PL230446B1 - Sposób otrzymywania erytrytolu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania erytrytolu. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym, chemicznym oraz kosmetycznym.

Obecne znane są metody otrzymywania erytrytolu na drodze biologicznej z udziałem drobnoustrojów z glukozy, sacharozy i mieszaniny glukozy i fruktozy, enzymatycznie zhydrolizowanej skrobi z pszenicy oraz skrobi kukurydzianej.

Jednym ze sposobów produkcji erytrytolu jest wykorzystanie drożdży Torulla corallina. Produkcję przy udziale tego szczepu prowadzi się na wstrząsarce w 250 ml kolbach w podłożu zwierającym 400 g/l glukozy, jako źródło węgla. Po 138 godzinach hodowli wstrząsanej uzyskuje się 196 g/l erytrytolu z wydajnością 0.49 g/g (Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim, Deok-Kun Oh, Biotechnology Letters. 2000, 22, str. 983.)

W innym sposobie produkcji erytrytolu z glukozy przez drożdże z rodzaju Moniliella, znany jest proces hodowli okresowej prowadzony w bioreaktorze, gdzie zastosowano wysokie stężenie początkowe glukozy równe 300 g/l. Po 144 godzinach hodowli okresowej uzyskano 111 g/l erytrytolu z wydajnością 0,37 g/g (Shie-Jea Lin, Chiou-Yen Wen, Jian-Ching Liau, Wen-Shen Chu. Process Biochemistry. 2001,36, str. 1249).

Znany jest również proces okresowej produkcji erytrytolu w pożywkach syntetycznych zawierających jedynie glicerol jako źródło węgla i energii przez drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica (Li-Βο Yang, Xiao-Bei Zhanl, Zhi-Yong Zheng, Jian-Rong Wu, Min-Jie Gao, Chi-Chung Lin. Bioresours Technology. 2014, 151, str. 120). W hodowli okresowej otrzymano 194.3 g/l erytrytolu z szybkością objętościową produkcji erytrytolu 0.95 g/lh.

Znany jest również sposób otrzymywania erytrytolu w hodowli okresowej zasilanej glicerolem z udziałem nowo wyizolowanego szczepu drożdży Y. lipolytica MK1 (Aleksandra Maria Mirończuk, Adam Dobrowolski, Magdalena Rakicka, Anita Rywińska, Waldemar Rymowicz. Process Biochemistry, 2015, 50 str. 61). Szczep MK1 produkował 243 g/l erytrytolu, z szybkością 0.54 g/lh.

Znane są drożdże Yarrowia lipolytica o fenotypie Suc⁺(Nicaud, J.M., Fabre, E., Gaillardin, C., 1989. Expression of invertase activity in Yarrowia lipolytica and its use as a selective marker. Curr. Ge net. 16 (4), str: 253-260).

Znane są również sposoby wykorzystania szczepów drożdży Yarrowia lipolytica o fenotypie Suc⁺ do produkcji kwasu cytrynowego (Wojtatowicz M., Rymowicz W., Robak M., Żarowska B., Nicaud J., 1997, Pol. J. Food Nutr. Sci., 6/47, 4, s. 49-54). Znany jest również sposób, opisany w patencie PL 216012, jednoczesnej produkcji kwasu cytrynowego oraz inwertazy przez drożdże Yarrowia lipolytica o fenotypie Suc⁺. Z hodowli tych uzyskuje się z 1 litra: 20-100 g kwasu cytrynowego, 2000-70000 jednostek inwertazy (U) oraz od 5-25 g suchej biomasy.

Nieznane są natomiast sposoby produkcji erytrytolu w pożywkach zawierających w swoim składzie melasę, otrzymywaną w procesie produkcji cukru białego, oraz dodatkowo glicerol. Melasa jest to produkt odpadowy, uzyskiwany podczas produkcji cukru spożywczego; o zawartości sacharozy 40%-50%, której dalsze odzyskiwanie jest nieopłacalne. Drożdże Yarrowia lipolytica o fenotypie Suc⁺ mają zdolność wzrostu na pożywkach zawierających melasę, w której głównym składnikiem jest sacharoza. Drożdże Y. lipolytica fenotypie Suc⁺ mają w klonowany gen SUC2 produkują inwertazę, enzym, który hydrolizuje sacharozę obecną w melasie do glukozy i fruktozy. Drożdże Y. lipolytica Suc⁺ są zdolne do wydajnej produkcji erytrytolu w systemie dwustopniowym, gdzie w pierwszej fazie namnażania biomasy komórkowej, drożdże wykorzystują do swojego wzrostu sacharozę z melasy, a w fazie produkcji erytrytolu wykorzystują wyłącznie glicerol do jego biosyntezy.

Istotą wynalazku jest to, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się wyciąg drożdżowy w ilości od 5 do 15 g, bakto-pepton od 5 do 20 g, glukoza od 15 do 30 g oraz pozostałą ilość wody. Następnie ustala się pH na poziomie od 5 do 6, po czym tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej, a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca Suc⁺, wytrząsa z prędkością od 150 do 260 obr./min., w temperaturze, co najmniej 27°C przez co najmniej dwie doby. Tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią: melasa buraczana od 30 do 150 g/l, (NH4)2SO4 od 1,5 do 5,0 g/l, MgSO4-7H2O od 0,5 do 2 g/l, KH2PO4 od 0,1 do 0,8 g/l, ekstrakt drożdżowy od 0,5 do 2 g/l, pepton od 0,1-1 g/l oraz pozostałą ilość wody. Hodowlę prowadzi się w temperaturze co najmniej 26°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200 rpm i szybkości napowietrzania

PL 230 446 Β1 od 100 do 800 ml/min. Po upływie co najmniej doby do pożywki dodaje się glicerol w ilości maksymalnie 25% wagowych, a po kolejnych 24 godzinach dodaje się co najmniej 1% wagowy NaCI, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,8-3,2 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania glicerolu z pożywki. Następnie oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym, a jony usuwa na wymieniaczach jonowych. Płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej, a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy, oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.

Korzystnie jest, gdy na wyhodowaną biomasę, po upływie 24 h od dodania glicerolu dodatkowo dodaje się co najmniej 1% wagowy NaCI na 1 litr pożywki produkcyjnej znajdującej się w bioreaktorze.

Korzystnie jest, gdy glicerol dodaje się do pożywki po upływie 24 do 48 godzin od początku prowadzenia hodowli.

Korzystnie również jest, gdy do namnożenia biomasy stosuje się melasę buraczaną.

Korzystnie także jest, gdy po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 3,0.

Korzystnie również jest, gdy glicerolem jest gliceryna odpadowa z produkcji biodiesla.

Zaletą sposobu według wynalazku, jest możliwość otrzymywania dużych ilości erytrytolu z odnawialnych, tanich surowców roślinnych oraz z surowców będących odpadami poprzemysłowymi. Ponadto dodawanie glicerolu do pożywki dopiero w 48 godzinie hodowli, znacznie zwiększa stężenie końcowe erytrytolu w brzeczce pofermentacyjnej, ze względu na znaczny wzrost ciśnienia osmotycznego w brzeczce, co stymuluje biosyntezę erytrytolu przez drożdże i nie wymaga dodawania dodatkowych, znacznych ilości NaCI do pożywki celem zwiększenia ciśnienia osmotycznego. Zaletą jest również to, że wysoką wydajność produkcji erytrytolu osiąga się na poziomie 73%, przy końcowym stężeniu erytrytolu do 146,0 g/l. Dodatkowo odzyskuje się do 25 g suchej biomasy drożdży z litra pożywki.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest na przykładach.

Przykład 1

Podłoże inokulacyjne o objętości 50 ml zawierające: glukoza - 20 g/l; ekstrakt drożdżowy - 10 g/l; bakto-pepton - 10 g/l; woda destylowana do 1 litra, zaszczepia się szczepem Yarrowia lipolytica MK1 Suc⁺ następnie hoduje się drożdże przez 48 godzin w kolbie stożkowej o objętości 300 ml, w temperaturze 28-30°C na wstrząsarce rotacyjnej przy 260 obr/min. Hodowla ta stanowi inokulum właściwej hodowli produkcyjnej, którą przeprowadza się w 5-litrowym bioreaktorze, zawierającym 2 litry podłoża produkcyjnego o składzie: melasa buraczana 60 g/l, (NH4)2SO4 - 2,3 g/l; MgSO4-7H2O - 1 g/l; KH2PO4 0,22 g/l, ekstrakt drożdżowy - 1 g/l; bakto-pepton 1 g/l, woda wodociągowa do 1 litra, pH początkowe hodowli 6,8. W trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 30°C, szybkość obrotową mieszadła 800 obr/min i szybkość napowietrzania 0,6 litra powietrza/min. Po 48 godzinach prowadzenia hodowli w podłożu z melasą buraczaną, dodaje się 200 g/l glicerolu oraz obniża pH hodowli do 3,0. Do utrzymania pH środowiska hodowlanego na tym poziomie stosuje się 20% NaOH. Po 200 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, w 1 litrze pożywki otrzymuje się 98 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 22,2 g/l suchej biomasy drożdży.

Przykład 2

Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym, że po 24 godzinach od dodania glicerolu, dodaje się 10 g/l NaCI. Po 210 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 145,6 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 22,9 g/l suchej biomasy drożdży. Proces biosyntezy erytrytolu rozpoczyna się po 48 h. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,69 g/l h.

Przykład 3

Przygotowuje się inokulum jak w przykładzie 1. Warunki prowadzenia procesu są takie same, jak w przykładzie 1, z tym że zastosowane podłoże produkcyjne zawiera: melasa buraczana 30 g/l, (NH4)2SO4 - 2,3 g/l; MgSO4-7H2O - 1 g/l; KH2PO4 0,22 g/l, ekstrakt drożdżowy - 1 g/l; woda wodociągowa do 1 litra. Po 48 h hodowli dodaje się 200 g/l glicerolu oraz obniża pH brzeczki do 3,0. Po kolejnych 24 h hodowli, dodaje się do podłoża 10 g/l NaCI. Po 262 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 42,3 g/l erytrytolu oraz 11 g/l suchej biomasy drożdży. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,16 g/l h.

Przykład 4

Przygotowuje się inokulum jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że biosyntezę erytrytolu prowadzi się z użyciem szczepu Yarrowia lipolytica A101 Suc⁺. Warunki prowadzenia procesu są takie same, jak w przykładzie 1, z tym że zastosowane podłoże produkcyjne zawiera: melasa buraczana 60 g/l,

PL 230 446 Β1 (NH4)2SO4 - 2,3 g/l; MgSO4-7H2O - 1 g/l; KH2PO4 0,22 g/l, ekstrakt drożdżowy - 1 g/l; woda wodociągowa do 1 litra. Po 48 h hodowli dodaje się 200 g/l glicerolu oraz obniża pH brzeczki do 3,0. Po kolejnych 24 h hodowli, dodaje się do podłoża 10 g/l NaCI. Po 236 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu otrzymuje się 97,7 g/l erytrytolu. Dodatkowo uzyskuje się 23 g/l suchej biomasy drożdży. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,42 g/l h.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania erytrytolu drogą biosyntezy z wykorzystaniem drożdży Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się wyciąg drożdżowy w ilości od 5 do 15 g, bakto-pepton od 5 do 20 g, glukoza od 15 do 30 g oraz pozostałą ilość wody, po czym ustala się pH na poziomie od 5 do 6, następnie tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej, a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca o genotypie Suc⁺, wytrząsa z prędkością od 150 do 200 obr./min., w temperaturze co najmniej 27°C przez co najmniej dwie doby, po czym tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią: melasa w ilości od 30 do 150 g/l, (NH4)2SO4 od 1,5 do 5,0 g/l, MgSO4-7H2O od 0,5 do 2 g/l, KH2PO4 od 0,1 do 0,8 g/l, oraz ekstrakt drożdżowy i pepton w ilościach jak poprzednio oraz pozostałą ilość wody i prowadzi hodowlę w temperaturze co najmniej 27°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200, szybkości napowietrzania od 100 do 800 ml/min, po upływie co najmniej 24 godzin do pożywki dodaje się glicerol w ilości maksymalnie 25% wagowych, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,8-3,2 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania glicerolu z pożywki, po czym oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym, a jony usuwa na wymieniaczach jonowych, następnie płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej, a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy erytrytolu, oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.
2. 2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że po upływie 24 h od dodania glicerolu dodaje się co najmniej 1% wagowy NaCI.
3. 3. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że glicerol dodaje się do pożywki po upływie 24 do 48 godzin od początku prowadzenia hodowli.
4. 4. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do namnożenia biomasy stosuje się melasę buraczaną.
5. 5. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 3,0.
6. 6. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że glicerolem jest gliceryna odpadowa z produkcji biodiesla.