PL225454B1 - Sposób wytwarzania podjednostek białka płaszcza wirusa nekrozy pomidora, ToTV, metodą nadekspresji w systemie prokariotycznym E. coli - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania podjednostek białka płaszcza wirusa nekrozy pomidora, ToTV, metodą nadekspresji w systemie prokariotycznym E. coli mający zastosowanie: w produkcji przeciwciał, tym samym w diagnostyce wirusa nekrozy pomidora, a także w badaniach nad poznaniem jego struktury.

Produkcja białek heterologicznych, a więc takich, które produkowane są w warunkach in vivo poza organizmem macierzystym, jest obecnie szeroko stosowana zarówno do celów naukowych, jak i terapeutycznych. Białka z powodzeniem produkowane w systemach prokariotycznych i eukariotycznych to białka terapeutyczne, białka stanowiące reagenty, enzymy powszechnie stosowane w biologii molekularnej, jak i białka mające szerokie zastosowanie aplikacyjne w przemyśle, jak również do diagnostyki. Produkcja białek in vivo jest procesem niezwykle złożonym, który często wiąże się z potranslacyjnymi modyfikacjami białek, wpływającymi na ich stabilność, jak i biologiczną aktywność, do których należą m.in. fosforylacja, glikozylacja, poprawne zwijanie. Obecnie w biotechnologii z powodzeniem produkuje się białka w komórkach Escherichia coli, Bacillus, Lactoccocus lactis, Pseudomonas oraz Streptomyces), drożdżach, grzybach, roślinach oraz w komórkach ssaczych (Chen R., 2012, Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotechnology Advances Vol.30 pp.1102-1107). Biorąc pod uwagę koszty mediów hodowlanych, bezpieczeństwo produkcji białek w roślinie czy też w komórkach ssaczych, jak i niewielką wydajność (głównie w komórkach roślinnych) często proces ten ogranicza się jedynie do skali laboratoryjnej. Zdecydowanie bardziej korzystne warunki produkcji oferują systemy bakteryjne. Produkcja białek heterologicznych w komórkach E. coli była pionierskim odkryciem końca lat 70, kiedy to po raz pierwszy metodą nadekspresji uzyskano białko terapeutyczne - somatostatynę (Itakura K, Hirose T, Crea R, Riggs AD., Heyneker HL, Bolivar F, Boyer HW., 1977. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science Vol.198 no.4321 pp.1056-1063; Desai PN., Shrivastava N., Padh H., 2010. Production of heterologus proteins in plants: strategies for optimal expression. Biotechnology Advances Vol.28, pp. 427-435). W przeciągu ostatnich kilkunastu lat nastąpił wielki postęp jeśli chodzi o zakres stosowanych bakteryjnych wektorów ekspresyjnych charakteryzujących się różnorodnością promotorów (od słabych do bardzo silnych umożliwiających produkcję białek heterologicznych nawet do 10-30% całkowitego białka w komórce), replikonów, a także dużą liczbę zmodyfikowanych genetycznie szczepów bakterii posiadających określone właściwości pozwalające na efektywną produkcję określonego typu białek. Dla przykładu, dostępne są m. in. szczepy, które zapewniają odpowiednie środowisko do powstawania mostków dwusiarczkowych, szczepy zapewniające wysoką stabilność mRNA, czy przeznaczone do produkcji białek błonowych. Plazmidy ekspresyjne mogą kodować sekwencję znaczników, które umożliwiają późniejszą detekcję, oczyszczanie produkowanych białek, monitorowanie lokalizacji białka w komórce, bądź też zwiększających rozpuszczalność białek. Najczęściej stosowane w systemie bakteryjnym są wektory wykorzystujące polimerazę RNA faga T7, której gen znajdujący się pod kontrolą promotora lac można indukować przy pomocy syntetycznego analogu galaktozy - IPTG (izopropylo-3-D-galaktopiranozyd), np. plazmidy typu pET występujące aktualnie w kilkudziesięciu różnych wersjach. Istota procesu nadprodukcji w stosowanym tu systemie pET polega na tym, że w momencie indukcji, IPTG wiąże się z receptorem lacl, przez co represor uwalnia promotor polimerazy T7 umożliwiając transkrypcję i translację genu fagowej polimerazy RNA, a tym samym transkrypcję, a następnie translację genu docelowego. Oprócz odpowiedniego doboru wektora ekspresyjnego, promotorów, replikonów, szczepów bakterii w produkcji heterologicznej bardzo istotne są zoptymalizowane warunki hodowli. Do głównych czynników zaliczyć należy temperaturę procesu nadprodukcji, stężenie induktora, jak również warunki natlenienia hodowli. Wszystkie te czynniki pozostają we wzajemnych relacjach. Dla przykładu obniżenie temperatury powoduje zahamowanie wzrostu, obniżając poziom ekspresji, jednocześnie powodując spadek zapotrzebowania na tlen. Obniżenie temperatury w znacznym stopniu wpływa także na ograniczenie powstawania ciał inkluzyjnych, zwiększając tym samym rozpuszczalność. (Nuc K., Nuc P., 2006. Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia coli. http://www.au.poznan.pl/kbib/nuc06.pdf). Produkcja białek w systemie ekspresyjnym E. coli, który jest bardzo dobrze poznany i scharakteryzowany pod względem mechanizmów transkrypcji i translacji, cechujący się możliwością samodzielnego skonstruowania, jest procesem czasochłonnym, wymagającym optymalizacji, z drugiej jednak strony jest to stosunkowo tania, jeżeli chodzi o koszty mediów hodowlanych, jak i czynników selekcyjnych (antybiotyki), wydajna metoda uzyskiwania większości białek.

PL 225 454 B1

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania podjednostek białka płaszcza wirusa nekrozy pom idora, ToTV, metodą nadekspresji w systemie prokariotycznym E. coli, polegający na tym, że składa się z sześciu etapów, w pierwszym etapie następuje izolacja RNA z preparatu wirusowego, gdzie do oczyszczonego z rośliny preparatu wirusowego dodaje się bufor ekstrakcyjny, a następnie inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37°C, dalej prowadzi się ekstrakcję fenolową RNA mieszaniną fenol : chloroform : alkohol izoamylowy w stosunku 25:24:1 wg znanej procedury, a następnie otrzymane próbki wytrząsa się przez 1 minutę i wiruje przez 3 minuty przy prędkości 14000 rpm, dalej fazę wodną zbiera się i wytrąca z niej RNA przy użyciu 3 M octanu sodu w obecności 90% alkoholu etyl owego w temperaturze -70°C przez minimum 4 godziny, następnie RNA osadza się przez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut, przy prędkości 14000 rpm, a osad przemywa 70% alkoholem etylowym, suszy i zawiesza w ok. 20 μl wody wolnej od RNAz, w drugim etapie prowadzi się reakcję syntezy cDNA w celu uzyskania matrycy dla amplifikacji poszczególnych podjednostek wirusowego białka CP, do 2 μg RNA dodaje się 200 ng mieszaniny heksamerów 5'NNN NNN3' i uzupełnia wodą do objętości końcowej 12,5 μ( następnie inkubuje się w temperaturze 65°C przez 5 minut i schładza w łaźni lodowej, następnie dodaje się bufor reakcyjny, 2 μl mieszaniny 10 mM deoksyrybonukleotydów oraz 200 U odwrotnej transkryptazy M-MuLV. Mieszaninę inkubuje się przez 10 minut w temperaturze 25°C, 60 minut w 42°C, a następnie 10 minut w 70°C uzyskując w ten sposób preparat cDNA, w trzecim etapie dokonuje się amplifikacji podjednostek białka płaszcza CP wirusa ToTV, gdzie namnaża się fragmenty kodujące domeny białka CP: Vp23, Vp26 oraz Vp35 przy użyciu bardzo dokładnej polimerazy oraz starterów zaprojektowanych na podstawie wcześniej poznanych sekwencji wirusa nekrozy pomidora, przy czym starter 'forward' posiada sygnał do ukierunkowanego klonowania w wektor ekspresyjny pET200 czyli fragment sekwencji nukleotydów: CACC, natomiast starter 'reverse' posiada kodon stop, w czwartym etapie prowadzi się transformację komórek E. coli uzyskanym wektorem ekspresyjnym w celu jego propagacji, przy czym transformowane komórki wysiewa się na szalkę z LB z kanamycyną i inkubuje w cieplarce w temperaturze 37°C przez 16-18 godzin, po czym weryfikuje się transformaty za pomocą reakcji PCR, dalej z pozytywnych transformantów izoluje się zrekombinowane plazmidy i trawi się enzymami restrykcyjnymi i poddaje sekwencjonowaniu, w piątym etapie przeprowadza się transformację komórek E. coli szczepu BL21 DE3 plazmidami niosącymi informację dla poszczególnych podjednostek białka CP w celu ich nadekspresji, gdzie przeprowadza się trzy reakcje transformacji z wykorzystaniem 10 ng plazmidu z poszczególnymi insertami i dodaje się do 50 μl komórek kompetentnych, dalej całość kultury po reakcji transformacji zaszczepia się do 10 ml LB z kanamycyną i wytrząsa w inkubatorze w temperaturze 37°C przy prędkości 180 rpm przez ok. 12 godzin, w szóstym etapie przeprowadza się nadekspresje podjednostek białka płaszcza do wytworzenia podjednostek białka CP we frakcji rozpuszczalnej, gdzie zaszczepia się po 500 μl ośmiogodzinnej hodowli do kolby z 10 ml LB z kanamycyną, i wytrząsa przy prędkości 190-200 rpm w inkubatorze w temperaturze 37°C przez ok. 2-4 h, gdy bakterie znajdują się w fazie logarytmicznego wzrostu do hodowli dodaje się induktor nadekspresji IPTG w stężeniu 1 mM i prowadzi się hodowlę w temperaturze 30°C przez 2 h-2,5 h, następnie hodowlę wiruje się przy maksymalnej prędkości, osad waży się i zawiesza w odpowiedniej ilości buforu I w proporcji 10 ml/5 g bakterii, następnie dodaje się lizozym w stężeniu 2 mg/ml i inhibitor proteaz i inkubuje przez 30 minut w łaźni lodowej w temperaturze 4°C, po czym dodaje się 4 M NaCI w proporcji 1 ml 4M NaCI/5 g osadu i inkubuje w tych samych warunkach kolejne 15 minut, a następnie próby poddaje się sonikacji, gdzie stosuje się 5 serii ultradźwięków 4 x po 40 sek oraz 1 x po 3 sek., przy czym każdą próbę przed traktowaniem kolejną serią ultradźwięków delikatnie wytrząsa się góra - dół i przekłada każdorazowo w inne miejsce w sonikatorze, a następnie wiruje się przez 15 min z prędkością 12000 rpm w temperaturze 4°C, aż do uzyskania białka.

Korzystnym jest, gdy w etapie trzecim uzyskuje się na matrycy cDNA komplementarnego do wirusowego RNA namnożone fragmenty kodujące podjednostki Vp23, Vp26 oraz Vp35 poprzez amplifikację PCR ze starterami specyficznymi: 23f 5'caacTTTTCATATGGGGCTG3',

23r 5'ctaATTTTCAAAACTCCTTAG3' Vp26f 5'caccGCACAATTTGGTATG3',

Vp26r 5'ctaCTTTCCTTTCTCATC 3' 35f 5'caccAAGGTGGCCCAAACTAG3,

35r 5'ctaACGAGGAGGCTGCATGATG3', gdzie przeprowadza się wstępną denaturację przez 2 minuty w temperaturze 94°C, następnie powtarza się 30 cykli o następującym profilu termicznym: denat uracja w temperaturze 94°C przez 30 sek, przyłączanie starterów w temperaturach 48.5°C, 54°C i 61°C odpowiednio dla Vp23, 26 oraz 35, wydłużanie w 72°C przez 40 sek., przy czym w każdej reakcji amplifikacji zwiększa się stężenie MgCl₂ aż do stężenia końcowego 3,5 mM.

PL 225 454 B1

Korzystnym jest także, gdy w czwartym etapie przygotowania wektorów do nadekspresji weryf ikuje się obecność insertów DNA, kodujących badane podjednostki białka CP, poprzez reakcje trawienia enzymami restrykcyjnymi, gdzie uzyskane wektory zawierające DNA podjednostek Vp23 i Vp35 trawi się podwójnie enzymami Nhel i Sacl, natomiast w przypadku wektora zawierającego DNA dla podjednostki Vp26 trawienie przeprowadza się enzymem Xbal.

Korzystnym jest również, gdy białko w szóstym etapie uzyskuje się poprzez zaindukowanie ekspresji badanych białek induktorem - IPTG w stężeniu 1 mM, hodowlę prowadzi się w temperaturze 30°C przez 2 h dla podjednostek Vp26 i Vp35 oraz 2,5 h dla Vp23, przy prędkości 190-200 rpm.

Dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku uzyskano następujące efekty techniczno-użytkowe:

• uzyskano szybki, tani sposób produkcji poszczególnych podjednostek białka płaszcza (CP) wirusa nekrozy pomidora z wykorzystaniem systemu prokariotycznego, • uzyskano wydajną metodę uzyskiwania białka wirusa we frakcji rozpuszczalnej.

Wynalazek w przykładowym wykonaniu został zilustrowany na rysunkach i w tabelach, gdzie fig. 1 przedstawia elektroforezę produktu PCR dla podjednostek białka płaszcza w 1% żelu agarozowym, fig. 2 przedstawia podjednostki Vp23 oraz Vp26 białka płaszcza wirusa nekrozy pomidora, wyprodukowane w systemie ekspresyjnym E. coli, uwidocznione za pomocą techniki western blot, fig. 3 przedstawia podjednostkę Vp35 białka płaszcza wirusa nekrozy pomidora, wyprodukowaną w systemie ekspresyjnym E coli, uwidocznione za pomocą techniki western blot, tabela 1 przedstawia sekwencje użytych starterów, tabela 2 przedstawia warunki nadprodukcji podjednostek CP we frakcji rozpuszczalnej.

Sposób nadprodukcji poszczególnych podjednostek białka płaszcza ilustrują przykłady wykonania:

P r z y k ł a d y w y k o n a n i a:

Etap 1

Izolacja RNA z preparatu wirusowego

Reakcje prowadzono celem uzyskania oczyszczonego kwasu nukleinowego wirusa. W pierwszym etapie do oczyszczonego z rośliny preparatu wirusowego dodano bufor ekstrakcyjny o składzie: 50 mM Tris-Cl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% SDS, przed użyciem 1 mg/ml proteinazę K i inkubowano przez 15 minut w 37°C. Następnie prowadzono ekstrakcję fenolową mieszaniną fenol : chloroform : alkohol izoamylowy w stosunku 25:24:1, intensywnie wytrząsano i wirowano 3 minuty przy prędkości 14000 rpm. Ekstrakcję fenolową prowadzono jeszcze dwukrotnie, a następnie zebrano fazę wodną zawierającą RNA i poddano trzykrotnej ekstrakcji mieszaniną chloroform : alkohol izoamylowy w stosunku 24:1 w celu usunięcia resztek fenolu. Próby wytrząsano przez 1 minutę i wirowano 3 minuty przy prędkości 14000 rpm. W kolejnym etapie fazę wodną zebrano i wytrącano z niej RNA prz y użyciu 3 M octanu sodu w obecności 90% alkoholu etylowego w -70°C przez minimum 4 godziny. Następnie RNA osadzano przez wirowanie w 4°C przez 20 minut, przy prędkości 14000 rpm. Osad przemywano 70% alkoholem etylowym, suszono i zawieszano w ok. 20 μl wody wolnej od RNAz. Jakość wyizolowanego RNA sprawdzano elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym, wizualizowano w świetle UV.

Etap 2

Reakcja syntezy nici cDNA celem uzyskania matrycy dla amplifikacji poszczególnych podjednostek wirusowego białka (CP)

Reakcja polega na wykorzystaniu uzyskanego wcześniej RNA jako matrycy do syntezy nici cDNA przy użyciu metody odwrotnej transkrypcji. W tym celu 2 μg RNA dodano do 200 ng mieszaniny heksanukleotydów przypadkowych (5'NNN NNN3') i uzupełniono wodą do końcowej objętości 12,5 μl i inkubowano w temperaturze 65°C przez 5 minut, dalej schładzano w łaźni lodowej. Następnie dodano bufor reakcyjny (wg opisu producenta), 2 μl mieszaniny 10 mM deoksyrybonukleotydów oraz 200 U odwrotnej transkryptazy M-MuLV. Mieszaninę inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C, 60 minut w 42°C, a następnie 10 minut w 70°C. Uzyskany preparat cDNA wykorzystano do reakcji PCR.

Etap 3

Amplifikacja podjednostek białka płaszcza wirusa ToTV CP

Polega na namnożeniu fragmentów kodujących domeny białka CP Vp23, Vp26 oraz Vp35 z użyciem wysoce dokładnej polimerazy oraz specyficznych starterów zaprojektowanych na podstawie wcześniej poznanych sekwencji wirusa nekrozy pomidora. Starter 'forward' 5' posiada sygnał do ukierunkowanego klonowania w wektor ekspresyjny (pET200) czyli fragment sekwencji nukleotydów:

PL 225 454 B1

CACC, natomiast starter 'reverse' (3') posiada kodon stop. Sekwencje użytych starterów przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1

Nazwa startera	Sekwencja starterów	Ta	Długość produktu	Amplifikowany fragment
23f	5'caacTTTTCATATGGGGCTG3'	48.5°C	650 nt	Podjednostka białka płaszcza Vp23
23r	5'ctaATTTTCAAAACTCCTTAG3'
26f	5'caccGCACAATTTGGTATG3'	54°C	710 nt	Podjednostka białka płaszcza Vp26
26r	5'ctaCTTTCCTTTCTCATC 3'
35f	5'caccAAGGTGGCCCAAACTAG3'	61°C	737 nt	Podjednostka białka płaszcza Vp35
35r	5'ctaACGAGGAGGCTGCATGATG3'

Reakcje amplifikacji białek Vp23, Vp26 i Vp35 prowadzono w obecności 0,5 uM mieszaniny odpowiednich starterów (Tab. 1), 5 U polimerazy PfuUltra, 250 μM mieszaniny czterech deoksynukleotydów, oraz 1 μl matrycy cDNA (gdzie do syntezy cDNA wyjściowo użyto 2 μg RNA) w buforze reakcyjnym oraz 3,5 mM MgCl₂ w objętości 50 μΚ Mieszaninę reakcyjną wstępnie denaturowano przez 2 minuty w temperaturze 94°C, następnie przeprowadzono 30 cykli o następującym profilu termicznym: denaturacja 94°C 30 sek, przyłączanie starterów w temperaturach odpowiednich dla używanej pary starterów (Tab. 1) przez 30 sek oraz wydłużanie w 72°C przez 40 sek. Uzyskany produkt PCR każdorazowo analizowano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym z Midori Green i wizualizowano w świetle UV. W kolejnym etapie prowadzono elucję poszczególnych produktów reakcji PCR dla podjednostek białka CP z żelu agarozowego i klonowano za pomocą topoizomerazy do ww. wektora ekspresyjnego. W tym celu, w oddzielnych probówkach, prowadzono ligacje produktów dla każde z trzech podjednostek białka CP przy stosunku molowym insertu do wektora 3:1.

Etap 4

Transformacja komórek E. coli uzyskanym wektorem ekspresyjnym w celu jego propagacji

Metoda polega na przeprowadzeniu reakcji transformacji komórek chemicznie kompetentnych E. coli szczepu TOP10. W tym celu do mieszaniny komórek kompetentnych dodano 3 μl wcześniej przygotowanej mieszaniny ligacyjnej i inkubowano w łaźni lodowej w temperaturze 4°C przez 30 minut. Następnie, przeprowadzano szok termiczny: tak przygotowaną mieszaninę komórek inkubowano przez 30 sek w temperaturze 42°C, po czym szybko schładzano do temperatury 4°C. Po 2 minutac h inkubacji w łaźni lodowej w temperaturze 4°C, do komórek dodawano 250 μl płynnej pożywki SOC, w skład której wchodzi 2% (wagowo/objętościowy) trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy (wagowo/objętościowy), 0,05% NaCI (wagowo/objętościowy), 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl₂,10 mM MgSO₄, 20 mM glukoza. Hodowlę wytrząsano przy prędkości 200 rpm w inkubatorze mikrobiologicznym w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie wysiano ok. 100-200 μl zawiesiny transformowanych komórek na szalki LB z kanamycyną, IPTG i X-Gal (test komplementacji) i inkubowano w cieplarce w 37°C przez 16-18 godzin. Po tym czasie weryfikowano transformanty na podstawie niebieskiego/białego zabarwienia oraz dodatkowo za pomocą reakcji PCR z wykorzystaniem odpowiednich starterów (Tabela 1). Z pozytywnych transformantów izolowano zrekombinowane plazmidy. W celu potwierdzenia obecności insertów dla interesujących nas białek, plazmidy poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi: Vp23 trawiono podwójnie Sacl/Nhel, Vp35 trawiono podwójnie Sacl/Nhel oraz Vp26 trawiono Xbal zgodnie ze specyfikacją producenta. Plazmidy posiadające insert poddano sekwencjonowaniu z użyciem startera T7 forward (5') i T7 reverse (3') w celu potwierdzenia, czy pożądany insert znajduje się w odpowiedniej ramce odczytu.

PL 225 454 B1

Etap 5

Transformacja komórek E. coli szczepu BL21 (DE3) plazmidami niosącymi informację dla poszczególnych podjednostek białka CP w celu ich nadekspresji

Każdy eksperyment nadekspresji białka CP w systemie bakteryjnym wymagał reakcji transformacji komórek E. coli szczepu BL21 (DE3) uprzednio wyizolowanym plazmidem niosącym informacje DNA dla tego białka. W tym celu przeprowadzono trzy reakcje transformacji używając 10 ng plazmidu z odpowiednim insertem i dodano do 50 μl komórek, inkubowano 30 min. w łaźni lodowej, w temperaturze 4°C. Następnie prowadzono reakcje szoku termicznego wg opisu jak powyżej. Hodowle wytrząsano przez 30 minut w temperaturze 37°C przy prędkości 200 rpm, a następnie całość kultury zaszczepiano do 10 ml LB z kanamycyną i wytrząsano w inkubatorze w 37°C przy prędkości 180 rpm przez ok. 12 godzin.

Etap 6

Reakcja nadekspresji podjednostek białka CP w komórkach E. coli

Istotą tego procesu było wytworzenie badanych podjednostek białka płaszcza w formie rozpuszczalnej. Dlatego też w pierwszym etapie reakcji nadekspresji optymalizowano warunki produkcji białka, a więc czas prowadzenia reakcji nadprodukcji, temperaturę oraz stężenie induktora. W tym celu zaszczepiono po 500 μl z 8 godzinnej hodowli komórek z etapu 5 do dwóch kolb z 10 ml LB kanamycyną, i wytrząsano przy prędkości 180 rpm w inkubatorze w 37°C przez ok. 2-4 godzin. Gdy bakterie znajdowały się w fazie logarytmicznego wzrostu hodowle rozlano do kolb po 5 ml i do jednej dodano induktor nadekspresji IPTG w stężeniu 0.5 mM. Druga hodowla stanowiła kontrolę negatywną. Monitorowano czas pojawienia się produkowanego białka poprzez pobieranie 500 μl zawiesiny z kolb co 1 godzinę. Pobrane próby następnie wirowano przy maksymalnej prędkości, osad przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz. Ponieważ podjednostki białka płaszcza charakteryzują się dużą nierozpuszczalnością: Vp23 71.2%, Vp26 90.9%, Vp35 72.6% jednorazowo sprawdzono, czy produkowane białko faktycznie znajduje się we frakcji nierozpuszczalnej, czy też rozpuszczalnej. Dlatego też osady z prowadzonych hodowli zawieszano w 500 μl buforu lizującego o składzie na 100 ml buforu: 3 ml KH2PO4 1M, 4,7 ml K2HPO4 1M, 400 mM NaCl, 100 mM KCI, 10 ml glicerol 100%, 0.5% triton X-100, oraz 10 mM imidazol, pH buforu 7.8, kilkukrotnie zamrażano w ciekłym azocie i rozmrażano w 42°C, wirowano przy maksymalnej prędkości. Przesącz przeniesiono do nowej probówki, pobrano 30 μl i zawieszono w buforze obciążającym 2 x SDS w stosunku 1:1, gotowano 5 minut. Osad zawieszono w 30 μl buforu obciążającego 1 x SDS i również gotowano 5 minut. Następnie próby analizowano w 12% żelu poliakryloamidowym względem odpowiedniego markera białek. Na żel nakładano 10 μl próby supernatantu (przesączu) oraz po 5 μl z próby z osadem, a następnie weryfikowano techniką western blot. W konsekwencji uzyskano białko we frakcji nierozpuszczalnej, dlatego też stosując powyżej opisaną procedurę nadekspresji prowadzono proces nadprodukcji białek optymalizując warunki poprzez manipulację stężeniem IPTG - 0.5 mM oraz 1 mM IPTG, temperaturą 28°C i 30°C oraz czasem prowadzenia reakcji. Po upływie określonego czasu dla produkcji każdej z podjednostek z hodowli pobrano 1 ml do reakcji kontroli nadekspresji. Resztę hodowli wirowano 5000 rpm przez 15 minut w temperaturze 4°C, a następnie osad bakterii zamrożono w temperaturze -80°C w celu dalszych procedur związanych z oczyszczaniem wyprodukowanego białka na złożu z niklem, wykorzystując metodę chromatografii powinowactwa. Ekspresję białka każdorazowo potwierdzano techniką western blot. Próby przygotowywano w sposób analogiczny jak do oczyszczania białka na złożu z niklem. W tym celu pobraną w objętości 1 ml zawiesinę komórek wirowano w temperaturze 4°C przy prędkości 5000 rpm. Osad ważono i zawieszano w odpowiedniej ilości buforu I w proporcji 10 ml/5 g bakterii, w skład którego wchodzi: 50 mM Na2HPO4, pH 8, 50 mM NaCI, następnie do mieszaniny dodano lizozym w stężeniu 2 mg/ml oraz inhibitor proteaz wg wskazań producenta i inkubowano przez 30 minut w łaźni lodowej w temperaturze 4°C, po tym czasie dodano 4 M NaCI w proporcji 1 ml 4 M NaCI/5 g osadu i inkubowano w tych samych warunkach kolejne 15 minut. W kolejnym etapie próby poddano sonikacji. Stosowano 5 serii ultradźwięków 4 x po 40 sek. oraz 1 x po 3 sek. Każdą próbę przed traktowaniem kolejną serią ultradźwięków delikatnie wytrząsano góra - dół i przekładano, każdorazowo, w inne miejsce w sonikatorze. Następnie próby wirowano przez 15 minut przy prędkości 12000 rpm, w temperaturze 4°C. Pobrano 30 μl supernatantu, zawieszono w takiej samej objętości buforu obciążającego 2xSDS. 20 μl mieszaniny pobierano do analizy w 12% żelu poliakrylamidowym i rozdzielano względem odpowiedniego markera białek. Po przeprowadzonym rozdziale prowadzono detekcje podjednostek Vp23, Vp26 oraz Vp35 techniką western blot z udziałem przeciwciała Xpress tag.

PL 225 454 B1

W efekcie opracowano warunki przedstawione w tabeli 2, pozwalające na wytworzenie trzech podjednostek CP wirusa ToTV we frakcji rozpuszczalnej.

T a b e l a 2

Warunki nadprodukcji podjednostek CP we frakcji rozpuszczalnej

Podjednostka CP	Vp35	Vp26	Vp23
Czas indukcji	2 h	2 h	2.5 h
Stężenie induktora IPTG	1 mM	1 mM	1 mM
Prędkość (rpm, obr/min)	190-200	190-200	190-200
Temperatura [°C]	30	30	30

Zastrzeżenia patentowe

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania podjednostek białka płaszcza wirusa nekrozy pomidora, ToTV, metodą nadekspresji w systemie prokariotycznym E. coli, znamienny tym, że składa się z sześciu etapów, w pierwszym etapie następuje izolacja RNA z preparatu wirusowego, gdzie do oczyszczonego z rośliny preparatu wirusowego dodaje się bufor ekstrakcyjny, a następnie inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37°C, dalej prowadzi się ekstrakcję fenolową RNA mieszaniną fenol : chloroform : alkohol izoamylowy w stosunku 25:24:1 wg znanej procedury, a następnie otrzymane próbki wytrząsa się przez 1 minutę i wiruje przez 3 minuty przy prędkości 14000 rpm, dalej fazę wodną zbiera się i wytrąca z niej RNA przy użyciu 3 M octanu sodu w obecności 90% alkoholu etylowego w temperaturze -70°C przez minimum 4 godziny, następnie RNA osadza się przez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut, przy prędkości 14000 rpm, a osad przemywa 70% alkoholem etylowym, suszy i zawiesza w ok. 20 μl wody wolnej od RNAz, w drugim etapie prowadzi się reakcję syntezy cDNA w celu uzyskania matrycy dla amplifikacji poszczególnych podjednostek wirusowego białka CP, do 2 μg RNA dodaje się 200 ng mieszaniny heksamerów 5'NNN NNN3' i uzupełnia wodą do objętości końcowej

12,5 μ!, następnie inkubuje się w temperaturze 65°C przez 5 minut i schładza w łaźni lodowej, następnie dodaje się bufor reakcyjny, 2 μl mieszaniny 10 mM deoksyrybonukleotydów oraz 200 U odwrotnej transkryptazy M-MuLV. Mieszaninę inkubuje się przez 10 minut w temperaturze 25°C, 60 minut w 42°C, a następnie 10 minut w 70°C uzyskując w ten sposób preparat cDNA, w trzecim etapie dokonuje się amplifikacji podjednostek białka płaszcza CP wirusa ToTV, gdzie namnaża się fragmenty kodujące domeny białka CP: Vp23, Vp26 oraz Vp35 przy użyciu bardzo dokładnej polimerazy oraz starterów zaprojektowanych na podstawie wcześniej poznanych sekwencji wirusa nekrozy pomidora, przy czym starter 'forward' posiada sygnał do ukierunkowanego klonowania w wektor ekspresyjny pET200 czyli fragment sekwencji nukleotydów: CACC, natomiast starter 'reverse' posiada kodon stop, w czwartym etapie prowadzi się transformację komórek E. coli uzyskanym wektorem ekspresyjnym w celu jego propagacji, przy czym transformowane komórki wysiewa się na szalkę z LB z kanamycyną i inkubuje w cieplarce w temperaturze 37°C przez 16-18 godzin, po czym weryfikuje się transformaty za pomocą reakcji PCR, dalej z pozytywnych transformantów izoluje się zrekombinowane plazmidy i trawi się enzymami restrykcyjnymi i poddaje sekwencjonowaniu, w piątym etapie przeprowadza się transformację komórek E. coli szczepu BL21 DE3 plazmidami niosącymi informację dla poszczególnych podjednostek białka CP w celu ich nadekspresji, gdzie przeprowadza się trzy reakcje transformacji z wykorzystaniem 10 ng plazmidu z poszczególnymi insertami i dodaje się do 50 μl komórek kompetentnych, dalej całość kultury po reakcji transformacji zaszczepia się do 10 ml LB z kanamyc yną i wytrząsa w inkubatorze w temperaturze 37°C przy prędkości 180 rpm przez ok. 12 godzin, w szóstym etapie przeprowadza się nadekspresję podjednostek białka płaszcza do wytworzenia podjednostek białka CP we frakcji rozpuszczalnej, gdzie zaszczepia się po 500 μl ośmiogodzinnej hodowli do kolby z 10 ml LB z kanamycyną, i wytrząsa przy prędkości 190-200 rpm w inkubatorze w temperaturze 37°C przez ok. 2-4 h, gdy bakterie znajdują się w fazie logarytmicznego wzrostu do hodowli dodaje się induktor nadekspresji IPTG w stężeniu 1 mM i prowadzi się hodowlę w temperaturze 30°C przez 2 h-2,5 h, następnie hodowlę wiruje się przy maksymalnej prędkości, osad waży

PL 225 454 B1 się i zawiesza w odpowiedniej ilości buforu I w proporcji 10 ml/5 g bakterii, następnie dodaje się lizozym w stężeniu 2 mg/ml i inhibitor proteaz i inkubuje przez 30 minut w łaźni lodowej w temperaturze 4°C, po czym dodaje się 4 M NaCI w proporcji 1 ml 4M NaCI/5 g osadu i inkubuje w tych samych warunkach kolejne 15 minut, a następnie próby poddaje się sonikacji, gdzie stosuje się 5 serii ultradźwięków 4 x po 40 sek oraz 1 x po 3 sek., przy czym każdą próbę przed traktowaniem kolejną serią ultradźwięków delikatnie wytrząsa się góra - dół i przekłada każdorazowo w inne miejsce w sonikatorze, a następnie wiruje się przez 15 min z prędkością 12000 rpm w temperaturze 4°C, aż do uzysk ania białka.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie trzecim uzyskuje się na matrycy cDNA komplementarnego do wirusowego RNA namnożone fragmenty kodujące podjednostki Vp23, Vp26 oraz Vp35 poprzez amplifikację PCR ze starterami specyficznymi:

23f 5'caacTTTTCATATGGGGCTG3', 23r 5'ctaATTTTCAAAACTCCTTAG3'

Vp26f 5'caccGCACAATTTGGTATG3', Vp26r 5'ctaCTTTCCTTTCTCATC 3'

35f 5'caccAAGGTGGCCCAAACTAG3; 35r 5'ctaACGAGGAGGCTGCATGATG3', gdzie przeprowadza się wstępną denaturację przez 2 minuty w temperaturze 94°C, następnie powtarza się 30 cykli o następującym profilu termicznym: denaturacja w temperaturze 94°C przez 30 sek, przyłączanie starterów w temperaturach 48.5°C, 54°C i 61°C odpowiednio dla Vp23, 26 oraz 35, wydłużanie w 72°C przez 40 sek., przy czym w każdej reakcji amplifikacji zwiększa się stężenie MgCI₂ aż do stężenia końcowego 3,5 mM.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w czwartym etapie przygotowania wektorów do nadekspresji weryfikuje się obecność insertów DNA, kodujących badane podjednostki białka CP, poprzez reakcje trawienia enzymami restrykcyjnymi, gdzie uzyskane wektory zawierające DNA podjednostek Vp23 i Vp35 trawi się podwójnie enzymami Nhel i Sacl, natomiast w przypadku wektora zawierającego DNA dla podjednostki Vp26 trawienie przeprowadza się enzymem Xbal.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko w szóstym etapie uzyskuje się poprzez zaindukowanie ekspresji badanych białek induktorem-IPTG w stężeniu 1 mM, hodowlę prowadzi się w temperaturze 30°C przez 2 h dla podjednostek Vp26 i Vp35 oraz 2,5 h dla Vp23, przy prędkości 190-200 rpm.