PL240311B1 - Amidosiarczanowe pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol- -3-ilo)fenolu, pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu, ich zastosowanie, oraz sposób otrzymywania amidosiarczanowych pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki, których struktura imituje budowę steroidów, która jest niezbędna w celu efektywnego wiązania się przedmiotowych związków zarówno w centrum aktywnym sulfatazy steroidowej jak również do receptorów, estrogenowych. Są to amidosiarczanowe pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu oraz pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu jako nowe związki.

Przedmiotem wynalazku jest pierwsze zastosowanie medyczne amidosiarczanowych pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu oraz pierwsze zastosowanie medyczne pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu.

Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie amidosiarczanowych pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu jako leku o właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej (STS) i/lub leku o działaniu modulatora receptora estrogenowego, jak i zastosowanie do użycia in vitro jako związku o właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub modulatora receptora estrogenowego.

Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol3-ilo)fenolu jako leku o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, w tym antybakteryjnym oraz jako leku o działaniu selektywnych modulatorów receptora estrogenowego, jak i ich zastosowanie do użycia in vitro jako środka przeciwdrobnoustrojowego i/lub, modulatora receptora estrogenowego. W szczególności przedmiotowe związki - amidosiarczanowe pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu znajdują zastosowanie medyczne jako leki w terapii nowotworowej, a w szczególności w terapii hormonalnej w leczeniu hormonozależnych nowotworów zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania tych nowych związków, przy czym pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu stanowią produkt pośredni, z którego bezpośrednio otrzymuje się pochodne amidosiarczanowe.

Z dokumentu EP1608671 znana jest struktura pierścienia steroidowego o ogólnym wzorze:

Każdy z tych pierścieni daje możliwość zastąpienia go pierścieniem heterocyklicznym jak i pierścieniem nieheterocyklicznym. Znane jest również połączenie różnych kombinacji struktury imitującej pierścień steroidowy z grupą amidosiarczanową.

Wśród znanych inhibitorów sulfatazy steroidowej STS zawierających ugrupowanie amidosiarczanowe, w szczególności z dokumentu EP 1193250 znane są inhibitory STS o wzorze ogólnym:

W publikacji 1,4-Diaryl-substituted triazoles os cyclooxygenase-2 inhibitors: Synthesis, biological evaluation and molecular modeling studies, Kam J, i wsp., Bioorganic & Medicinal Chemistry (2013), 21(14), 4288-4295, ujawniono związki chemiczne zawierające grupę sulfonamidową o wzorze:

PL 240 311 Β1

Opisane związki mają właściwości inhibitorów cyklooksygenazy.

Z dokumentu WO2015101670, znane są związki o wzorze ogólnym:

zwłaszcza:

Związki mają zastosowanie jako inhibitory dehydrogenazy 17p-hydroksysteroidowej. Enzym dehydrogenazy 17p-hydroksysteroidowej katalizuje redukcję 17p-steroidów, w tym: estronu do estradiolu, siarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEAS) do siarczanu androstenediolu czy też dehydroepiandrosteronu (DHEA) do androstenediolu, wykazując działanie w odmiennym szlaku biosyntezy estrogenów oraz androgenów w organizmie w porównaniu ze szlakiem obejmującym działanie sulfatazy steroidowej. Ze względu na odmienną topologię miejsca aktywnego dehydrogenazy 17p-hydroksysteroidowej oraz sulfatazy steroidowej, inhibicja tych enzymów angażuje związki różniące się pod względem strukturalnym oraz mechanizmu działania.

W publikacji pt. Design, Synthesis, Biological Evaluation and Pharmacokinetics of Bis(hydroxyphenyi) substituted Azoles, Thiophenes, Benzenes, and Aza-Benzenes as Potent and Selective Nonsteroidal Inhibitors of 17fl-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 (17fi-HSDl), Bey. E. i wsp., J. Med. Chem., 2008, 51 (21), pp 6725-6739 przedstawiono związki o wzorze ogólnym:

W, X, Y, Z « N, S, Se, C, CH, CCH_a

R,. R₂- H. OH

Opisane związki mają również zastosowanie jako inhibitory dehydrogenazy 17p-hydroksysteroidowej. Ze względu na odmienną topologię miejsca aktywnego dehydrogenazy 17p-hydroksysteroidowej oraz sulfatazy, steroidowej, inhibicja tych enzymów angażuje związki różniące się pod względem strukturalnym oraz mechanizmu działania.

Z publikacji WO2019245393 amidosiarczanowe pochodne 4-(1 -fenylo-1 H-[1,2,3]triazol-4-ylo)-fenolu oraz pochodne 4-(1-fenylo-1 H-[1,2,3]triazol-4-ylo)-fenolu są opisane. Opisano zastosowanie nowych związków jako środka o właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub modulatora receptora estrogenowego.

Wciąż poszukuje się związków o wysokiej selektywności oraz możliwości zahamowania aktywności enzymu sulfatazy steroidowej, i brakiem efektów ubocznych działania takich inhibitorów.

PL 240 311 Β1

Przedmiotem wynalazku są w szczególności nowe związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

gdzie Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

Związki o wzorze ogólnym 1 charakteryzują się budową zawierającą układ trzech pierścieni aromatycznych w tym pierścień oksadiazolu oraz istotną (z punktu widzenia aktywności biologicznej) funkcję amidosiarczanu. Geometria związków o strukturze ogólnej 1 imituje budowę steroidów, która jest niezbędna w celu efektywnego wiązania się przedmiotowych związków zarówno w centrum aktywnym sulfatazy steroidowej jak również do receptorów, estrogenowych. Budowa związków o wzorze ogólnym 1 wpływa znacząco na zmianę ich właściwości fizykochemicznych (w porównaniu ze związkami o budowie steroidowej) oraz stanowi o ich unikatowych właściwościach biologicznych w tym o znacznym ograniczeniu lub braku właściwości estrogenowych związków, które to właściwości są zaliczane do jednych z najczęściej występujących skutków ubocznych w terapii, hormonalnej, limitujących wykorzystanie substancji (zwłaszcza inhibitorów sulfatazy steroidowej lub selektywnych modulatorów receptora estrogenowego - SERMs) w praktyce klinicznej. Związki o strukturze ogólnej 1 wykazują znaczące różnice w stosunku do znanych, związków imitujących układ steroidowy, wynikające z obecności trzech pierścieni aromatycznych w tym pierścienia oksadiazolu oraz podstawników R1-R5 w strukturze związków. Obecność niniejszych ugrupowań wpływa znacząco na rodzaj oraz efektywność wiązania się niniejszych związków w centrum aktywnym enzymu sulfatazy steroidowej, prowadząc do skutecznego zahamowania jego aktywności. Znaczącą rolę w efektywnej inhibicji STS odgrywa zdolność grup funkcyjnych obecnych w konstytucji związków o wzorze ogólnym 1 w tym pierścienia oksadiazolu, podstawników R1-R5 jak również ugrupowania amidosiarczanowego do uczestniczenia w tworzeniu licznych oddziaływań elektrostatycznych w centrum katalitycznym enzymu sulfatazy steroidowej. Powyższe oddziaływania wpływają na znaczne obniżenie swobodnej energii wiązania kompleksów inhibitor-enzym, co- prowadzi do ich wyższej stabilizacji wpływającej na efektywność zahamowania aktywności enzymu STS. Konsekwencją tego jest również zdecydowanie wyższa selektywność związków o wzorze ogólnym 1 w porównaniu ze związkami stanowiącymi stan techniki oraz niższe lub brak efektów ubocznych działania tych inhibitorów. Przykładowe, korzystne związki z tej grupy, przedstawiono poniżej w tabeli 1. Związki te mają aktywne działanie medyczne i biologiczne, i mają zastosowanie jako leki, a w szczególności jako leki o działaniu inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub o działaniu modulatora receptora estrogenowego, mające zastosowanie zwłaszcza w przeciwnowotworowej terapii, zwłaszcza przeznaczone do terapii hormonalnej w leczeniu nowotworów hormonozależnych zwierząt a zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Związki będące przedmiotem wynalazku mają zastosowanie biologiczne, w tym np. w diagnostyce i badaniach in vitro, jako inhibitory sulfatazy steroidowej i/lub modulatory receptora estrogenowego.

Przedmiotem wynalazku są również nowe związki chemiczne, stanowiące związki pośrednie w szlaku otrzymywania związków o wzorze ogólnym 1. Związki te stanowią pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu, które zostały scharakteryzowane wzorem ogólnym 2:

□H

PL 240 311 Β1 gdzie Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2

Ścieżka syntezy produktu końcowego o wzorze ogólnym 1 obejmuje w pierwszej kolejności otrzymywanie związku o strukturze ogólnej 2, który jest związkiem pośrednim. Zarówno produkt pośredni o wzorze ogólnym 2 jak również produkt końcowy zawiera ten sam rdzeń cząsteczki imitujący budowę steroidu będący pochodną 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu. Związki o wzorze ogólnym, 2 wykazują aktywne właściwości medyczne i biologiczne, i znajdują zastosowanie jako leki, zwłaszcza leki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, w tym antybakteryjnym lub leki o działaniu selektywnych modulatorów receptora, estrogenowego (SERMs). Wstępne badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej wykazały, iż związki o wzorze ogólnym 2 charakteryzują się skuteczniejszym działaniem przeciwdrobnoustrojowym, w tym antybakteryjnym w porównaniu ze związkami znanymi ze stanu techniki. Ponadto związki scharakteryzowane wzorem ogólnym 2 wykazywały obniżoną zdolność lub brak zdolności do indukowania zjawiska lekooporności będącego najczęstszą przyczyną spadku skuteczności leków przeciwbakteryjnych. Wstępne badania dowiodły również niższą toksyczność lub jej brak dla organizmu ssaków. Związki o wzorze ogólnym 2 znajdują zastosowanie również jako środek przeciwdrobnoustrojowy i/lub selektywny modulator receptora estrogenowego (SERM), zwłaszcza w diagnostyce i badaniach in vitro. Związki o wzorze ogólnym 2, ze względu na swoją budowę zawierającą układ trzech pierścieni aromatycznych w tym heterocykliczny pierścień oksadiazolu imitujący budowę steroidową oraz podstawniki R1-R5, wpływające na właściwości związków, zwłaszcza siłę wiązania się tych związków do receptorów estrogenowych, wykazują wyższe powinowactwo i silniejsze wiązanie się do receptorów estrogenowych w porównaniu ze związkami ujawnionymi w stanie techniki i znajdują zastosowanie zwłaszcza jako selektywne modulatory receptora estrogenowego (SERMs) - zarówno w medycynie jak i ogólnych naukach biologicznych. Przykładowe, korzystne związki o wzorze ogólnym 2 przedstawiono w tabeli 2. Według wstępnych wyników badań, związki te wykazują również działanie przeciwdrobnoustrojowe, zwłaszcza antybakteryjne.

Wynalazek przedstawiono bliżej na wzorach, tabeli 1 i 2 i przykładach, w jakich opisano sposób wytwarzania związków oraz opisano ich skuteczność.

Tabela 1

Przykładowe, korzystne amidosiarczanowe pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu:’

PL 240 311 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(3(trifluorometyio)fenylo)-l ,2,4oksad tazo)-3-i!o) fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-( trifluoromety !o)fenylo)-1,2,4oksadi0zol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4(tnfluorometoksy)feny io>-1,2,4oksadiazo!-3-iio)fcnylu

Amidosiarczan 4-(5-(2,4,5trifluorofenylo)-1,2,4-oksadiazo!-3ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(pernuorofenylo)1,2,4-oksadiazol-3-ilo)feny lu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(luoro-2(trifluorometyto)feny to)-1,2,4oksadiazoi-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(3-chtorofenylo)1,2,4-oksadiazoł-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(3,5di c h 1 orofenylo)-1,2,4-oksadiazo!-3ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(3-bromofenylo)! ,2,4-oksadiazol-3-iio)fcnylu

PL 240 311 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(3,5d ibromofeny lo)-1,2,4 -oksadiazoi-3 ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-metylofenylo)1,2,4 -oksadiazo l-3-ilo)feny lu

Amidosiarczan 4-(5-(3-metylofeny1o)1,2,4 -ok$adiazol-3-iio)feny lu

Amidosiarczan 4-(5-(3,5dimctylofenylo)-I,2,4-oksadiazol-3ilo)fenylu

t ,2,4-oksadiazol-3 -ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(3-niirofenyio)1,2,4-oksadiazol-3 - ilo)feny 1u

CH₂CH₃

Amidosiarczan 4-(5-(3-eiylofenylo)1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenyiu

CH(CH₃)₂

Amidosiarczan 4-(5-(3izopropy loieny !o)-1,2,4- oksadiazoi-3i!n)fenyfu

Amidosiarczan 4-(5-(3-jodofeny!o)1 ^,4-oksadiazol-3-ilo)reny tu

PL 240 311 Β1

-(5 -(3,5-difluwofeny lo)~ 1,2,4oksadiazoi-3-ilo)feno)

4-(5-(4-fluorofenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenol

4-(5-(2,3,4-tri fi uorofenyloj-l ,2,4oksadiazol-3-flo)feno!

PL 240 311 Β1

PL 240 311 Β1

Przykład A) Otrzymywanie związków o wzorze ogólnym I R, N-T. R Ϊ 1 ZN ώτ° R,

0 O-S-NH, / H ( 0

PL 240 311 Β1 gdzie Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH3 albo NO2, zostało przeprowadzone wg sposobu przedstawionego na schemacie 1:

R,. R?. *4. ^R« ^D H. F. ar. Cl, I, CFj, OCFj, CHj, OCH,. NO_}

Schemat 1. Synteza nowych inhibitorów STS na bazie amidosiarczanowych pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu; Py- pirydyna, A/,A/-DMA-dimetyloacetamid, DCM - dichlorometan.

Pierwszy etap syntezy polega na otrzymaniu A/’,4-dihydroksybenzimidamidu (2) w wyniku reakcji 4-hydroksybenzonitrylu (1) z chlorowodorkiem hydroksyloaminy w obecności węglanu sodu. Otrzymany oczyszczony lub surowy produkt (2) jest kolejno traktowany odpowiednią pochodną chlorku kwasu benzoesowego (3) (generowanego in situ w reakcji z chlorkiem tionylu SOCI2) prowadząc do otrzymania rdzenia inhibitora w postaci pochodnej 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (4). Trzeci etap polega na otrzymaniu produktu końcowego (5) w wyniku reakcji generowanego in situ chlorku aminosulfurylu z pochodną 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (4).

W zależności od tego jaki produkt końcowy, będzie otrzymywany, do rekcji używa się innego substratu tj. podstawionego w pierścieniu aromatycznym chlorku kwasu benzoesowego, o wzorze ogólnym 3:

gdzie R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

Podstawniki w substracie dobiera się stosownie do otrzymywanych związków pośrednich i produktu końcowego, co jest znane, dla osoby bieglej w tej dziedzinie. Poszczególne etapy syntezy, dla wariantów wynalazku, przedstawiono poniżej. Każdy związek otrzymuje się podobnie dobierając substraty w zależności do danych podstawników.

PL 240 311 Β1

Etap 1:

Otrzymywanie A/’,4-dihydroksybenzimidamidu (2)

Do roztworu 4-hydroksybenzonitrylu (1 eq, 2 g, 16.79 mmol) w 20 mL bezwodnego etanolu wprowadzono, chlorowodorek hydroksyloaminy: (1.3 eq, ,1.517 g, 21.826 mmol) oraz węglan sodu (1.3 eq, 2.313 g, 21.826 mmol). Tak przygotowaną mieszaninę reakcyjną doprowadzono do, temperatury, wrzenia rozpuszczalnika, którą utrzymywano przez 3 godziny. Po tym czasie dodano ponownie chlorowodorek hydroksyloaminy (1.3 eq, 1.517 g, 21.826 mmol) oraz węglan sodu (1.3 eq, 2.313 g, 21.826 mmol). Reakcję ogrzewano przez kolejne 20 godzin. Osad przesączono a rozpuszczalnik odparowano. Otrzymano 2.552 g produktu z wydajnością 96%.

Etap 2:

Ogólna procedura otrzymywania pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (4) Do roztworu pochodnej kwasu benzoesowego (1 eq, 7.1 mmol) w bezwodnym toluenie (6 mL) wprowadzono chlorek tionylu (4 eq, 28.4 mmol). Reakcję prowadzono: w temperaturze wrzenia przez 3 godziny. Następnie; rozpuszczalnik odparowano i dodano pirydynę (6 mL) oraz A/’,4-dihydroksybenzimidamid (1.2 eq, 8.52 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez noc. Następnie mieszaninę ochłodzono, dodano etanol (3 mL) i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z mieszaniny FWOHsOH (1:1).

Przykład 1- etap 2:

4-(S-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol

Do roztworu kwasu benzoesowego (1 eq, 7.1 mmol, 0.866 g) w bezwodnym toluenie (6 mL) wprowadzono chlorek tionylu (4 eq, 28.4 mmol, 3.363 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano i dodano pirydynę (6 mL) oraz A/’,4-dihydroksybenzimidamid (1.2 eq, 8.52 mmol, 1.296 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez noc. Następnie mieszaninę ochłodzono, dodano etanol (3 mL) i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z mieszaniny FhOOHsOH (1:1).

Wydajność 56%; temperatura topnienia: 184-185°C; v_max (ATR)/cm'¹ 3176, 1606, 1558, 1434, 1362, 1272, 1236, 1173, 838, 749, 682; ¹H NMR8h (400 MHz, DMSO-de) 10.19 (1H, s, OH), 8.18 (2H, d, J = 7.0 Hz, Ar-H), 7.94 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ar-H), 7.74 (1H, m, Ar-H), 7.67 (2H, m, Ar-H) 6.96 (2H, d, J= 8.7 Hz, Ar-H); ¹³C NMR 8c (101 MHz, DMSO-de) 175.4, 168.6, 160.9, 133.6, 130.0, 129.4, 128.3, 124.0, 117.3, 116.5; HRMS (m/z) [M - H]- calcd: 237.0669, found: 237.0752

Przykład 2 - etap 2:

4-(5-(3 - fi uor ofe ny lo)-1,2,4 -oksad i azo l-3-i lo)fenol

PL 240 311 Β1

Do roztworu kwasu 3-fluorobenzoesowego (1 eq, 7.1 mmol, 1 g) w bezwodnym toluenie (6 mL) wprowadzono chlorek tionylu (4 eq, 28.4 mmol, 3.363 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano i dodano pirydynę (6 mL) oraz A/’,4-dihydroksybenzimidamid (1.2 eq, 8.52 mmol, 1.296 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez noc. Następnie mieszaninę ochłodzono, dodano etanol (3 mL) i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z mieszaniny FWOHsOH (1:1).

Wydajność 49%; temperatura topnienia; 209-210°C; v_max (ATR)/cm'¹ 3207, 1566, 1440, 1364, 1281, 1241, 1201, 1176, 846, 759, 670; ¹H NMR6h (400 MHz, DMSO-de) 10.23 (1H, s, OH), 8.02 (1H, m, Ar-H), 7.98-7.96 (1H, m, Ar-H), 7.94 (2H, d, J = 8,8;Hz, Ar-H), 7.72 (1H, m, Ar-H), 7.59 (1H, m, Ar-H) 6.96 (2H, d, J = 8,8 Hz, Ar-H); ¹³C NMR δο(101 MHz, DMSO-de) 174.33 (d, ⁴Jc-f = 3.2 Hz), 168.7, 162.7 (d, ¹Jc-f = 245.8 Hz), 161.0, 132.4 (d, ³Jc-f= 8.4 Hz), 129.4, 125.9 (d, ³Jc-f= 8.7 Hz), 124.6 (d, ³Jc-f =2.9 Hz), 120.7 (d, ²Jc-f= 21.1 Hz), 117.0, 116.5, 115.0 (d, ²Jc-f= 24.1 Hz); HRMS (m/z) [M-H]calcd: 255.0575, found: 255.0733

Etap 3:

Ogólna procedura otrzymywania amidosiarczanowych pochodnych 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (5)

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, 1.5 mmol) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol). Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny w warunkach bezwodnych. Następnie roztwór pochodnej 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (1 eq, 1 mmol) w /V,/V-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z dichlorometanu.

Przykład 1 - etap 3:

Amidosiarczan 4-(5-fenylo-l,2,4- oksadiazol-3-ilo)fenylu

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny w warunkach bezwodnych. Następnie roztwór 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (otrzymanego wg procedury, przedstawionej w przykładzie 1, etap 2) (1 eq, 1 mmol, 0.238 g) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono, do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z dichlorometanu.

Wydajność 56%; temperatura, topnienia: 166-167°C; v_max (ATR)/cm'¹ 3301, 3193, 1607, 1556, 1493, 1425, 1376, 1206, 1155, 862, 758, 746; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 8.24-8.15 (6H, m, Ar-H, NH₂), 7.77-7.73 (1H, m, Ar-H), 7.71-7.64 (2H, m, Ar-H), 7.51 (2H, d, J= 8.8 Hz, Ar-H); ¹³C NMR6c(101 MHz, DMSO-de) 176.1, 168.1, 153.0, 133.9, 130.1, 129.4, 128.4, 124.8, 123.8, 123.4; HRMS (m/z) [M-H]~ calcd: 316.0397, found: 316.0566

PL 240 311 Β1

Przykład 2 - etap 3:

Amidosiarczan 4-(5-(3-fluorofenylo)-l,2,4- oksadiazol-3-ilo)fenylu

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016.eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny w warunkach bezwodnych. Następnie roztwór 4-(5-(3-fluorofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (otrzymanego wg procedury przedstawionej w przykładzie 2, etap 2) (1 eq, 1 mmol, 0.256 g) w N,N-dimetyloacetamidzie (5 ml) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z dichlorometanu.

Wydajność 47%; temperatura topnienia: 181-183°C; v_max (ATR)/cm·¹ 3398, 3296, 1565, 1491, 1363, 1204, 1159, 1127, 869, 769, 732; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DFMSO-de) 8.24-8.16 (4H, m, Ar-H, NH₂), 8.09-8.03 (1H, m, Ar-H), 8.00-7.97 (1H, m, Ar-H), 7.77-7.72 (1H, m, Ar-H), 7.65-7.60 (1H, m, Ar-H), 7.54-7.50 (2H, J = 8.8 Hz, Ar-H); ¹³C NMR δο (101 MHz, DMSO-de) 175.0 (d, ⁴Jc-f = 3.2 Hz), 5168.2, 162.3 (d, ¹Jc-f = 245.8 Hz), 153.1, 132.5 (d, ³Jc-f = 8.3 Hz), 129.4, 125.7 (d, ³Jc-f = 8.7 Hz), 124.8 (d, ⁴Jc-f = 3.0 Hz), 124.6, 123.5, 121.0 (d, ²Jc-f =21.1 Hz), 115.2 (d, ²Jc-f = 24,2 Hz); HRMS (m/z) [M-Hj- calcd: 334.0303, found: 334.0534

W podobny sposób otrzymuje się pozostałe związki o wzorze ogólnym 1 i 2.

B ) Badania aktywności biologicznej i medycznej otrzymanych pochodnych w teście radioizotopowym z wykorzystaniem linii komórkowej MCF-7 jako źródła enzymu sulfatazy steroidowej.

Badania aktywności w eksperymentach in vitro otrzymanych nowych związków o wzorze ogólnym 1:

gdzie Ri, R₂, Rs, R4, Rs = H albo F albo, Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH₂CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂

Aktywność medyczną i biologiczną związków o wzorze ogólnym 1, mających zastosowanie jako związki aktywne biologicznie - leki lub środki do wykorzystania in vitro np. w diagnostyce, wykazujące działanie jako inhibitory sulfatazy steroidowej STS, oznaczono w teście radioizotopowym z wykorzystaniem linii komórkowej MCF-7 jako źródła enzymu sulfatazy steroidowej według następującej procedury opisanej poniżej

Komórki MCF-7 zawieszono w zmodyfikowanej pożywce Eagle Dulbecco zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej i hodowano do uzyskania 80%-owej konfluencji.

Uzyskane komórki wysiano w 24-komorowych mikropłytkach (Nest Biotechnology) przy gęstości 105 komórek w komorze.

Ilość komórek określono przy pomocy Burker Counting Chamber.

PL 240 311 B1

- Inkubację komórek prowadzono przez 20 godzin w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 oraz 95% powietrza w pożywce bez surowicy (0.5 mL) z dodatkiem znakowanego radioizotopowe siarczanu estronu ([3H]E1S) wraz z inhibitorem lub bez.

- Po przeprowadzonej inkubacji pożywkę (0.45 mL) usunięto z komory, a utworzony produkt w postaci estronu ekstrahowano za pomocą toluenu (4 mL).

- Aktywność sulfatazy steroidowej mierzono za pomocą radioluminometru MicroBeta (Perkin Elmer).

- Każdy test wykonano w trzech powtórzeniach

Aktywność biologiczna i medyczna inhibitorów STS tj. związków według wzoru 1, została oznaczona poprzez analizę przebiegu reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem znakowanego radioizotopowe siarczanu estronu ([3H]E1S). Powyższa reakcja polegała na hydrolizie pochodnej ([3H]E1S) doestronu w wyniku działania enzymu STS. Uwolniony estron został oznaczony poprzez pomiar radioluminometrem. W końcowym etapie badań wyznaczono stopień zahamowania aktywności enzymu sulfatazy steroidowej (%) po inkubacji z odpowiednim inhibitorem tj. związkiem o wzorze ogólnym 1. Dla wszystkich możliwych związków o wzorze ogólnym 1, które szczegółowo przedstawiono w tabeli 1 jako. korzystne amidosiarczanowe pochodne 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu, zaobserwowano zredukowanie aktywności enzymu sulfatazy steroidowej do poziomu od 10.6 do 22.9% oraz od 40:9 do 75,1% przy stężeniu inhibitora równym odpowiednio 1 oraz 10 nM. W toku przeprowadzonych eksperymentów, przykładowo wykazano, że dla amidosiarczanu 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu stopień inhibicji enzymu sulfatazy steroidowej przy stężeniu inhibitora równym 1 nM wyniósł 77.1%, amidosiarczanu 4-(5-(3-fluorofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu 89.4%. Z tego względu związki o wzorze ogólnym 1 wykazują działanie biologiczne jak i medyczne, i mają zastosowanie medyczne jako leki. Potwierdzono, że nowe związki według wzoru ogólnego 1, jako jeden z możliwych mechanizmów działania biologicznego, wykazują silne działanie hamujące aktywność enzymu sulfatazy steroidowej w niskim nanomolowym stężeniu, co jest wystarczające aby związki działały jako leki zaliczane do inhibitorów sulfatazy steroidowej lub też jako związki znajdujące zastosowanie jako inhibitory sulfatazy steroidowej w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych, badaniach klinicznych in vivo. W szczególności związki o wzorze ogólnym 1 mają zastosowanie jako leki w terapii nowotworowej a w szczególności w terapii hormonozależnych nowotworów zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi.

Zbadano również działanie biologiczne i medyczne związków o wzorze ogólnym 2 mających zastosowanie jako leki o działaniu modulatora receptora estrogenowego (SERM) lub też jako związki znajdujące zastosowanie w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych jako, modulatory receptora estrogenowego (SERMs). Badanie to przeprowadzono za pomocą wstępnej analizy powinowactwa związków do receptorów estrogenowych w znanych testach in vitro. W toku podjętych badań in vitro, ludzkie receptory .estrogenowe (ERa i ERe) poddano inkubacji przez 4 godziny w temperaturze 23°C, po uprzednim potraktowaniu testowanymi związkami w różnych stężeniach oraz w obecności 5 nM [2,4,6,7,16,17-3 H]-estradiolu w objętości całkowitej 150 μl. Testowane związki użyte do w/w eksperymentów przygotowano w roztworze DMSO. Wszystkie związki, w tym [2,4,6,7,16,17-3 H ]-estradiol i receptory, rozcieńczono następnie w odpowiednim buforze (Tween/PBS 99.85: 0.15 w/v) oraz poddano inkubacji. Następnie, niezwiązany [2,4,6,7,16,17-3 H]-estradiol usunięto przez dodanie mieszaniny 10% DCC i 2% albuminy z surowicy bydlęcej, inkubując przez 15 min w 4°C, a następnie wirowano przy 6000 g przez 5 minut w 4°C. 150 μl supernatantu dodano do 4 cm³ cieczy scyntylacyjnej i radioaktywność związanego estradiolu zmierzono przy użyciu licznika ciekłoscyntylacyjnego. W przeprowadzonym w/w wstępnym teście potwierdzono działanie biologiczne i medyczne związków przedstawionych w tabeli 2, charakteryzujących się wysokim stopniem powinowactwa do ludzkich receptorów estrogenowych (ERa i ERe).

Ze względu na fakt, iż związki o wzorze ogólnym 1 mogą być hydrolizowane do związków o wzorze ogólnym 2, zbadano również działanie biologiczne i medyczne związków o wzorze ogólnym 1 mających zastosowanie jako leki o działaniu modulatora receptora estrogenowego (SERM) lub też jako związki znajdujące zastosowanie w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych jako modulatory receptora estrogenowego (SERMs). W badaniach z wykorzystaniem standardowego testu in vitro zaobserwowano wysoki stopień powinowactwa związków o wzorze ogólnym 1 do receptorów estrogenowych.

We wstępnych badaniach mikrobiologicznych na podstawie antybiogramów potwierdzono również działanie biologiczne i medyczne - przeciwdrobnoustrojowe związków o wzorze ogólnym 2. W celu

PL 240 311 Β1 oznaczenia potencjału związków o wzorze ogólnym 2 jako środków przeciwdrobnoustrojowych, przeprowadzono wstępne testy z wykorzystaniem metody krążkowo-dyfuzyjnej. W testowanej metodzie złoża zostały zaszczepione powierzchniowo inokulum szczepów testowych, przygotowanym z hodowli bakteryjnej w płynnym podłożu, odwirowanej i zamieszczonej w sterylnej soli fizjologicznej. Na przygotowane podłoże nałożono krążki bibuły nasączone roztworem testowanych związków o odpowiednio dobranych stężeniach. Po 24 godzinnej inkubacji mierzono strefy zahamowania wzrostu [mm]. Przeprowadzone wstępne badania udowodniły potencjał testowanych związków 2, które to w niniejszych badaniach charakteryzowały się wysokim stopniem zahamowania wzrostu bakteryjnych szczepów testowych in vitro.

Claims (15)

1. Związki chemiczne imitujące układ steroidowy i zawierające ugrupowanie amidosiarczanowe o wzorze ogólnym 1:

gdzie Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CFsalbo OCFsalbo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

2. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

do zastosowania jako leki, gdzie R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

3. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 2 jako lek o działaniu inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub jako lek o działaniu modulatorów receptora estrogenowego.

4. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

do zastosowania jako inhibitor sulfatazy steroidowej/modulator receptora estrogenowego,

PL 240 311 Β1 gdzie Ri, R₂, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH₂CH₃ albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂.

5. Związki chemiczne imitujące układ steroidowy o wzorze ogólnym 2:

gdzie R1, R₂, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH₂CH₃ albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂.

6. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 2:

do zastosowania jako leki, gdzie R1, R₂, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH₂CH₃ albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂

7. Związki chemiczne do zastosowania według zastrz. 6 leki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym i/lub jako leki o działaniu modulatorów receptora estrogenowego.

8. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 2:

do zastosowania jako leki, gdzie R1, R₂, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo CH₂CH₃ albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂

9. Sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym 1:

PL 240 311 Β1 gdzie Ri, R₂, R3, R4, Rs = H albo F albo Br albo Cl albo I albo CF3 albo OCF3 albo CH3 albo

CH₂CH₃ albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO₂, przy czym sposób przeprowadza się kilkuetapowo według schematu 1:

NH^OH HCI

Na^COj EtOH

A

4 β

R_t R₂, R_s. R₄, Rj = H, F, Br. Cl. I, CF_3> OCF_S, CHj, CHjCH₃. CH(CHj)₂, OCHj. NO₂ gdzie w pierwszym etapie otrzymuje się A/’,4-dihydroksybenzimidamid (2) w wyniku reakcji 4-hydroksybenzonitrylu (1) z chlorowodorkiem hydroksyloaminy w obecności węglanu sodu; a następnie otrzymany oczyszczony lub surowy produkt (2) jest kolejno traktowany odpowiednią pochodną chlorku kwasu benzoesowego (3) (generowanego in situ w reakcji z chlorkiem tionylu SOCI₂) prowadząc do otrzymania rdzenia inhibitora w postaci pochodnej 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (4), zaś kolejny etap polega na otrzymaniu produktu końcowego (5) w wyniku reakcji generowanego in situ chlorku aminosulfurylu z pochodną 4-(5-fenylo-1,2,4-oksadiazol-3ilo)fenolu (4) i ten etap przeprowadza się warunkach bezwodnych.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że pierwszy etap przeprowadza się w czasie minimum 30 minut, korzystnie w czasie od 2 do 24 godzin.

11. Sposób według zastrz. 9 lub 10, znamienny tym, że po upływie minimum 1 godziny (najkorzystniej 3 godzin) dodaje się kolejny ekwiwalent chlorowodorku hydroksyloaminy oraz soli węglanu lub wodorowęglanu, najkorzystniej węglanu sodu i całość ogrzewa się najkorzystniej w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez kolejne 20 godzin.

12. Sposób według zastrz. 9 znamienny tym, że drugi etap przeprowadza się in situ bez izolacji lub z izolacją produktów pośrednich.

13. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-12, znamienny tym, że drugi etap prowadzi się przez co najmniej 12 godzin, korzystnie w czasie od 12 do 48 godzin.

14. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-13, znamienny tym, że trzeci etap przeprowadza się w warunkach bezwodnych w temperaturze w zakresie od 15 do 40°C, korzystnie 30-40°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

15. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-14, znamienny tym, że trzeci etap przeprowadza się w czasie minimum 6 godzin.