PL239258B1 - Krystaliczna postać insuliny glargine o stechiometrycznej zawartości cynku i sposób jej otrzymywania - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania krystalicznej postaci insuliny glargine z zawartością cynku odpowiadającą stosunkowi molowemu cynku do insuliny wynoszącemu 1:3, która powinna znaleźć zastosowanie w wytwarzaniu preparatów farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia cukrzycy.

Stan techniki

Insulina glargine (znana również jako Lantus®) to analog ludzkiej insuliny, w której występujący w pozycji 21 łańcucha A kwas asparaginowy został zastąpiony glicyną Gly (A21) natomiast sekwencję łańcucha B przedłużono o dodatkowe dwa aminokwasy, tj. dodając dwie argininy, Arg (B31) i Arg (B32). Wprowadzone modyfikacje zmieniają punkt izoelektryczny uzyskiwanego analogu z pH 5,4 na pH 6,7, dzięki czemu posiada on lepszą rozpuszczalność w roztworze o pH kwaśnym (zwłaszcza wynoszącym około 4) niż o pH fizjologicznym (wynoszącym około 7,4). W efekcie, po podskórnym wstrzyknięciu kwaśnego roztworu tego analogu, np. o pH około 4, wytrąca się on w miejscu wstrzyknięcia tworząc tzw. depot, z którego później następuje stopniowe uwalnianie białka do organizmu. Dlatego insulina glargine jest stosowana do wytwarzania preparatów insuliny o spowolnionym uwalnianiu przeznaczonych do leczenia cukrzycy.

Ze względów praktycznych, takich jak lepsza stabilność i trwałość białka, szczególnie pożądane jest otrzymywanie insuliny i jej analogów w postaci krystalicznej. Dotyczy to w szczególności insuliny glargine.

W zgłoszeniu WO2015084694 opisano sposób krystalizacji insuliny glargine z zasadowego roztworu (o pH wyższym o co najmniej 1 od wartości punktu izoelektrycznego analogu insuliny) zawierającego czynnik stabilizujący kryształy (związek fenolowy) oraz rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą (taki jak: etanol, metanol, aceton lub izopropanol) przy czym krystalizacja inicjowana jest poprzez dodanie soli cynku.

Znane metody wiążą się ze stosowaniem fenolu lub jego pochodnych podczas krystalizacji insuliny glargine, co rodzi konieczność usuwania z uzyskanych kryształów silnie toksycznego związku fenolowego. Kolejnym problemem jest ścisłe kontrolowanie poziomu zawartości cynku w uzyskiwanej postaci krystalicznej insuliny glargine, tak aby wytwarzany preparat spełniał normy farmakopealne.

Cel wynalazku

Zasadniczym celem wynalazku jest dostarczenie krystalicznej postaci insuliny glargine bez obecności związków fenolowych, spełniającej farmakopealne wymagania dotyczące czystości określone dla tej substancji aktywnej, a także stabilnej przez co najmniej 12 miesięcy w zakresie wymagań farmakopealnych oraz łatwo rozpuszczalnej.

Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu otrzymywania krystalicznej postaci insuliny glargine pozwalającego na uzyskanie tej postaci substancji aktywnej ze stechiometrycznie ustaloną zawartością cynku, mieszczącą się jednocześnie w normach farmakopealnych.

Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie tej postaci insuliny glargine w formie kryształów o długościach krawędzi dochodzących do 10 μm.

Szczególnym celem wynalazku jest również dostarczenie postaci krystalicznej insuliny w formie kryształów o jednorodnym rozmiarze i kształcie oraz trwałości ułatwiającej ich dalszą obróbkę, taką jak odsiewanie, frakcjonowanie i suszenie. Uzyskiwane kryształy nie powinny zbyt łatwo pękać w trakcie tych zabiegów, aby nie zakłócać ich przebiegu np. poprzez zatykanie sita.

Nieoczekiwanie, określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest krystaliczna postać insuliny glargine składająca się z insuliny glargine i cynku, przy czym zawartość cynku odpowiada stosunkowi molowemu cynku do insuliny glargine wynoszącemu 1:3. Korzystnie, ma ona postać kryształów o długościach krawędzi dochodzących do 10 μm.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine według wynalazku określonej powyżej charakteryzujący się tym, że przygotowuje się mieszaninę krystalizacyjną stanowiącą roztwór wodny o pH od 6,5 do 7,5 o składzie:

- insulina glargine w stężeniu od 5 do 11 mg/ml,

PL 239 258 B1

- rozpuszczalnik organiczny wybrany spośród izopropanolu lub 1 -propanolu w stężeniu od 15 do 35% wagowych,

- cytrynian sodu w stężeniu od 10 do 30 mM,

- związek cynku (II) w stężeniu od 2 do 8 mM, z której następnie prowadzi się proces krystalizacji, a po jego zakończeniu oddziela się otrzymaną postać krystaliczną insuliny glargine składająca się z insuliny glargine i cynku, w której zawartość cynku odpowiada stosunkowi molowemu cynku do insuliny glargine wynoszącemu 1:3.

Korzystnie, mieszanina krystalizacyjna zawiera sól cynku, korzystnie octan cynku.

Korzystnie, czas trwania etapu krystalizacji wynosi od 30 minut do 12 godzin, korzystnie co najmniej 3 godziny. Szczególnie korzystnie czas trwania etapu krystalizacji wynosi od 30 minut do 60 minut.

W pierwszym korzystnym wariancie, krystalizację prowadzi się w gradiencie temperatury, a etap krystalizacji inicjuje się poprzez obniżenie temperatury początkowej mieszaniny krystalizacyjnej do temperatury inicjacji krystalizacji, przy czym temperatura początkowa jest wyższa od 28°C. Szczególnie korzystnie, na początku etapu krystalizacji utrzymuje się mieszaninę w temperaturze inicjacji przez czas z zakresu od 30 do 60 min. Szczególnie korzystnie, temperatura mieszaniny krystalizacyjnej jest obniżana w trakcie etapu krystalizacji, korzystnie do temperatury końcowej o wartości leżącej w zakresie od 10°C do 18°C, zwłaszcza około 12°C.

W drugim korzystnym wariancie, krystalizację prowadzi się w stałej temperaturze o wartości w zakresie od 10°C do 27°C, a etap krystalizacji inicjuje się poprzez uzyskanie mieszaniny krystalizacyjnej w wyniku zmieszania dwóch roztworów:

a) roztworu RA zawierającego insulinę glargine i rozpuszczalnik organiczny, oraz

b) roztworu RB zawierającego związek cynku (II) oraz cytrynian sodu.

Szczegółowy opis wynalazku

Ujawniony sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine według wynalazku i zdefiniowanej powyżej polega on na przygotowaniu mieszaniny, w której insulina glargine jest początkowo rozpuszczona, a następnie przez zmianę temperatury lub składu mieszaniny, obniża się jej rozpuszczalność inicjując w ten sposób proces krystalizacji.

Prezentowany sposób krystalizacji umożliwia uzyskanie substancji insuliny glargine w postaci krystalicznej, bez wykorzystania fenolu i jego pochodnych. Mieszanina krystalizacyjna zawiera wodę, rekombinowaną insulinę glargine, związek cynku, rozpuszczalnik organiczny oraz cytrynian sodu.

W korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku polega na przygotowaniu roztworu insuliny glargine w wodzie z dodatkiem rozpuszczalnika organicznego, związku cynku i cytrynianu sodu, a następnie zainicjowaniu krystalizacji przez zmianę temperatury. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku polega na przygotowaniu dwóch roztworów procesowych: roztworu RA zawierającego insulinę glargine, wodę i rozpuszczalnik organiczny oraz roztworu RB zawierającego wodę, cytrynian sodu oraz związek cynku. Krystalizacja inicjowana jest przez dodanie roztworu RB do roztworu RA w stałej temperaturze.

Wydajność obu korzystnych wariantów realizacji sposobu według wynalazku oscyluje w okolicach 90%.

Dla celów niniejszego opisu przyjęto następujące rozumienie poniższych pojęć.

Warunki początkowe - ustalony skład, pH i temperatura mieszaniny przed rozpoczęciem inicjacji krystalizacji.

Inicjacja krystalizacji - zmiana warunków początkowych mieszaniny prowadząca do rozpoczęcia procesu krystalizacji.

Warunki końcowe - ustalony skład, pH i temperatura mieszaniny do których doprowadza się w trakcie krystalizacji. Charakteryzują się one niższą rozpuszczalnością białka niż w warunkach początkowych.

Proces krystalizacji - proces stopniowego przeprowadzenia mieszaniny z warunków początkowych do końcowych mający na celu uzyskanie insuliny glargine w postaci krystalicznej.

Temperatura początkowa - temperatura mieszaniny w warunkach początkowych.

Temperatura inicjacji - temperatura, w której rozpoczyna się krystalizacja insuliny glargine na skutek zmniejszenia jej rozpuszczalności w mieszaninie.

Temperatura końcowa - temperatura mieszaniny, w której kończy się prowadzenie krystalizacji.

W sposobie przebiegającym zgodnie z pierwszym korzystnym wariantem realizacji wynalazku krystalizacja prowadzona jest w gradiencie temperaturowym. Mieszaninę krystalizacyjną uzyskuje się

PL 239 258 B1 przez zmieszanie roztworu białka z rozpuszczalnikiem organicznym, cytrynianem sodu oraz związkiem cynku. Kolejność dodawania składników nie ma większego znaczenia, ale najkorzystniej jest gdy rozpuszczalnik dodaje się do roztworu białka jako pierwszy. Po korekcie pH do zadanej wartości inicjuje się krystalizację przez obniżenie temperatury mieszaniny.

W sposobie przebiegającym zgodnie z drugim korzystnym wariantem realizacji wynalazku krystalizacja prowadzona jest w stałej temperaturze a inicjacja krystalizacji następuje poprzez zmieszanie dwóch roztworów tj. roztworu białka i rozpuszczalnika organicznego (roztwór RA) i roztworu zawierającego jony cynku i cytrynian (roztwór RB). Krystalizację prowadzi się w stałej temperaturze, korzystnie o wartości z zakresu od 10°C do 27°C.

W obu korzystnych wariantach istotne parametry sposobu według wynalazku obejmują: stężenie insuliny glargine, pH, stężenie rozpuszczalnika organicznego, stężenie cytrynianu sodu, temperaturę poszczególnych etapów sposobu oraz stężenie jonów Zn²⁺. Na uzyskane wyniki mogą wpływać również takie parametry jak sposób mieszania podczas procesu krystalizacji oraz czas krystalizacji.

Stężenie insuliny glargine w mieszaninie krystalizacyjnej powinno wynosić od 5 do 11 mg/ml. Stężenie insuliny glargine w mieszaninie krystalizacyjnej determinuje czas procesu potrzebny do otrzymania kryształów białka z wydajnością 90% i więcej. Wzrost stężenia białka w podanym zakresie skutkuje skróceniem czasu krystalizacji o ok. 50%.

Wartość pH powinna wynosić od 6,5 do 7,5. Wartość pH mieszaniny krystalizacyjnej około 7 pozwala na całkowite przejście formy amorficznej insuliny glargine w formę krystaliczną. Ustalono, że obniżenie pH do 6 lub podniesienie do 8 skutkuje otrzymaniem mieszaniny zarówno formy krystalicznej jak i amorficznej.

Stężenie rozpuszczalnika organicznego powinno wynosić od 15 do 35%. Jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się: izopropanol lub 1-propanol lub ich mieszaninę. Zawartość rozpuszczalnika w mieszaninie krystalizacyjnej ma wpływ na rozpuszczalność insuliny glargine w roztworze. Ustalono, że zawartość rozpuszczalnika organicznego w mieszaninie krystalizacyjnej mniejsza niż 15% albo większa niż 35% skutkuje otrzymaniem mieszaniny formy krystalicznej i amorficznej insuliny glargine.

Stężenie cytrynianu sodu powinno wynosić od 10 do 30 mM. Ustalono, że obecność cytrynianu sodu ma wpływ na rozpuszczalność białka oraz na stabilność formy krystalicznej. Zbyt niskie stężenie soli powoduje otrzymanie mieszaniny zarówno formy krystalicznej jak i amorficznej. Zbyt duże stężenie soli powoduje deformację i przerost formy krystalicznej oraz obniżenie wydajności procesu. Rolą cząsteczek cytrynianu sodu jest również buforowanie mieszaniny krystalizacyjnej. W przypadku, gdy obok soli w mieszaninie będzie obecny rozpuszczalnik organiczny należy pamiętać, że niewłaściwy dobór stężenia soli względem stężenia rozpuszczalnika może spowodować rozwarstwienie się mieszaniny, co w efekcie prowadzi do powstania mieszaniny formy krystalicznej i amorficznej podzielonej między obie fazy.

Temperatura początkowa (tj. temperatura mieszaniny początkowej, w której znajduje się insulina glargine) nie powinna być niższa od temperatury inicjacji krystalizacji. Korzystnie, temperatura początkowa jest wyższa od temperatury inicjacji krystalizacji - tak, aby roztwór był klarowny. Zapobiega to wypadaniu białka w postaci amorficznej, która może już nie przejść do formy krystalicznej, obniżając wydajność i/lub utrudniając odsączenie kryształów. Jednak należy unikać zbyt wysokiej temperatury (zwłaszcza powyżej 40°C) , która może przyczyniać się do denaturacji białka bądź znacząco przyspieszyć jego degradację. W pierwszym wariancie realizacji temperatura początkowa jest wyższa od 28°C. W drugim wariancie realizacji wynalazku, w którym wszystkie etapy prowadzone są zasadniczo w tej samej temperaturze, temperatura początkowa, inicjacji krystalizacji i końcowa powinny być stałe, a ich wartość powinna mieścić się w zakresie od 10°C do 27°C.

W wariancie realizacji wynalazku w gradiencie temperaturowym, inicjacja krystalizacji następuje w temperaturze niższej niż temperatura początkowa. Temperatura inicjacji jest temperaturą, w której nadwyżka insuliny glargine w stosunku do jej rozpuszczalności zaczyna krystalizować - objawia się to opalizacją, a następnie zmętnieniem mieszaniny. Czas utrzymania mieszaniny krystalizacyjnej w temperaturze inicjacji przekłada się na jakość kryształów. Korzystnie jest utrzymać mieszaninę w temperaturze inicjacji przez czas z zakresu od 30 do 60 min. Ma to pozytywny wpływ na jednorodność otrzymanych form krystalicznych oraz wielkość kryształów. Następnie obniża się temperaturę mieszaniny krystalizacyjnej aż do osiągnięcia temperatury końcowej.

Temperatura końcowa (tj. temperatura mieszaniny po zakończeniu krystalizacji) nie powinna być wyższa od temperatury inicjacji. W przypadku krystalizacji prowadzonej przez obniżenie temperatury,

PL 239 258 B1 temperatura końcowa ma wpływ na wydajność procesu i jest ograniczona jedynie możliwością zamarznięcia mieszaniny. Im niższa temperatura, tym niższa rozpuszczalność, a tym samym wyższa wydajność. Korzystnie jeśli temperatura końcowa krystalizacji znajduje się w zakresie 10-18°C.

Stężenie jonów cynku w mieszaninie krystalizacyjnej powinno wynosić od 2 do 8 mM. Krystalizacja nie zachodzi bez jego udziału dla określonych zgodnie z wynalazkiem zakresów stężeń białka, izopropanolu oraz soli. Ustalono, że w tych warunkach cynk jest odpowiedzialny za stabilizację form krystalicznych, a jego zawartość w kryształach jest bliska teoretycznej, stechiometrycznej zawartości cynku (0,36%) (tj. 1 cząsteczka Zn przypada na 3 cząsteczki insuliny). Oznaczanie zawartości cynku w uzyskanym preparacie krystalicznej insuliny glargine wykonywano metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej (ASA) zgodnie z procedurą opisaną w farmakopei europejskiej (Ph Eur. 9.0 - 2.2.23 Method) i określono w % wagowych z granicą wykrywalności (LOD) wynoszącą 0,01%.

Na przebieg procesu krystalizacji może mieć również wpływ sposób mieszania. Inicjacji krystalizacji może towarzyszyć intensywne mieszanie, natomiast proces krystalizacji ma korzystny przebieg przy łagodnym mieszaniu.

W wariancie realizacji wynalazku prowadzonym w gradiencie temperaturowym mieszanie jest wykorzystywane do tego, aby cała forma amorficzna przekształciła się w formę krystaliczną. Skraca również czas krystalizacji do < 6h. Mieszanie zwiększa efektywność wymiany ciepła pomiędzy mieszaniną krystalizacyjną a medium chłodzącym i/lub skraca czas wymieszania się składników mieszaniny podczas zmiany jej składu.

W wariancie wynalazku realizowanym w zasadniczo stałej temperaturze mieszanie skraca czas uzyskania jednorodnej mieszaniny reakcyjnej oraz skraca czas krystalizacji.

Ustalono, że niezależnie od wariantu realizacji, zbyt intensywne mieszanie prowadzi do uzyskania stosunkowo małych kryształów, a zbyt łagodne wydłuża czas krystalizacji w stosunku do tych mieszanych właściwie.

W jednej z korzystnych realizacji pożądaną jednorodność i kształt kryształów uzyskuje się dla czasu krystalizacji leżącego w zakresie od 30 do 60 minut. Uzyskiwane są wówczas kryształy, które mają regularny kształt i dużą trwałość zapobiegającą ich pękaniu w kolejnych etapach obróbki. Dzięki temu mogą być łatwo odfiltrowane, ponieważ nie zawierają zbyt dużych kryształów o nieregularnych kształtach, które zazwyczaj podczas odsiewania pękają, a powstająca w ten sposób frakcja zatyka sito.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się insulinę glargine w postać kryształów o długościach krawędzi dochodzących do 10 μm.

Przykłady

Dla lepszego zrozumienia jego istoty wynalazek został dodatkowo wyjaśniony na poniższych przykładach. Załączone figury przedstawiają obrazy mikroskopowe uzyskanych kryształów. Wykorzystano mikroskop Nikon Eclipse 80i z obiektywem Nikon Plan Apo 100x/l.4.

P r z y k ł a d 1

W celu przygotowania roztworu RA do 25 ml roztworu insuliny glargine o stężeniu białka 15g/L dodano 11,25 ml izopropanolu. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 1 minutę. W celu przygotowania roztworu RB do 0,375 ml 1M roztworu cytrynianu sodu dodano 0,3 ml 1M roztworu octanu cynku. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 1 minutę a następnie skorygowano jej pH do wartości 7,0. Do roztworu RA dodano roztwór RB i skorygowano pH mieszaniny do wartości 7,0. Otrzymaną mieszaninę krystalizacyjną mieszano intensywnie przez 10 min a następnie pozostawiono w temperaturze otoczenia do krystalizacji. Otrzymane kryształy insuliny przefiltrowano. Wydajność procesu krystalizacji po 12 godzinach wynosiła 90%. Uzyskane kryształy zostały przedstawione na Fig. 1.

P r z y k ł a d 2

W celu przygotowania roztworu RA do 25 ml roztworu insuliny glargine o stężeniu białka 15 g/L dodano 7,5 ml n-propanolu. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 1 minutę. W celu przygotowania roztworu RB do 4,725 ml wody dodano 0,125 ml IM roztworu cytrynianu sodu i 0,15 ml octanu cynku. Do roztworu RA dodano roztwór RB i skorygowano pH mieszaniny do wartości 7,0. Otrzymaną mieszaninę krystalizacyjną mieszano intensywnie przez 10 min w temperaturze 10°C a następnie pozostawiono w tej temperaturze do krystalizacji. Wydajność procesu krystalizacji po ponad 12 godzinach wynosiła 90%. Uzyskane kryształy zostały przedstawione na Fig. 2.

PL 239 258 B1

P r z y k ł a d 3

Przygotowano 100 ml mieszaniny krystalizacyjnej o temperaturze 29°C i pH 7,0 zawierającą insulinę glargine o stężeniu 5 g/L, 30 ml izopropanolu, 0,8 ml 1M roztworu octanu cynku oraz 2 ml roztworu cytrynianu sodu. Mieszaninę podczas intensywnego mieszania schłodzono do temperatury 27°C. Po osiągnięciu temperatury inicjacji krystalizacji przerwano mieszanie i utrzymywano osiągniętą temperaturę przez 60 minut. Następnie rozpoczęto łagodne mieszanie i kontynuowano chłodzenie mieszaniny przez 150 minut do temperatury 12°C. Uzyskane kryształy zostały przedstawione na Fig. 3.

Claims (10)

1. Postać krystaliczna insuliny glargine składająca się z insuliny glargine i cynku, przy czym zawartość cynku odpowiada stosunkowi molowemu cynku do insuliny glargine wynoszącemu 1:3.

2. Postać insuliny glargine według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać kryształów o długościach krawędzi dochodzących do 10 μm.

3. Sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowuje się mieszaninę krystalizacyjną stanowiącą roztwór wodny o pH od 6,5 do 7,5 o składzie:

- insulina glargine w stężeniu od 5 do 11 mg/ml,

- rozpuszczalnik organiczny wybrany spośród izopropanolu lub 1-propanolu w stężeniu od 15 do 35% wagowych,

- cytrynian sodu w stężeniu od 10 do 30 mM,

- związek cynku (II) w stężeniu od 2 do 8 mM, z której następnie prowadzi się proces krystalizacji, a po jego zakończeniu oddziela się otrzymaną postać krystaliczną insuliny glargine składająca się z insuliny glargine i cynku, w której zawartość cynku odpowiada stosunkowi molowemu cynku do insuliny glargine wynoszącemu 1:3.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że mieszanina krystalizacyjna zawiera sól cynku, korzystnie octan cynku.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że czas trwania etapu krystalizacji wynosi od 30 minut do 12 godzin, korzystnie co najmniej 3 godziny.

6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że czas trwania etapu krystalizacji wynosi od 30 minut do 60 minut.

7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że krystalizację prowadzi się w gradiencie temperatury, a etap krystalizacji inicjuje się poprzez obniżenie temperatury początkowej mieszaniny krystalizacyjnej do temperatury inicjacji krystalizacji, przy czym temperatura początkowa jest wyższa od 28°C.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że na początku etapu krystalizacji utrzymuje się mieszaninę w temperaturze inicjacji przez czas z zakresu od 30 do 60 min.

9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że temperatura mieszaniny krystalizacyjnej jest obniżana w trakcie etapu krystalizacji, korzystnie do temperatury końcowej o wartości leżącej w zakresie od 10°C do 18°C, szczególnie korzystnie około 12°C.

10. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że krystalizację prowadzi się w stałej temperaturze o wartości w zakresie od 10°C do 27°C, a etap krystalizacji inicjuje się poprzez uzyskanie mieszaniny krystalizacyjnej w wyniku zmieszania dwóch roztworów:

a) roztworu RA zawierającego insulinę glargine i rozpuszczalnik organiczny, oraz

b) roztworu RB zawierającego związek cynku (II) oraz cytrynian sodu.