie HvD53 w układzie homozygotycznym będą wykazywały mniejsze rozkrzewienie części nadziemnej w porównaniu do roślin bez mutacji oraz roślin z mutacją w układzie heterozygotycznym.

PL 249299 Β1

Przykład 3

Sposób identyfikacji roślin jęczmienia niosących mutację T4001C w genie HvD53 oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o wykorzystanie enzymu Piel prowadzi się jak w przykładzie 2, z tą różnicą, że w etapie 2 izoluje się DNA z liści jęczmienia, z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-1KT) i ustala koncentrację DNA na poziomie 20 ng/μΙ.

Przykład 4

Sposób identyfikacji roślin jęczmienia niosących mutację T4001C w genie HvD53 oraz określenie stanu homo- bądź heterozygotyczności tej mutacji, w oparciu o wykorzystanie enzymu Piel prowadzi się jak w przykładzie 2, z tą różnicą, że w etapie 2 izoluje się DNA z liści jęczmienia, z użyciem REDExtract-N-Amp™ Plant PCR Kit (Sigma, XNAPR-1KT) i ustala koncentrację DNA na poziomie 500 ng/μΙ.

Literatura:

[1] Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Naturę, 455(7210), 189-194.

[2] Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by newterpenoid plant hormones. Naturę, 455(7210), 195-200.

[3] Marzec M, Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.

[4] Marzec M, Gruszka D, Tylec P, Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum yulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.

[5] Marzec M, Muszyńska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.

[6] Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.

Claims

1. Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53 obejmujące miejsce mutacji T4001C, przedstawione w wykazie sekwencji:

a) Sekwencja nukleotydowa nr 1

b) Sekwencja nukleotydowa nr 2.

2. Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu jęczmienia HvD53 wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) z dowolnej tkanki jęczmienia izoluje się DNA genomowe, stosując dowolną metodę ekstrakcji DNA genomowego,

b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu od 20 do 500 ng/μl,

i. Sekwencja nukleotydowa nr 1, ii. Sekwencja nukleotydowa nr 2 zgodnie z programem reakcji PCR, d) przeprowadza się elektroforezę dla produktów reakcji PCR w żelu agarozowym,

e) dokonuje się ekstrakcji prążka o długości 1225 pz z żelu agarozowego i przeprowadza cięcie z użyciem enzymu Plel,

3. Sposób identyfikacji według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie b) ustala się koncentrację DNA genomowego do poziomu 100 ng/pl.

4. Sposób identyfikacji według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcję PCR prowadzi się zgodnie z programem:

i. Wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut ii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund iii. Przyłączanie starterów: 69°C przez 50 sekund iv. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy ii-iv powtórzone trzykrotnie)

v. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund vi. Przyłączanie starterów: 67°C przez 50 sekund vii. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy v-vii powtórzone trzykrotnie) viii. Denaturacja: 95°C przez 45 sekund ix. Przyłączanie starterów: 65°C przez 50 sekund

x. Wydłużanie produktów: 72°C przez 90 sekund (etapy viii-x powtórzone 36 razy) xi. Końcowa elongacja: 72°C przez 5 min.