PL225448B1 - Aptamer DNA rozpoznający metkę histydynową oraz jego zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest unikatowa sekwencja nukleotydowa jednoniciowego aptameru DNA rozpoznającego metkę histydynową oraz jej zastosowanie.

Prokariotyczne oraz eukariotyczne systemy pozyskiwania białek rekombinowanych są wykorzystywane na szeroką skalę w badaniach naukowych. Celem szybkiego i wydajnego uzyskania pożąd anych preparatów białkowych charakteryzujących się zadowalającą czystością do sekwencji eks presjonowanych białek za pomocą metod inżynierii genetycznej dodawane są metki fuzyjne np.: metka histydynowa (His). Najczęściej metka His składa się z kilku (np. sześciu) następujących po sobie p owtórzeń reszt histydynowych. Wysokie powinowactwo metki His do określonych jonów metali (cynk, kobalt, miedź czy nikiel) umożliwia zastosowanie złóż chromatograficznych z wyżej wymienionymi jonami do oczyszczania lub unieruchamiania białka z metką His. Metka His dołączona do białka rekombinowanego umożliwia jego detekcję poprzez zastosowanie techniki western blotting wykorzystującej przeciwciała mono- lub poliklonalne skierowań przeciwko metce. Przytoczony system detekcji białek posiadających w swojej sekwencji aminokwasowej metkę His wykorzystywany jest w technik ach in vitro m.in.: „pull down, koimmunoprecyitacja czy też „far western blotting, które służą do badania oddziaływań międzybiałkowych.

Aptamerami DNA określa się jednoniciowe cząsteczki kwasu nukleinowego o długości około 40-100 nukleotydów, które wykazują zdolność do wiązania określonego ligandu z wysoką specyficznością oraz powinowactwem. Optymalne dopasowanie wyselekcjonowanego aptameru do określonej cząsteczki jest możliwe dzięki tworzonym bogatym strukturom drugo- i trzeciorzędowym.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej metody identyfikowania molekuł posiadających metkę histydynową, w szczególności poprzez zapewnienie nowej cząsteczki posiadającej wysokie pow inowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę histydynową to jest dowolnej cząsteczki (np. peptydu, białka, pochodnej DNA) zawierającej metkę histydynową.

Nieoczekiwanie okazało się, że określony powyżej cel techniczny może być zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Przedmiotem wynalazku jest aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki His i zawierający sekwencję nukleotydową Sekw Id Nr 1:

5'-GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3' zwany także w dalszej części opisu aptamerem B1.

Dopuszczalna jest pewna zmienność sekwencji DNA według wynalazku, pod warunkiem zachowania ich powinowactwa do peptydów lub białek zawierających metkę His, które umożliwia selektywne wiązanie białek z metką His z mieszaniny kilku białek. W szczególności zakresem wynalazku objęte są warianty wskazanych powyżej sekwencji różniące się co najmniej jedną zasadą purynową lub pirymidynową.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligonukleotydu B1 do wytwarzania cząsteczek posiadających powinowactwo do celów molekularnych zawierających metkę His, w szczególności :

- do wiązania metki His a więc tym samym do wiązania celów molekularnych posiadających tą metkę.

W szczególności oligonukleotyd według wynalazku może być stosowany w postaci cząsteczek z przyłączonymi znacznikami, zwłaszcza fluorescencyjnymi, i służyć w szczególności do znakowania celów molekularnych posiadających metkę His.

Tego typu cząsteczki mogą być korzystnie wykorzystane np. do badania oddziaływań pomiędzy białkami znanymi specjaliście technikami spektroskopowymi, takimi jak: FRET (Forsterowskie rezonansowe przeniesienie energii) lub BiFC (bimolekularna komplementacja fluorescencji).

W celu lepszego ujawnienia istoty zdefiniowanego powyżej wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o następujące figury:

Na Figurze 1 przedstawiono wiązanie białka posiadającego metkę histydynową przez opracowany aptamer. Ścieżki: 1) marker białkowy, 2) białko His-PCNA wiązane do aptameru B1, 3) białko PCNA wiązane do aptameru B1, 4) białko His-PCNA wiązane do referencyjnego aptameru, 5) białko PCNA wiązane do referencyjnego aptameru. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w Coomassie Brilliant Blue R-250.

Na Figurze 2 przedstawiono oczyszczanie białka z metką His z ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli. Ścieżki: 1) marker białkowy, 2) 40 μg ekstraktu białkowego z komórek E. coli,

PL 225 448 B1

3) oczyszczone białko His-PCNA na złożu chromatograficznym ze związanym aptamerem B1. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w Coomassie Brilliant Blue R-250.

Na Figurze 3 przedstawiono wykrywanie rekombinantowego białka zawierającego metkę His metodą ELISA z wykorzystaniem aptameru B1. Przedstawiony rezultat jest wynikiem uśrednionym z trzech niezależnie powtórzonych eksperymentów.

Ponadto niniejszy opis został uzupełniony o podane poniżej przykłady realizacji. Nie powinny być one utożsamiane z pełnym zakresem zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Uzyskanie aptameru DNA posiadającego powinowactwo do metki His.

W wyniku badań mających na celu opracowanie cząsteczek DNA wykazujących powinowactwo do celów molekularnych zawierających metkę His ustalono, że aptamer DNA o sekwencji: 5'-GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3' (Sekw. Id. Nr 1) posiada wysokie powinowactwo do takich celów.

Cząsteczka DNA według wynalazku może być uzyskana dowolną rutynową metodą syntezy DNA znaną specjaliście.

W przykładowej realizacji cząsteczka oligonukleotydu została uzyskana przy wykorzystaniu techniki syntezy chemicznej w fazie stałej (Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J.-J. and Morvan, F. Solid-Phase Chemical Synthesis of 5'-Triphosphate DNA, RNA, and Chemically Modified Oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2012; 50:1.28.1-1.28.16.)

Uzyskaną cząsteczkę aptameru B1 o zdefiniowanej powyżej sekwencji, długości 60 nukleotydów, zsyntetyzowaną odpowiednio w ilości 612 mikrogramów zweryfikowano metodą HPLC.

Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję według wynalazku może być poddawana dodatkowym modyfikacjom, w szczególności sprzęgana ze znanymi barwnikami (np. fluorescencyjnymi) lub innymi cząsteczkami (np. biotyną).

Przykładowo, biotynylowany aptamer B1 w ilości 459 mikrogramów uzyskano poprzez zastosowanie metody zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów biotynylowanych na końcu 5'. (Pon, R.T. A Long Chain Biotin Phosphoramidite Reagent for The Automated Synthesis of 5'-Biotinylated Oligonucleotides, Tetrahedron Lett.1991; 32: 1715-1718).

Otrzymane produkty zweryfikowano metodą HPLC.

P r z y k ł a d 2. Wiązanie białka zawierającego metkę His do złoża chromatograficznego zawierającego aptamer według wynalazku.

μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem BW (17,5 g/L NaCl; 50 mM bufor fosforanowy NaH₂PO₄/Na₂HPO₄; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 μl buforu BW, po czym dodano 20 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru B1 lub referencyjnego o sekwencji (ACTG)x10-GAGGAACATGCGTCGCAAAC.

Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem BW, a następnie dwukrotne płukanie buforem AS (137 mM NaCl;

12,7 mM KCl; 10 mM Na₂HPO4; 2 mM KH₂PO4; 5 mM MgCl₂; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,4;). Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μl buforu AS, po czym dodano rekombinantowego ludzkiego białka PCNA, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 0,13 mg/ml. W przeprowadzonym eksperymencie wykorzystano dwa warianty białka PCNA: a) z metką His oraz b) bez metki His. Złoże inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem AS. Następnie do złoża dodano buforu GLB (50 mM Tris-HCl; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmliego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione poprzez wykorzystanie barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 1.

P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie białka posiadającego metkę His z białkowego ekstraktu komórkowego.

μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem BW (0,3 M NaCl; 50 mM bufor fosforanowy NaH₂PO₄/Na₂HPO₄; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 μl buforu BW, po czym dodano 20 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru B1. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono

PL 225 448 B1 trzykrotne płukanie buforem BW, a następnie dwukrotne płukanie buforem AS (137 mM NaCI; 12,3 mM KCI; 10 mM Na₂HPO4; 2 mM KH₂PO₄; 5 mM MgCI₂, 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,4). Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μl buforu AS, po czym dodano białkowego ekstraktu przygotowanego z komórek E. coli ekspresjonujących rekombinantowe ludzkie białko His-PCNA tak aby końcowe stężenie białka całkowitego wyniosło 2,0 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem AS. Następnie białko His-PCNA eluowano buforem elucyjnym (50 mM Tris, pH 7,5). Do preparatu uzyskanego białka dodano buforu GLB (50 mM Tris; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDSPAGE; metoda Laemmli'ego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione poprzez wykorzystanie barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 2.

P r z y k ł a d 4. Oznaczanie białka z metką His metodą ELISA.

Płytkę 96-dołkową do testu ELISA opłaszczono ludzkim białkiem PCNA (0,5 μg białka/studzienkę). W przeprowadzonym eksperymencie wykorzystano dwa warianty białka PCNA: a) z metką His oraz b) bez metki His. Białko wiązano do płytki w temperaturze 4°C przez 16 h. Następnie płytkę przepłukano trzykrotnie buforem PBST (1 x PBS zawierający 0,5% (v/v) Tween 20). W kolejnym etapie płytkę poddano blokowaniu w buforze 1 x PBS zawierającym 2% (w/v) albuminę wołową przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie płytkę przepłukano trzy razy buforem PBST i dodano biotynylowanego aptameru B1 lub aptameru referencyjnego rozpuszczonego w buforze AS (137 mM NaCl; 12,3 mM KCl; 10 mM Na₂HPO4; 2 mM KH₂PO4; 5 mM MgCl₂; pH 7,4; 0,1% (v/v) Tween 20) tak aby końcowe stężenie aptameru wyniosło 0,01 mg/ml. Aptamery inkubowano z białkiem przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji płytkę przepłukano trzy razy buforem PBST, do studzienek dodano streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:200 w buforze PBS) i inkubowano 40 minut w temperaturze pokojowej. Płytkę ponownie przepłukano trzy razy buforem PBST, a następnie do studzienek dodano substratu dla peroksydazy chrzanowej. Po pojawieniu się niebieskiego zabarwienia reakcję zatrzymano dodając 1 M H₂SO₄ i zmierzono absorbancję przy długości fali 450 nm. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 3.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki His posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw Id Nr 1.
2. 2. Zastosowanie oligonukleotydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę His, zwłaszcza do wiązania białka zawierającego metkę His.