PL221293B1 - Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny oraz sposób jego wytwarzania.

Zakażenia szpitalne to problem jaki jest obecny w współczesnej służbie zdrowia, do najpoważniejszych zakażeń szpitalnych należą zakażenia bakteryjne takimi bakteriami jak: Pseudomonas areugineosa, Staphylococcus aureus czy też Enterococcus spp. Największe zagrożenie dla człowieka stanowią zakażenia szczepami bakteryjnymi opornymi na działanie antybiotyków. Wśród zakażeń szpitalnych najczęściej izolowane szczepy Pseudomonas areugineosa oporne na działanie karbapenemów, Staphylococus aureus oporne na działanie antybiotyków β-laktamowych czy też Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny.

Obecnie stosowane procedury diagnostyczne zmierzające do identyfikacji i charakterystyki biochemicznej zakażeń bakteryjnych to techniki bazujące na procedurach klasycznej mikrobiologii - posiewy izolacyjne oraz testy krążkowe oporności na antybiotyki lub też testy bazujące na technikach biologii molekularnej reakcja - łańcuchowa polimerazy PCR. Wymienione procedury diagnostyczne są czasochłonne oraz kosztowne i wymagają wykorzystania drogiego sprzętu w celu realizacji kompleksowego badania mającego na celu izolację szczepu i jego charakterystykę biochemiczną taką jak oporność na antybiotyki).

Wśród opisanych w literaturze rozwiązań diagnostycznych wykorzystywanych do identyfikacji antybiotykoodporności należy wymienić głównie techniki bazujące na mikromacierzach. Jedną z technik opisanych w literaturze przez Douglas R. Call i współpracowników w artykule pt. „Identifying Antimicrobial Resistance Genes with DNA Microarrays” (Antimicrob. Agents Chemother. October 2003 vol. 47 no. 10 3290-3295) jest metoda identyfikacji antybiotykoodporności szczepów bakteryjnych wykorzystująca macierz diagnostyczną wykonaną na bazie silanizowanego szkła z immobilizowanym kolwancyjnie nukleotydem (sondą molekularną) znakowaną fluoroforem hybrydyzującą z genem warunkującym antybiotykooporność. Procedura analityczna związana z detekcją genu oporności na antybiotyki zaproponowana przez autorów wymaga ekstrakcji DNA bakteryjnego a analiza wyników wymaga zastosowania skanera fluorescencyjnego, co czyni procedurę mało użyteczną w warunkach słabo wyposażonych laboratoriów szpitalnych.

Alternatywne rozwiązanie mikromacierzowe bazujące na badaniach polimorfizmu pojedynczych nukleotydów w celu identyfikacji antybiotykooporności przedstawiła Verena Grimm i współautorzy w publikacji „Use of DNA Microarrays for Rapid Genotyping of TEM Beta-Lactamases That Confer Resistance” (J. Clin. Microbiol. August 2004 vol. 42 no. 8 3 766-3 7 74). Opisane rozwiązanie diagnostyczne bazuje na zastosowaniu matrycy diagnostycznej z szeregiem sond diagnostycznych o określonej sekwencji (z polimorfizmem pojedynczych nukleotydów), które wykorzystywane są w procedurze analitycznej do detekcji genu oporności na antybiotyki. Jako znacznika fluorescencyjnego użyto dodatkowej sondy znakowanej fluorescencyjnie, której związanie z genem przejawia się wzrostem fluorescencji określonego rejonu macierzy diagnostycznej. Fluorescencja układu diagnostycznego a zarazem obecność genu warunkującego oporność na antybiotyki jest rejestrowana za pomocą skanera fluorescencyjnego.

Z publikacji James J Storhoff i współpracownicy „Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanoparticle probes” (Nature Biotechnology 22, 883-887 2004) znany jest układ diagnostyczny na bazie szkła oraz nanocząstek złota do detekcji antybiotykoodporności bakterii. Zaproponowane rozwiązanie wykorzystuje nanocząstki modyfikowane sondami nukleotydowymi hybrydyzującymi z genem oporności na antybiotyki. Analiza wyniku testu diagnostycznego odbywa się na ocenie barwy układu nanocząstek naniesionych na szklaną powierzchnię.

Z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US 2012129180 znana jest metoda detekcji bakterii opornych na karbapemy bazująca na multipleksowej reakcji PCR ze specjalnie zaprojektowanymi starterami pozwalającymi na detekcję bakterii Gram-.

Natomiast z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 2010062001 znany jest sposób wytwarzania testu diagnostycznego opartego na dwóch sondach hybrydyzacyjnych, z których jedna jest immobilizowana na powierzchni szkła natomiast druga znakowana fluorescencyjnie jest dodana do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Warunkiem zadziałania testu jest obecność w badanym maPL 221 293 B1 teriale genu o sekwencjach komplementarnych do dwóch sond, których rolą jest wychwyt i zabarwienie analitu.

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp, który składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do ₂

240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² 2 do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg amino modyfikowanych nanocząstek Au sprzęganych kowalencyjnie z równomolową mieszaniną 4 sond o wzorze 1 lub 2 modyfikowanych łącznikiem karboksylowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami równomolowej mieszaniny 4 sond o wzorze odpowiednio 2 lub 1 znakowanych biotyną.

Korzystnie białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.

Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp polega na tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek Au o stężeniu 25 μg/ml z równomolową mieszaniną 4 sond o wzorze 1 lub 2 z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 μΩ200 μΐ dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 μΐ dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej równomolowej mieszaniny 4 sond o wzorze odpowiednio 2 lub 1 zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 μl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

Korzystnie jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.

Zaletą testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp według wynalazku jest to, że test pozwala na identyfikację lekooporności w oparciu o genetyczne mechanizmy oporności. Analiza lekooporności bakterii nie wymaga wstępnej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem aminowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 10 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach:

CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT znakowanych łącznikiem karboksylowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów:

PL 221 293 B1

CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 25 μΐ reagenta detekcyjnego z 10 μΐ gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny,

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

P r z y k ł a d 2. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,05 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem aminowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 5 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach:

CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem karboksylowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów:

CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 30 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny,

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

P r z y k ł a d 3. Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,025 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania memPL 221 293 B1 branę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml złota koloidalnego modyfikowanego łącznikiem aminowym zawierającego 25 μg czystego złota dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach:

CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem karboksylowym zawieszonych w 25 mM buforze MES (kwas 2-[N-morfolino]etylosulfonowy) o pH=6 z dodatkiem karbodiimidu w ilości 10 mg/ml. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie wirowaniu przy 14 400 x g przez 30 minut. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nanocząstek Au zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów:

CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 30 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny,

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

Claims (4)

1. Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp, znamienny tym, że składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do ₂

240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² ₂ do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg amino modyfikowanych nanocząstek Au sprzęganych kowalencyjnie z równomolową mieszaniną 4 sond o wzorze 1 lub 2 modyfikowanych łącznikiem karboksylowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami równomolowej mieszaniny 4 sond o wzorze odpowiednio 2 lub 1 znakowanych biotyną.

2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.

3. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanego nanozłota sprzężonego z karboksy modyfikowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności Enterococcus spp, znamienny tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm² do 0,1 mg/mm² zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych łącznikiem aminowym nanocząstek Au o stężeniu 25 μg/ml z równomolową mieszaniną 4 sond o wzorze 1 lub 2 z wolną grupą karboksylową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki Au poddaje się koncentracji w procesie wirowania 14 400 x g przez 30 minut, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 μΡ200 μl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji, osad nanocząstek Au zawiesza się w 39-109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej równomolowej mieszaniny 4 sond o wzorze odpowiednio 2 lub 1 zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 μl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia

PL 221 293 B1 do temperatury pokojowej i 10-20 μΐ mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.