PL242262B1 - Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów - Google Patents
Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów Download PDFInfo
- Publication number
- PL242262B1 PL242262B1 PL437301A PL43730121A PL242262B1 PL 242262 B1 PL242262 B1 PL 242262B1 PL 437301 A PL437301 A PL 437301A PL 43730121 A PL43730121 A PL 43730121A PL 242262 B1 PL242262 B1 PL 242262B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- nucleotide sequence
- genes
- arabidopsis
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 45
- XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N (3e,3ar,8bs)-3-[[(2r)-4-methyl-5-oxo-2h-furan-2-yl]oxymethylidene]-4,8b-dihydro-3ah-indeno[1,2-b]furan-2-one Chemical compound O1C(=O)C(C)=C[C@@H]1O\C=C/1C(=O)O[C@@H]2C3=CC=CC=C3C[C@@H]2\1 XHSDUVBUZOUAOQ-WJQMYRPNSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 title claims description 39
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 title 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 244000211187 Lepidium sativum Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000007849 Lepidium sativum Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 8
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 101710140859 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026620 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 244000136541 Lepidium campestre Species 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710180399 Glycine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100028262 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm4 Human genes 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024428 response to biotic stimulus Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, specyficznych dla genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów, charakteryzujące się tym, że mają sekwencję nukleotydową: a) dla genu AT5G33390: starter F 5'-TATGGGACGTGGACGTGGCCGTGG-3', starter R 5'-TGAATGAAGAACAGGCATCAATC-3'; b) dla genu AT3G45760: starter F 5'-TCTGTGATCAAGGGACTGGTATCG-3', starter R 5'-GCTCTGGCCCAATGCTTAATCAAC-3'; c) dla genu AT5G10140: starter F 5'-TGTTCAACTGGAGGAACACCTTG-3', starter R 5'-AGCTTCAACATGAGTTCGGTCTTC-3'. Przedmiotem wynalazku jest również sposób analizy poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, z użyciem wymienionych par starterów oraz sposób selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego z mutacjami w szlaku biosyntezy strigolaktonów w oparciu o poziomy ekspresji wymienionych wyżej genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i sposób analizy poziomu ekspresji tych genów z użyciem wspomnianych starterów pozwalający na identyfikację mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy genów o identyfikatorach AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, kodujących odpowiednio białko bogate w glicynę, białko z rodziny nukleotydylotransferaz oraz loci kwitnienia C. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji z użyciem zaproponowanego systemu badania ekspresji genów.
Strigolaktony to grupa hormonów roślinnych opisanych w 2008 r. (Gomez-Roldan i inni, 2008; Umehara i inni, 2008). Pierwotnie wskazano ich udział w procesie regulacji rozkrzewiania części nadziemnej pędu, jednak w kolejnych latach wykazano, że są również zaangażowane w rozwój systemu korzeniowego, starzenie się roślin czy odpowiedź roślin na stresy biotyczne i abiotyczne (Marzec i Muszyńska, 2015; Marzec 2016; Marzec i Alqudah, 2018). Do tej pory opisano szereg mutantów z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy oraz sygnalizacji strigolaktonów u różnych gatunków roślin, w tym rzodkiewnika pospolitego. Wszystkie do tej pory opisane mutanty wykazują fenotyp charakterystyczny dla mutantów strigolaktonowych - są formami półkarłowymi z większą liczbą rozgałęzień pędu. Fenotyp ten jest dobrze widoczny w późniejszych etapach rozwoju rośliny, natomiast w stadium siewki, zanim zaczną pojawiać się dodatkowe rozgałęzienia pędów, brak jest widocznych cech pozwalających na rozróżnienie mutantów strigolaktonowych od innych genotypów. Często do selekcji form z uszkodzeniem w szlakach biosyntezy strigolaktonów wykorzystuje się traktowanie syntetycznymi strigolaktonami, które są w stanie odwrócić fenotyp mutantów biosyntezy oraz nie wpływają na fenotyp mutantów sygnalizacji. Jednak w tym wypadku wiąże się to z dodatkowymi kosztami zakupu syntetycznych strigolaktonów i taka selekcja również może zostać przeprowadzona w późniejszych etapach rozwoju rośliny, gdy obecna jest większa liczba rozgałęzień pędu.
W niniejszym zgłoszeniu przedstawiono metodę analizy ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego, która może posłużyć do selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego, z uszkodzeniem w szklaku biosyntezy strigolaktonów (mutanty biosyntezy) na wczesnym etapie rozwoju (4-tygodniowe siewki), gdy brak jeszcze rozgałęzień pędu.
Dotychczas ujawnione zgłoszenia patentowe związane ze strigolaktonami dotyczyły głównie syntezy ich analogów (RO131928 A2; US2015250170 A1; US2015141255 A1; WO2013050325 A1) bądź też ich wykorzystania do zwiększenia interakcji pomiędzy roślinami a mikroorganizmami (RO131930 A2) czy metod badania ich bioaktywności (R0131933 A2). W zgłoszeniu o numerze CN109940031 A wykazano, że wykorzystanie syntetycznego strigolaktonu GR24 może zmniejszyć akumulację kadmu u jęczmienia. Natomiast w zgłoszeniu JP2020083853 A opisano substancję hamującą produkcję strigolaktonów u roślin. Ponadto wykazano, że strigolaktony bądź ich analogi mogą też być wykorzystane do kontroli kiełkowania nasion roślin pasożytniczych (CZ2017660 A3) czy nawożenia upraw ryżu (CN108623397 A).
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie nowych sekwencji starterów pozwalających na identyfikację genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140. U genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 100 do 150 μmol m-2 s-1 najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1) wykazano podwyższoną ekspresję genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, w porównaniu do odmiany wyjściowej.
Proponowane rozwiązanie dotyczące analizy poziomów ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140) jest metodą pozwalającą na selekcję genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów rzodkiewnika pospolitego między sobą i wybranie tych, które niosą uszkodzenie w szlaku biosyntezy strigolaktonów. Podstawa wynalazku to informacje o poziomie ekspresji trzech genów rzodkiewnika pospolitego (AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140) w siewkach, korzystnie czterotygodniowych, rzodkiewnika pospolitego, rosnących w optymalnych warunkach (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1). Informacje te mogą być wykorzystane do oceny genotypów rzodkiewnika pospolitego pod kątem identyfikacji genotypów z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów i identyfikację genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
Istotę wynalazku stanowi również sposób analizy poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 rzodkiewnika pospolitego metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
Kolejną istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2 ii. dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4 iii. dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, korzystnie genów: GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) i/lub ACT1 (Actin1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA,
f. wybiera się genotypy rzodkiewnika pospolitego wykazujące podwyższony poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, wykazujące obniżoną produkcję strigolaktonów (mutanty biosyntezy strigolaktonów).
Korzystnie, wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie i takie poddaje się dalszym procesom.
Korzystnie, optymalne warunki w jakich prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1 najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym fig. przedstawia przykładową analizę ekspresji genów u trzech genotypów rzodkiewnika pospolitego: odmiany wyjściowej, mutanta sygnalizacji strigolaktonów oraz mutanta biosyntezy strigolaktonów. Ekspresja genów badana była przez porównanie ekspresji genów u genotypów, które rosły w takich samych, optymalnych warunkach. Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na figurze 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów u badanych genotypów.
Wynalazek został przedstawiony w przykładach wykonania, które nie mają charakteru ograniczającego. Jak wynika z uzyskanych wyników, dla celów wynalazku identyfikację mutantów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 można przeprowadzić najkorzystniej na czterotygodniowych siewkach rzodkiewnika pospolitego, które rosną w optymalnych warunkach. Przez optymalne warunki rozumie się temperaturę powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1 najkorzystniej 120 μmol m- 2 s-1. Selekcję odmian o zmniejszonej produkcji strigolaktonów prowadzi się w oparciu o przeprowadzoną wcześniej analizę poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 w tkankach całych siewek rzodkiewnika pospolitego.
Przykład 1. Analiza poziomu ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140.
RNA wyizolowano z 4-tygodniowych siewek rzodkiewnika pospolitego, które rosły w optymalnych warunkach (temperatura powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 120 μmol m-2 s-1) z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu AT5G33390:
starter F sekwencja nukleotydowa 1 starter R sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F sekwencja nukleotydowa 3 starter R sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F sekwencja nukleotydowa 5 starter R sekwencja nukleotydowa 6.
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) oraz ACT1 (Actin1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA.
Przykład 2. Metoda selekcji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140.
Istotą metody selekcji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów jest porównanie poziomów ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140, z użyciem odpowiednio dobranych starterów. Przykładowy sposób selekcji mutantów strigolaktonowych rzodkiewnika pospolitego obejmuje następujące etapy:
1. wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie w optymalnych warunkach (temperatura powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlna 120 μmol m-2 s-1),
2. izolację RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego, z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub innym, pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
3. syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA wyizolowanego wcześniej,
4. reakcję qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140:
a) dla genu AT5G33390:
starter F sekwencja nukleotydowa 1 starter R sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F sekwencja nukleotydowa 3 starter R sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F sekwencja nukleotydowa 5 starter R sekwencja nukleotydowa 6 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym,
5. reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) oraz ACT1 (Actin1) (Jin i inni, 2019) dla każdej próby cDNA,
6. obliczenie - bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140 oraz genów referencyjnych - względnego poziomu ekspresji badanych genów wykorzystując zwyczajowo przyjęte metody obliczeniowe, oraz porównanie poziomów ekspresji genów pomiędzy badanymi roślinami,
7. wybór genotypów rzodkiewnika pospolitego wykazujących podwyższony poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, gdzie genotypy z podwyższonym poziomem ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140 w porównaniu do pozostałych badanych genotypów są mutantami strigolaktonowymi z uszkodzeniami w szlaku biosyntezy. Specyficzność podwyższonej ekspresji u mutantów biosyntezy udowodniono sprawdzając poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 oraz AT5G10140 u odmiany wyjściowej, znanego mutanta biosyntezy strigolaktonów oraz znanego mutanta sygnalizacji strigolaktonów (Fig. 1).
Literatura:
Gomez-Roldan, V., Fermas, S., Brewer, P. B., Puech-Pages, V., Dun, E. A., Pillot, J. P., & Bouwmeester, H. (2008). Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 455(7210), 189-194.
Jin, Y., Liu, F., Huang, W., Sun, Q., & Huang, X. (2019). Identification of reliable reference genes for qRT-PCR in the ephemeral plant Arabidopsis pumila based on full-length transcriptome data. Scientific reports, 9(1), 1-11.
Marzec M. (2016). Perception and signaling of strigolactones. Front Plant Sci, 7, 1260.
Marzec M, Alqudah AM. (2018). Key hormonal components regulate agronomically important traits in barley. IJMS, 19, 795.
Marzec M, Gruszka D, Tylec P, Szarejko I. (2016). Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiol Plant 158(3), 341-355.
Marzec M, Muszyńska A. (2015). In silico analysis of the genes encoding proteins that are involved in the biosynthesis of the RMS/MAX/D pathway revealed new roles of strigolactones in plants. IJMS, 16(4), 6757-6782.
Umehara, M., Hanada, A., Yoshida, S., Akiyama, K., Arite, T., Takeda-Kamiya, N., ... & Kyozuka, J. (2008). Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature, 455(7210), 195-200.
PL 242262 Β1
Wykaz sekwencji starterów <110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiew nika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy stngolaktonów.
<130> 596 <140> P.437301 <141> 2022-11-05 <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tatgggacgt ggacgtggcc gtgg 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 tgaatgaaga acaggcatca atc
PL 242262 Β1 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 tctgtgatca agggactggt atcg <210>
<211>
<212>
DNA <213>
Arabidopsis thaliana <400>
gctctggccc aatgcttaat caac <210> 5 <211> 23 < 212> DNA < 213> Arabidopsis thaliana < 400> 5 tgttcaactg gaggaacacc ttg < 210> 6 < 211> 24 < 212> DNA < 213> Arabidopsis thaliana < 400> 6 agcttcaaca tgagttcggt cttc 24
Claims (7)
1. Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów i identyfikację genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
2. Sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 metodą qPCR, służący do identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, znamienny tym, że stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6.
3. Sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego w optymalnych warunkach,
b. izoluje się RNA z siewek rzodkiewnika pospolitego,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140 metodą qPCR znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu AT5G33390:
starter F - sekwencja nukleotydowa 1 starter R - sekwencja nukleotydowa 2 ii. dla genu AT3G45760:
starter F - sekwencja nukleotydowa 3 starter R - sekwencja nukleotydowa 4 iii. dla genu AT5G10140:
starter F - sekwencja nukleotydowa 5 starter R - sekwencja nukleotydowa 6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, dla każdej próby cDNA,
f. wybiera się genotypy rzodkiewnika pospolitego wykazujące podwyższony poziom ekspresji genów AT5G33390, AT3G45760 lub AT5G10140, w odniesieniu do innych genotypów analizowanych w tym samym procesie, wskazujący na obniżoną produkcję strigolaktonów.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wzrost siewek rzodkiewnika pospolitego prowadzi się przez 4 tygodnie.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza od 18 do 22°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, intensywność świetlną od 100 do 150 μmol m-2 s-1.
PL 242262 Β1
6. Sposób według zastrz. 3 i 5, znamienny tym, że optymalne warunki oznaczają temperaturę powietrza 20°C, fotoperiod 16/8, intensywność świetlną 120 pmol pmol m-2 s’1.
7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) i/lub ACT1 (Actinl).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437301A PL242262B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437301A PL242262B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL437301A1 PL437301A1 (pl) | 2022-09-19 |
| PL242262B1 true PL242262B1 (pl) | 2023-02-06 |
Family
ID=83724211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL437301A PL242262B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów specyficznych dla genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy poziomu ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy strigolaktonów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242262B1 (pl) |
-
2021
- 2021-03-15 PL PL437301A patent/PL242262B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL437301A1 (pl) | 2022-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mattiello et al. | Physiological and transcriptional analyses of developmental stages along sugarcane leaf | |
| PL242227B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony | |
| US20210076578A1 (en) | Non-gm improved tomato crops and methods for obtaining crops with improved inheritable traits | |
| Zhang et al. | The genetic architecture of shoot–root covariation during seedling emergence of a desert tree, Populus euphratica | |
| Ge et al. | Spatiotemporal transcriptome and metabolome landscapes of cotton somatic embryos | |
| Dong et al. | The regulatory role of gibberellin related genes DKGA2ox1 and MIR171f_3 in persimmon dwarfism | |
| PL242263B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku sygnalizacji strigolaktonów | |
| PL242225B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów rzodkiewnika pospolitego, sposób analizy ekspresji genów rzodkiewnika pospolitego oraz sposób identyfikacji genotypów rzodkiewnika pospolitego z uszkodzeniem w szlaku biosyntezy lub sygnalizacji strigolaktonów | |
| CN119193612A (zh) | 茶树CsGRF7基因及其应用 | |
| CN117070536A (zh) | 拟南芥hos1基因在调控叶片衰老中的应用 | |
| CN108823328B (zh) | 野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用 | |
| CN120574848B (zh) | 一种判断小麦缺氮条件下氮耐受性的基因HD-Zip及其应用 | |
| US20100279284A1 (en) | Method for selecting hop line and breeding marker and primer set used for selecting hop line | |
| JPWO2008035702A1 (ja) | ホップ株の選抜方法並びにホップ株の選抜に用いる育種マーカー及びプライマーセット | |
| Guo et al. | Combined omics unravels the molecular mechanism of golden-leaf coloration in Koelreuteria paniculata ‘jinye’ | |
| PL249492B1 (pl) | Sekwencje starterów do amplifikacji fragmentu genu HvD53 jęczmienia i sposób identyfikacji osobników jęczmienia pod kątem występowania mutacji T4001C w obrębie fragmentu genu HvD53 jęczmienia, wpływającej na zmniejszenie rozkrzewienia części nadziemnej jęczmienia | |
| Shanmugaraj | Spatiotemporal multi-omics analyses of the barley (Hordeum vulgare L.) inflorescence reveal a multilayered regulation of developmentally programmed pre-anthesis tip degeneration | |
| Awakale et al. | Osmotic stress induced root growth and regulation of root development related genes in progenitors of wheat | |
| CN105385687B (zh) | 烟草26s rna内参基因的克隆方法及其应用 | |
| Doque | On the biological relevance of alternative splicing in plants: dual function of an Arabidopsis membrane transporter | |
| Dou | Genetic analysis to determine if S33Ab, S33Ac and S33Ad chloroplast proteases contribute to stromal protein degradation during Arabidopsis thaliana leaf senescence | |
| Glander | Is the immune system required to adapt to flowering time change? | |
| Jopek | The preliminary stage of SCAR markers development for Ranunculus subgen. Batrachium | |
| Siwinska et al. | Gene-to-metabolite network for coumarins biosynthesis in natural accessions of Arabidopsis thaliana | |
| Wilmowicz et al. | Molecular cloning and preliminary expression analysis of complete cDNA homologue LOX2 gene in Lupinus luteus |