CN107557437A - 一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对，其特征在于：所述的引物对的引物1为Seq ID No.1所示序列，引物2为Seq ID No.2所示序列，Seq ID No.1：5’GATGAGATGTGTGCATACTTG 3’；Seq ID No.2:5’CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG 3’。利用本发明获得引物结合HRM可以对大量杂交后代群体进行筛选，可有效区分非突变、突变杂合体与突变纯合体，从而准确高效鉴定出含烟草CYP82E4突变基因的材料。

Description

一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对及 方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

烟草中的降烟碱含量直接影响烟草制品的品质和安全性，降烟碱可通过亚硝化作用形成烟草特有亚硝胺(TSNAs)，TSNAs可诱导实验动物产生多种癌症，其中NNN和NNK的致癌性已被验证。

烟草是富含生物碱的经济作物，其中烟碱是最主要的生物碱，烟草在生长发育、衰老、调制等过程中会出现烟碱去甲基化而转化成降烟碱。因降烟碱检测易受环境影响且检测较为复杂，采用常规育种手段选育低降烟碱含量品种较为困难，利用RNAi、基因敲除、EMS诱变等技术阻断或降低烟草中烟碱向降烟碱的转化是提高烟叶品质，降低烟叶中TSNAs含量的重要途径。目前转基因生物品种的安全性备受争议，因此，开展烟草非转基因的分子育种，选育低烟碱转化的烟草新品种，对降低烟草危害具有重要的经济和社会意义，其中EMS诱变结合TILLING技术筛选降烟碱转化相关基因突变体是获得非转基因低降烟碱材料的重要手段之一。

目前，研究人员相继分离和鉴定了与降烟碱转化密切相关的多个基因如：CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10，其中CYP82E4是烟碱转化成降烟碱的关键基因，起主导作用。因此，通过诱导该基因产生突变，进而影响烟碱转化过程，可望获得低降烟碱材料。项目组前期通过对贵烟1号EMS突变体库进行筛选获得了 CYP82E4基因发生突变的材料，表型鉴定表明该突变体相比野生型降烟碱含量显著降低。针对CYP82E4基因开发了功能性的分子标记， PCR产物用HRM检测仪器扫描，根据高分辨率熔解曲线(HRM)，可准确高效的鉴定出杂交后代中含相关突变基因的材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种鉴别烤烟低降烟碱突变基因CYP82E4的引物及检测方法，通过高分辨率溶解曲线快速筛选包含CYP82E4突变基因的材料，加快烟草低降烟碱育种进程。

本发明的技术方案是：一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对，所述的引物对的引物1为Seq ID No.1所示序列，引物2为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’GATGAGATGTGTGCATACTTG 3’；

Seq ID No.2:5’CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG 3’。

一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对的检测方法，根据权利要求1中所述的引物对，以被检测烟草的DNA为模板进行扩增，其扩增产物可根据HRM曲线可区分突变型和非突变型。

具体包含以下步骤：

(1)提取烟草样品苗期叶片总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；

(3)PCR产物利用HRM检测仪器LightScanner96进行扫描；

(4)根据HRM曲线结果，判断烟草样品的基因型；当HRM曲线与野生型贵烟1号一致时，则为非突变型；如果HRM荧光曲线峰值ΔF≥0.05，且曲线与纯合突变体一致时，则为纯合突变型；如果出现其他曲线类型，则为杂合突变类型。

突变型基因序列如Seq ID No.4所示，非突变型基因序列如Seq ID No.3所示。

本发明的有益效果：

1、利用本发明获得引物结合HRM可以对大量杂交后代群体进行筛选，可有效区分非突变、突变杂合体与突变纯合体，从而准确高效鉴定出含烟草CYP82E4突变基因的材料。

2、利用该引物及检测方法可在苗期对其叶片进行检测，无需进行表型验证，可以大大提高烟草低降烟碱品种的选择效率，加快低降烟碱烟草育种进程。

附图说明

图1为HRM检测(左为标准熔解曲线图，右为熔解曲线衍生图)；说明： HRM可以检测到所有单碱基的变化，对G/A变化特别敏感，AT碱基对稳定性比GC碱基对差，而杂合子型稳定性更差，故熔解温度GA(杂合子突变)<AA (纯合子突变)<GG(野生型)；

图2为测序验证结果(测序结果与HRM检测结果吻合)；①为G/G野生型的测序结果；②为G/A的杂合型的测序结果，SNP处显示重叠峰，从曲线颜色可以判断出是GA杂合型；③为A/A的纯合型的测序图。

具体实施方式

一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物及方法:包含以下步骤：

(1)提取烟草样品苗期叶片总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用引物对Seq ID No.1：5’ GATGAGATGTGTGCATACTTG3’；Seq ID No.2:5’ CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG 3’进行PCR扩增；

(3)PCR产物利用HRM检测仪器LightScanner96进行扫描；

(4)根据HRM曲线结果结果，判断烟草样品的基因型；当HRM 曲线与野生型贵烟1号一致时(图1，灰色曲线)，则为野生(非突变)型；如果HRM荧光曲线峰值ΔF≥0.05，且曲线与纯合突变体一致时，则为纯合突变型(图1)；如果出现其他曲线类型，则为杂合突变类型(图1)。

具体实施：

(1)提取烟草样品苗期叶片总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；

10μlPCR体系包括5μl的2×Gene Solution master mix(上海硕盟生物科技有限公司)，20×EvaGreen Dye(Biotium，Hayward，USA) 0.5μl，各0.2μl的正、反向引物(10μM)以及1μl的模板DNA(～100 ng/μl)，去离子无菌水补足至10μl，最后加一滴矿物油防止溶液蒸发。 PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。

(3)PCR产物利用HRM检测仪器LightScanner96进行扫描；

PCR结束后，将PCR板短暂离心后直接用HRM检测仪器 LightScanner96(IdahoTechnology Inc.，USA)对PCR产物进行扫描。 PCR产物以每秒0.1℃的速度从55℃加热至95℃，荧光信号强度随温度升高而发生变化形成熔解曲线，之后用LightScanner数据分析软件 Call IT TM 2.0(Idaho Technology Inc.)根据操作说明分析数据。观察并分析表示样本与对照(野生型)的荧光值相对差异(Δ Fluorescence，ΔF)的荧光变化曲线以及非标记探针分型的荧光值随温度变化的导数(-dF/dT)曲线。当荧光曲线峰值ΔF≥0.05认为有明显的差异，并重复验证。

(4)测序验证HRM准确性：候选基因突变材料，利用高保真 Taq酶进行PCR反应，PCR体系为50μl，PCR程序及条件同上，1％琼脂糖凝胶电泳检测分离PCR产物，紫外分析仪下切割目的片段，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化产物。将回收的DNA进行测序，根据测序结果判断HRM分析是否正确。

(5)突变后代材料的跟踪检测：筛选出的材料后代每份种植15 个单株，后代材料按照上述同样方法跟踪分子检测，进一步确认基因野生型及突变体测序结果。

(6)纯和突变体降烟碱测定：田间试验采用完全随机区组设计， 3次重复，2行区，每行种植15株，行株距1.1m×0.6m，四周设置保护行。栽培管理措施：选择有代表性、地面平整、前茬一致、排灌方便、土壤肥力中等且基本均匀的旱作土壤作为试验地；严格按照最佳育苗方式和管理措施进行育苗；移栽方式为“井窖式”，所有试验品种(系)在同一天移栽，其它农事操作做到严格一致；亩施纯氮量6.0 kg，氮、磷、钾比例为1：2：3，基肥占总肥料用量的70％，追肥占 30％；在烟株中心花开放达50％一次性打顶，严格把握各品种(系) 烟叶的田间成熟度，按品系挂牌，分部位分重复进行采样，杀青烘干后测定其降烟碱含量，经测定该突变体与野生型相比降烟碱含量降幅达29％。

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院 浙江大学

<120>一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对及方法

<160>4

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

GATGAGATGTGTGCATACTTG

<210>2

<211>23

<212> DNA

<213>人工合成

<400>2

CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG

<210>3

<211>811

<212> DNA

<213>贵烟1号（野生型）CYP82E4

<400>3

GATGAGATGT GTGCATACTT GACAATAACT ATACTAACTA AAACAAGGTA TGTGAATAAT 60

TGATATTCCT TTTTTAATTA TTCTTTTTTC CAGAGTTTGG TCTTGGATGC AGCAGACACA 120

GTTGCTCTTC ACATAAATTG GGGAATGGCA TTATTGATAA ACAATCAAAA GGCCTTGACG 180

AAAGCACAAG AAGAGATAGA CACAAAAGTT GGTAAGGACA GATGGGTAGA AGAGAGTGAT 240

ATTAAGGATT TGGTATACCT CCAAGCTATT GTTAAAGAAG TGTTACGATT ATATCCACCA 300

GGACCTTTGT TAGTACCACA CGAAAATGTA GAAGATTGTG TTGTTAGTGG ATATCACATT 360

CCTAAAGGGA CAAGATTATT CGCAAACGTC ATGAAACTGC AACGTGATCC TAAACTCTGG 420

TCTGATCCTG ATACTTTCGA TCCAGAGAGA TTCATTGCTA CTGATATTGA CTTTCGTGGT 480

CAGTACTATA AGTATATCCC GTTTGGTTCT GGAAGACGAT CTTGTCCAGG GATGACTTAT 540

GCATTGCAAG TGGAACACTT AACAATGGCA CATTTGATCC AAGGTTTCAA TTACAGAACT 600

CCAAATGACG AGCCCTTGGA TATGAAGGAA GGTGCAGGCA TAACTATACG TAAGGTAAAT 660

CCTGTGGAAC TGATAATAGC GCCTCGCCTG GCACCTGAGC TTTATTAAAA CCTAAGATCT 720

TTCATCTTGG TTGATCATTG TATAATACTC CTAAATGGAT ATTCATTTAC CTTTTATCAA 780

TTAATTGTCA GTACGAGTTT TTCTAATTTG G 811

<210>4

<211>811

<212> DNA

<213>贵烟1号（突变型）CYP82E4

<400>4

GATGAGATGT GTGCATACTT GACAATAACT ATACTAACTA AAACAAGGTA TGTGAATAAT 60

TGATATTCCT TTTTTAATTA TTCTTTTTTC CAGAGTTTGG TCTTGGATGC AGCAGACACA 120

GTTGCTCTTC ACATAAATTG GGGAATGGCA TTATTGATAA ACAATCAAAA GGCCTTGACG 180

AAAGCACAAG AAGAGATAGA CACAAAAGTT GGTAAGGACA GATGGGTAGA AGAGAGTGAT 240

ATTAAGGATT TGGTATACCT CCAAGCTATT GTTAAAGAAG TGTTACGATT ATATCCACCA 300

GGACCTTTGT TAGTACCACA CGAAAATGTA GAAGATTGTG TTGTTAGTGG ATATCACATT 360

CCTAAAGGGA CAAGATTATT CGCAAACGTC ATGAAACTGC AACGTGATCC TAAACTCTGG 420

TCTGATCCTG ATACTTTCGA TCCAGAGAGA TTCATTGCTA CTGATATTGA CTTTCGTGGT 480

CAGTACTATA AGTATATCCC GTTTGGTTCT GGAAGACGAT CTTGTCCAGG GATGACTTAT 540

GCATTGCAAG TGGAACACTT AACAATGGCA CATTTGATCC AAGGTTTCAA TTACAGAACT 600

CCAAATGACG AGCCCTTGGA TATGAAGGAA GGTGCAAGCA TAACTATACG TAAGGTAAAT 660

CCTGTGGAAC TGATAATAGC GCCTCGCCTG GCACCTGAGC TTTATTAAAA CCTAAGATCT 720

TTCATCTTGG TTGATCATTG TATAATACTC CTAAATGGAT ATTCATTTAC CTTTTATCAA 780

TTAATTGTCA GTACGAGTTT TTCTAATTTG G 811

Claims (3)

1.一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对，其特征在于：所述的引物对的引物1为Seq ID No.1所示序列，引物2为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’GATGAGATGTGTGCATACTTG 3’；

Seq ID No.2:5’CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG 3’。

2.如权利要求1所述的一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对的检测方法，其特征在于：根据权利要求1中所述的引物对，以被检测烟草的DNA为模板进行PCR扩增，其扩增产物可根据HRM熔解曲线区分为突变型和非突变型。

3.根据权利要求2所述的一种鉴定烟草低降烟碱突变体杂交后代基因型的引物对的检测方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)提取烟草样品苗期叶片总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；

(3)PCR产物利用HRM检测仪器LightScanner96进行扫描；

(4)根据HRM曲线结果，判断烟草样品的基因型；当HRM曲线与野生型贵烟1号一致时，则为非突变型；如果HRM荧光曲线峰值ΔF≥0.05，且曲线与纯合突变体一致时，则为纯合突变型；如果出现其他曲线类型，则为杂合突变类型。