PL237531B1 - Aptamer DNA wiążący metkę lizylową i jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Lys i posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Nr Id. 1. Zgłoszenie obejmuje również zastosowanie ww oligonukleotydu do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do metki Lys, w szczególności: do detekcji cząsteczki zawierającej metkę Lys, do wiązania cząsteczki zawierającej metkę Lys, do oczyszczania cząsteczki zawierającej metkę Lys.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest unikatowa sekwencja nukleotydowa aptameru DNA rozpoznającego metkę lizylową oraz jej zastosowanie.

Czyste preparaty białkowe, poza badaniami naukowymi, są coraz częściej wykorzystywane w celach terapeutycznych. Preparaty te można otrzymywać m.in. przeprowadzając proces izolacji białek rekombinowanych z komórek prokariotycznych lub eukariotycznych przy zastosowaniu odpowiednich metod chromatograficznych. Przykładem takiej metody jest chromatografia powinowactwa, która bazuje na specyficznym oddziaływaniu dwóch cząsteczek: liganda, zimmobilizowanego na stałym nośniku, z analitem znajdującym się w fazie ruchomej. Niejednokrotnie w celu oczyszczenia z mieszaniny białek pożądanego białka przyłącza się do niego tak zwaną metkę fuzyjną, wykorzystując do tego metody inżynierii genetycznej. Metkami fuzyjnymi często używanymi w chromatografii powinowactwa białek rekombinowanych są m.in.: metka histydylowa (His-tag) , transferaza glutationu (GST), czy białko wiążące maltozę (MBP) wykazujące powinowactwo odpowiednio do jonów niklu, glutationu i maltozy.

Aptamery DNA są to krótkie jednoniciowe cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego składające się od 40 do 120 nukleotydów. Charakteryzują się one wysokim powinowactwem i specyficznością wiązania do rozpoznawanej cząsteczki. Optymalne dopasowanie aptameru do cząsteczki docelowej uzależnione jest od jego unikatowej struktury drugo- i trzeciorzędowej.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej metody identyfikowania molekuł posiadających metkę lizylową (określaną dalej jako „metka Lys), w szczególności poprzez zapewnienie nowej cząsteczki posiadającej wysokie powinowactwo do molekuły zawierającej metkę Lys, to jest dowolnej cząsteczki (np. peptydu, białka, pochodnej DNA) zawierającej kilka kolejno występujących po sobie reszt lizylowych.

Nieoczekiwanie okazało się, że określony powyżej cel techniczny może być zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem

Według wynalazku aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Lys posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako:

Sekw. Nr Id. 1

5' - GATCGCGGGGGTTGGGGTATTTTGTTGGTGGCTTGGGGCGCGATTG - 3'

Istotą wynalazku jest również zastosowanie oligonukleotydu posiadającego Sekw. Nr Id. 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę Lys.

Korzystnie, oligonukleotyd może być zastosowany do wiązania białka lub peptydu zawierającego metkę Lys.

Oligounkleotyd nr Id. 1 według wynalazku jest także zwany w dalszej części opisu aptamerem B7.

Niewątpliwie, specjalista będzie świadomy, że dopuszczalna jest pewna zmienność sekwencji DNA według wynalazku, pod warunkiem zachowania możliwości wiązania do molekuł zawierających metkę Lys, umożliwiająca selektywne oczyszczenie białek z metką Lys z mieszaniny białek. W szczególności możliwe są warianty wskazanej powyżej sekwencji różniące się co najmniej jedną zasadą purynową lub pirymidynową.

Aptamer B7 o sekwencji określonej powyżej może być zastosowany do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celów molekularnych zawierających metkę Lys, w szczególności:

- do detekcji celów molekularnych zawierających metkę Lys,

- do wiązania celów molekularnych zawierających metkę Lys,

- do oczyszczania celów molekularnych zawierających metkę Lys.

W szczególności oligonukleotydy według wynalazku mogą być stosowane w postaci cząsteczek z przyłączonymi znacznikami, np. biotyną i służyć do znakowania białek rekombinowanych.

W celu lepszego ujawnienia istoty zdefiniowanego powyżej wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o rysunki.

Na Figurze 1 przedstawiono wiązanie białka posiadającego metkę lizylową przez opracowany aptamer B7. Ścieżki: 1) marker białkowy, 2) białko PCNA wykorzystane do eksperymentu, 3) białko 5xLys-PCNA wykorzystane do eksperymentu, 4) preparat odzyskany ze złoża zawierającego aptamer B7, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem PCNA, 5) preparat odzyskany ze złoża zawierającego aptamer B7, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem 5xLys-PCNA 6) preparat odzyskany ze złoża zawierającego aptamer REF, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem PCNA, 7) preparat odzyskany ze złoża zawierającego aptamer REF, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem 5xLys-PCNA. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym w układzie

PL 237 531 B1

Laemmli'ego, a następnie wybarwiono korzystając z barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Aptamer referencyjny (REF) posiadał sekwencję: 3'- (ACTG) 10 -5'.

Na Figurze 2 przedstawiono oczyszczanie białka GST posiadającego metkę 5xLys z ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli. Ścieżki 1) marker białkowy, 2) profil białkowy komórek bakterii E. coli, 3) profil białkowy komórek bakterii E. coli z nadprodukcją białka 5xLys-GST, 4) 20 μg ekstraktu białkowego, wykorzystanego do inkubacji z złożem zawierającym aptamer B7, przygotowanego z komórek E. coli, produkujących białko 5xLys-GST, 5) białko 5xLys-GST wyeluowane ze złoża chromatograficznego ze związanym aptamerem B7. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym w układzie Laemmli'ego, a następnie wybarwiono korzystając z barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250.

Ponadto niniejszy opis został uzupełniony o podane poniżej przykłady realizacji. Nie powinny być one utożsamiane z pełnym zakresem zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Uzyskanie aptamerów DNA posiadających powinowactwo do metki Lys.

W wyniku badań mających na celu opracowanie cząsteczki DNA wykazującej powinowactwo do molekuł zawierających metkę Lys ustalono, że aptamer DNA zawierający następującą sekwencję:

Sekw. Nr Id. 1.

5' - GATCGCGGGGGTTGGGGTATTTTGTTGGTGGCTTGGGGCGCGATTG - 3' posiada wysokie powinowactwo do takich celów.

Cząsteczka DNA według wynalazku może być uzyskana dowolną rutynową metodą syntezy DNA znaną specjaliście.

W przykładowej realizacji cząsteczka oligonukleotydowa została uzyskana przy wykorzystaniu techniki syntezy chemicznej w fazie stałej (Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J.- J. and Morvan, F. Solid-Phase Chemical Synthesis of 5'-Triphosphate DNA, RNA, and Chemically Modified Oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2012; 50:1.28.1-1.28.16.).

Uzyskaną cząsteczkę aptameru B7 o zdefiniowanej powyżej sekwencji, o długości 46 nukleotydów, zsyntetyzowaną w ilości 357,8 mikrogramów, zweryfikowano metodą HPLC.

Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję według wynalazku może być poddawana dodatkowym modyfikacjom, w szczególności sprzęgania ze znanymi barwnikami (np. fluorescencyjnymi) lub innymi cząsteczkami (np. biotyną).

Przykładowo, biotynylowany aptamer B7 w ilości 344,7 mikrogramów uzyskano poprzez zastosowanie metody zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów biotynylowanych na końcu 5' (Pon, R.T. A Long Chain Biotin Phosphoramidite Reagent for The Automated Synthesis of 5'-Biotinylated Oligonucleotides, Tetrahedron Lett. 1991; 32: 1715-1718). Otrzymany produkt zweryfikowano metodą HPLC.

P r z y k ł a d 2

Wiązanie białka zawierającego metkę Lys do złoża chromatograficznego zawierającego aptamer według wynalazku.

μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem WB (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 μl buforu WB, po czym dodano 15 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru B7 lub REF (3'(ACTG)io -5'). Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem WB. Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 500 μl buforu WB, po czym dodano rekombinowanego ludzkiego białka PCNA lub 5xLysPCNA, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 0,16 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem WB. Następnie do złoża dodano 40 μl buforu GLB (50 mM Tris-HCl; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę odwirowano (5 min, 10 000 x g) i poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE; układ Laemmli'ego). Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione za pomocą barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 1.

P r z y k ł a d 3.

Oczyszczanie białka posiadającego metkę Lys z białkowego ekstraktu komórkowego przygotowanego z komórek E. coli.

PL 237 531 B1 μl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem WB. Przepłukane złoże zawieszono w 300 μΙ buforu WB, po czym dodano 15 μg biotynylowanego na końcu 5' aptameru B7. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem WB. Po ostatnim płukaniu do złoża dodano 800 μl ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli zawierających rekombinowane ludzkie białko 5xLys-GST, tak aby końcowe stężenie białka całkowitego wyniosło 2,0 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 h, a po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem WB. Następnie białko odzyskano ze złoża stosując bufor elucyjny EB (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 200 mM chlorowodorek guaniny, pH 7,5) . Do osadu bakteryjnego uzyskanego z komórek bakterii E. coli produkujących białko 5xLys-GST, 20 μg ekstraktu białkowego uzyskanego z komórek bakterii E. coli produkujących białko 5xLys-GST lub 4 μg preparatu oczyszczonego białka dodano buforu GLB i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS- PAGE; metoda Laemmli'ego). Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione przy pomocy barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na Fig. 2.

Claims (3)

1. Aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Lys i posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Nr Id. 1.

2. Zastosowanie oligonukleotydu określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do metki Lys, w szczególności:

- do detekcji cząsteczki zawierającej metkę Lys,

- do wiązania cząsteczki zawierającej metkę Lys,

- do oczyszczania cząsteczki zawierającej metkę Lys.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cząsteczką zawierającą metkę Lys jest peptyd lub białko.