PL242225B1 - Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów - Google Patents
Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów Download PDFInfo
- Publication number
- PL242225B1 PL242225B1 PL437300A PL43730021A PL242225B1 PL 242225 B1 PL242225 B1 PL 242225B1 PL 437300 A PL437300 A PL 437300A PL 43730021 A PL43730021 A PL 43730021A PL 242225 B1 PL242225 B1 PL 242225B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- nucleotide sequence
- genes
- gene
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 45
- XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N (3e,3ar,8bs)-3-[[(2r)-4-methyl-5-oxo-2h-furan-2-yl]oxymethylidene]-4,8b-dihydro-3ah-indeno[1,2-b]furan-2-one Chemical compound O1C(=O)C(C)=C[C@@H]1O\C=C/1C(=O)O[C@@H]2C3=CC=CC=C3C[C@@H]2\1 XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 title description 10
- 230000007547 defect Effects 0.000 title description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 49
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims abstract description 32
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 8
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 244000211187 Lepidium sativum Species 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 101710140859 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026620 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- 244000136541 Lepidium campestre Species 0.000 claims description 2
- 235000007849 Lepidium sativum Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 101710180399 Glycine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100028262 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm4 Human genes 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024428 response to biotic stimulus Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, specyficzne dla genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów, charakteryzujące się tym, że mają sekwencję nukleotydową: a) dla genu AT1G73890: starter F 5'-GCCTAGTGATTCCTCCTCTGTTGC-3', starter R 5'-CCATTTGAGCCACTGGAGTAGCAG-3'; b) dla genu AT4G32810: starter F 5'-GTGCAACCCATGAGGATGATGGAG-3', starter R 5'-ACCATGCAAGCCATAAGGAAGGC-3'; c) dla genu AT1G71380: starter F 5'-TGCTCCTACTCTGGTTACAAGGAC-3', starter R 5'-GTTGCTCTTAGCAGCCATGACG-3'. Przedmiotem wynalazku jest również sposób analizy poziomu ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, z użyciem wymienionych par starterów oraz sposób selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego z mutacjami w szlaku biosyntezy bądź sygnalizacji strigolaktonów w oparciu o poziomy ekspresji wymienionych wyżej genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalających na analizę ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i sposób analizy ekspresji tych genów z użyciem wspomnianych starterów pozwalający na selekcję mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy bądź sygnalizacji strigolaktonów. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy genów o identyfikatorach AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 kodujących odpowiednio białko bogate w glicynę, dioksygenazę karotenoidów oraz endoglukanazę. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji z użyciem zaproponowanego systemu badania ekspresji genów.
Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych opisanych w 2008 r (Gomez-Roldan i inni, 2008; Umehara i inni, 2008). Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne (Marzec i Muszyńska, 2015; Marzec 2016; Marzec i Alqudah, 2018). Do tej pory opisano szereg mutantów z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy oraz sygnalizacji strigolaktonów u różnych gatunków roślin, w tym rzodkiewnika pospolitego. Wszystkie do tej pory opisane mutanty wykazują fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych - są formami półkarłowymi z większą liczbą rozgałęzień pędu. Fenotyp ten jest dobrze widoczny w późniejszych etapach rozwoju rośliny, natomiast w stadium siewki, zanim zaczną pojawiać się dodatkowe rozgałęzienia pędów, brak jest widocznych cech pozwalających na rozróżnienie mutantów strigolaktonowych od innych genotypów. Często do selekcji form z uszkodzeniem w szlakach biosyntezy strigolaktonów wykorzystuje się traktowanie syntetycznymi strigolaktonami, które są w stanie odwrócić fenotyp mutantów biosyntezy oraz nie wpływają na fenotyp mutantów sygnalizacji. Jednak w tym wypadku wiąże się to z dodatkowymi kosztami zakupu syntetycznych strigolaktonów i taka selekcja również może zostać przeprowadzona w późniejszych etapach rozwoju rośliny, gdy obecna jest większa liczba rozgałęzień pędu.
W niniejszym zgłoszeniu przedstawiono metodę analizy ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego, która może posłużyć do selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego, zarówno z uszkodzeniem w szlaku sygnalizacji strigolaktonów (mutanty sygnalizacji), jak i uszkodzeniem w szklaku biosyntezy strigolaktonów (mutanty biosyntezy) na wczesnym etapie rozwoju (4-tygodniowe siewki), gdy brak jeszcze rozgałęzień pędu.
Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO31928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325A1) bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizmami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (RO131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie nowych sekwencji starterów pozwalających na identyfikację mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380. U mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego, rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 100 do 150 μmol m-2 s-1 najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1) wykazano podwyższoną ekspresję genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w porównaniu do odmiany wyjściowej.
Proponowane rozwiązanie dotyczące analizy poziomów ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380) jest metodą pozwalającą na selekcję mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów rzodkiewnika pospolitego między sobą i wybranie tych, które niosą uszkodzenie w szlaku biosyntezy bądź sygnalizacji strigolaktonów. Podstawa wynalazku to informacje o poziomie ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380) w siewkach, korzystnie czterotygodniowych, rzodkiewnika pospolitego, rosnących w optymalnych warunkach (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, foto period od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1). Informacje te mogą być wykorzystane do oceny genotypów rzodkiewnika pospolitego pod kątem identyfikacji mutantów strigolaktonowych.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, specyficznych dla genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
Istotę wynalazku stanowi również sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
Kolejną istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2 ii. dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4 iii. dla genu ATIG71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, korzystnie genów: GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) i/lub ACT1 (Actin 1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA,
f. wybiera się genotypy rzodkiewnika pospolitego wykazujące podwyższony poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, wskazujący na obniżoną wrażliwość na strigolaktony (mutant sygnalizacji strigolaktonów) bądź obniżoną produkcję strigolaktonów (mutant biosyntezy strigolaktonów).
Korzystnie, wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie i takie poddaje się dalszym procesom.
Korzystnie, optymalne warunki w jakich prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1 najkorzystniej 120 μmol m-2 s’1.
Przedmiot wynalazku przestawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia przykładową analizę ekspresji genów u trzech genotypów rzodkiewnika pospolitego: odmiany wyjściowej, mutanta sygnalizacji strigolaktonów oraz mutanta biosyntezy strigolaktonów. Ekspresja genów badana była przez porównanie ekspresji genów u genotypów, które rosły w takich samych, optymalnych warunkach. Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na figurze 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów u badanych genotypów.
Wynalazek został przedstawiony w przykładach wykonania, które nie mają charakteru ograniczającego. Jak wynika z uzyskanych wyników, dla celów wynalazku identyfikację mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 można przeprowadzić najkorzystniej na czterotygodniowych siewkach rzodkiewnika pospolitego, które rosną w optymalnych warunkach. Przez optymalne warunki rozumie się temperaturę powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 μmol m-2 s’1. Selekcję odmian o obniżonej wrażliwości na strigolaktony bądź o zmniejszonej produkcji strigolaktonów prowadzi się w oparciu o przeprowadzoną wcześniej analizę poziomu ekspresji genów AT3G59845, AT1G06260 lub AT1G73890 w tkankach całych siewek rzodkiewnika pospolitego.
Przykład 1. Analiza poziomu ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380.
RNA wyizolowano z 4-tygodniowych siewek rzodkiewnika pospolitego, które rosły w optymalnych warunkach (temperatura powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 120 μmol m-2 s-1) z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM 1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) oraz ACT1 (Actin1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA.
Przykład 2. Metoda selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380.
Istotą metody selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego jest porównanie poziomów ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380, z użyciem odpowiednio dobranych starterów. Przykładowy sposób selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego obejmuje następujące etapy:
1. wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie w optymalnych warunkach (temp. powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 120 μmol m-2 s-1),
2. izolację RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego, z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub innym, pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
3. syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA wyizolowanego wcześniej,
4. reakcję qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym,
5. reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) oraz ACT1 (Actin1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA,
6. obliczenie - bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380 oraz genów referencyjnych - względnego poziomu ekspresji badanych genów wykorzystując zwyczajowo przyjęte metody obliczeniowe, oraz porównanie poziomów ekspresji genów pomiędzy badanymi roślinami,
7. wybór genotypów rzodkiewnika pospolitego wykazujących podwyższony poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, gdzie genotypy z podwyższonym poziomem ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 oraz AT1G71380 w porównaniu do pozostałych badanych genotypów są mutantami strigolaktonowymi z uszkodzeniami w szlaku biosyntezy bądź sygnalizacji. Specyficzność podwyższonej ekspresji u mutantów strigolaktonów udowodniono sprawdzając poziom ekspresji genów AT3G59845, AT1G06260 oraz AT1G73890 u odmiany wyjściowej, znanego mutanta biosyntezy strigolaktonów oraz znanego mutanta sygnalizacji strigolaktonów (Fig. 1).
Literatura:
Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 455(7210), 189-194.
Jin, Y., Liu, F., Huang, W., Sun, Q., & Huang, X. (2019). Identification of reliable reference genes for qRT- PCR in the ephemeral plant Arabidopsis pumila based on full-length transcriptome data. Scientific reports, 9(1), 1-11.
Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.
Marzec M, Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.
Marzec M, Gruszka D, Tylec P, Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.
Marzec M, Muszyńska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.
Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., ... & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature, 455(7210), 195-200.
PL 242225 BI
Wykaz sekwencji starterów < 110> Uniwersytet Śląski w Katowicach < 120> Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów <130> 595 <140> P.437300 <141> 2022-11-05 <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gcctagtgat tcctcctctg ttgc 24 <210> 2 <211> 24 < 212> DNA < 213> Arabidopsis thaliana < 400> 2 ccatttgagc cactggagta gcag
PL 242225 BI <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 gtgcaaccca tgaggatgat ggag 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 accatgcaag ccataaggaa ggc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5
| tgctcctact ctggttacaa ggac | 24 |
<210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 gttgctctta gcagccatga cg
Claims (7)
1. Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, specyficznych dla genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
2. Sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 metodą qPCR, znamienny tym, że stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
3. Sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380 metodą qPCR znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu AT1G73890:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2 ii. dla genu AT4G32810:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4 iii. dla genu AT1G71380:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, dla każdej próby cDNA,
f. wybiera się genotypy rzodkiewnika pospolitego wykazujące podwyższony poziom ekspresji genów AT1G73890, AT4G32810 lub AT1G71380, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, wskazujący na obniżoną wrażliwość na strigolaktony bądź obniżoną produkcję strigolaktonów.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1.
PL 242225 BI
6. Sposób według zastrz. 3 i 5, znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlną 120 pmol nr2 s-1.
7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny:
GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) i/lubACT1 (Actinl).
Rysunek
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437300A PL242225B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437300A PL242225B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL437300A1 PL437300A1 (pl) | 2022-09-19 |
| PL242225B1 true PL242225B1 (pl) | 2023-01-30 |
Family
ID=83724209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL437300A PL242225B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242225B1 (pl) |
-
2021
- 2021-03-15 PL PL437300A patent/PL242225B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL437300A1 (pl) | 2022-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Song et al. | Functional properties and expression quantitative trait loci for phosphate transporter GmPT1 in soybean | |
| PL242227B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony | |
| McAdam et al. | Quantitative trait loci in hop (Humulus lupulus L.) reveal complex genetic architecture underlying variation in sex, yield and cone chemistry | |
| Selvaraj et al. | Development and field performance of nitrogen use efficient rice lines for Africa | |
| CN110578015A (zh) | 甘蓝型油菜高矮性状紧密连锁的snp标记及其应用 | |
| US20210076578A1 (en) | Non-gm improved tomato crops and methods for obtaining crops with improved inheritable traits | |
| CN114196772A (zh) | 南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基因及其筛选方法和应用 | |
| Pozzi et al. | Xenia in bahiagrass: gene expression at initial seed formation | |
| CN114457187B (zh) | 梅花实时荧光定量pcr分析中内参基因的筛选方法和应用 | |
| PL242263B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku sygnalizacji strigolaktonów | |
| Shang et al. | Preliminary identification of candidate genes associated with the peach fruit sorbitol content based on comparative transcriptome analysis | |
| PL242262B1 (pl) | Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów | |
| CN119193612A (zh) | 茶树CsGRF7基因及其应用 | |
| CN117778461A (zh) | 番茄SlAAP6基因在促进番茄氨基酸积累、生长发育和耐盐性上的应用 | |
| Magon et al. | Genetics, genomics and breeding of fennel | |
| EP2088194B1 (en) | Method for selecting hop line and breeding marker and primer set used for selecting hop line | |
| CN108823328B (zh) | 野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用 | |
| EP2067860A1 (en) | Method for selection of hop strain, bleeding marker for use in selection of hop strain, and primer set | |
| CN106034659A (zh) | 一种室内快速鉴定小麦冬春性的方法 | |
| CN120574848B (zh) | 一种判断小麦缺氮条件下氮耐受性的基因HD-Zip及其应用 | |
| He et al. | Application of Multiplex Genome Editing Technology on Targeted Improvement of Ecological Adaptability of the Geng Rice Variety Jiahe212 | |
| CN116064655B (zh) | 一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法 | |
| Shanmugaraj | Spatiotemporal multi-omics analyses of the barley (Hordeum vulgare L.) inflorescence reveal a multilayered regulation of developmentally programmed pre-anthesis tip degeneration | |
| US20220251590A1 (en) | Increasing water use efficiency in plants | |
| PL249492B1 (pl) | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia |