PL248657B1

PL248657B1 - Sposób określania ryzyka raka u kobiety będącej nosicielką mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej w zależności od stężenia selenu lub stosunku stężeń selenu do arsenu we krwi

Info

Publication number: PL248657B1
Application number: PL439318A
Authority: PL
Inventors: Jan LUBIŃSKI; Jan Lubiński; Anna Jakubowska; Wojciech MARCINIAK; Wojciech Marciniak; Magdalena MUSZYŃSKA; Magdalena Muszyńska; Róża Derkacz; Katarzyna Kaczmarek; Tomasz Huzarski; Jacek Gronwald; Cezary Cybulski
Original assignee: Read Gene Spolka Akcyjna
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2026-01-12
Also published as: PL439318A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób określenia ryzyka raka, charakteryzujący się tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia selenu w próbce biologicznej osoby badanej, przy czym stężenie selenu wskazuje na znacząco obniżone ryzyko: rozwoju raka wśród kobiet poniżej 50 roku życia, w przypadku występowania optymalnego stężenia we krwi, zwłaszcza w przedziale od 70 µg/l do 89 µg/l rozwoju raka wśród kobiet powyżej 50 roku życia, w przypadku występowania optymalnego stężenia selenu we krwi, zwłaszcza w przedziale od 95 µg/l do 120 µg/l; rozwoju raka w przypadku występowania optymalnego stosunku stężeń selenu do arsenu we krwi, zwłaszcza w zakresie od 115,00 do 200,00.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu określenia ryzyka raków u kobiet. Opisywany wynalazek opiera się na ustaleniu, że istnieje korelacja między stężeniem selenu lub stosunkiem stężeń selenu do arsenu we krwi pełnej a ryzykiem raków u kobiet będących nosicielkami mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej. Prezentowany sposób powinien znaleźć zastosowanie w szeroko rozumianej diagnostyce i profilaktyce nowotworów, zwłaszcza u kobiet.

Selen

W organizmie selen działa poprzez białka, do których jest wbudowany w postaci selenocysteiny. Jako składnik selenobiałek selen odgrywa rolę enzymatyczną, jak i strukturalną. Do jednych z ważniejszych funkcji selenobiałek należy udział w produkcji hormonów tarczycy, pobudzanie układu immunologicznego, oraz ochrona przed stresem oksydacyjnym (Combs GF, 2001). Zarówno niedobór jak i nadmiar tego pierwiastka może mieć niekorzystny wpływ na organizm. Jednakże, wydaje się, że znacznie poważniejsze konsekwencje są związane z niedoborem selenu. Prowadzą one do m.in. zaburzeń pracy serca, zwyrodnienia serca i wątroby, zwiększenia ryzyka choroby nadciśnieniowej, ograniczenia sprawności układu odpornościowego, zaburzenia funkcji tarczycy, zaburzenia mineralizacji kości i prawidłowego wykształcenia zębów oraz zwiększenia ryzyka chorób nowotworowych (Reddy VN, 2001). Wyniki badań eksperymentalnych przeprowadzonych na modelach zwierzęcych (Kim JH, 2011; Yang H, 2011) jak i prób klinicznych u ludzi wskazują na związek pomiędzy stężeniem tego pierwiastka w organizmie, a zachorowaniem na nowotwory (Schrauzer GN, 1977; Pourmand G, 2008; Vand den Brandt PA, 1993; Knekt P, 1998; Mark SD, 2000; Borawska MH, 2009; Jabłońska E, 2008; Duffield-Lillico AJ, 2002; Duffield-Lillico AJ, 2003; Reid ME, 2002; Reid ME, 2006; Lippman SM, 2009; Klein EA, 2011). Większość badań wykazała odwrotną zależność między stężeniem selenu a zachorowaniem na nowotworowy bądź ryzykiem wystąpienia choroby. Jednak u kobiet stwierdzano nieoczekiwanie, że wysokie stężenie selenu zwiększało ryzyko raków (Duffield-Lillico AJ, 2002).

Arsen

Bez wątpienia arsen i jego związki są jednymi z najbardziej rozpoznawalnych trucizn. Według klasyfikacji międzynarodowej agencji do badań nad rakiem (IARC, ang. International Agency for Cancer Research) arsen i jego związki zostały określone jako bezwzględne ludzkie karcynogeny - grupa 1 (strona inetrnetowa: http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/latest classif.php; data wejścia 201708-26). Różnorodność objawów klinicznych wywołanych inhalacją związkami arsenu lub jego spożyciem jest bardzo duża. W zależności od stężenia, czasu ekspozycji i drogi zaabsorbowania skutki oddziaływania arsenu z tkankami są od stosunkowo niegroźnych na przykład hipopigmentacji, po zagrażające życiu nowotwory (WHO). W świetle istniejących danych literaturowych można stwierdzić, że wysokie stężenia arsenu mogą być przyczyną takich raków jak rak płuca (Mostafa MG, 2008), nerki (Hopenhayn-Rich C, 1996), skóry (Karagas MR, 2001), pęcherza (Mostafa MG, 2008), czy trzustki (Liu Mares W, 2013). Istnieją też prace wskazujące odwrotną korelację - np. Lamm i wsp. stwierdzili nieistotne zmniejszenie ryzyka zachorowania na raka pęcherza moczowego wraz z rosnącym narażeniem na arsen w wodzie pitnej, w zakresie 3,0-6,0 j.xg/l (Lamm SH, 2004)

Przedmiotem wynalazku jest sposób określania ryzyka raka u kobiety będącej nosicielką mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej, charakteryzujący się tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia selenu lub stosunku stężenia selenu do arsenu w próbce krwi uzyskanej od badanej kobiety, przy czym stężenie selenu i arsenu:

- wskazuje na istotnie 10,4-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka wśród kobiet poniżej 50 roku życia, w przypadku występowania stężenia selenu we krwi w przedziale od 70 μ-g/l do 89 μ-g/l, w porównaniu do kobiet z tej grupy wiekowej, u których stężenie selenu znajduje się poza wskazanym zakresem,

- wskazuje na istotnie 4,2-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka wśród kobiet powyżej 50 roku życia, w przypadku występowania stężenia selenu we krwi w przedziale od 95 μ-g/l do 120 μ-g/l, w porównaniu do kobiet z tej grupy wiekowej, u których stężenie selenu znajduje się poza wskazanym zakresem,

- wskazuje na istotnie 15,8-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka w przypadku występowania stosunku stężeń selenu do arsenu we krwi w zakresie od 115,00 do 200,00, w porównaniu do kobiet, u których stosunek stężeń selenu do arsenu we krwi znajduje się poza wskazanym zakresem,

PL 248657 Β1 przy czym badana kobieta jest nosicielką mutacji w genie BRCA1 wybranej spośród: 5382insC, C61G, 4153delA i należy do populacji polskiej.

Korzystnie próbkę materiału stanowi krew pełna.

Korzystnie stężenie selenu i arsenu w próbce oznacza się poprzez bezpośredni pomiar we krwi pełnej.

Przykład realizacji wynalazku

Grupa obserwacyjna została wybrana spośród osób, których materiał znajduje się w biobanku naszego ośrodka. Pacjentki, którzy zgłosili się w latach 2010-2016 do Onkologicznej Poradni Genetycznej przy Szpitalu Klinicznym Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, byli zapraszani do oddania próbki krwi w celu biobankowania i podpisywali zgodę na przechowywanie i wykorzystywanie materiału w celach naukowych. Próbki krwi były pobierane w godzinach 8-14, a pacjentki były poinformowane o konieczności bycia na czczo przez co najmniej przez 4 godziny przed pobraniem. Dla większości pacjentek próbka była pobrana tylko raz, ale w niektórych przypadkach również więcej razy przy okazji kolejnych wizyt. Próbkę krwi przechowywano w -80°C do momentu oznaczenia stężenia selenu.

W biobanku zgromadzono próbki od 33062 osób, które nigdy wcześniej przed pobraniem próbki nie chorowały na nowotwór złośliwy. Na potrzeby badania grupę 601 nosicielek jednej z mutacji w genie BRCA1 charakterystycznych dla populacji polskiej tj. 5382insC, C61G, 4153delA poddano 3 letniej obserwacji. Do grupy nie włączono osób z nowotworem złośliwym rozpoznanym przed pobraniem próbki krwi. Następnie w trzech głównych ośrodkach onkologicznych w Szczecinie, sprawdzano która z osób wyjściowo zdrowych w momencie włączenia do biobanku, zachorowała. Spośród 601 osób, w ciągu ponad 3 lat obserwacji, na nowotwór złośliwy zachorowały 42 kobiety. Pozostała część grupy stanowiła grupę kontrolną badania.

Charakterystykę kohorty prospektywnej przedstawiono w tabeli poniżej (Tabela 1).

Tabela 1. Charakterystyka grupy

Cecha	Chore	Zdrow^re
Liczba osób	42 osób	559 osób
Średni wiek w momencie zabezpieczenia materiału	43,66 lat	39,57 lat
Średni okres śledzenia stanu zdrowia (follow-up)	3 6 mi esi ęcy
Liczba osób po zabiegu adneksektomii	8	15
Lokalizacja narządowa nowotworu	Liczba osób	Procentowy udział w całej grupie chorych
Pierś	31	73,81
Jajniki _f	¹ .?	21,43
Otrzewna	1	2,38
Szyjka macicy	l	2,38

Materiał

Od każdej osoby włączonej do badania pobrano próbkę krwi do pomiaru stężenia selenu i arsenu.

Metoda oznaczania zawartości Se i As we krwi pełnej.

1.1 Aparat

Do określenia zawartości wskazanych metali wykorzystana została technika spektrometrii mass ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej.

Do wykonania pomiaru wykorzystano spektrometr mas ELAN DRC-e (PerkinElmer) oraz NexION 350D (PerkinElmer). Wykorzystanie ICP-MS pozwala uzyskać limity detekcji <0,1 μg/l. Podczas prowadzenia oznaczeń populacji nieeksponowanej zawodowo na metale i ich związki, czułość aparatury odgrywa kluczową rolę.

1.2 Przygotowanie do pomiaru

Zebrane próby krwi, zostały rozmrożone z temperatury -80°C do temperatury pokojowej, w dniu wykonywania analiz. Każda próbka została dokładnie wymieszana przy użyciu wstrząsarki lub worteksu w celu uzyskania możliwie największej homogenności materiału. Proces ten został powtórzony bezpośrednio przed pobraniem objętości krwi do rozcieńczeń z uwagi na zjawisko rozwarstwiania się krwi. Stosując możliwie najprostszą technikę, próbki krwi zostały rozcieńczone w stosunku 1:30 (50 μl krwi : 1450 μl buforu). Z uwagi na specyfikę pomiaru do rozcieńczeń zastosowano roztwór wodorotlenku tetrametyloamonowego (TMAH). Alkaliczne pH zapewnia dobrą rozpuszczalność składników krwi, nie powodując tym samym precypitacji żadnej z frakcji. Dodatkowo w celu lepszej dyspersji rozpuszczonych składników krwi zastosowano dodatek niejonowego surfaktantu w postaci Trytonu X-100. Wykorzystanie tego związku nie tylko ułatwia rozpuszczanie m.in. białek ale także przyczynia się do szybszego wypłukiwania próbki z układu wprowadzenia spektrometru. Do korekcji efektu matrycy oraz dryfu aparatu użyty został standard wewnętrzny w postaci rodu (¹⁰⁵Rh). Do uzyskania stabilności jonów metali rozpuszczonych w roztworze zastosowany został dodatek kwasu wersenowego (EDTA). Dodatkowo, z racji zawartości związków zawierających węgiel, zastosowano dodatek butanolu do wszystkich roztworów w celu niwelacji efektu związanego ze znaczną ilością węgla w badanej próbie.

1.3 Warunki pomiaru

Wszystkie oznaczenia przeprowadzono z wykorzystaniem kwadrupolowej celi reakcyjnej spektrometru, tzw. trybie DRC (ang. Dynamic Reaction Cell) aparatu Elan DRC-e oraz NexION 350D (PerkinElmer) z tlenem jako gazem reakcyjnym. Tlen jest gazem z wyboru dla prowadzenia oznaczeń As i Cd. W przypadku oznaczeń As, wykorzystanie tlenu pozwala uzyskać na drodze reakcji chemicznej stabilnego produktu w postaci jonu ⁷⁵As¹⁶O+. Jon ten posiada masę 91, która wolna jest od interferencji spektralnych. Rozwiązanie to zapewnia maksimum specyfiki pomiaru As. Podobne rozwiązanie dotyczy oznaczeń kadmu. W tym przypadku jednak dokonano transferu atomu tlenu na interferent a nie jak w przypadku As na pożądany jon. Najpoważniejszą interferencję w oznaczeniach ¹¹⁴Cd stanowi tlenek molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O. Zastosowanie tlenu pozwala na uzyskanie ditlenku molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O2, niwelując tym samym problem nakładania się tych dwóch mas. Obecnie jest to najbardziej czuła technika oznaczeń dla materiału biologicznego.

W przypadku Zn tlen pozostaje inertny.

1.4 Walidacja pomiarów

Do walidacji pomiarów zastosowano następujące materiały referencyjne ClinCheck (Recipe, Niemcy), NIST 955c (National Institute of Standards and Technology, Stany Zjednoczone) oraz BCR 634 (European Commission, Community Bureau of Reference). Są to standardy odniesienia powszechnie stosowane w spektrometrii, pozwalające na potwierdzenie precyzji, czułości i specyfiki pomiaru.

Statystyka

Różnice w częstościach pomiędzy analizowanymi grupami oceniano przy pomocy Testu Zgodności Fishera.

Wyniki

Analiza otrzymanych wyników wykazała istotną zależność między ryzykiem raków u Polek, będących nosicielkami mutacji w genie BRCA1, a stężeniem selenu lub stosunku stężenia selenu do arsenu we krwi.

Selen

Kobiety, poniżej 50 roku życia, ze stężeniem selenu we krwi zawierającym się w przedziale 70,00 - 89,00 μg/l wykazują ponad 10 krotnie obniżone ryzyko raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu poza przedstawionym przedziałem (OR= 10,40; p=0,0031; 95%CI:1,40-77,50) (Tabela 2).

PL 248657 Β1

Tabela 2. Częstość występowania raków w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet

Grupa	Zakres stężeń pg/l	Chore	Zdrowe
I J	Ł- >70 i <89 M	' - 1 ’	121
,^cr * *	SBSł-—jfiEtestó- · -·' '		tt
TI	<70 i >89	27	314

Kobiety, powyżej 50 roku życia, ze stężeniem selenu we krwi zawierającym się w przedziale 95,00 - 120,00 μ-g/l wykazują ponad 4 krotnie obniżone ryzyko raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu poza przedstawionym przedziałem (OR=4,20; p=0,0452; 95%CI:1,10—15,70) (Tabela 3).

Tabela 3. Częstość występowania raków w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet powyżej 50 r.ż.

Grupa	Zakres stężeń pgl	Chore	Zdrowe
I	>95 i <120	3 _c j,	⁶⁶
II	<95 i >120	11	58

Stosunek wartości stężeń selenu do arsenu

Kobiety posiadające wartości stosunku selenu do arsenu (Se/As) zawierające się w przedziale od 115,00 do 200,00, wykazują blisko 16 krotnie niższe ryzyko wystąpienia raka w porównaniu do kobiet ze stosunkiem Se/As nie zawierającym się w przedstawionym przedziale (OR=15,80; p<0,0001; 95%CI:2,20-116,70) (Tabela 4).

Tabela 4. Częstość występowania raków w zależności od stosunku stężenia selenu do stężenia arsenu we krwi wśród kobiet

Grupa	Zakres stężeń pg/l	Chore	Zdrowe
I	115-200.	j nil Tl	156 <
II	<115i >200	41	403

Literatura

Borawska M.H., Socha K., Łazarczyk B., Czyżewska E., Markiewicz R., Darewicz B., The effects of diet on selenium concentration in serum in patients with cancer, NutrCancer. 2009; 61 (5): 629-33.

Combs GF, Clark LC, Turnbull BW, An analysis of cancer prevention by selenium. BioFactors 14 2001; 153-9.

Duffield-Lillico A.J., Dalkin B.L., Reid M.E., Turnbull B.W., Siatę E.H., Jacobs E.T., Marshall J.R., Clark L.C., Selenium supplementation, baseline plasma selenium status and incidence of prostatę cancer: an analysis of the complete treatment period of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, BJU Int. 2003; 91 (7): 608-12.

Duffield-Lillico A.J., Reid M.E., Turnbull B.W., Combs G.F.J.r, Siatę E.H., Fischbach L.A., Marshall J.R., Clark L.C., Baseline characteristics and the effect of selenium supplemental ion cancer incidence in a randomized clinical trial: a summary report 5 of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11: 630-9.

Duffield-Lillico A.J., Reid M.E., Turnbull B.W., Combs G.F.J.r, Siatę E.H., Fischbach L.A., Marshall J.R., Clark L.C., Baseline characteristics and the effect of selenium supplementationon cancer incidence in a randomized clinical trial: a summary report of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11: 630-9.

Jabłońska E., Gromadzińska J., Sobala W., Reszka E., Wąsowicz W., Lung cancer risk associated with selenium status is modified in smoking individuals by Sep 15 polymorphism, Eur J Nutr. 2008; 47 (1): 47-54.

Kim J.H., Hue J.J., Kang B.S., Park H., Nam S.Y., Yun Y.W., Kim J.S., Lee B.J., Effects of selenium on colon carcinogenesis induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate in mouse model with high-iron diet, Lab Anim Res. 2011; 27 (1): 9-18.

Klein E.A., Thompson I.M., Tangen C.M., Crowley J.J., Lucia M.S., Goodman P.J., Minasian L.M., Ford L.G., Pames H.L., Gaziano J.M., Karp D.D., Lieber M.M., Walther P.J., Klotz L., Parsons J.K., Chin J.L., Darke A.K., Lippman S.M., Goodman G.E., Meyskens F.L., Baker L.H., Vitamin E and the risk of prostate cancer: the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial (SELECT). JAMA. 2011; 306: 1549-56.

Knekt P., Marniemi J., Teppo L., Heliovaara M., Aromaa A., Is low selenium status a risk factor for lung cancer?, Am J Epidemiol. 1998; 148 (10): 975-82.

Lamm SH, Engel A, Kruse MB, Feinleib M, Byrd DM, Lai S, Wilson R. Arsenic in drinking water and bladder cancer mortality in the United States: an anylysis based on 133 U.S. counties and 30 years of observation. J Occup Environ Med. 2004, 45(3): 298-306.

Lippman S.M., Klein E.A., Goodman P.J., Lucia M.S., Thompson I.M., Ford L.G., Parnes H.L., Minasian L.M., Gaziano J.M., Hartline J.A., Parsons J.K., Bearden J.D., Crawford E.D., Goodman G.E., Claudio J., Winquist E., Cook E.D., Karp D.D., Walther P., Lieber M.M., Kristal A.R., Darke A.K., Arnold K.B., Ganz P.A., Santella R.M., Albanes D., Taylor P.R., Probstfield J.L., Jagpal T.J., Crowley J.J., Meyskens F.L., Baker L.H., Coltman C.A., Effect of selenium and vitamin E on risk of prostate cancer and other cancers: the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial (SELECT), JAMA. 2009; 301 (1): 39-51.

Liu Mares W., Mackinnon J.A., Sherman R., Fleming L.E., Rocha-Lima C., Hu J.J., Lee D.J. Pancreatic cancer clusters and arsenic-contaminated drinking water wells in Florida. BMC Cancer, 2013; 13(111).

Mark S.D., Qiao Y.L., Dawsey S.M., Wu Y.P., Katki H., Gunter E.W., Fraumeni J.F.Jr., Blot W.J., Dong Z.W., Taylor P.R., Prospective study of serum selenium levels and incident esophageal and gastric cancers, J Natl Cancer Inst. 2000; 92 (21): 1753-63.

Mostafa M.G., McDOnald J.C., Cherry N.M. Lung cancer and exposure to arsenic in rural Bangladesh. Occup. Environ. Med. 2008; 65(11) 765-768.

Pourmand G., Salem S., Moradi K., Nikoobakht M.R., Tajik P., Mehrsai A., Serum selenium level and prostate cancer: a case-control study, Nutr Cancer. 2008; 60 (2): 171-6.

Reddy V.N., Giblin F.J., Lin L.R., Dang L., Unakar N.J., Musch D.C., Boyle D.L., Takemoto L.J., Ho Y. S., Knoernschild T., Juenemann A., Lutjen-Drecoll E., Glutathione peroxidase-1 deficiency leads to increased nuclear light scattering, membrane damage, and cataract formation in gene-knockout mice, Invest. Ophthal. Vis. Sci. 2001; 42: 3247-3255.

Reid M.E., Duffield-Lillico A.J., Garland L., Turnbull B.W., Clark L.C., Marshall J.R., Selenium supplementation and lung cancer incidence: an update of the nutritional prevention of cancer trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11 (11): 1285-91.

Reid M.E., Duffield-Lillico A.J., Sunga A., Fakih M., Alberts D.S., Marshal J.R., Selenium supplementation and colorectal adenomas: An analysis of the nutritional prevention of cancer trial, Int. J. Cancer 2006; 118: 1777-81.

Schrauzer G.N., White D.A., Schneider C.J., Cancer mortality correlation studies--III: statistical associations with dietary selenium intakes, Bioinorg Chem. 1977; 7 (1): 23-31.

Strona internetowa: http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/latest_classif.php. Data wejścia: 2016-09-11

World Health Organization. Arsenic. Environmental Health Criteria, 18, Geneva.

Vand den Brandt P.A., Goldbohm R.A., van 't Veer P., Bode P., Dorant E., Hermus R.J., Sturmans F., A prospective cohort study on selenium status and the risk of lung cancer, Cancer Res. 1993; 53 (20): 4860-5.

Yang H., Fang J., Jia X., Han C., Chen X., Yang C.S., Li N., Chemopreventive effects of earlystage and late-stage supplementation of vitamin E and selenium on esophageal carcinogenesis in rats maintained on a low vitamin E/selenium diet, Carcinogenesis. 2011; 32 (3): 381-8.

Claims

1. Sposób określania ryzyka raka u kobiety będącej nosicielką mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej, znamienny tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia selenu lub stosunku stężenia selenu do arsenu w próbce krwi uzyskanej od badanej kobiety, przy czym stężenie selenu i arsenu:

- wskazuje na istotnie 15,8-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka w przypadku występowania stosunku stężeń selenu do arsenu we krwi w zakresie od 115,00 do 200,00, w porównaniu do kobiet, u których stosunek stężeń selenu do arsenu we krwi znajduje się poza wskazanym zakresem, przy czym badana kobieta jest nosicielką mutacji w genie BRCA1 wybranej spośród: 5382insC, C61G, 4153delA i należy do populacji polskiej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał biologiczny do oceny stężenia selenu i arsenu stanowi krew pełna.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że poziom selenu i arsenu jest oznaczany przez bezpośredni pomiar selenu i selenu we krwi pełnej.