PL220450B1 - Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents
Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzaniaInfo
- Publication number
- PL220450B1 PL220450B1 PL401159A PL40115912A PL220450B1 PL 220450 B1 PL220450 B1 PL 220450B1 PL 401159 A PL401159 A PL 401159A PL 40115912 A PL40115912 A PL 40115912A PL 220450 B1 PL220450 B1 PL 220450B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- suspended
- modified
- membrane
- solution
- strain
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 239000010931 gold Substances 0.000 title claims description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 19
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 14
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 title claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 title 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 60
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 20
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 19
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 18
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 17
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 13
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 12
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 10
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 claims description 10
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 9
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 8
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 8
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 5
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 3
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 3
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- -1 carboxylic acid modified colloidal gold Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 2
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych takich jak: Pseudomonas areugineosa opornych na działanie karbapenemów, Staphylococcus aureus opornych na działanie antybiotyków β-laktamowych i Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny oraz sposób jego wytwarzania.
Zakażenia szpitalne to problem jaki jest obecny we współczesnej służbie zdrowia, do najpoważniejszych zakażeń szpitalnych należą zakażenia bakteryjne takimi bakteriami jak: Pseudomonas areugineosa, Staphylococcus aureus czy też Enterococcus spp. Największe zagrożenie dla człowieka stanowią zakażenia szczepami bakteryjnymi opornymi na działanie antybiotyków. Wśród zakażeń szpitalnych najczęściej występują izolowane szczepy: Pseudomonas areugineosa oporne na działanie karbapenemów, Staphylococcus aureus oporne na działanie antybiotyków β-laktamowych czy też Enterococcus spp. oporne na działanie wankomycyny.
Obecnie stosowane procedury diagnostyczne zmierzające do identyfikacji i charakterystyki biochemicznej zakażeń bakteryjnych to techniki bazujące na procedurach klasycznej mikrobiologii - posiewy izolacyjne oraz testy krążkowe oporności na antybiotyki lub też testy bazujące na technikach biologii molekularnej - reakcja X łańcuchowa polimerazy PCR. Wymienione procedury diagnostyczne są czasochłonne oraz kosztowne i wymagają wykorzystania drogiego sprzętu w celu realizacji kompleksowego badania mającego na celu izolację szczepu i jego charakterystykę biochemiczną taką jak oporność na antybiotyki.
Wśród opisanych w literaturze rozwiązań diagnostycznych wykorzystywanych do identyfikacji antybiotykooporności należy wymienić głównie techniki bazujące na mikromacierzach. Jedną z technik opisanych w literaturze przez Douglas R. Call i współpracowników w artykule pt. „Identifying Antimicrobial Resistance Genes with DNA Microarrays” (Antimicrob. Agents Chemother. October 2003 vol. 47 no. 10 3290-3295) jest metoda identyfikacji antybiotykooporności szczepów bakteryjnych wykorzystująca macierz diagnostyczną wykonaną na bazie silanizowanego szkła z immobilizowanym kolwancyjnie nukleotydem (sondą molekularną) znakowaną fluoroforem hybrydyzującą z genem warunkującym antybiotykooporność. Procedura analityczna związana z detekcją genu oporności na antybiotyki zaproponowana przez autorów wymaga ekstrakcji DNA bakteryjnego a analiza wyników wymaga zastosowania skanera fluorescencyjnego, co czyni procedurę mało użyteczną w warunkach słabo wyposażonych laboratoriów szpitalnych.
Alternatywne rozwiązanie mikromacierzowe bazujące na badaniach polimorfizmu pojedynczych nukleotydów w celu identyfikacji antybiotykooporności przedstawiła Verena Grimm i współautorzy w publikacji „Use of DNA Microarrays for Rapid Genotyping of TEM Beta-Lactamases That Confer Resistance” (J. Clin. Microbiol. August 2004 vol. 42 no. 8 3766-3774). Opisane rozwiązanie diagnostyczne bazuje na zastosowaniu matrycy diagnostycznej z szeregiem sond diagnostycznych o określonej sekwencji (z polimorfizmem pojedynczych nukleotydów), które wykorzystywane są w procedurze analitycznej do detekcji genu oporności na antybiotyki. Jako znacznika fluorescencyjnego użyto dodatkowej sondy znakowanej fluorescencyjnie, której związanie z genem przejawia się wzrostem fluorescencji określonego rejonu macierzy diagnostycznej. Fluorescencja układu diagnostycznego a zarazem obecność genu warunkującego oporność na antybiotyki jest rejestrowana za pomocą skanera fluorescencyjnego.
Z publikacji James J. Storhoff i współpracownicy „Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanoparticle probes” (Nature Biotechnology 22, 883-887 2004) znany jest układ diagnostyczny na bazie szkła oraz nanocząstek złota do detekcji antybiotykooporności bakterii. Zaproponowane rozwiązanie wykorzystuje nanocząstki modyfikowane sondami nukleotydowymi hybrydyzującymi z genem oporności na antybiotyki. Analiza wyniku testu diagnostycznego odbywa się poprzez ocenę barwy układu nanocząstek naniesionych na szklaną powierzchnię.
Z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US2012129180 znana jest metoda detekcji bakterii opornych na karbapemy bazująca na multipleksowej reakcji PCR ze specjalnie zaprojektowanymi starterami pozwalającymi na detekcję bakterii Gram X (-).
Natomiast z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO2010062001 znany jest sposób wytwarzania testu diagnostycznego opartego na dwóch sondach hybrydyzacyjnych , z których jedna jest immobilizowana na powierzchni szkła, natomiast druga znakowana fluorescencyjnie jest dodana
PL 220 450 B1 do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Warunkiem zadziałania testu jest obecność w badanym materiale genu o sekwencjach komplementarnych do dwóch sond, których rolą jest wychwyt i zabarwienie analitu.
Istotą wynalazku jest test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych, który składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 2 do 240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg nanocząstek Au modyfikowanych kwasami karboksylowanymi sprzęganych kowalencyjnie z sondą hybrydyzacyjną z łącznikiem aminowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyną, przy czym sondy hybrydyzacyjne określone są wzorami od 1 do 6.
Korzystnie białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.
Korzystnie test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Pseudomonas Areugineosa zawiera pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
Korzystnie test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Staphylococcus Aureus zawiera równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
Korzystnie test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Enterococcus spp. zawiera równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.
Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych polega na tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek Au o stężeniu 25 μg/ml z sondą hybrydyzacyjną z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 μύ-200 μl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 μl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.
Korzystnie jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.
Korzystnie w przypadku identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa stosuje się pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
Korzystnie w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
Korzystnie w przypadku identyfikacji szczepu Enterococcus spp. stosuje się równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.
Zaletą testu diagnostycznego na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych według wynalazku jest to, że test pozwala na identyfikację lekooporności w oparciu o genetyczne mechanizmy oporności. Analiza lekooporności bakterii nie wymaga wstępnej ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania.
Przykład 1. Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem streptawidyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
PL 220 450 B1
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 1 nmol oligonukleotydu GTTTGGTCGCATATCGCAAC znakowanego łącznikiem aminowym zawieszonego w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 39 μΐ dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy AATGCGCAGCACCAGGATAG zawierającej 1 pmol oligonukleotydu.
W kolejnym etapie miesza się 10 μΐ reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
P r z y k ł a d 2. Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem awidyny 2 w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 5 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego łącznikiem aminowym zawieszonego w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 39 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 5 pmol oligonukleotydu.
W kolejnym etapie miesza się 10 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną awidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
PL 220 450 B1
Przykład 3. Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekom2 binowanej awidyny w ilości 0,01 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 10 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego łącznikiem aminowym zawieszonym w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 59 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 10 pmol oligonukleotydu.
W kolejnym etapie miesza się 20 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną rekombinowaną awidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
P r z y k ł a d 4. Sposób wytworzenia testu do detekcji Staphylococcus Aureus opornego na metycylinę.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 180 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem 2 rekombinowanej streptawidyny w ilości 0,005 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA, TTACAGAGTTAACTGTTACC znakowanych łącznikiem aminowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 69 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA, ATACAAATCCAGCACGCTCT zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.
W kolejnym etapie miesza się 10 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się
PL 220 450 B1 do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μΐ mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną rekombinowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
P r z y k ł a d 5. Sposób wytworzenia testu do detekcji Staphylococcus Aureus opornego na metycylinę.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 180 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekom2 binowanej streptawidyny w ilości 0,005 μl/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA, ATACAAATCCAGCACGCTCT znakowanych łącznikiem aminowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 69 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA, TTACAGAGTTAACTGTTACC zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.
W kolejnym etapie miesza się 25 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną rekombinowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
P r z y k ł a d 6. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta2 widyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 10 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach:
CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC,
CGGGGAAGATGGCAGTAT znakowanych łącznikiem aminowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml.
PL 220 450 B1
Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.
W kolejnym etapie miesza się 25 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
P r z y k ł a d 7. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta2 widyny w ilości 0,05 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 5 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach:
CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem aminowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx5 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.
W kolejnym etapie miesza się 30 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce, płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
PL 220 450 B1
P r z y k ł a d 8. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę.
Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta2 widyny w ilości 0,025 μl/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.
Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego kwasem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT,
CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem aminowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pHx6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.
W kolejnym etapie miesza się 30 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml, preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki, zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.
Analiza wyniku:
a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych, znamienny tym, że składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 2240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg nanocząstek Au modyfikowanych kwasami karboksylowanymi sprzęganych kowalencyjnie z sondą hybrydyzacyjną z łącznikiem aminowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyną, przy czym sondy hybrydyzacyjne określone są wzorami od 1 do 6.
- 2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.
- 3. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Pseudomonas Areugineosa zawiera pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
- 4. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
- 5. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Enterococcus spp. zawiera równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.
- 6. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepówPL 220 450 B1 bakteryjnych, znamienny tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka 22 wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek Au o stężeniu 25 pg/ml z sondą hybrydyzacyjną z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 μ1-200 μΐ dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 μΐ dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 pl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 pl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 pl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 pl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.
- 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Psudomonas areugineosa stosuje się pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
- 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
- 10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przypadku identyfikacji szczepu Enterococcus spp. stosuje się równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL401159A PL220450B1 (pl) | 2012-10-11 | 2012-10-11 | Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL401159A PL220450B1 (pl) | 2012-10-11 | 2012-10-11 | Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL401159A1 PL401159A1 (pl) | 2013-05-27 |
PL220450B1 true PL220450B1 (pl) | 2015-10-30 |
Family
ID=48522807
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL401159A PL220450B1 (pl) | 2012-10-11 | 2012-10-11 | Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
PL (1) | PL220450B1 (pl) |
-
2012
- 2012-10-11 PL PL401159A patent/PL220450B1/pl unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL401159A1 (pl) | 2013-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Stoeva et al. | Multiplexed DNA detection with biobarcoded nanoparticle probes | |
KR101602305B1 (ko) | 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법 | |
JP2008507296A (ja) | 混合培養物中でメチシリン耐性黄色ブドウ球菌とメチシリン感受性黄色ブドウ球菌とを区別する方法 | |
CN115244185A (zh) | 使用探针对连接的原位rna分析 | |
US9228240B2 (en) | Methods for detecting and quantifying viable bacterial endo-spores | |
JP2013520980A (ja) | 増強マルチプレックスfish | |
KR20080094911A (ko) | 하이브리드화 프로브 분석 및 어레이 | |
WO2018098404A1 (en) | Methods, compositions, and kits for detecting a cell in a sample | |
Ma et al. | A NASBA on microgel-tethered molecular-beacon microarray for real-time microbial molecular diagnostics | |
US10443085B2 (en) | Method for detecting nucleic acid and nucleic acid detection kit | |
US9482666B2 (en) | High throughput selection of specific cell binding and lytic polypeptides | |
KR101546887B1 (ko) | 산화효소 활성을 가지는 산화세륨 나노입자를 이용한 핵산 및 생체물질 검출방법 | |
Satokari et al. | Multiplexed quantification of bacterial 16S rRNA by solution hybridization with oligonucleotide probes and affinity capture | |
PL220450B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie karboksy modyfikowanego nanozłota sprzężonego z amino modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
US8206935B2 (en) | Method of rapidly quantifying hydroxymethylated DNA | |
PL221293B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp oraz sposób jego wytwarzania | |
PL221294B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Staphylococcus aureus oraz sposób jego wytwarzania | |
PL218813B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aeruginosa oraz sposób jego wytwarzania | |
PL220464B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie aminosilanizowanych cząstek magnetycznych sprzężonych z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
PL220131B1 (pl) | Test diagnostyczny do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
PL220201B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z fosforylowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
US8765369B2 (en) | Ultrasensitive detection of target using target-ready particles | |
PL220190B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie aminosilanizowanych cząstek magnetycznych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
PL220198B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania | |
PL220337B1 (pl) | Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek polistyrenowych sprzężonych z fosforylowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania |