PL233887B1 - Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method - Google Patents
Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method Download PDFInfo
- Publication number
- PL233887B1 PL233887B1 PL415495A PL41549515A PL233887B1 PL 233887 B1 PL233887 B1 PL 233887B1 PL 415495 A PL415495 A PL 415495A PL 41549515 A PL41549515 A PL 41549515A PL 233887 B1 PL233887 B1 PL 233887B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- real time
- sacchari
- identification
- aphelenchoides
- time pcr
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000294569 Aphelenchoides Species 0.000 title claims abstract description 16
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 3
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000134843 Aphelenchoides besseyi Species 0.000 description 1
- 241000418444 Aphelenchoides composticola Species 0.000 description 1
- 241000294568 Aphelenchoides fragariae Species 0.000 description 1
- 241000680417 Aphelenchoides ritzemabosi Species 0.000 description 1
- 241001341708 Aphelenchoides subtenuis Species 0.000 description 1
- 241001220428 Aphelenchus avenae Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom, rozwiązanie to umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanego gatunku nicienia, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.The subject of the application is a method and kit for identifying the fungal pest nematode Aphelenchoides sacchari using the Real Time PCR method. Thanks to specifically selected primers and probes, this solution enables precise identification of the indicated nematode species, regardless of the type of samples tested, their origin and purpose, and the stage of development.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR.The present invention relates to a method and a kit for identifying Aphelenchoides sacchari nematode, a fungal pest, by Real Time PCR.
Nicienie pasożytnicze żerujące na grzybni są wyposażone w specjalny aparat gębowy, którym wysysają sok komórkowy z grzybni pieczarek, co prowadzi do jej obumierania. Straty widoczne są zwykle dopiero w dalszych rzutach, lecz jeśli podłoże było bardzo zainfekowane w czasie rozrostu grzybni, to mogą one pojawić się wcześniej. W razie występowania nicieni pasożytniczych jedynym sposobem ich eliminacji jest gotowanie podłoża na półkach po zakończeniu uprawy i uprzątnięcie wszelkich jego resztek z pieczarkami, a drewniane półki należy ponownie impregnować. Najgroźniejszymi dla uprawy pieczarki są Aphelenchus avenae, Aphelenchoides composticola i Aphelenchoides sacchari.Parasitic nematodes feeding on the mycelium are equipped with a special mouthpiece that sucks the cell sap from the mushroom mycelium, which leads to its death. Losses are usually not seen until later flushes, but if the substrate was heavily infected during mycelial growth, it may appear earlier. In the case of parasitic nematodes, the only way to eliminate them is to boil the substrate on the shelves after the end of cultivation and clean up any remains of it with mushrooms, and the wooden shelves should be re-impregnated. The most dangerous for mushroom cultivation are Aphelenchus avenae, Aphelenchoides composticola and Aphelenchoides sacchari.
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.Identification of nematode species is based on the analysis of morphological and morphometric features, including the diagnosis of female coloration at various stages of development, cyst shape, length and shape of dagger tumors, length of invasive larvae, pattern on the perineal plate. However, this is a very laborious and time-consuming analysis. It requires a lot of knowledge and experience in working with biological material. Moreover, there is the possibility of overlapping dimensions of different species. The method based on the analysis of morphological and morphometric features cannot be used to identify adolescents in which morphological features are not yet developed.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to s tosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.Currently, techniques based on the analysis of nucleic acids, including the polymerase chain reaction (PCR), are increasingly used in nematological diagnostics. The basis of the PCR technique is the amplification of a DNA fragment (s) specific for a specific organism to a level that allows for its quick and simple detection using electrophoresis. This is achieved by using short single-stranded oligonucleotides (12-40 nucleotides), the so-called primers, specific for the amplified DNA fragment, and the enzyme - thermostable polymerase, which enables the amplification of the desired fragment in a cyclic, three-step reaction consisting of denaturation, primer binding and DNA synthesis. Typically, after about 30 reaction cycles, more than a million copies of the amplified DNA fragment are obtained, which can be identified by gel electrophoresis.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji poiimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragm entu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primerdimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.An improvement to the polymerase chain reaction is Real Time PCR, that is, a PCR reaction with the measurement of the amount of amplified fragment in each reaction cycle. To measure the amount of the amplified fragment, fluorochromes (fluorescent dyes) are used, e.g. SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, whose fluorescence is proportional to the amount of the amplified fragment. Identification of the resulting products is carried out by measuring the amount of fluorescence and analyzing the melting curve of the reaction products without electrophoresis. The sensitivity of Real Time PCR is much higher than that of traditional PCR, and the lack of electrophoresis shortens the analysis time. The disadvantage of Real Time PCR with fluorescent dyes (similar to traditional PCR) is the limited specificity of the reaction. In most cases, the PCR reaction occurs not only when the primer sequence is 100% identical to the template sequence but also when 1-2 nucleotides are non-identical. This property of traditional PCR and Real Time PCR with fluorescent dyes requires precise setting of the thermal parameters of the reaction. In addition, fluorescent dyes bind to each double-stranded DNA fragment, also resulting from primer amplification (primer-primer products, primerdimer), which also requires careful selection of the appropriate primer concentration. An alternative to fluorescent dyes are fluorescently labeled DNA probes. These are short sections of DNA, complementary to the searched sequence, which, when attached to DNA during PCR reactions, emit fluorescence at a specific wavelength. Currently, several types of probes are known, e.g. TaqMan, FRET, molecular beacons, and scorpions. The specificity of the Real Time PCR reaction with labeled probes is much higher than with fluorescent dyes. Unlike primers, a single nucleotide mismatch in the probe sequence usually leads to no reaction or a very significant reduction in yield, which is easy to see when monitoring the course of the reaction or analyzing the results of the reaction.
Identyfikacja gatunków należących do rodzaju Aphelenchoides (A. besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis) metodą real time PCR została opisana w pracy Rybarczyk-Mydłowska K, Mooyman P, van Megen H, van den Elsen S, Vervoort M, Veenhuizen P, van Doorn J, Dees R, Karssen G, Bakker J, Helder J. 2012 Small Subunit Ribosomal DNA-Based Phylogenetic Analysis of Foliar Nematodes (Aphelenchoides spp.) and Their Quantitative Detection in Complex DNA Backgrounds. Nematology 102(12): 1153-1160, natomiast do identyfikacji Aphelenchoides sacchari doIdentification of species belonging to the genus Aphelenchoides (A. besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi, A. subtenuis) using the real time PCR method was described in the work by Rybarczyk-Mydłowska K, Mooyman P, van Megen H, van den Elsen S, Vervoort M , Veenhuizen P, van Doorn J, Dees R, Karssen G, Bakker J, Helder J. 2012 Small Subunit Ribosomal DNA-Based Phylogenetic Analysis of Foliar Nematodes (Aphelenchoides spp.) And Their Quantitative Detection in Complex DNA Backgrounds. Nematology 102 (12): 1153-1160, while the identification of Aphelenchoides sacchari to
PL 233 887 Β1 tychczas stosowano tylko tradycyjne metody morfologiczne i morfometryczne. Identyfikacja tych gatunków za pomocą PCR została zaproponowana przez autorów po raz pierwszy.PL 233 887 Β1 at that time only traditional morphological and morphometric methods were used. Identification of these species by PCR was proposed by the authors for the first time.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.In the state of the art, there is still a need to provide a tool enabling the detection of selected nematode species that are not genetically identified, as well as an improved method of identifying those nematode species that are detected by known genetic techniques, but do not ensure high precision and do not exclude errors in the analysis.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywanie nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.The object of the invention is to provide a method that allows the identification of nematode species with high sensitivity and specificity. The aim of the invention is also to provide a method for the identification of nematodes which have not been detected so far by methods of analyzing the genetic material of the species tested. It is also an object of the invention to provide new nucleotide sequences of primers and probes or a non-obvious selection of known sequences and probes, applicable in the method of detecting nematodes by PCR, especially Real Time PCR, regardless of the type of test, their origin and purpose, and the stage of development.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.The above objectives have been achieved in the present invention.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, obejmujący następujące etapy:The present invention relates to a method for identifying the nematode Aphelenchoides sacchari, comprising the following steps:
a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;(a) providing a soil sample containing nematodes for identification;
b) wypłukanie nicieni z gleby;b) rinsing the nematodes from the soil;
c) izolację DNA;c) DNA isolation;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;d) performing a PCR reaction, in particular Real Time PCR, using a pair of 3 'and 5' primers and a probe;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:e) comparison of the amplification curve of the tested sample with the amplification curves of the blank sample and the negative control, where for the identification of one of the above species in the PCR reaction, especially Real Time PCR, primers 3 'and 5' appropriate for a given species and the probe are used:
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Aphelenchoides sacchari, metodą PCR, zwłaszcza Real Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:The subject of the invention is also a kit for the identification of nematodes selected from the group consisting of Aphelenchoides sacchari species, by PCR, especially Real Time PCR, containing species-specific 3 'and 5' primers and a probe:
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.The reaction mixture contains a buffer, thermostable Taq polymerase, magnesium ions, primers and a probe. The concentration of primers in the reaction mixture is 1-2 μM, probes 50-100 nM, magnesium ions 2-5 mM. The reaction is carried out at an annealing temperature of the primers of 55-60 ° C, in a volume of the reaction mixture of 10-20 µΙ, using 35 to 40 reaction cycles. Product identification is accomplished by comparing the amplification curves of the test sample with the amplification curves of the blank.
Poniżej podano przykład identyfikacji Aphelenchoides sacchari. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju z tej samej rodziny.An example of the identification of Aphelenchoides sacchari is given below. In each case, the same isolation and amplification conditions were applied to the blank (deionized H2O free from nuclease) and the negative sample. The material for the negative sample was DNA of a nematode species belonging to the same genus as the tested species, a mixture of equal amounts of nematode DNA belonging to the same species as the tested species, or in the absence of species belonging to the same genus from the same family.
PrzykładExample
Identyfikacja nicienia Aphelenchoides sacchari.Identification of the nematode Aphelenchoides sacchari.
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:DNA was isolated using Macherey-Nagel's commercial NucleoSpin Tissue XS DNA isolation kits. The reaction used primers and probes with the following sequences:
PL 233 887 Β1PL 233 887 Β1
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:The Real Time PCR reaction was performed in a 20 μΙ mixture in a Qiagen RotorGene 6000 apparatus using reagents from the LuminoCt qPCR ReadyMix kit (Sigma-Aldrich) in the following amounts:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,- Nuclease-free H2O up to a volume of 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Asachfv i Asachrv,- 2 μ110.0 μΜ of each of the Asachfv and Asachrv primers,
- 1 μΙ 4,0 μΜ Asachs znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,- 1 μΙ 4.0 μΜ Asachs labeled at the 5 'end with JOE dye and in the 3' end with HBQ1 quencher,
- 10 μΙ 2X Lumino Ct qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),- 10 μΙ 2X Lumino Ct qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorCiene 6000 i przeprowadzano reakcje amplilfikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:The reaction mixture was placed in a 20 μΙ tube, placed in the rotor of a RotorCiene 6000 thermal cycler, and 40 cycles of amplilation were carried out under the following conditions:
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Aphelenchoides avenae.DNA from Aphelenchoides avenae nematodes was a negative control.
Krzywe amplifikacje uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig 1.The amplification curves obtained as a result of the performed analysis are shown in Fig 1.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie Aphelenchoides sacchari w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w ty nr etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real Time PCR. Metodę według wynalazku można zastosować do identfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenie oraz stadium rozwoju.The solution according to the invention allows the detection of Aphelenchoides sacchari within a few hours, including the stages of sample preparation, DNA isolation and Real Time PCR reactions. The method according to the invention can be used to identify the above-mentioned species of nematodes irrespective of the type of test, its origin and stage of development.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej nicienie wymienione gatunki nicienie w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.The proposed set of probes allows to identify the above-mentioned nematode species in the Real Time PCR reaction, which is much more sensitive and faster than other PCR methods. The use of probes in the Real Time PCR reaction significantly increases the specificity of the reaction in relation to the Real Time PCR reaction with fluorescent dyes.
Wykaz sekwencji starterów i sondPrimer and probe sequence listing
PL 233 887 B1PL 233 887 B1
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL415495A PL233887B1 (en) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL415495A PL233887B1 (en) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL415495A1 PL415495A1 (en) | 2017-07-03 |
PL233887B1 true PL233887B1 (en) | 2019-12-31 |
Family
ID=59201358
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL415495A PL233887B1 (en) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
PL (1) | PL233887B1 (en) |
-
2015
- 2015-12-23 PL PL415495A patent/PL233887B1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL415495A1 (en) | 2017-07-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108060257A (en) | It is a kind of that strong male rotten mould Primer composition and its detection method are detected based on loop-mediated isothermal amplification technique | |
KR101771402B1 (en) | Methods for nucleic acid quantification | |
KR102128651B1 (en) | Detection set for dengue virus serotypes using multiplex real-time pcr and detection method thereof | |
PL233887B1 (en) | Method and a kit for identification of Aphelenchoides sacchari nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method | |
PL233889B1 (en) | Method and a kit for identification of Paraphelenchus myceliophthorus nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method | |
PL231509B1 (en) | Method and a kit for identification of Paraphelenchus tritici nematode, mushroom pests, by the Real Time PCR based method | |
PL230913B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes, mushroom pests, by Real Time PCR based method | |
PL230914B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes, forest plant pests, preferably coniferous trees, by Real Time PCR based method | |
PL233837B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes, papilionaceous plant growing pests, by Real Time PCR based method | |
RU2642273C1 (en) | Method of differentiating yersinia pestis strains on basic and nonbasic subtypes by pcr method in real time mode | |
PL232394B1 (en) | Method and a kit for identification of Xiphinema diversicaudatum nematode that is harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL233892B1 (en) | Method and a kit for identification of Longidorus eonymus nematode that is harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL233886B1 (en) | Method and a kit for identification of Geocenamus longus nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL233888B1 (en) | Method and a kit for identification of Paralongidorus maximus nematode that is harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL231512B1 (en) | Method and a kit for identification of Longidorus intermedius nematode that is harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL231513B1 (en) | Method and a kit for identification of Longidorus poessneckensis nematode that is harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL231511B1 (en) | Method and a kit for identification of Bursaphelenchus tiliae nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL230915B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes, root crop pests, by Real Time PCR based method | |
PL233836B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes that are harmful to fruit trees and bushes, by Real Time PCR based method | |
PL232392B1 (en) | Method and a kit for identification of Bursaphelenchus fraudulentus nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL232391B1 (en) | Method and a kit for identification of Bursaphelenchus hofmanni nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL233891B1 (en) | Method and a kit for identification of Geocenamus curvatum nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL233839B1 (en) | Method and a kit for identification of nematodes, pests of grains and grasses, by Real Time PCR based method | |
PL231510B1 (en) | Method and a kit for identification of Rotylenchus capitatus nematode, forest plants pest, by the Real Time PCR based method | |
PL233894B1 (en) | Method and a kit for identification of Merlinius microdorus nematode, pest of grains and grasses, by Real Time PCR based method |