PL218813B1 - Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aeruginosa oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekoopomości Pseudomonas aerugineosa opornych na działanie karbapenemów oraz sposób jego wytwarzania.

Zakażenia szpitalne to problem jaki jest obecny w współczesnej służbie zdrowia, do najpoważniejszych zakażeń szpitalnych należą zakażenia bakteryjne takimi bakteriami jak: Pseudomonas aerugineosa, Staphylococcus aureus czy też Enterococcus spp. Największe zagrożenie dla człowieka stanowią zakażenia szczepami bakteryjnymi opornymi na działanie antybiotyków. Wśród zakażeń szpitalnych najczęściej izolowane szczepy Pseudomonas aerugineosa oporne na działanie karbapenemów, Staphylococus aureus oporne na działanie antybiotyków β-laktamowych czy też Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny.

Obecnie stosowane procedury diagnostyczne zmierzające do identyfikacji i charakterystyki biochemicznej zakażeń bakteryjnych to techniki bazujące na procedurach klasycznej mikrobiologii - posiewy izolacyjne oraz testy krążkowe oporności na antybiotyki lub też testy bazujące na technikach biologii molekularnej reakcja - łańcuchowa polimerazy PCR. Wymienione procedury diagnostyczne są czasochłonne oraz kosztowne i wymagają wykorzystania drogiego sprzętu w celu realizacji kompleksowego badania mającego na celu izolację szczepu i jego charakterystykę biochemiczną taką jak oporność na antybiotyki.

Wśród opisanych w literaturze rozwiązań diagnostycznych wykorzystywanych do identyfikacji antybiotykoodporności należy wymienić głównie techniki bazujące na mikromacierzach. Jedną z technik opisanych w literaturze przez Douglas R. Cali i współpracowników w artykule pt. „Identifying Antimicrobial Resistance Genes with DNA Microarrays” (Antimicrob. Agents Chemother. October 2003 vol. 47 no. 10, 3290-3295) jest metoda identyfikacji antybiotykoodporności szczepów bakteryjnych wykorzystująca macierz diagnostyczną wykonaną na bazie silanizowanego szkła z immobilizowanym kolwancyjnie nukleotydem (sondą molekularną) znakowaną fluoroforem hybrydyzującą z genem warunkującym antybiotykooporność. Procedura analityczna związana z detekcją genu oporności na antybiotyki zaproponowana przez autorów wymaga ekstrakcji DNA bakteryjnego a analiza wyników wymaga zastosowania skanera fluorescencyjnego, co czyni procedurę mało użyteczną w warunkach słabo wyposażonych laboratoriów szpitalnych.

Alternatywne rozwiązanie mikromacierzowe bazujące na badaniach polimorfizmu pojedynczych nukleotydów w celu identyfikacji antybiotykooporności przedstawiła Verena Grimm i współautorzy w publikacji „Use of DNA Microarrays for Rapid Genotyping of TEM Beta-Lactamases That Confer Resistance” (J. Clin. Microbiol. August 2004 vol. 42 no. 8, 3766-3774). Opisane rozwiązanie diagnostyczne bazuje na zastosowaniu matrycy diagnostycznej z szeregiem sond diagnostycznych o określonej sekwencji (z polimorfizmem pojedynczych nukleotydów), które wykorzystywane są w procedurze analitycznej do detekcji genu oporności na antybiotyki. Jako znacznika fluorescencyjnego użyto dodatkowej sondy znakowanej fluorescencyjnie, której związanie z genem przejawia się wzrostem fluorescencji określonego rejonu macierzy diagnostycznej. Fluorescencja układu diagnostycznego a zarazem obecność genu warunkującego oporność na antybiotyki jest rejestrowana za pomocą skanera fluorescencyjnego.

Z publikacji James J. Storhoff i współpracownicy „Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanoparticle probes” (Nature Biotechnology 22, 883-887 2004) znany jest układ diagnostyczny na bazie szkła oraz nanocząstek złota do detekcji antybiotykoodporności bakterii. Zaproponowane rozwiązanie wykorzystuje nanocząstki modyfikowane sondami nukleotydowymi hybrydyzującymi z genem oporności na antybiotyki. Analiza wyniku testu diagnostycznego odbywa się na ocenie barwy układu nanocząstek naniesionych na szklaną powierzchnię.

Z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US2012129180 znana jest metoda detekcji bakterii opornych na karbapemy bazująca na multipleksowej reakcji PCR ze specjalnie zaprojektowanymi starterami pozwalającymi na detekcję bakterii Gram -.

Natomiast z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO2010062001 znany jest sposób wytwarzania testu diagnostycznego opartego na dwóch sondach hybrydyzacyjnych, z których jedna jest immobilizowana na powierzchni szkła natomiast druga znakowana fluorescencyjnie jest dodana do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Warunkiem zadziałania testu jest obecność w badanym materiale genu o sekwencjach komplementarnych do dwóch sond, których rolą jest wychwyt i zabarwienie analitu.

PL 218 813 B1

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aerugineosa, który składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 22

0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 pg amino modyfikowanych nanocząstek Au sprzęganych kowalencyjnie z pojedyńczą sondą hybrydyzacyjną o wzorze 1 lub 2 modyfikowaną łącznikiem karboksylowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej o wzorze 2 lub 1 odpowiednio znakowanej biotyną.

Korzystnie białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.

Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekoopomości Pseudomonas aerugineosa polega na tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek Au o stężeniu 25 pg/ml z pojedynczą sondą hybrydyzacyjną o wzorze 1 lub 2 z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 pl - 200 pl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 pl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 pl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej o wzorze 2 lub 1 odpowiednio, zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 pl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 pl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 pl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

Korzystnie jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.

Zaletą testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aerugineosa według wynalazku jest to, że test pozwala na identyfikację lekooporności w oparciu o genetyczne mechanizmy oporności. Analiza lekooporności bakterii nie wymaga wstępnej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania.

Przykła d 1

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas aerugineosa opornego na karbapenemy.

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,1 pg/mm² zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem aminowym zawierającego 25 pg czystego złota dodaje się 1 nmol oligonukleotydu GTTTGGTCGCATATCGCAAC znakowanego łącznikiem karboksylowym zawieszonego w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 pl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 39 pl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 pl roztworu biotynylowanej sondy AATGCGCAGCACCAGGATAG zawierającej 1 pmol oligonukleotydu.

PL 218 813 B1

W kolejnym etapie miesza się 10 μΐ reagenta detekcyjnego z 10 μΐ gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μΐ dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

„bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

„z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

P r z y k ł a d 2

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas aerugineosa opornego na karbapenemy. Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem ₂ awidyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem karboksylowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 5 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego łącznikiem karboksylowym zawieszonego w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 39 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 5 pmol oligonukleotydu.

W kolejnym etapie miesza się 10 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną awidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

P r z y k ł a d 3

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas aerugineosa opornego na karbapenemy.

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekom₂ binowanej awidyny w ilości 0,01 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem aminowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 10 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego

PL 218 813 B1 łącznikiem karboksylowym zawieszonym ego w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μΐ dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 59 μΐ dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μΐ roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 10 pmol oligonukleotydu.

W kolejnym etapie miesza się 20 μΐ reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowanym rekombinowaną awidyną.

Analiza wyniku:

„bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

„z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

Claims (4)

1. Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aerugineosa, znamienny tym, że składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilo22 ści od 0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg amino modyfikowanych nanocząstek Au sprzęganych kowalencyjnie z pojedynczą sondą hybrydyzacyj ną o wzorze 1 lub 2 modyfikowaną łączn ikiem karboksylowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej o wzorze 2 lub 1 odpowiednio, znakowanej biotyną.

2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.

3. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Pseudomonas aerugineosa, znamienny tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wią22 żącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek złota o stężeniu 25 μg/ml z sondą hybrydyzacyjną o wzorze 1 lub 2 z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 μl - 200 μl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej o wzorze 2 lub 1 odpowiednio, zawierającej 1-10 nmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 μl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.