PL242227B1 - Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony - Google Patents
Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony Download PDFInfo
- Publication number
- PL242227B1 PL242227B1 PL437297A PL43729721A PL242227B1 PL 242227 B1 PL242227 B1 PL 242227B1 PL 437297 A PL437297 A PL 437297A PL 43729721 A PL43729721 A PL 43729721A PL 242227 B1 PL242227 B1 PL 242227B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- genes
- barley
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 48
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract description 11
- XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N (3e,3ar,8bs)-3-[[(2r)-4-methyl-5-oxo-2h-furan-2-yl]oxymethylidene]-4,8b-dihydro-3ah-indeno[1,2-b]furan-2-one Chemical compound O1C(=O)C(C)=C[C@@H]1O\C=C/1C(=O)O[C@@H]2C3=CC=CC=C3C[C@@H]2\1 XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N 0.000 title description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 claims description 2
- 241000173698 Hordeum pubiflorum Species 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101000904460 Encephalitozoon cuniculi (strain GB-M1) Probable glycerol-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 40
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016954 ADP-Ribosylation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010053971 ADP-Ribosylation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010004539 Chalcone isomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001647 brassinosteroids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024428 response to biotic stimulus Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy sekwencji starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 umożliwiających analizę poziomu ekspresji tych genów. Przedmiotem wynalazku jest również sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, z użyciem specyficznych par starterów oraz sposób selekcji odmian jęczmienia o obniżonej wrażliwości na strigolaktony w oparciu o poziomy ekspresji wymienionych wyżej genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalających na analizę ekspresji czterech genów jęczmienia i sposób analizy ekspresji tych genów z użyciem wspomnianych starterów pozwalający na selekcję genotypów jęczmienia pod kątem niewrażliwości na hormony roślinne - strigolaktony. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy genów o identyfikatorach HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, kodujących odpowiednio izomerazę chalkonu, białko indukowane jasmonianami, S-metylotransferazę L-metioniny oraz czynnik rybozylacji ADP. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji z użyciem zaproponowanego systemu badania ekspresji genów.
Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych opisanych w 2008 r. (Gomez-Roldan i inni, 2008; Umehara i inni, 2008). Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne (Marzec i Muszyńska, 2015; Marzec 2016; Marzec i Alqudah, 2018). W 2016 roku zidentyfikowano pierwszego mutanta jęczmienia, który jest niewrażliwy na strigolaktony. Mutant ten, wyprowadzony na drodze chemicznej mutagenezy po traktowaniu azydkiem sodu oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNU), został scharakteryzowany fenotypowo i funkcjonalnie, we wcześniejszych pracach Zespołu Genetyki Uniwersytetu Śląskiego (Marzec i inni, 2016). Scharakteryzowany mutant wykazuje fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych - jest formą półkarłową z większą liczbą rozgałęzień pędu. Fenotyp ten jest dobrze widoczny w późniejszych etapach rozwoju rośliny, natomiast w stadium siewki, zanim zaczną pojawiać się dodatkowe rozgałęzienia pędów, jedyną różnicą pomiędzy mutantem a odmianą wyjściową jest zmniejszona długość siewki. Fenotyp ten, na tym etapie rozwoju rośliny, jest również charakterystyczny dla innych mutantów z uszkodzeniami w szklakach biosyntezy czy sygnalizacji innych hormonów roślinnych, takich jak brasinosteroidy czy gibereliny. Stąd nie jest możliwe przeprowadzenie selekcji mutantów strigolaktonowych jęczmienia, na etapie siewki na podstawie fenotypu. Badania porównawcze ekspresji genów odmiany wyjściowej Sebastian oraz mutanta strigolaktonowego hvd14.d na etapie siewki pozwoliły na zidentyfikowanie genów o zróżnicowanej ekspresji u obydwu genotypów. Geny te mogą zostać wykorzystane do identyfikacji mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony, na etapie siewki, bez użycia dodatkowych traktowań.
Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO131928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325 A1) bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (RO131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).
W pracy opisującej mutanta hvd14.d wykazano, że możliwe jest dokonanie selekcji form jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony dzięki zastosowaniu traktowania syntetycznym strigolaktonem GR24. O ile odmiana wyjściowa Sebastian potraktowana roztworem GR24 o koncentracji 10-6 M, wykazuje zmniejszone rozkrzewienie, to efekt ten był niewidoczny u mutanta hvd14.d (Marzec i inni, 2016).
Celem wynalazku było opracowanie nowych sekwencji starterów pozwalających na analizę form jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, bez dodatkowych traktowań. U genotypów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony, rosnących w warunkach kontrolnych wykazano podwyższoną ekspresję genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550 oraz obniżoną ekspresję genów HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, w porównaniu do odmiany wyjściowej.
Proponowane rozwiązanie techniczne dotyczące analizy poziomów ekspresji czterech genów jęczmienia (HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190) jest metodą pozwalającą na selekcję genotypów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów jęczmienia między sobą i wybranie tych, które są niewrażliwe na strigolaktony. Podstawa wynalazku to informacje o poziome ekspresji czterech genów jęczmienia (HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190) w liściach dwutygodniowej siewki jęczmienia rosnącej w optymalnych warunkach. Informacje te mogą być wykorzystane do oceny genotypów jęczmienia pod kątem wrażliwości na strigolaktony i identyfikacji nowych mutantów jęczmienia z uszkodzeniami w szlaku sygnalizacji strigolaktonów.
Istotą wynalazku są sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów charakteryzujące się tym, że mają sekwencję nukleotydową:
a. Dla genu HORVU6Hr1G025330 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2
b. Dla genu HORVU3Hr1G117550 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4
c. Dla genu HORVU3Hr1G104600 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6
d. Dla genu HORVU7Hr1G080190 starter F - sekwencja nr 7 starter R- sekwencja nr 8
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że stosuje się sekwencje starterów określone powyżej.
Istotę wynalazku stanowi również sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o obniżonej wrażliwości na strigolaktony, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia, korzystnie 14-dniowy, w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z liści siewek jęczmienia,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów określone powyżej,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, korzystnie genów: EF1 i/lub GPDH,
f. wybiera się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do innych analizowanych genotypów poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550 i niższy w porównaniu do innych analizowanych genotypów poziom ekspresji genów HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, wskazujące na obniżoną wrażliwość na strigolaktony.
Korzystnie, gdy optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlną od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, który przedstawia przykładową analizę ekspresji genów u dwóch genotypów o zróżnicowanej wrażliwości na strigolaktony. Odmiana wyjściowa Sebastian jest wrażliwa na strigolaktony, w przeciwieństwie do mutanta hvd14.d, który jest niewrażliwy na strigolaktony. Ekspresja genów badana była przez porównanie ekspresji genów u obu genotypów, które rosły w optymalnych warunkach. Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na figurze zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów u obydwu genotypów.
Wynalazek został przedstawiony w przykładzie wykonania, które nie ma charakteru ograniczającego. Jak wynika z uzyskanych przez Twórców wyników, dla celów wynalazku identyfikację odmian jęczmienia o obniżonej wrażliwości na strigolaktony w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 można przeprowadzić na dwutygodniowych siewkach jęczmienia, które rosną w optymalnych warunkach. Przez optymalne warunki rozumie się temperaturę powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 900 μmol m-2 s-1. Selekcję odmian o obniżonej wrażliwości na strigolaktony prowadzi się w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, H0RVU3Hr1G117550,
HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 w tkankach liści dwutygodniowych siewek jęczmienia.
Przykład 1
Analiza poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550,
HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190.
RNA wyizolowano z liści 2-tygodniowych siewek jęczmienia, które rosły w optymalnych warunkach (temperatura powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 900 μmol m-2 s-1) z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
1. Dla genu HORVU6Hr1 G025330 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2
2. Dla genu HORVU3Hr1G117550 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4
3. Dla genu HORVU3Hr1G104600 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6
4. Dla genu HORVU7Hr1G080190 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-α) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (Rapacz et al., 2012).
Przykład 2
Metoda selekcji odmian jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1GW4600,
HORVU7Hr1G080190.
Metoda selekcji odmian jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony opiera się na porównaniu poziomów ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600,
HORVU7Hr1G080190, z użyciem wspomnianych starterów.
Ocena poziomu ekspresji genów wykonywana jest z użyciem reakcji qPCR i obejmuje:
1. Wzrost roślin jęczmienia w optymalnych warunkach temperatura 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 900 μmol m-2 s-1 przez okres 14 dni.
2. Izolację RNA z liści jęczmienia, z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub innym, pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności.
3. Syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA.
4. Reakcję qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym.
5. Reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-α) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (Rapacz et al., 2012) dla każdej próby cDNA.
6. Bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów wykorzystując zwyczajowo
PL 242227 BI przyjęte metody obliczeniowe. Poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy badanymi roślinami.
7. Wynik porównania dwóch odmian o zróżnicowanej wrażliwości na strigolaktony przedstawiono na figurze. Im wyższy poziom ekspresji (w odniesieniu do innych analizowanych genotypów jęczmienia rosnących w warunkach optymalnych) genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550 i niższy poziom ekspresji (w odniesieniu do innych analizowanych genotypów jęczmienia rosnących w warunkach optymalnych) genów HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, tym mniejsza wrażliwość na strigolaktony.
Literatura:
Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Naturę, 455(7210), 189-194.
Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.
Marzec M, Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.
Marzec M, Gruszka D, Tylec P, Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.
Marzec M, Muszyńska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.
Rapacz, M., Stępień, A., & Skorupa, K. (2012). Internal standardsforquantitative RT-PCRstudies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by newterpenoid plant hormones. Naturę, 455(7210), 195-200.
Wykaz sekwencji starterów:
<110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony.
<130> 592 <140> P.437297 <141> 2022-11-05 <160> 8 <170> Patentln version 3.5 <2IO> 1 <211> 24 < 212> DNA < 213> Hordeum vulgare
PL 242227 BI <400> 1 cttcctcctg tgtacaagaa ccac 24 < 210> 2 < 211> 24 < 212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 2 ccgcacatgt gaagagtaat ctgg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 3 taacagacgg gcttactgct tgcc
| <21 O> | 4 |
| <211> | 23 |
| <212> | DNA |
| <213> | Hordeum vulgarc |
| <400> | 4 |
tgtttcacca gacgagcaag tgg 23 <21 O> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 5 accgcctaca ttggcaaatc gc 22
PL 242227 BI
| <210> | 6 |
| <211> | 22 |
| <212> | DNA |
| <213> | Hordeum vulgare |
| <400> | 6 |
atgttgtggc tgtccagctt gc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 7 tctgagcacg aactacgcta cc <210> 8 <211> 22 < 212> DNA < 213> Hordeum vulgarc < 400> 8 agagatcgac gttgcctttg cc 22
Claims (7)
1. Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów znamienne tym, że mają sekwencję nukleotydową:
a. Dla genu HGRVU6Hr1G025330 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2
b. Dla genu HORVU3Hr1G117550 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4
c. Dla genu HORVU3Hr1G104600 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6
d. Dla genu HORVU7Hr1G080190 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
2. Sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 metodą qPCR, znamienny tym, że stosuje się następujące pary starterów:
a. Dla genu HORVU6Hr1G025330 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2
b. Dla genu HORVU3Hr1G117550 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4
c. Dla genu HORVU3Hr1G104600 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6
d. Dla genu HORVU7Hr1G080190 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
3. Sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o obniżonej wrażliwości na strigolaktony, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z liści siewek jęczmienia,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 metodą qPCR, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów:
i. Dla genu HORVU6Hr1G025330 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2 ii. Dla genu HORVU3Hr1G117550 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4 iii. Dla genu HORVU3Hr1G104600 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6 iv. Dla genu HORVU7Hr1G080190 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550, HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych,
f. wybiera się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do innych analizowanych genotypów poziom ekspresji genów HORVU6Hr1G025330, HORVU3Hr1G117550 i niższy w porównaniu do innych analizowanych genotypów poziom ekspresji genów HORVU3Hr1G104600, HORVU7Hr1G080190 wskazujące na obniżoną wrażliwość na strigolaktony.
4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że wzrost siewek jęczmienia prowadzi się przez 14 dni.
5. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, intensywność świetlną od 750 do 1000 μmol m-2 s-1.
6. Sposób według zastrz. 5 znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlną najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
7. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 i/lub GPDH.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437297A PL242227B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437297A PL242227B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL437297A1 PL437297A1 (pl) | 2022-09-19 |
| PL242227B1 true PL242227B1 (pl) | 2023-01-30 |
Family
ID=83724202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL437297A PL242227B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242227B1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL249294B1 (pl) * | 2023-01-26 | 2026-03-23 | Univ Slaski W Katowicach | Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej |
| PL249299B1 (pl) * | 2023-01-26 | 2026-03-23 | Univ Slaski W Katowicach | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu jęczmienia HvD53 i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu jęczmienia HvD53 wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |
| PL249300B1 (pl) * | 2023-01-26 | 2026-03-23 | Univ Slaski W Katowicach | Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej |
| PL249492B1 (pl) * | 2023-01-26 | 2026-04-27 | Uniwersytet Śląski W Katowicach | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |
-
2021
- 2021-03-15 PL PL437297A patent/PL242227B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL437297A1 (pl) | 2022-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Placido et al. | The LATERAL ROOT DENSITY gene regulates root growth during water stress in wheat | |
| WO2020093103A1 (en) | Cannabis plants with a cannabinoid profile enriched for δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabigerol | |
| CN110578015A (zh) | 甘蓝型油菜高矮性状紧密连锁的snp标记及其应用 | |
| Durand et al. | Sexual determination and sexual differentiation | |
| Wu et al. | Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco (Nicotiana tabacum L.) | |
| Cao et al. | Identification of major genomic regions for soybean seed weight by genome-wide association study | |
| Jiang et al. | Mutations in the miRNA165/166 binding site of the HB2 gene result in pleiotropic effects on morphological traits in wheat | |
| Wang et al. | Two soybean homologues of TERMINAL FLOWER 1 control flowering time under long day conditions | |
| Xu et al. | An integrated analysis of transcriptome and metabolome reveals aerenchyma-mediated antioxidant defense and energy metabolism conferring high waterlogging tolerance in sea barley | |
| CN110592114B (zh) | 水稻生长素糖基转移酶基因的应用 | |
| WO2016047778A1 (ja) | トマト耐暑性変異体及びその作出方法 | |
| Boldizsár et al. | The mvp2 mutation affects the generative transition through the modification of transcriptome pattern, salicylic acid and cytokinin metabolism in Triticum monococcum | |
| EP2992756A1 (en) | Onion which have less pungent taste and does not form lachrymatory factor | |
| PL242225B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów | |
| PL242263B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku sygnalizacji strigolaktonów | |
| PL242262B1 (pl) | Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów | |
| Abedian-Chermahini et al. | Rootstock effects on floral induction in commercial Iranian almond cultivars: Insights from morphophysiological, biochemical, and molecular analyses | |
| PL249492B1 (pl) | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia | |
| Dawlah et al. | Genetic relationship between some Egyptian and Yemeni wheat based on different markers | |
| Nguyen et al. | Mapping quantitative trait loci controlling low-temperature germinability in rice | |
| PL249294B1 (pl) | Sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej | |
| Mora | Dissection of genetic determinants of phenology and qualitative traits in Vitis vinifera through two complementary genetic approaches | |
| Zhao et al. | Identification of Candidate Genes Associated with Albino Phenotype in ‘Huangjinya’tea Plant through Genome Resequencing | |
| Shen et al. | Mining the potential of VRS1-5 gene to raise barley grain yield | |
| WO2020260890A1 (en) | Increasing water use efficiency in plants |