PL248410B1

PL248410B1 - Sposób określenia ryzyka raków u kobiet w zależności od stężenia selenu we krwi

Info

Publication number: PL248410B1
Application number: PL439315A
Authority: PL
Inventors: Jan LUBIŃSKI; Jan Lubiński; Anna Jakubowska; Wojciech MARCINIAK; Wojciech Marciniak; Magdalena MUSZYŃSKA; Magdalena Muszyńska; Róża Derkacz; Katarzyna Kaczmarek; Tomasz Huzarski; Jacek Gronwald; Cezary Cybulski
Original assignee: Read Gene Spolka Akcyjna
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2025-12-08
Also published as: PL439315A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób określenia ryzyka raka, charakteryzujący się tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia selenu w próbce biologicznej osoby badanej, przy czym stężenie selenu wskazuje na znacząco obniżone ryzyko: rozwoju raka pozasutkowego w przypadku optymalnych stężeń selenu we krwi, zwłaszcza w przedziale od 98 µg/l do 108 µg/l; rozwoju raka, zwłaszcza pozasutkowego, w przypadku występowania stężenia selenu we krwi, zwłaszcza leżącego w przedziale od 98 µg/l do 108 µg/, przy jednoczesnym występowaniu niskiego stężenia arsenu, szczególnie poniżej 1,10 µg/l.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu określenia ryzyka raków u kobiet. Opisywany wynalazek opiera się na ustaleniu, że istnieje korelacja między stężeniem selenu i arsenu we krwi pełnej a ryzykiem raków u kobiet nie będących nosicielkami mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej. Prezentowany sposób powinien znaleźć zastosowanie w szeroko rozumianej diagnostyce i profilaktyce nowotworów, zwłaszcza u kobiet.

W organizmie selen działa poprzez białka, do których jest wbudowany w postaci selenocysteiny. Jako składnik selenobiałek selen odgrywa rolę enzymatyczną, jak i strukturalną. Do jednych z ważniejszych funkcji selenobiałek należy udział w produkcji hormonów tarczycy, pobudzanie układu immunologicznego, oraz ochrona przed stresem oksydacyjnym (Combs GF, 2001). Zarówno niedobór jak i nadmiar tego pierwiastka może mieć niekorzystny wpływ na organizm. Jednakże, wydaje się, że znacznie poważniejsze konsekwencje są związane z niedoborem selenu. Prowadzą one do m.in. zaburzeń pracy serca, zwyrodnienia serca i wątroby, zwiększenia ryzyka choroby nadciśnieniowej, ograniczenia sprawności układu odpornościowego, zaburzenia funkcji tarczycy, zaburzenia mineralizacji kości i prawidłowego wykształcenia zębów oraz zwiększenia ryzyka chorób nowotworowych (Reddy VN, 2001). Wyniki badań eksperymentalnych przeprowadzonych na modelach zwierzęcych (Kim JH, 2011; Yang H, 2011) jak i prób klinicznych u ludzi wskazują na związek pomiędzy stężeniem tego pierwiastka w organizmie, a zachorowaniem na nowotwory (Schrauzer GN, 1977; Pourmand G, 2008; Vand den Brandt PA, 1993; Knekt P, 1998; Mark SD, 2000; Borawska MH, 2009; Jabłońska E, 2008; Duffield-Lillico AJ, 2002; Duffield-Lillico AJ, 2003; Reid ME, 2002; Reid ME, 2006; Lippman SM, 2009; Klein EA, 2011). Większość badań wykazała odwrotną zależność między stężeniem selenu a zachorowaniem na nowotworowy bądź ryzykiem wystąpienia choroby. Jednak u kobiet stwierdzano nieoczekiwanie, że wysokie stężenie selenu zwiększało ryzyko raków (Duffield-Lillico AJ, 2002).

Przedmiotem wynalazku jest sposób określenia ryzyka zachorowania na raka u kobiety nie będącej nosicielką mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej, charakteryzujący się tym, że obejmuje ustalenie stężenia selenu oraz arsenu w próbce krwi pełnej pochodzącej od pacjentki, przy czym stężenie selenu oraz arsenu wskazują na:

- 3-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka pozasutkowego w przypadku stężeń selenu we krwi w przedziale 98 - 108 ąg/l,

- 20-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka pozasutkowego w przypadku stężeń selenu we krwi w przedziale 98 - 108 ąg/l przy jednoczesnym występowaniu stężenia arsenu we krwi poniżej 1,10 ąg/l,

- 2,5-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka o różnej lokalizacji w przypadku występowania stężenia selenu we krwi w przedziale 98 - 108 ąg/l przy jednoczesnym występowaniu stężenia arsenu we krwi poniżej 1,10 ąg/l, przy czym badana pacjentka należy do populacji polskiej i nie jest nosicielką żadnej spośród następujących mutacji w genie BRCA1: 5382insC, C61G, 4153delA.

Korzystnie materiał biologiczny do oceny stężenia selenu i arsenu stanowi krew pełna.

Korzystnie poziom selenu jest oznaczany przez bezpośredni pomiar selenu we krwi pełnej.

Przykład realizacji wynalazku

Grupa obserwacyjna została wybrana spośród osób, których materiał znajduje się w biobanku naszego ośrodka. Pacjenci, którzy zgłosili się w latach 2010-2016 do Onkologicznej Poradni Genetycznej przy Szpitalu Klinicznym Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, byli zapraszani do oddania próbki krwi w celu biobankowania i podpisywali zgodę na przechowywanie i wykorzystywanie materiału w celach naukowych. Próbki krwi były pobierane w godzinach 8-14, a pacjenci byli poinformowani o konieczności bycia na czczo przez co najmniej przez 4 godziny przed pobraniem. Dla większości pacjentów próbka była pobrana tylko raz, ale w niektórych przypadkach również więcej razy przy okazji kolejnych wizyt. Próbkę krwi przechowywano w -80°C do momentu oznaczenia stężenia selenu.

W biobanku zgromadzono próbki od 33062 osób, które nigdy wcześniej przed pobraniem próbki nie chorowały na nowotwór złośliwy. Na potrzeby badania grupę 1698 osób bez mutacji w genie BRCA1 charakterystycznych dla populacji polskiej tj. 5382insC, C61G, 4153delA poddano ponad 3 letniej obserwacji. Do grupy nie włączono osób z nowotworem złośliwym rozpoznanym przed pobraniem próbki krwi. Następnie w trzech głównych ośrodkach onkologicznych w Szczecinie, sprawdzano która z osób wyjściowo zdrowych w momencie włączenia do biobanku, zachorowała. Spośród 1698 osób, w ciągu

PL 248410 Β1 ponad 3 lat obserwacji, na nowotwór złośliwy zachorowało 110 kobiet. Pozostała część grupy stanowiła grupę kontrolną badania.

Charakterystykę kohorty prospektywnej przedstawiono w tabeli poniżej (Tabela 1).

Tabela 1. Charakterystyka grupy

Cecha Chore Zdrowe

Liczba osób ’ ; ‘‘ 110 osób ^J' ‘ ‘ 1588 osób ‘ ¹

Średni wiek w momencie

55,60 lat 55,10 lat zabezpieczenia materiału

Średni okres śledzenia , ;

; ‘ ,,, “ ' * 39,50 miesięcy , , i stanu zdrowia (follow-up) _t

Lokalizacja narządowa	Liczba osób ,;	Procentowy udział w całej_{; [}
raka¹	B ^J __	ggrupie chorych
Pierś	68	61,81
Jajniki	λ,·... - r 4	.. ' 5,45 ··' -^,Ł ^ΰΙ 1.: .
Jelito grube	5	4,55
Szpiczak • Λ l r $ _C	• ' Ą, a	¹ 4,55
Macica	5	4,55
Pęcherz moczowy ¹	4 · 1 1 ΙΓ	¹ ¹ 3,64 i ^E
Białaczka/Chłoniak	4	3,64
Tarczyca ¹ i	4 .[	3,64
Szyjka macicy	2	1,81
, Nerka	.......2 ' ’ ^r 1	1,81 ¹ '' (^ζ
Skóra (czerniak)	2	1,81
Endo metr i urn 1 r II ·, d	., ' 1 Ί .. :	0,91
Płuco	1	0,91
Centralny układ nerwowy 0 0	¹ ‘ '1	0,91₁ ,

Materiał

Od każdej osoby włączonej do badania pobrano próbkę krwi do pomiaru stężenia selenu.

Metoda oznaczania zawartości Se we krwi pełnej.

1.1 Aparat

Do określenia zawartości wskazanych metali wykorzystana została technika spektrometrii mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej.

Do wykonania pomiaru wykorzystano spektrometr mas ELAN DRC-e (PerkinElmer) oraz NexION 350D (PerkinElmer). Wykorzystanie ICP-MS pozwala uzyskać limity detekcji <0,1 ąg/l. Podczas prowadzenia oznaczeń populacji nieeksponowanej zawodowo na metale i ich związki, czułość aparatury odgrywa kluczową rolę.

1.2 Przygotowanie do pomiaru

Zebrane próby krwi, zostały rozmrożone z temperatury -80°C do temperatury pokojowej, w dniu wykonywania analiz. Każda próbka została dokładnie wymieszana przy użyciu wstrząsarki lub worteksu w celu uzyskania możliwie największej homogenności materiału. Proces ten został powtórzony bezpośrednio przed pobraniem objętości krwi do rozcieńczeń z uwagi na zjawisko rozwarstwiania się krwi. Stosując możliwie najprostszą technikę, próbki krwi zostały rozcieńczone w stosunku 1:30 (50 ąl krwi : 1450 ąl buforu). Z uwagi na specyfikę pomiaru do rozcieńczeń zastosowano roztwór wodorotlenku tetrametyloamonowego (TMAH). Alkaliczne pH zapewnia dobrą rozpuszczalność składników krwi, nie powodując tym samym precypitacji żadnej z frakcji. Dodatkowo w celu lepszej dyspersji rozpuszczonych składników krwi zastosowano dodatek niejonowego surfaktantu w postaci Trytonu X-100. Wykorzystanie tego związku nie tylko ułatwia rozpuszczanie m.in. białek ale także przyczynia się do szybszego wypłukiwania próbki z układu wprowadzenia spektrometru. Do korekcji efektu matrycy oraz dryfu aparatu użyty został standard wewnętrzny w postaci rodu (¹⁰⁵Rh). Do uzyskania stabilności jonów metali rozpuszczonych w roztworze zastosowany został dodatek kwasu wersenowego (EDTA).

Dodatkowo, z racji zawartości związków zawierających węgiel, zastosowano dodatek butanolu do wszystkich roztworów w celu niwelacji efektu związanego ze znaczną ilością węgla w badanej próbie.

1.3 Warunki pomiaru

Wszystkie oznaczenia przeprowadzono z wykorzystaniem kwadrupolowej celi reakcyjnej spektrometru, tzw. trybie DRC (ang. Dynamic Reaction Cell) aparatu Elan DRC-e oraz NexION 350D (PerkinElmer) z tlenem jako gazem reakcyjnym. Tlen jest gazem z wyboru dla prowadzenia oznaczeń As i Cd. W przypadku oznaczeń As, wykorzystanie tlenu pozwala uzyskać na drodze reakcji chemicznej stabilnego produktu w postaci jonu ⁷⁵As¹⁶O+. Jon ten posiada masę 91, która wolna jest od interferencji spektralnych. Rozwiązanie to zapewnia maksimum specyfiki pomiaru As. Podobne rozwiązanie dotyczy oznaczeń kadmu. W tym przypadku jednak dokonano transferu atomu tlenu na interferent a nie jak w przypadku As na pożądany jon. Najpoważniejszą interferencję w oznaczeniach ¹¹⁴Cd stanowi tlenek molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O. Zastosowanie tlenu pozwala na uzyskanie ditlenku molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O2, niwelując tym samym problem nakładania się tych dwóch mas. Obecnie jest to najbardziej czuła technika oznaczeń dla materiału biologicznego.

W przypadku Zn tlen pozostaje inertny.

1.4 Walidacja pomiarów

Do walidacji pomiarów zastosowano następujące materiały referencyjne ClinCheck (Recipe, Niemcy), NIST 955c (National Institute of Standards and Technology, Stany Zjednoczone) oraz BCR 634 (European Commission, Community Bureau of Reference). Są to standardy odniesienia powszechnie stosowane w spektrometrii, pozwalające na potwierdzenie precyzji, czułości i specyfiki pomiaru.

Statystyka

Różnice w częstościach pomiędzy analizowanymi grupami oceniano przy pomocy Testu Zgodności Fishera.

Wyniki

Analiza otrzymanych wyników wykazała istotną zależność między ryzykiem raków u kobiet a stężeniem selenu we krwi.

Selen

Kobiety ze stężeniem selenu we krwi zawierającym się w przedziale 98,00 - 108,00 ąg/l wykazują tendencję ku blisko 1,5 krotnemu obniżeniu ryzyka raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=1,40; p=0,19; 95% CI: 0,90-2,20) (Tabela 2).

PL 248410 Β1

Tabela 2. Częstość występowania raków w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet

Grupa	Zakres stężeń pgl	Chore	Zdrowe
; I . ”	, >98 i <108	25 _t 11	4M,;
II	..... Li <98 i >108	f a j il 85	1132

Ryzyko raka piersi wśród kobiet nie ulega zmianie gdy stężenie selenu zawiera się w przedziale 98,00 - 108,00 μ-g/l w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=1,00; p=0,89; 95% Cl: 0,60-1,70) (Tabela 3).

Tabela 3. Częstość występowania raków piersi w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet

Grupa	Zakres stężeń pg/I	Chore	Zdrowe
	>98 i <108 r	20	461 '· ¹ TtfllHBW:.:.· . °
II	<98 i >108	48	1132

Ryzyko raków pozasutkowych wśród kobiet ze stężeniem selenu we krwi zawierającym się w przedziale 98,00 - 108,00 ptg/l jest istotnie 3 krotnie obniżone w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=3,00; p=0,0147; 95% Cl: 1,10-7,70) (Tabela 4).

Tabela 4. Częstość występowania raków pozasutkowych w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet

Grupa	Zakres stężeń ugl Chore Zdrowe
L ¹	>98 i’<108 _t,5 461 ^{1 Γ 1} . :............ ‘ ί ¹
11	<98 i >108 37 1132

Kobiety z niskimi wartościami stężeń arsenu we krwi, tj. poniżej 1,10 μ-g/l a przy tym stężeniem selenu we krwi w zakresie 98,00 - 108,00 μ-g/l wykazują istotnie 2,5 krotnie zmniejszone ryzyko wystąpienia raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=2,50; p=0,0152; 95% Cl: 1,10-5,20) (Tabela 5).

Tabela 5. Częstość występowania raków w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet w podgrupie z niskimi stężeniem arsenu we krwi (<1,10 pg/l)

Grupa	Zakres stężeń Se pg/l	Chore	Zdrowe
. I ^i,\|\|; J i 3 _r	>98 i <108 $ 1	8	> 326
II	<98 i >108	49	W:ł V. ·“ 812

Kobiety z niskimi wartościami stężeń arsenu we krwi, tj. poniżej 1,10 μ-g/l a przy tym stężeniem selenu we krwi zawierającym się w zakresie 98,00 - 108,00 μ-g/l nie wykazują istotnie zmniejszonego ryzyka wystąpienia raka piersi w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=1,30; p=0,0700; 95% Cl: 0,60-2,80) (Tabela 6).

PL 248410 Β1

Tabela 6. Częstość występowania raków piersi w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet w podgrupie z niskimi stężeniem arsenu we krwi (<1,10 pg/l)

Grupa	Zakres stężeń Se gg/l	Chore	Zdrowe
I	>98 i <108	⁸ ”	; 326
“ II	<98 i >108	25	812

Kobiety z niskimi wartościami stężeń arsenu we krwi, tj. poniżej 1,10 μ-g/l a przy tym stężeniem selenu we krwi zawierającym się w zakresie 98,00 - 108,00 μ-g/l wykazują istotnie blisko 20 krotnie zmniejszone ryzyko wystąpienia raków pozasutkowych w porównaniu do kobiet ze stężeniami selenu we krwi poza powyższym przedziałem (OR=19,70; p=0,0007; 95% Cl: 1,20-324,90) (Tabela 7).

Tabela 7. Częstość występowania raków pozasutkowych w zależności od stężenia selenu we krwi wśród kobiet w podgrupie z niskimi stężeniem arsenu we krwi (<1,10 μg/l)

Zakres stężeń	Zdrowe
Grupa	Se pg/l	Chore
I	>98 i <108	“ 0	,< 326 ,
II	<98 i >108	24	812

Literatura

Borawska M.H., Socha K., Łazarczyk B., Czyżewska E., Markiewicz R., Darewicz B., The effects of diet on selenium concentration in serum in patients with cancer, NutrCancer. 2009; 61 (5): 629-33.

Combs GF, Clark LC, Turnbull BW, An analysis of cancer prevention by selenium. BioFactors 14 2001; 153-9.

Duffield-Lillico A.J., Dalkin B.L., Reid M.E., Turnbull B.W., Siatę E.H., Jacobs E.T., Marshall J.R., Clark L.C., Selenium supplementation, baseline plasma selenium status and incidence of prostatę cancer: an analysis of the complete treatment period of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, BJU Int. 2003; 91 (7): 608-12.

Duffield-Lillico A.J., Reid M.E., Turnbull B.W., Combs G.F.J.r, Siatę E.H., Fischbach L.A., Marshall J.R., Clark L.C., Baseline characteristics and the effect of selenium supplementation cancer incidence in a randomized clinical trial: a summary report 5 of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11: 630-9.

Duffield-Lillico A.J., Reid M.E., Turnbull B.W., Combs G.F.J.r, Siatę E.H., Fischbach L.A., Marshall J.R., Clark L.C., Baseline characteristics and the effect of selenium supplementationon cancer incidence in a randomized clinical trial: a summary report of the Nutritional Prevention of Cancer Trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11: 630-9.

Jabłońska E., Gromadzińska J., Sobala W., Reszka E., Wąsowicz W., Lung cancer risk associated with selenium status is modified in smoking individuals by Sep 15 polymorphism, Eur J Nutr. 2008; 47 (1): 47-54.

Kim J.H., Hue J.J., Kang B.S., Park H„ Nam S.Y., Yun Y.W., Kim J.S., Lee B.J., Effects of selenium on colon carcinogenesis induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate in mouse model with high-iron diet, Lab Anim Res. 2011; 27 (1): 9-18.

Klein E.A., Thompson I.M., Tangen C.M., Crowley J.J., Lucia M.S., Goodman P.J., Minasian L.M., Ford L.G., Parnes H.L., Gaziano J.M., Karp D.D., Lieber M.M., Walther P.J., Klotz L., Parsons J.K., Chin J.L., Darke A.K., Lippman S.M., Goodman G.E., Meyskens F.L., Baker L.H., Vitamin E and the risk of prostatę cancer: the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial (SELECT). JAMA. 2011; 306: 1549-56.

Knekt P., Marniemi J., Teppo L., Heliovaara M., Aromaa A., Is low selenium status a risk factor for lung cancer?, Am J Epidemiol. 1998; 148 (10): 975-82.

Lippman S.M., Klein E.A., Goodman P.J., Lucia M.S., Thompson I.M., Ford L.G., Parnes H.L., Minasian L.M., Gaziano J.M., Hartline J.A., Parsons J.K., Bearden J.D., Crawford E.D., Goodman G.E., Claudio J., Winquist E., Cook E.D., Karp D.D., Walther P., Lieber M.M., Kristal A.R., Darke A.K., Arnold K.B., Ganz P.A., Santella R.M., Albanes D., Taylor P.R., Probstfield J.L., Jagpal T.J., Crowley J.J., Meyskens F.L., Baker L.H., Coltman C.A., Effect of selenium and vitamin E on risk of prostate cancer and other cancers: the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial (SELECT), JAMA. 2009; 301 (1): 39-51.

Mark S.D., Qiao Y.L., Dawsey S.M., Wu Y.P., Katki H., Gunter E.W, Fraumeni J.F.Jr., Blot W.J., Dong Z.W., Taylor P.R., Prospective study of serum selenium levels and incident esophageal and gastric cancers, J Natl Cancer Inst. 2000; 92 (21): 1753-63.

Pourmand G., Salem S., Moradi K., Nikoobakht M.R., Tajik P., Mehrsai A., Serum selenium level and prostate cancer: a case-control study, Nutr Cancer. 2008; 60 (2): 171-6.

Reddy V.N., Giblin F.J., Lin L.R., Dang L., Unakar N.J., Musch D.C., Boyle D.L., Takemoto L.J., Ho Y.S., Knoernschild T., Juenemann A., Lutjen-Drecoll E., Glutathione peroxidase-1 deficiency leads to increased nuclear light scattering, membrane damage, and cataract formation in gene-knockout mice, Invest. Ophthal. Vis. Sci. 2001; 42: 3247-3255.

Reid M.E., Duffield-Lillico A.J., Garland L., Turnbull B.W., Clark L.C., Marshall J.R., Selenium supplementation and lung cancer incidence: an update of the nutritional prevention of cancer trial, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11 (11): 1285-91.

Reid M.E., Duffield-Lillico A.J., Sunga A., Fakih M., Alberts D.S., Marshal J.R., Selenium supplementation and colorectal adenomas: An analysis of the nutritional prevention of cancer trial, Int. J. Cancer 2006; 118: 1777-81.

Schrauzer G.N., White D.A., Schneider C.J., Cancer mortality correlation studies--III: statistical associations with dietary selenium intakes, Bioinorg Chem. 1977; 7 (1): 23-31.

Vand den Brandt P.A., Goldbohm R.A., van 't Veer P., Bode P., Dorant E., Hermus R.J., Sturmans F., A prospective cohort study on selenium status and the risk of lung cancer, Cancer Res. 1993; 53 (20): 4860-5.

Yang H., Fang J., Jia X., Han C., Chen X., Yang C.S., Li N., Chemopreventive effects of earlystage and late-stage supplementation of vitamin E and selenium on esophageal carcinogenesis in rats maintained on a low vitamin E/selenium diet, Carcinogenesis. 2011; 32 (3): 381-8.

Claims

1. Sposób określenia ryzyka raka u kobiety nie będącej nosicielką mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej, znamienny tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia selenu w próbce krwi od badanej pacjentki, przy czym stężenie selenu wskazuje na: - 3-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka pozasutkowego w przypadku stężeń selenu we krwi w przedziale 98 - 108 μ-g/l,

- 20-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka pozasutkowego w przypadku stężeń selenu we krwi w przedziale 98 - 108 μ-g/l przy jednoczesnym występowaniu stężenia arsenu we krwi poniżej 1,10 pg/l,

- 2,5-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka o różnej lokalizacji w przypadku występowania stężenia selenu we krwi w przedziale 98 - 108 pg/l przy jednoczesnym występowaniu stężenia arsenu we krwi poniżej 1,10 pg/l, przy czym badana pacjentka należy do populacji polskiej i nie jest nosicielką żadnej spośród następujących mutacji w genie BRCA1: 5382insC, C61G, 4153delA.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał biologiczny do oceny stężenia selenu i arsenu stanowi krew pełna.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że poziom selenu jest oznaczany przez bezpośredni pomiar selenu we krwi pełnej.