KR100987013B1 - 내재 라이보좀 진입 부위 배열을 포함하는 베타카로틴생합성 유도 다중 발현 재조합 유전자 피아이씨, 이를포함하는 발현 벡터 및 그 형질전환 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내재 라이보좀 진입 부위(internal ribosome entry site) 배열을 이용하여 식물 대사공학에 유용한 유전자 다중발현 기술을 확립하고 그 기술을 이용한 베타카로틴 생합성 다중 발현 재조합 유전자, 그 발현 벡터 및 그 형질전환 벼 식물체의 개발에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 베타카로틴(프로비타민 A)이 축적되는 형질전환 쌀을 얻을 수 있다.

내재 라이보좀 진입 부위, 베타카로틴, 다중 발현, 발현 벡터, 형질전환

Description

내재 라이보좀 진입 부위 배열을 포함하는 베타카로틴 생합성 유도 다중 발현 재조합 유전자 피아이씨, 이를 포함하는 발현 벡터 및 그 형질전환 세포{Recombinant PIC gene including internal ribosome entry site sequence of crucifer-infecting Tobamovirus for beta-carotene biosysthesis, expression vector comprising thereof and a transformant cell}

본 발명은 내재 라이보좀 진입 부위(internal ribosome entry site) 배열을 이용하여 식물 대사공학에 유용한 유전자 다중발현 기술을 확립하고 그 기술을 이용한 베타카로틴 생합성 다중 발현 재조합 유전자, 그 발현 벡터 및 그 형질전환 벼 식물체의 개발에 관한 것이다.

본 발명은 하나의 프로모터에 의해서는 하나의 유전자만이 발현되는 모노-시스트로닉(mono-cistronic) mRNA 생성 기작을 가진 진핵생물(식물, 동물 등)에서 하나의 프로모터에 의해 다중의 유전자 클로스터(gene cluster)가 동시에 발현되는 원핵생물(박테리아 등)의 폴리-시스트로닉(poly-cistronic) mRNA 생성 기작과 같은 다중 유전자의 발현을 동시에 유도하려는 분자생물학 분야 중 유전자 발현 조절에 관한 매우 중요한 기술이다.

특히 식물의 경우, 아그로박테리아 매개 T-DNA 삽입 방법으로 다중의 유전자를 동시에 도입하여 발현 시키고자 할 때 사용되는 기술들을 그 기작에 따라서 분류하면 다음과 같다. 1) 다중 카세트 도입, 2) 아그로박테리아 공동 형질전환, 3) 형질전환체의 교배, 4) 단일 카세트 내에 다중 유전자 도입 ① 유전자-유전자 단순 융합(fusion), ② 프로테아제 인식 부위 및 프로테아제 삽입, ③ 자가절단 2A 배열 삽입, ④ 내재 라이보좀 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES) 삽입 등이 존재한다.

먼저 다중 카세트 도입에 관해 살펴보면 다음과 같다.

하나의 T-DNA 운반체에 여러 개의 도입 유전자 카세트(프로모터:유전자:터미네이터로 구성된 단위)를 삽입하는 방법은 가장 보편적으로 사용되고 있는 방법으로, 기존 사용되고 있는 거의 모든 기본 바이너리 운반체(pCambia, pBI, pGA, pSB 등)들은 형질전환 시 유전자 도입을 선발할 수 있는 항생제(카나마이신, 하이그로마시신 등) 또는 제초제(바스타, 근사미 등) 내성 유전자 카세트를 기본적으로 내재하고 있다. 목적으로 하는 도입 유전자 카세트를 추가할 경우 기본적으로 두 개의 카세트 도입은 불가피하고 리포터 유전자 카세트를 추가하거나 추가로 원하는 유전자 카세트를 도입하는 등 보편적으로 3～4개 카세트를 넘지 않는 게 일반적이다. 결국, 선발 마커를 제외하면 두 개의 목적 유전자 그 이상을 하나의 T-DNA 운반체에서 발현시키는 것은 어렵다고 할 수 있다.

다음으로 아그로박테리아 공동 형질전환(co-transformation)은 여러 개의 목적 유전자를 한 식물체에 도입하고자 할 때 개개의 T-DNA를 포함하는 이(異)종의 아그로박테리아를 공동배양하여 공동 형질전환시키는 방법이다. 이때 두 개의 T-DNA 도입을 동시에 선발하기 위해서 각 T-DNA는 다른 종류의 선발 마커 보유가 필수적이다. 식물에 따라 형질전환 조건이 특정 선발 마커에 국한되어 확립되어 있다고 볼 때, 이 방법은 적용대상 선정 시 제한이 큰 방법이다. 현재 비교적 형질전환 효율이 높은 벼 등에서는 각각 하이그로마이신과 포스피노트라이신(바스타 제초제 성분) 선발 마커로 제작된 이종의 T-DNA를 이용하여 공동 형질전환이 가능하다.

또한 형질전환체의 교배(sexual crossing)에 의한 유전자 집적(gene stacking)은 개개의 목적으로 이미 도입된 형질전환체의 유용 형질을 한 식물체로 모으고자 하는 유전자 집적(gene stacking) 연구에 주로 이용되는 방법이다. 이 경우에도 각각의 유전자가 다른 선발 마커를 가지고 도입되었을 경우 교배 후 선발이 용이하다.

다음으로 단일 카세트 내에 다중 단백질 발현 유전자 도입 하나의 T-DNA 운반체에 도입할 수 있는 유전자의 수가 제한적이라고 볼 때 단일 카세트 내에 다중 유전자를 발현시키려는 노력은 다중 유전자 발현이 불가피한 대사공학 연구, 스트레스나 병 등에 대한 복합내성 형질을 얻고자 할 때 매우 유용한 기술이다. 주로 목적으로 하는 도입 유전자 사이에 특수 인식 부위를 삽입하는 방법을 사용하는데 그 기능에 따라서 분류하면 다음과 같다.

① 유전자-유전자 단순 융합(fusion)

주로 유전자의 발현 특성(조직이나 세포 수준에서의 발현 부위 및 조건 등)을 알고자 하는 타겟팅(targeting) 연구시 GFP 등의 리포터 유전자를 해당 유전자 의 N- 또는 C-말단에 융합(fusion)시키는데 주로 이용된다. 별다른 특이 배열의 삽입 없이 유전자 사이에 번역 종결 코돈(stop codon)을 제거하고 인프레임(in frame)으로 연결되도록 하는 것이 기본이다.

② 프로테아제 인식 부위 및 프로테아제 삽입

독립적인 두 연구 그룹에 의해 식물 내막계(endomembrane system)를 거치면서 미지의 식물 자체 프로테인네이즈(host cell proteinase)에 의해 절단되는 프로테아제 인식 링커 배열(protease-susceptible linker sequence)이 보고되었고(Urwin 등, 1998; Francois 등 2002), 이 중 한 종류의 링커 펩타이드 배열을 두 개의 항 미생물 단백질 사이에 연결시켜 애기장대 식물에 도입했을 때 두 개의 항미생물 펩타이드가 각각 활성을 가지고 세포외 공간(extracellular space)으로 분비되는 것이 확인된바 있다(Francois 등 2002). 그러나 이 경우에는 아직까지 식물 자체 프로테인네이즈(host cell proteinase) 연구의 미비로 목적 유전자의 시기적(temporal), 장소적(spatial) 동시 발현을 예상하기 힘들다는 단점이 있고 이 문제를 극복할 수 있는 방법의 하나로 여러 종류의 식물 포티바이러스(potyvirus)에서 유래한 NIa 프로테아제 (NIa protease)의 경우, 특이적인 헵타펩타이드(heptapeptide) 배열에서 절단하는 48kDa의 프로테아제 코딩 서열(coding sequence)을 두 종류의 목적 유전자 사이에 삽입하면 이 유전자들을 동시에 발현시킬 수 있다(Marcos and Beachy, 1994).

③ 자가 절단(self-processing) 2A 배열 삽입

두 종류의 유전자를 융합 형태로 번역시킨 후 특정 부위(2A 배열의 C-말단)에서 비단백질가수분해(non-proteolytic) 기작(intra-ribosomal 'skip' mechanism during translation)으로 자가 절단되는 FMDV 유래 2A 배열이 보고된 이래(Donnelly 등, 1997; Ryan 등, 1991), 2A 배열 삽입에 의한 다중 단백질 발현 시도는 사람을 포함한 포유류, 곤충, 효모, 곰팡이 세포 등에서 꾸준히 계속되어 왔다. 특히, 암 등의 질병 치료를 목적으로 하는 유전자 치료(gene therapy) 분야에서 디씨101 하이브리도마 세포 배양 시스템(DC101 hybridoma cell culture system)에서 안정적인 항체 생산을 위해 항체의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain) 유전자 사이에 FMDV 유래의 2A를 삽입하여 성공적인 단일클론 항체(monoclonal antibody)의 생성을 보고하였다(Fang 등, 2005). 이때 특이적으로 2A 배열 바로 앞에 단백질 분해 효소의 일종인 퓨린(furin) 절단 인식 부위(furin cleavage site)를 삽입하는 등 2에이 퓨린 기술(2A-furin technology)이 종합적으로 사용되었다.

2A 기작의 식물 적용 연구는 두 종류의 리포터 효소 유전자인 CAT (chloramphenicol acetyl transferase)과 GUS(β-glucuronidase) 사이에 2A 배열을 삽입한 플라스미드를 제작하여 맥아 용해물(wheatgerm lysate)을 이용한 인 비트로 전사(in vitro translation) 실험과 담배 형질전환을 통해 CAT과 GUS 단백질 발현을 확인하였다(Halpin 등, 1999). 같은 그룹에 의해 2A에 의해 하나의 도입 유전자(single transgene)처럼 재조합된 두 개 혹은 세 개의 유전자들이 번역 후 2A 절단 과정을 거친 후 ER 또는 엽록체(chloroplast)로 각각 성공적으로 타겟팅(targeting)된다는 사실이 역시 인 비트로 전사(in vitro translation) 실험과 담배 형질전환을 통해 확인되었다(Halpin 등, 2004). 본 발명과 다소 관련이 높은 카로티노이드(carotenoid) 대사공학에서 시도된 2A 연구는 35S 프로모터를 사용하여 해양 박테리아(marine bacteria(Paracoccus species))에서 유래한 카로틴 산소첨가효소(carotene 4,4' oxygenase, CrtW)와 카로틴 수산화효소(carotene 3,3' hydroxylase, CrtZ) 유전자 사이에 FMDV 유래 2A배열을 삽입하여 제작된 플라스미드를 담배와 토마토에 형질전환시켜 담배에서만 소량의 아스탁산틴 등 케토카로티노이드의 생성을 확인한 보고가 있다(Rally 등, 2004).

④ 내재 라이보좀 진입 부위(internal ribosome entry site; 이하 'IRES' 이라 한다) 삽입

일반적인 진핵생물의 번역기작이 캡-의존성 라이보좀 스캐닝 모델(cap-dependent ribosome scanning model)에 따라 5′-비번역서열(untranslated sequence) 뒤에 오는 첫 번째 AUG 코돈(codon)을 번역 개시로 인식한다. 그러나 이 캡-의존성(cap-dependent) 기작이 손상되었을 때 대체 캡-비의존성(alternative cap-independent) 기작으로 바이러스, 곤충, 동물 등에서 IRES-의존성 번역(IRES-dependent translation) 기작이 발표되었다. 그 중 대표적인 것이 동물 바이러스인 EMCV(encephalomyocarditis virus) 유래 IRES로 90년대 초반 주로 동물 세포에서 연구된 이래, 식물 적용 연구는 두 종류의 리포터 효소 유전자인 GFP(green fluorescent protein)와 LUC(luciferase)사이에 EMCV-IRES와 비슷한 크기의 의미 없는 DNA 단편을 스페이서(spacer)로 각각 삽입한 두 종의 플라스미드를 제작하여 담배 형질전환을 통해 GFP 형광 관찰 및 GFP와 LUC 웨스턴 분석을 통해 유전자 다중 발현 효과를 검증하였다(Urwin 등, 2000). 그 후 식물 바이러스인 배추 토바모바이러스(crucifer-infecting Tobamovirus)의 외피 단백질(coat protein) 유전자의 상위 148bp(CrIRES)가 특이한 2차 구조를 가지고 IRES 기능이 있음이 검증된 이래(Ivanov 등, 1997), 같은 그룹에 의해 맥아 추출물(wheat germ extract)과 담배 원형질체(tobacco protoplast) 같은 식물 시스템에서는 EMCV-IRES보다 CrIRES의 바이시스트로닉 발현(bicistronic expression) 효율이 현저히 높음이 보고되었다(Dorokhov 등 2002).

본 발명은 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site; IRES) 배열을 이용하여 식물 대사공학에 유용한 유전자 다중발현 기술 확립 및 그 기술을 이용한 베타카로틴 생합성 다중 발현 재조합 유전자 및 그 형질전환 벼 식물체 개발을 목적으로 한다.

본 발명은 진핵세포에서 두 개 이상의 유전자가 단일 프로모터에 의해 동시에 발현시키는 방법을 통해, 두 개의 유전자가 동시에 발현했을 때만 베타카로틴 물질 생성이 가능하도록 의도하여 제작된 플라스미드를 식물 형질전환을 통해 벼에 도입함으로써 유전자 다중 발현 기능 확립을 통한 가치 있는 물질 생성 유전자 및 식물체 개발에 관한 내용이다. 특히 유전공학적 방법에 의해 유용 대사 물질을 생성하거나 더 유용한 물질로 변경코자 하는 식물 대사공학(plant metabolic engineering) 연구, 또는 비 식물유래 고부가 경구용 백신(edible vaccine) 및 의료용 단백질 등을 식물체에서 생산하는 식물 분자농업(plant molecular farming) 연구 등에는 가능한 한 여러 개의 유전자를 동일한 조건에서 동시에 발현시킬 수 있는 기술 적용이 불가피하나 현재까지 식물에서는 담배 등에서 리포터 유전자를 이용한 모델 연구 수준의 보고만 있을 뿐 본 발명 수준의 성공적인 대사공학 결과는 현재까지 전무한 상황이다. 따라서 본 발명은 IRES 기작에 의한 유전자 다중 발현 기술을 카로티노이드가 전혀 생성되지 않는 벼 종자에서 영양학적으로 의미가 있는 베타카로틴 물질 생성을 통해 실험적으로 입증한 결과로써 유전자 다중 발현 이 요구되는 어떤 유전공학적 시도에도 적용 가능한 기술을 제공하여 유전공학적으로 개량된 식물 형질전환체를 개발하는 기술적 과제를 해결하려는 시도이다.

본 발명은 서열번호 1로 구성되는 내재 라이보좀 진입 부위를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 5로 구성되는 내재 라이보좀 진입 부위 합성을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1을 포함하고 서열번호 18로 구성되는 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 제공한다.

본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 8의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pGEM-PIC을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 9의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pENTR-PIC를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 10 및 11의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P을 제공한다.

본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P로 형질전환된 아그로박테리움을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유 전자 PIC를 포함하는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC가 도입되어 베타카로틴을 합성하는 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명은 CrTMV(crucifer-infecting Tobamovirus) 유래 외피 단백질(coat protein) 유전자의 상위 150bp에 해당하는 내재 라이보좀 진입 부위 배열(IRES)을 서열번호 1로 합성하고, 이 합성 CrTMV-IRES 배열을 2종의 독립적인 카로티노이드 생합성 효소인 서열번호 8로 구성되는 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase, PSY)와 서열번호 11로 구성되는 박테리아 유래 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase, CrtI) 유전자 사이에 삽입함으로써 CrTMV-IRES 유전자 연결에 의해 2종의 카로티노이드 생합성 유전자가 마치 한 개의 유전자처럼 하나의 프로모터에 의해 발현할 때 베타카로틴이 합성되도록 서열번호 18로 구성되는 유전자 PIC(Psy:IRES:CrtI)을 재조합하였다. 이 재조합 유전자 PIC을 벼 형질전환을 통해 벼 배유에서 베타카로틴을 생성하는 기능을 확인함으로써 CrTMV-IRES 배열의 유전자 다중 발현 유도 기능을 확인함과 동시에 베타카로틴 생합성 유도 다중 발현 재조합 유전자(PIC) 및 벼 배유에서 베타카로틴을 생성하는 형질전환 벼(PIC rice) 개발에 관한 것이다.

본 발명은 베타카로틴 생성 확인에 의해 식물 대사공학에 필요한 유전자 다 중 발현 기술 확립이 검증된 내용으로, 카로티노이드가 생성되는 않는 벼 배유가 카로티노이드 대사공학의 성공여부를 특정 성분 생성을 육안으로 확인할 수 있는 훌륭한 모델 시스템이라는데 착안하여, 하나의 프로모터에 의해서는 하나의 유전자만이 발현되는 모노-시스트로닉(mono-cistronic) mRNA 생성 기작을 가진 진핵생물인 식물에서 하나의 프로모터에 의해 다중의 유전자 클러스터(gene cluster)가 발현되는 원핵생물의 폴리-시스트로닉(polycistronic) mRNA 생성 기작 같은 다중 유전자 발현을 유도한 내용을 포함한다. CrTMV(crucifer-infecting Tobamovirus) 유래 IRES 유전자 배열을 합성한 후, 고추 유래 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase, PSY)와 박테리아 유래 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase, CrtI) 유전자 사이에 삽입하여 재조합된 PIC 유전자를 도정에 의해 손실되는 부분을 최소화하도록 벼 배유의 중심에서 강하게 발현되는 글로불린 프로모터에 연결하여 발현될 때 최종적으로 영양학적으로 의미가 있는 베타카로틴(프로비타민 A)이 축적되는 형질전환 쌀을 개발한 결과이다. 따라서 본 발명은 식물체내 다수의 유전자를 도입·발현시킴으로써 그 식물에 새로운 형질을 부여하고 그 기능과 가치를 향상시키고자 하는 식물 대사공학 등의 연구에 다중 유전자 발현을 가능케 하는 기술 제공의 효과가 있다.

본 발명은 하기의 실시 예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기의 실시 예들에서 특별히 언급되지 아니한 분자생 물학적 실험기법들은 샘브룩(Sambrook) 등의 분자 클로닝: 실험실 메뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989))을 참조하였다.

[실시예 1] CrTMV(crucifer-infecting Tobamovirus) 유래 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site) 유전자 합성

진핵생물의 일반적인 번역 기작인 캡(cap)구조 의존성 기작이 손상되었을 때 대체 기작으로 바이러스, 곤충, 동물 등에 존재하는 내재 라이보좀 진입 부위 배열 중 식물 바이러스의 일종인 CrTMV(crucifer-infecting Tobamovirus) 유래 외피 단백질(coat protein) 유전자의 상위 150bp에 해당하는 CrTMV-IRES 배열(서열번호 1) 유전자를 합성하기 위하여 우선 각각 53, 53, 54 및 56 mer로 구성되며 각각 연결 배열에서 21, 20, 25 mer씩 중첩되도록 설계된 다음의 네 개의 프라이머를 합성하였다(도 3 참조):

1F(5'-ACGAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGA-3': 서열번호 2),

2R(5'-ACTACACCCTTTTCTTCAACCTTCTTTTTCCTTCTTTTAAAGTTGTCAACCGC-3': 서열번호 3),

3F(5'-GTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCC-3': 서열번호 4), 및

4R(5'-TTTCTTCTTTCAAATTAAACGAATCAGGACCGGCGTACTTCTCCGGTCTGTACTTA-3': 서열 번호 5)

합성된 프라이머를 각각 40 pmole/㎕로 희석한 후 1F와 4R 프라이머 각 1㎕ 씩과 2R과 3F 프라이머 각 2㎕를 기질 겸 프라이머로 포함하는 반응액을 준비하여 95℃에서 10초, 58℃에서 10초, 72℃에서 10초씩 35 주기(cycles) 동안 증폭시켜서 얻은 150 bp에 해당하는 PCR 산물을 pGEM-T easy(Promega 제품) 벡터에 DNA연결효소(ligase) 반응으로 클로닝 하여 염기서열 결정 후 최종적인 pCrTMV-IRES 벡터를 다음 실험의 재료로 사용하였다. 그 개열지도를 도 4에 도시하였다.

[실시예 2] 고추 PSY 및 미생물 CrtI 유전자 분리

한국산 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. NocKwang)에서 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase, 이하 "PSY"이라 한다) 유전자의 클로닝을 위해 유인제(elicitor)를 처리한 고추 식물체의 뿌리로부터 전체 RNA를 분리하여 mRNA를 합성한 후, 고추 PSY 유전자 특이 프라이머 세트, 즉 5'-ATGTCTGTTGCCTTGTTATGGGTT-3' 염기서열의 Psy-Fw 프라이머(서열번호 6)와 5'-TCATGTTCTTGTAGAAGGCACAAG-3' 염기서열의 Psy-Rv 프라이머(서열번호 7)를 사용하여 역전사 효소 유전자 증폭 반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, 이하 "RT-PCR"이라 한다) 반응으로 증폭하여 고추 PSY 유전자(서열번호 8)를 분리하였다.

박테리아(Erwinia uredovora, 20D3) 유래 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase, 이하 "CrtI"이라 한다) 유전자의 클로닝을 위해 한국농업미생물보존센 터(KACC)로부터 ATCC 19321 균주를 분양받아 게놈 DNA를 분리한 후, 박테리아 CrtI 유전자 특이 프라이머 세트, 즉 5'-ATGAAACCAACTACGGTAATTGGT-3' 염기서열의 CrtI-Fw 프라이머(서열번호 9)와 5'-TCAAATCAGATCCTCCAGCATCAA-3' 염기서열의 CrtI-Rv 프라이머(서열번호 10)를 사용하여 유전자 증폭 반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 한다)으로 증폭하여 박테리아 CrtI 유전자(서열번호 11)를 분리하였다.

PCR반응 산물들은 각각 pCR2.1(Invitrogen 제품)과 pGEM-T easy(Promega 제품) 벡터에 DNA연결효소(ligase) 반응으로 클로닝 하여 염기서열 결정 후 최종적인 pCR2.1-Psy와 pGEM-CrtI 벡터가 다음 실험의 재료로 사용하였다.

[실시예 3] 베타카로틴 생성용 다중발현 유전자 PIC 재조합

베타카로틴을 유도하는 PSY와 CrtI 유전자의 다중발현 유전자(PIC)의 재조합을 위해 우선적으로 박테리아 유래 CrtI 유전자에 부가적으로 베타카로틴 생합성 장소(엽록체 및 전분체를 포함하는 플라스티드 등)로 CrtI 효소 단백질을 이동시키는데 필요한 이동 신호인 트랜지트 펩타이드(transit peptide, 이하 "Tp"이라 한다) 연결이 필요하다. 그러므로 벼 알비씨에스(ribulose biphophate carboxylase/oxygenase small subunit, 이하 "rbcS"이라 한다) 유전자의 Tp 150bp 부위(rbcS-Tp)를 CrtI 유전자의 5' 상위에 연결시키기 위해 벼 rbcS 유전자를 보유한 플라스미드 pSK-RTG 벡터를 주형으로 Tp 배열 양쪽 말단에 특정 제한효소인 PstI와 NcoI 인식부위가 부가된 5'-ccgctgcagATGGCCCCCTCCGTGAT-3' 염기서열의 5P- Tp 프라이머(서열번호 12)와 5'-ccgccatggCCTGCATGCACCTGAT-3' 염기서열의 3Nc-Tp 프라이머(서열번호 13)의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 실시한 후 증폭된 160bp 크기의 DNA 단편을 제한효소 PstI와 NcoI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-T easy 벡터에 연결하여 pGEM-Tp를 제작하였다. 그 개열지도를 도 5에 도시하였다.

Tp 배열 하위에 CrtI 유전자 연결을 위해 CrtI 유전자 양 말단에 특정 제한효소인 NcoI과 ApaI 인식부위를 부가하기 위하여 pGEM-CrtI 벡터를 주형으로 프라이머 세트, 즉 5'-ccgccATGGAACCAACTACGGTAATT-3' 염기서열의 5Nc-CrtI 프라이머(서열번호 14)와 5'-ccggggcccTCAAATCAGATCCTCCA-3' 염기서열의 3Ap-CrtI 프라이머(서열번호 15)를 이용한 PCR을 실시한 후 증폭된 1.5kb DNA 단편을 제한효소 NcoI과 ApaI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-Tp의 Tp 배열 3' 하위에 클로닝하여 pGEM-Tp-CrtI를 제작하였다. 그 개열지도를 도 6에 도시하였다.

다음으로, CrTMV-IRES 유전자 말단에 특정 제한효소인 SacI과 SacI 및 BamHI 인식부위를 부가하기 위하여 pCrTMV-IRES 벡터를 주형으로 프라이머 세트, 즉 5'-ccggagctcACGAATTCGTCGATTCG-3' 염기서열의 5SacIRES 프라이머(서열번호 16)와 5'-ccggagctcggatccTTTCTTCTTTCAAATTAAACG- 3' 염기서열의 3SacBamIRES 프라이머(서열번호 17)를 이용한 PCR을 실시한 후 증폭된 DNA 단편을 제한효소 SacI으로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-Tp-CrtI에 클로닝하여 pGEM-IRES-TpCrtI를 제작하였다. 그 개열지도를 도 7에 도시하였다.

CrTMV-IRES 유전자 상위에 Psy 유전자를 클로닝하기 위하여, pCR2.1-Psy를 제한효소 EcoRI으로 절단하여 1,257bp에 해당하는 Psy 유전자를 분리한 후 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-IRES-TpCrtI에 DNA연결효소(ligase) 반응으로 클로닝 하여 염기서열 결정 후 최종적인 pGEM- P sy- I RES-Tp C rtI, 즉 pGEM-PIC을 제작하였다. 그 개열지도를 도 8에 도시하였다. 이때 최종 연결된 PIC 유전자의 전체 염기서열은 3,077bp(서열번호 18) 이였다.

[실시예 4] 벼 형질전환용 플라스미드 제작

벼 배유 특이적 발현을 유도하는 벼 형질전환용 플라스미드 제작을 위해 우선, pGEM-PIC을 주형으로 양 말단에 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리아 측 특이적 재조합 핵산서열 부위(attB1과 attB2)의 일부(각 12bp 씩)를 포함하면서 PIC 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머 세트, 즉 5'-aaaaagcaggctATGTCTGTTGCCTTGTT-3' 염기서열의 PIC-B1 프라이머(서열번호 19)와 5'-agaaagctgggtgTCAAATCAGATCCTCCA-3' 염기서열의 PIC-B2 프라이머(서열번호 20)를 제작하고, 이를 사용한 유전자 증폭 PCR 반응을 수행하여 3,101bp의 PIC 유전자 부위를 분리하였다.

상기 프라이머 세트(PIC-B1과 PIC-B2)로 증폭된 PIC 유전자의 PCR 산물들은 각각 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리아 측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체(각 29bp 씩)를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 21의 attB1 프라이머(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') 및 서열번호 22의 attB2 프라이머(5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3')를 사용하여 재 PCR 되었다.

재 PCR된 산물로부터 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위(attP1과 attP2)를 포함하는 pDONR221(Invitrogen 제품) 벡터와 BP 재조합 반응을 거쳐 pENTR-PIC 벡터를 제작하였다. 그 개열지도를 도 9에 도시하였다.

상기 pENTR-PIC 벡터 내의 PIC 유전자를 최종 벼 형질전환 운반체로 이동시키기 위해 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있는 수퍼-바이너리(super-binary) 플라스미드 pSB11 벡터를 백본(backborn)으로 벼 배유 특이발현 글로블린(globulin, Glb) 프로모터와 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터가 내재되어 있는 일종의 게이트웨이 운반체인 pMJ-103 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종 벼 형질전환용 발현벡터 pGlb-PIC(도 10 및 11 참조)을 제작하였다. 이때 pMJ-103 벡터는 식물체 선발인자로 35S 프로모터와 연결된 제초제 저항성 Bar유전자를 포함한다. 또한 pGlb-PIC 벡터를 2007년 12월 6일에 한국농업미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC 95070P의 특허미생물 수탁증을 2008년 1월 2일에 받았다.

상기 pGlb-PIC 벡터는 벼 형질전환을 위한 아그로박테리움에 도입하기 위하여 통상적인 트리 페어렌탈 메이팅(tri-parental mating) 방법을 이용하였다. 우선, vir 유전자를 포함하는 수퍼-바이너리(super-binary) 플라스미드 pSB1이 기내재되어 있는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404 균주를 테트라사이크린(tetracyclin, 10mg/L)이 함유된 고체 AB배지(AB-t)에서 2～3 일 동안 배양(28℃)하고, 2일 후 컨주걸 헬퍼 플라스미드(conjugal helper palsmid) pRK2013을 포함하는 대장균 HB101 균주와 pGlb-PIC을 포함하는 대장균 DH-5α 균주를 각각 카나마이신(kanamycin, 50mg/L)과 스펙티노마이신(50mg/L)이 함유된 고체 LB배지에서 하룻밤 배양(37℃)하여 총 3종의 미생물 콜로니(colony)를 준비한다. 상기 3종의 콜로니를 영양 한천 플레이트(Nutrient Agar plate; Difco 제품)에서 미생물 접종용 루프를 이용하여 섞어 하룻밤 배양(28℃)한 후 혼합배양된 미생물을 스펙티노마이신(50mg/L)과 테트라사이크린(10mg/L)이 포함된 고체 AB배지(AB-st)에 액체배지(또는 물)로 10배 희석하여 단일 세포 분리(single cell isolation)를 위한 스트리크(streak) 접종하여 3일 동안 배양(28℃)한다. AB-st에서 생성된 단일 콜로니(single colony)를 한 번 더 고체 AB-st에 스트리크(streak)하여 3일 동안 배양(28℃)하여 재생성된 단일 콜로니(single colony)를 최종 선발한다. 선발된 아그로박테리움을 스펙티노마이신(50mg/L)과 테트라사이크린(10mg/L)이 포함된 액체 YEP배지(YEP-st)에 접종하여 2일 동안 진탕배양(28℃)한 후 플라스미드를 분리하고 제한효소 패턴을 분석함으로써 pGlb-PIC유전자의 아그로박테리움 내로의 형질전환을 재확인한 후 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404 pGlb-PIC을 벼 형질전환에 사용하였다.

[실시예 5] 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환

벼 형질전환을 위하여 완숙종자를 이용하였다. 먼저 벼 종자의 종피를 제거하여 70% 에탄올에 1분간 침지한 후 멸균수로 2～3회 세척하고 2% 하이포아염소산 나트륨(sodium hypochloride; 시판 '락스') 용액에 20분간 교반하면서 종자 표면을 살균하였다. 이 후 종자를 멸균수로 4~5회 세척하고 멸균 필터지(filter paper)로 건조시켜 캘러스 유도배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린(proline), 500mg/L 글루타민(glutamine), 3% 수크로오즈(sucrose), 2mg/L 2,4-D, 0.25% 파이타젤(phytagel, pH5.8)에 종자를 치상하였다. 치상한 종자를 28℃ 암조건에서 4～5주 배양시키고 생성된 캘러스에서 식물체로 재분화할 수 있는 캘러스(부정배 캘러스, embryogenic callus) 만을 선별하여 형질전환 캘러스로 사용하였다. pGlb-PIC으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404를 30시간 배양 후 균액의 농도를 AAM 배지(100 mM 아세토시리곤(acetosyringone) 포함)로 OD600=1.0～1.2로 희석하여 상기 부정배 캘러스와 15분간 방치하였다. 캘러스를 멸균된 필터지(filter paper)로 건조시킨 후 공동배양배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린(proline), 500mg/L 글루타민(glutamine), 3% 수크로오즈(sucrose), 2mg/L 2,4-D, 100 mM 아세토실린곤(acetosyringone), 0.25% 파이타젤(phytagel)에서 24℃ 암조건, 2～3일간 공동배양(co-culture)하였다.

표면에 잔류하는 아그로박테리움을 제거하기 위하여, 공동배양한 캘러스를 세포탁심(cefotaxime) 250 mg/L가 첨가된 AAM 배지로 세척한 후 멸균된 여지에 올려 표면의 수분을 제거한 뒤 선별배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린(proline), 500mg/L 글루타민(glutamine), 3% 수크로오즈(sucrose), 2mg/L 2,4-D, 0.25% ㅍ파파이타젤(phytagel), 6mg/L 포스피노트리신(phosphinothricin), 250mg/L 세포탁심(cefotaxime, pH 5.8)에 옮겨서 형질전환된 캘러스만을 유도되도록 하였다. 2주 마다 새로운 선별 배지로 계대배양하고 5주 경과 후 선발된 캘러스를 식물체 재분화 배지(MS 기본배지, 3% 수크로오즈(sucrose), 0.5mg/L NAA, 2mg/L 키네틴(kinetin), 250mg/L 세포탁심(cefotaxime), 0.3% 파이타젤(phytagel, pH5.8), 3mg/L 포스피노트리신(phosphinothricin))에서 배양·식물체 유도 후에 MS 기본배지에서 기내 순화하였다.

각 단계에서 사용된 배지의 조건을 정리하면 표1과 같다.

(표 1)

품종	캘러스유도		전배양	Agrobacterium 공동배양	캘러스선별	식물체유도	기내순화
종자	N6 기본배지 2,4-D 2mg/L		N6 기본배지 2,4-D 2mg/L	N6기본배지 2,4-D 2mg/L acetosyringone 100mM	N6기본배지 2,4-D 2mg/L PPT 6mg/L	MS기본배지 NAA 0.5mg/L kinetin 2mg/L PPT 3mg/L	MS 기본배지
배양기간	4~5주		2~3일	2~3일	5주	2~4주	1~2주
항생제 조건	없음				cefotaxime 250mg/L	cefotaxime 250mg/L	cefotaxime 250mg/L

일정 크기로 성장한 개체들은 배양 병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 논토양으로 채워진 플라스틱 통에 이식하여 온실에서 생육하였다.

[실시예 6] 형질전환 벼 식물체로부터 수확된 쌀 색깔의 육안 관찰

상기 벼 형질전환을 통하여 확보된 pGlb-PIC 도입 벼 재분화 식물체 7 개체(PIC3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)는 형질전환 진행상 재분화 시기가 상이한 관계로 PIC4, 5, 6, 7, 8 라인은 T2 종자에서, PIC3, 9 라인은 T1 종자 세대에서 베타카로틴 생성에 의한 종자 색깔의 황색 정도를 비교하였다. 이때 성숙 건조 종자로 수확 된 종자는 현미기(TR-200 Electromotion rice husker, Kett 제품)를 이용해 종피를 제거한 후 백미기(Pearlest polisher, Kett 제품)를 이용해 호분층이 제거(1분 동안)된 백미끼리 비교하였다. 그 결과, 육안 관찰시 PIC8 라인의 황색 정도가 가장 강하고, PIC4, 5, 6, 7은 비슷한 정도로 PIC8 보단 상대적으로 약하고, T1 세대 종자인 PIC3, 9의 황색 정도는 T2 세대 종자에 비해 상대적으로 훨씬 약했다(도 12 참조).

[실시예 7] 형질전환 식물체의 게놈 DNA 분리, PCR 분석 및 써던 블랏 분석

형질전환 벼 식물체 라인 PIC 4, 5, 6, 7, 8의 잎 조직을 채취한 후 게놈 DNA 정제 키트(Genomic DNA Purification Kit; I.J.BIO DNA System)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 정제하고 DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280을 측정하여 정량하였다. 형질전환체 내에 유전자의 삽입을 확인하기 위해 분리한 게놈 DNA 100ng을 주형으로 CrTMV-IRES를 포함하는 프라이머 세트, 즉 5'-GAGATCGAAGCCAATGAC-3' 염기서열의 Psy 유전자의 C-말단 부위에서 제작된 Psy-CT-Fw 프라이머(서열번호 23)와 5'-GAAGCCTGCACCAATTAC-3' 염기서열의 CrtI 유전자의 N-말단 부위에서 제작된 CrtI-NT-Rv 프라이머(서열번호 24)를 각각 10pmol 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 위한 반응액은 10x 타크 중합효소 버퍼(Taq polymerase buffer), 250μM MgCl2, 100μM dNTP, 1 unit 타크 중합효소(Taq polymerase)를 총 20㎕가 되도록 혼합하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분 동안 반응시키고, 다음으로 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안 총 30 사 이클로 증폭시킨 후, 72℃에서 5분 동안 연장 단계로 수행하였다. 그 결과 예상대로 460bp 위치에서 유전자가 증폭되었다(도 13 참조).

상기 게놈 DNA을 각 라인 당 5 ㎍씩 BamHI과 XbaI의 두가지 제한효소로 각각 절단하여 아가로즈젤에 전기영동 한 후, 32P로 표지된 207bp의 Psy 유전자 프로브와 420bp 크기의 CrtI 유전자를 각각 프로브로 이용하여 유전자 삽입여부를 확인한 결과 PIC8을 제외한 PIC 4, 5, 6, 7에서 예상한 1.4kb와 4.1kb 크기의 삽입 유전자를 확인하였다. 그러나 PIC8의 경우, XbaI으로 절단된 DNA를 CrtI 프로브로 서던 블랏(southern blot)했을 때 최소 세 개의 시그널 밴드가 검출된바, CrtI 유전자 부근에서 유전자의 재배열(rearrangement)이 일어난 것으로 해석될 수 있다. 또한 유전자 삽입 카피 수(copy number)를 확인하기 위해 동일한 게놈 DNA을 각 라인당 5 ㎍씩 EcoRI 제한효소로 절단하여 아가로즈 젤에 전기영동 한 후, 32P로 표지된 1.3kb 크기의 Mar 유전자를 프로브를 이용하여 서던 블랏 분석을 수행하였다. 그 결과, PIC 5, 6, 7의 경우 Mar 유전자 프로브 시 원 카피 유전자 삽입 시 예상되는 패턴과 정확히 일치하는 두 개의 Mar 시그널 밴드(left board에 위치하는 1.3kb Mar 시그널 밴드와 right board에 위치하는 Mar를 포함하여 삽입 위치에 따라 미지의 벼 게놈 DNA의 EcoRI 부위에서 절단되어 다른 크기로 생성된 Mar 시그널 밴드)가 확인되었고, PIC4의 경우 투 카피 삽입이 예상되는 시그널 패턴을 보였다. PIC8의 경우, 최소한 3～4 개 이상의 유전자 삽입이 예상되는 패턴이 결과 되었다(도 14 참조).

[실시예 8] 형질전환 식물체의 RT-PCR 반응

형질전환 벼에서 수확된 쌀로부터 전체 RNA를 분리하여 삽입 PIC 유전자의 유전자 다중 발현 부위별 발현 특성을 조사하였다. 전체 RNA의 분리과정을 상세히 설명하면, 각 라인별 쌀 시료 1그램을 약 2시간 정도 물에 불린 후 액체 질소가 담긴 막자사발에서 충분히 마쇄한 다음, 5ml의 RNA 추출 완충액 [200mM Tris-HCl(pH 9.0), 400mM LiCl, 25mM EDTA(pH 8.2), 1% SDS]과 5ml 페놀을 첨가하여 충분히 혼합하였다. 상기 혼합액을 15ml 튜브에 옮긴 다음 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름 1ml과 페놀 1ml를 첨가하여 vortex 기기로 잘 섞어준 후 다시 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 다시 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고 2ml의 클로로포름을 첨가하여 vortex 기기로 충분히 혼합하고 분리하는 작업을 2회 반복한다. 상등액을 새 튜브에 옮기도 2.5배 부피의 에탄놀과 10분 1 부피의 3M 아세트산나트륨(sodium acetate; pH 5.2)을 첨가해 -20℃에 1시간 보관하였다. 다음, 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 RNA와 DNA 침전물을 2M 리튬클로라이드(LiCl)용액을 첨가하여 용해한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하여 RNA만 침전시켰다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 얻은 RNA 침전물을 80% 에탄올로 한차례 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 80-100㎕의 DEPC 용액에 녹였다. RNA 추출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하여 mRNA selective RT-PCR에 이용하였다.

추출한 전체 RNA 1㎍을 주형으로 이용하고 타카라 mRNA 선택적 RT-PCR 키 트(TAKARA mRNA selective RT-PCR kit) [1xRT buffer, 5mM MgCl2, 1mM dNTP, 50μM Oligo dT primer, RNase inhibitor(0.8units/㎕), AMV RTase XL (0.1units/㎕)]를 사용하여 30℃에서 10분, 42℃에서 30분 반응시키고, 4℃에서 냉각시켜 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 PSY 유전자 특이 증폭 프라이머 세트(서열번호 6과 7), Tp-CrtI 유전자 특이 증폭 프라이머 세트(서열번호 25과 26), PIC유전자의 CrTMV-IRES 연결 부위에서 460bp의 SL(small-length)를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트(서열번호 23과 24), PIC유전자를 FL(full-length)로 증폭하는 프라이머 세트(서열번호 27과 28)]와 주형으로 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일함을 증명하기 위한 벼 글루테린 특이 프라이머 세트(서열번호 29와 30)를 사용하여 각각의 PCR을 수행하였다.

역전사 PCR 반응의 결과, 비형질전환 낙동벼(종자)에서는 Psy, CrtI, PIC_SL, PIC_FL의 전사체 모두가 전혀 검출되지 않은데 비하여, PIC 형질전환 벼(종자)에서는 Psy, CrtI, PIC_SL, PIC_FL의 전사체가 모두 뚜렷이 예상 크기에서 검출되었다. 대조구로 증폭된 글루테린 유전자의 발현량을 기준으로 라인별로 비교해 본 결과, PIC 형질전환체 중 4가지 상이한 부위에서 증폭된 유전자의 발현도는 모든 유전자의 발현이 3～4배 정도 높은 PIC8을 제외하고는 모두 비슷하였다(도 15 참조).

[실시예 9] 형질전환 식물체 종자의 HPLC 물질 분석

형질전환 쌀 시료를 식품 성분 분석의 공인기관인 한국식품연구원에 베타카 로틴 분석[식품공전(2006) 미량영양성분분석시험법]을 의뢰한 결과, 예상대로 일반 쌀에서는 베타카로틴이 전혀 검출되지 않은 반면, PIC4, 5, 6, 7에서 183㎍/100g, 171㎍/100g, 195㎍/100g, 206㎍/100g로 비슷한 수준의 베타카로틴이 검출되어 베타카로틴 생성용 유전자 다중발현 재조합 유전자 PIC의 도입에 의해 형질전환 쌀 100g당 0.2㎎ 정도의 베타카로틴이 생성됨을 확인하였다.

도 1은 식물에서 베타카로틴을 포함한 카로티노이드 대사과정을 나타낸 것이다.

도면 기호에 대한 설명

GGPS: geranylgeranyl pyrophosphate synthase;

PSY: phytoene synthase;

ZDS: ζ-carotene desaturase;

PDS: phytoene desaturase;

β-LCY: lycopene-β-cyclase;

ε-LCY: lycopene-ε-cyclase;

β-CH: β-carotene hydroxylase;

ε-CH: ε-carotene hydroxylase;

ZE: zeaxanthin epoxydase;

VDE: violaxanthin de-epoxidase;

NXS: neoxanthin synthase;

CCS, capsanthin-capsorubin synthase

도 2는 독립적인 2종의 유전자가 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site) 배열 삽입에 의해 하나의 프로모터에 의해 동시 발현되는 모식도이다.

도 3은 CrTMV-IRES 배열 유전자를 합성하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.

도 4는 pCrTMV-IRES 벡터의 개열지도이다.

도 5는 pGEM-Tp 벡터의 개열지도이다.

도 6은 pGEM-Tp-Crtl 벡터의 개열지도이다.

도 7은 pGEM-IRES-TpCrtl 벡터의 개열지도이다.

도 8은 pGEM-PIC 벡터의 개열지도이다.

도 9는 pENTR-PIC 벡터의 개열지도이다.

도 10은 pGlb-PIC 벡터의 간단한 개열지도이다.

도 11은 베타카로틴 생성용 다중 발현 재조합 유전자 PIC을 포함하는 벼 배유 특이 발현 벼 형질전환용 최종 벡터 pGlb-PIC의 상세 개열지도(유전자 모식도)이다.

도면 기호 및 번호에 대한 설명

LB: left board; RB: right board;

Glb: 벼 배유 특이 발현 유도 글로블린 프로모터;

Psy: 한국산 고추 녹광 유래 phytoene synthase;

IRES: 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site) 배열;

Tp: 엽록체 적중 transit peptide;

CrtI: 박테리아 유래 carotene desaturase;

PinII: 감자 protease inhibitor II 터미네이터;

P35S: CaMV 35S promotor;

Bar: phosphinothricin acetyltransferase;

NOS: nopaline synthase 터미네이터;

MAR: matrix attachment region

도 12는 베타카로틴 생성용 다중 발현 재조합 유전자 발현벡터 pGlb-PIC을 형질전환시킨 벼의 배유에서 베타카로틴 생성에 의해 노란색 형질을 보이는 형질전환체들의 T1 및 T2 세대 성숙 종자 사진이다.

도 13은 벼 형질전환체들의 염색체 DNA을 이용하여 PCR로 유전자 삽입을 확인한 전기영동 사진이다.

* 도면 기호 및 번호에 대한 설명

M: lkb ladder DNA 크기 측정 마커;

PC: 플라스미드 pGlb-PIC DNA;

NC: 비형질전환 벼 낙동 품종;

4, 5, 6, 7, 8 등 pGlb-PIC 형질전환 벼 식물체 T1 세대 라인

도 14는 벼 형질전환체들의 염색체 DNA을 이용하여 게놈 서던 블랏(genomic southern blot) 분석을 통해 유전자 삽입 및 삽입 카피수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

* 도면 기호 및 번호에 대한 설명

M: lkb ladder DNA 크기 측정 마커;

PC: 플라스미드 pGlb-PIC DNA;

NC: 비형질전환 벼 낙동 품종;

4-2, 5-1, 6-1, 7-1, 8-2, 8-3 등 pGlb-PIC 형질전환 벼 식물체 T2 세대 라 인

도 15는 베타카로틴 생성용 다중 발현 재조합 유전자 발현벡터 pGlb-PIC으로 형질전환된 벼 종자에서 추출된 전체 RNA를 이용하여 역전사 효소 반응 후 PCR로 유전자별 전사체 발현 양상을 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.

* 도면 기호 및 번호에 대한 설명

M: lkb ladder DNA 크기 측정 마커;

NC: 비형질전환 벼 낙동 품종의 성숙 종자;

4, 5, 6, 7, 8 등 pGlb-PIC 형질전환 벼 식물체 라인별 성숙 종자

도 16은 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site) 배열을 포함하는 베타카로틴 생합성 유도 다중 발현 재조합 유전자, 이를 포함하는 발현 벡터 및 그 형질전환 벼 배유에서 베타카로틴 생성에 의해 노란색 형질을 보이는 형질전환체의 종자 사진이다.

* 도면 기호 및 번호에 대한 설명

Glb: 벼 배유 특이 발현 유도 글로블린 프로모터;

Tp: 엽록체 적중 transit peptide;

Psy: 한국산 고추 녹광 유래 phytoene synthase;

IRES: 내재 라이보좀 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site) 배열;

CrtI: 박테리아 유래 carotene desaturase;

PinII, 감자 protease inhibitor II 터미네이터

<110> Korea <120> Recombinant PIC gene including internal ribosome entry site sequence of crucifer-infecting Tobamovirus for beta-carotene biosysthesis, expression vector comprising thereof and a transformant cell <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 150 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 1 acgaattcgt cgattcggtt gcagcattta aagcggttga caactttaaa agaaggaaaa 60 agaaggttga agaaaagggt gtagtaagta agtataagta cagaccggag aagtacgccg 120 gtcctgattc gtttaatttg aaagaagaaa 150 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 2 acgaattcgt cgattcggtt gcagcattta aagcggttga caactttaaa aga 53 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 3 actacaccct tttcttcaac cttctttttc cttcttttaa agttgtcaac cgc 53 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 4 gttgaagaaa agggtgtagt aagtaagtat aagtacagac cggagaagta cgcc 54 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 5 tttcttcttt caaattaaac gaatcaggac cggcgtactt ctccggtctg tactta 56 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 6 atgtctgttg ccttgttatg ggtt 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 7 tcatgttctt gtagaaggca caag 24 <210> 8 <211> 1260 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 8 atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaacgg gacaggattc 60 ttggtatccg ttcgtgaggg aaaccggatt tttgattcgt cggggcgtag gaatttggcg 120 tgcaatgaga gaatcaagag aggaggtgga aaacaaaggt ggagttttgg ttcttacttg 180 ggaggagcac aaactggaag tggacggaaa ttttctgtac gttctgctat cgtggctact 240 ccggctggag aaatgacgat gtcatcagaa cggatggtat atgatgtggt tttgaggcag 300 gcagccttgg tgaagagaca gctgagatcg accgatgagt tagatgtgaa gaaggatata 360 cctattccgg ggactttggg cttgttgagt gaagcatatg ataggtgtag tgaagtatgt 420 gcagagtacg caaagacgtt ttacttagga acgatgctaa tgactccgga gagaagaaag 480 gctatctggg caatatacgt atggtgcagg agaacagacg aacttgttga tggtccgaat 540 gcatcacaca ttactccggc ggccttagat aggtgggaag acaggctaga agatgttttc 600 agtggacggc catttgacat gctcgatgct gctttgtccg acacagtttc caaatttcca 660 gttgatattc agccattcag agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gaggaagtca 720 agatacagaa actttgacga actataccta tattgttatt acgttgctgg tacggttggg 780 ttgatgagtg ttccaattat gggcatcgca cctgaatcaa aggcaacaac ggagagcgta 840 tataatgctg ctttggcttt ggggatcgca aatcagctga ccaacatact tagagatgtt 900 ggagaagatg ccagaagagg aagagtctat ttgcctcaag atgaattagc acaggcaggt 960 ctatccgacg aagacatatt tgctggaaga gtgaccgata aatggagaat cttcatgaag 1020 aaacaaattc agagggcaag aaagttcttt gacgaggcag agaaaggagt gaccgaattg 1080 agcgcagcta gtagatggcc tgtgttggca tctctgctgt tgtaccgcag gatactggac 1140 gagatcgaag ccaatgacta caacaacttc acaaagagag cttatgtgag caaaccaaag 1200 aagttgattg cattacctat tgcatatgca aaatctcttg tgccttctac aagaacatga 1260 1260 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 9 atgaaaccaa ctacggtaat tggt 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 10 tcaaatcaga tcctccagca tcaa 24 <210> 11 <211> 1479 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 11 atggaaccaa ctacggtaat tggtgcaggc ttcggtggcc tggcactggc aattcgtcta 60 caagctgcgg ggatccccgt cttactgctt gaacaacgtg ataaacccgg cggtcgggct 120 tatgtctacg aggatcaggg gtttaccttt gatgcaggcc cgacggttat caccgatccc 180 agtgccattg aagaactgtt tgcactggca ggaaaacagt taaaagagta tgtcgaactg 240 ctgccggtta cgccgtttta ccgcctgtgt tgggagtcag ggaaggtctt taattacgat 300 aacgatcaaa cccggctcga agcgcagatt cagcagttta atccccgcga tgtcgaaggt 360 tatcgtcagt ttctggacta ttcacgcgcg gtgtttaaag aaggctatct aaagctcggt 420 actgtccctt ttttatcgtt cagagacatg cttcgcgccg cacctcaact ggcgaaactg 480 caggcatgga gaagcgttta cagtaaggtt gccagttaca tcgaagatga acatctgcgc 540 caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc ccttcgccac ctcatccatt 600 tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct ggtttccgcg tggcggcacc 660 ggcgcattag ttcaggggat gataaagctg tttcaggatc tgggtggcga agtcgtgtta 720 aacgccagag tcagccatat ggaaacgaca ggaaacaaga ttgaagccgt gcatttagag 780 gacggtcgca ggttcctgac gcaagccgtc gcgtcaaatg cagatgtggt tcatacctat 840 cgcgacctgt taagccagca ccctgccgcg gttaagcagt ccaacaaact gcagactaag 900 cgcatgagta actctctgtt tgtgctctat tttggtttga atcaccatca tgatcagctc 960 gcgcatcaca cggtttgttt cggcccgcgt taccgcgagc tgattgacga aatttttaat 1020 catgatggcc tcgcagagga cttctcactt tatctgcacg cgccctgtgt cacggattcg 1080 tcactggcgc ctgaaggttg cggcagttac tatgtgttgg cgccggtgcc gcatttaggc 1140 accgcgaacc tcgactggac ggttgagggg ccaaaactac gcgaccgtat ttttgcgtac 1200 cttgagcagc attacatgcc tggcttacgg agtcagctgg tcacgcaccg gatgtttacg 1260 ccgtttgatt ttcgcgacca gcttaatgcc tatcatggct cagccttttc tgtggagccc 1320 gttcttaccc agagcgcctg gtttcggccg cataaccgcg ataaaaccat tactaatctc 1380 tacctggtcg gcgcaggcac gcatcccggc gcaggcattc ctggcgtcat cggctcggca 1440 aaagcgacag caggtttgat gctggaggat ctgatttga 1479 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 ccgctgcaga tggccccctc cgtgat 26 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 ccgccatggc ctgcatgcac ctgat 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 14 ccgccatgga accaactacg gtaatt 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 15 ccggggccct caaatcagat cctcca 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 16 ccggagctca cgaattcgtc gattcg 26 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> crucifer-infecting Tobamovirus <400> 17 ccggagctcg gatcctttct tctttcaaat taaacg 36 <210> 18 <211> 3077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant PIC gene including internal ribosome entry site sequence of crucifer infecting Tobamovirus for beta carotene biosynthesis <400> 18 atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaacgg gacaggattc 60 ttggtatccg ttcgtgaggg aaaccggatt tttgattcgt cggggcgtag gaatttggcg 120 tgcaatgaga gaatcaagag aggaggtgga aaacaaaggt ggagttttgg ttcttacttg 180 ggaggagcac aaactggaag tggacggaaa ttttctgtac gttctgctat cgtggctact 240 ccggctggag aaatgacgat gtcatcagaa cggatggtat atgatgtggt tttgaggcag 300 gcagccttgg tgaagagaca gctgagatcg accgatgagt tagatgtgaa gaaggatata 360 cctattccgg ggactttggg cttgttgagt gaagcatatg ataggtgtag tgaagtatgt 420 gcagagtacg caaagacgtt ttacttagga acgatgctaa tgactccgga gagaagaaag 480 gctatctggg caatatacgt atggtgcagg agaacagacg aacttgttga tggtccgaat 540 gcatcacaca ttactccggc ggccttagat aggtgggaag acaggctaga agatgttttc 600 agtggacggc catttgacat gctcgatgct gctttgtccg acacagtttc caaatttcca 660 gttgatattc agccattcag agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gaggaagtca 720 agatacagaa actttgacga actataccta tattgttatt acgttgctgg tacggttggg 780 ttgatgagtg ttccaattat gggcatcgca cctgaatcaa aggcaacaac ggagagcgta 840 tataatgctg ctttggcttt ggggatcgca aatcagctga ccaacatact tagagatgtt 900 ggagaagatg ccagaagagg aagagtctat ttgcctcaag atgaattagc acaggcaggt 960 ctatccgacg aagacatatt tgctggaaga gtgaccgata aatggagaat cttcatgaag 1020 aaacaaattc agagggcaag aaagttcttt gacgaggcag agaaaggagt gaccgaattg 1080 agcgcagcta gtagatggcc tgtgttggca tctctgctgt tgtaccgcag gatactggac 1140 gagatcgaag ccaatgacta caacaacttc acaaagagag cttatgtgag caaaccaaag 1200 aagttgattg cattacctat tgcatatgca aaatctcttg tgccttctac aagaacatga 1260 aagccgaatt cgtcgattcg gttgcagcat ttaaagcggt tgacaacttt aaaagaagga 1320 aaaagaaggt tgaagaaaag ggtgtagtaa gtaagtataa gtacagaccg gagaagtacg 1380 ccggtcctga ttcgtttaat ttgaaagaag aaaggatccg agctctccca tatggtcgac 1440 ctgcagagat ggccccctcc gtgatggcgt cgtcggccac caccgtcgct cccttccagg 1500 ggctcaagtc caccgccggc atgcccgtcg cccgccgctc cggcaactcc agcttcggca 1560 acgtcagcaa tggcggcagg atcaggtgca tgcaggccat ggaaccaact acggtaattg 1620 gtgcaggctt cggtggcctg gcactggcaa ttcgtctaca agctgcgggg atccccgtct 1680 tactgcttga acaacgtgat aaacccggcg gtcgggctta tgtctacgag gatcaggggt 1740 ttacctttga tgcaggcccg acggttatca ccgatcccag tgccattgaa gaactgtttg 1800 cactggcagg aaaacagtta aaagagtatg tcgaactgct gccggttacg ccgttttacc 1860 gcctgtgttg ggagtcaggg aaggtcttta attacgataa cgatcaaacc cggctcgaag 1920 cgcagattca gcagtttaat ccccgcgatg tcgaaggtta tcgtcagttt ctggactatt 1980 cacgcgcggt gtttaaagaa ggctatctaa agctcggtac tgtccctttt ttatcgttca 2040 gagacatgct tcgcgccgca cctcaactgg cgaaactgca ggcatggaga agcgtttaca 2100 gtaaggttgc cagttacatc gaagatgaac atctgcgcca ggcgttttct ttccactcgc 2160 tgttggtggg cggcaatccc ttcgccacct catccattta tacgttgata cacgcgctgg 2220 agcgtgagtg gggcgtctgg tttccgcgtg gcggcaccgg cgcattagtt caggggatga 2280 taaagctgtt tcaggatctg ggtggcgaag tcgtgttaaa cgccagagtc agccatatgg 2340 aaacgacagg aaacaagatt gaagccgtgc atttagagga cggtcgcagg ttcctgacgc 2400 aagccgtcgc gtcaaatgca gatgtggttc atacctatcg cgacctgtta agccagcacc 2460 ctgccgcggt taagcagtcc aacaaactgc agactaagcg catgagtaac tctctgtttg 2520 tgctctattt tggtttgaat caccatcatg atcagctcgc gcatcacacg gtttgtttcg 2580 gcccgcgtta ccgcgagctg attgacgaaa tttttaatca tgatggcctc gcagaggact 2640 tctcacttta tctgcacgcg ccctgtgtca cggattcgtc actggcgcct gaaggttgcg 2700 gcagttacta tgtgttggcg ccggtgccgc atttaggcac cgcgaacctc gactggacgg 2760 ttgaggggcc aaaactacgc gaccgtattt ttgcgtacct tgagcagcat tacatgcctg 2820 gcttacggag tcagctggtc acgcaccgga tgtttacgcc gtttgatttt cgcgaccagc 2880 ttaatgccta tcatggctca gccttttctg tggagcccgt tcttacccag agcgcctggt 2940 ttcggccgca taaccgcgat aaaaccatta ctaatctcta cctggtcggc gcaggcacgc 3000 atcccggcgc aggcattcct ggcgtcatcg gctcggcaaa agcgacagca ggtttgatgc 3060 tggaggatct gatttga 3077 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying the PIC gene <400> 19 aaaaagcagg ctatgtctgt tgccttgtt 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying the PIC gene <400> 20 agaaagctgg gttcaaatca gatcctcca 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer including specific recombined nucleic acid of bacteria <400> 21 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer including specific recombined nucleic acid of bacteria <400> 22 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer including CrTMV IRES <400> 23 gagatcgaag ccaatgac 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer including CrTMV IRES <400> 24 gaagcctgca ccaattac 18 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying Tp CrtI gene <400> 25 ccgcccgggc atggccccct ccgtgat 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying Tp CrtI gene <400> 26 ccgtctagat caaatcagat cctcca 26 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying PIC gene into full-length <400> 27 atgtctgttg ccttgttatg gg 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the specific primer for amplifying PIC gene into full-length <400> 28 tcaaatcaga tcctccagca 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 29 ccgagcccag gttcaagt 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 30 aagaggattc cgccacatta t 21

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1을 포함하고 서열번호 18로 구성되는 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC.
4. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 8의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pGEM-PIC.
5. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 9의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pENTR-PIC.
6. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하고 도 10 및 11의 개열지도로 표현되는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P.
7. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함 하는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P로 형질전환된 아그로박테리움.
8. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC를 포함하는 발현 벡터 pGlb-PIC KACC 95070P로 형질전환된 식물체.
9. 서열번호 18의 베타카로틴 생합성 유도 다중발현 재조합 유전자 PIC가 도입되어 베타카로틴을 합성하는 형질전환된 식물체.

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