PL218070B1

PL218070B1 - Zastosowanie inhibitorów wazopeptydazy do leczenia i/lub zapobiegania nefropatii u chorych na cukrzycęi

Info

Publication number: PL218070B1
Application number: PL372992A
Authority: PL
Inventors: Stefan Schäfer; Wolfgang Linz; Markus Bleich; Jochen Huber
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2014-10-31
Also published as: WO2004002492A1; CA2490277A1; CR7667A; US20050171090A1; SV2004001560A; AU2003280440A1; JP2005533815A; ATE548040T1; TW200406214A; UY27869A1; AU2003280440B2; PT1519732E; MA27281A1; ZA200409382B; NO334811B1; CY1112905T1; EP1519732B1; RS52478B; AR040343A1; CN1665512A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitorów wazopeptydazy o wzorze II określonym w dalszej części opisu do wytwarzania leków do leczenia i/lub zapobiegania nefropatii u chorych na cukrzycę.

Enzym przekształcający angiotensynę (ACE) jest to dipeptydaza peptydylowa katalizująca przekształcenie angiotensyny I w angiotensynę II. Angiotensyna II jest czynnikiem zwężającym naczynia, który także stymuluje wydzielanie aldosteronu przez korę nadnercza. Zahamowanie czynności ACE zapobiega zarówno przekształceniu angiotensyny I w angiotensynę II, jak i metabolizmowi bradykininy, czego wynikiem jest obniżenie stężenia krążącej angiotensyny II, aldosteronu i podwyższenie stężenia krążącej bradykininy. Oprócz tych zmian neurohormonalnych, obserwuje się zmniejszenie oporności obwodowej i ciśnienia krwi, zwłaszcza u osobników z wysokim poziomem krążącej reniny. Do innych skutków farmakologicznych związanych z zahamowaniem ACE należą: regresja przerostu lewej komory, polepszenie klinicznych objawów niewydolności serca i zmniejszenie śmiertelności chorych na zastoinową niewydolność krążenia (CHF) lub dysfunkcję lewokomorową po zawale mięśnia sercowego.

Obojętna endopeptydaza (NEP) jest enzymem odpowiedzialnym za metabolizm przedsionkowego peptydu sodopędnego (ANP). Zahamowanie NEP skutkuje podwyższeniem stężenia ANP, co z kolei prowadzi do zwiększonego wydalania sodu z moczem, diurezy i spadku objętości wewnątrznaczyniowej, ilości krwi powracającej do serca z krążenia wielkiego i ciśnienia krwi. ANP jest uwalniany przez przedsionkowe komórki mięśniowe w odpowiedzi na rozciągnięcie przedsionka lub zwiększoną objętość wewnątrznaczyniową. Wykazano, że podwyższone stężenia ANP leżą u podstaw potencjalnego mechanizmu wyrównawczego w rozmaitych stanach chorobowych, włącznie z zastoinową niewydolnością krążenia, niewydolnością nerek, nadciśnieniem samoistnym i marskością wątroby.

Wydzielanie ANP przez przedsionkowe komórki mięśniowe powoduje rozszerzenie naczyń, diurezę, zwiększone wydalanie sodu z moczem oraz zahamowanie uwalniania reniny i wydzielania aldosteronu. W przeciwieństwie do tego, działanie angiotensyny II skutkuje zwężeniem naczyń, resorpcją sodu i wody i wytwarzaniem aldosteronu. Te dwa układy hormonów wzajemnie oddziaływują na siebie w sposób zwrotny lub równoważący, w wyniku czego utrzymują się normalne fizjologiczne odpowiedzi naczyniowe i hemodynamiczne.

W opisach patentowych US 5430145, EP 481522 ujawniono tricykliczne pochodne merkaptoacetyloamidowe o wzorze I, użyteczne jako inhibitory ACE i NEP, a więc przydatne w leczeniu i/lub zapobieganiu niewydolności serca i nadciśnieniu.

W opisie WO 02083671(będącym publikacją zgłoszenia międzynarodowego PCT/EP02/03668) opisano pochodne merkaptoacetyloamidowe o wzorach odpowiadających wzorom II-A, II-B i II-C według niniejszego zgłoszenia, sposób ich wytwarzania i ich zastosowanie do wytwarzania leków do leczenia m.in. niewydolności nerek. W opisie tym nie wskazano jednak żadnego powodu ani rodzaju choroby, z których ta niewydolność nerek by wynikała.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (II)

w którym:

R1 oznacza wodór, grupę -CH2OC(O)C(CH3)3 lub grupę (C1-C4)acylową;

R2 oznacza wodór, grupę -CH2O-C(O)C(CH3)3, grupę C1-C4-alkilową, grupę arylową, grupę (C1-C4-alkilo)arylową, lub grupę difenylometylową;

PL 218 070 B1

X oznacza grupę o wzorze -(CH2)n, w którym n oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1;

B1 i B2 oznaczają, niezależnie od siebie, wodór, grupę hydroksylową, grupę o wzorze -OR5, w którym R5 oznacza grupę C1-C4-alkilową, grupę arylową lub grupę -(C1-C4-alkilo)arylową, albo gdy B1 i B2 są przyłączone do sąsiednich atomów węgla, wtedy B1 i B2 razem ze wspomnianymi sąsiednimi atomami węgla tworzą pierścień benzenowy lub grupę metylenodioksylową, przy czym termin grupa arylowa odnosi się do grupy fenylowej lub grupy naftylowej niepodstawionej lub podstawionej 1-3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej grupę metylenodioksylową, grupę hydroksylową, grupę C1-C4-alkoksylową, fluor i chlor, do wytwarzania leku, do leczenia i/lub zapobiegania nefropatii u chorych na cukrzycę.

Korzystnie według wynalazku stosuje się związek o wzorze (II), w którym R1 oznacza acetyl. Korzystnie według wynalazku stosuje się związek o wzorze (II), w którym R1 oznacza wodór. Korzystnie według wynalazku stosuje się związek o wzorze (II), w którym B1 i/lub B2 oznaczają wodór.

Korzystnie według wynalazku stosuje się związek o wzorze (II), w którym X oznacza grupę -CH2. Korzystnie według wynalazku stosuje się związek przedstawiony wzorem (II-A):

w którym: R1 oznacza grupę acetylową lub wodór, oraz związek przedstawiony wzorem (II-B):

i związek przedstawiony wzorem (II-C)

PL 218 070 B1

Stosowany w niniejszym opisie termin „grupa C1-C4-alkilowa” odnosi się do nasyconego, prostego lub rozgałęzionego, jednowartościowego łańcucha węglowodorowego zawierającego jeden, dwa, trzy lub cztery atomy węgla, i obejmuje swym zakresem grupę metylową, grupę etylową, grupę propylową, grupę izopropylową, grupę n-butylową, grupę izobutylową, trzeciorzędową grupę butylową i grupy podobne.

Stosowany w niniejszym opisie termin „grupa C1-C4-alkoksylowa” odnosi się do jednowartościowego podstawnika złożonego z prostego lub rozgałęzionego łańcucha alkilowego zawierającego od 1 do 4 atomów węgla, związanego poprzez eterowy atom tlenu i mającego swe wolne wiązanie walencyjne pochodzące od eterowego tlenu, i obejmuje swym zakresem grupę metoksylową, grupę etoksylową, grupę propoksylową, grupę Izo-propoksylową, grupę butoksylową, grupę sec-butoksylową, grupę tert-butoksylową i grupy podobne.

Termin „grupa -(C1-C4-alkilo)arylowa” obejmuje swym zakresem grupę fenylometylową (grupę benzylową), grupę fenyloetylową, grupę p-metoksybenzylową, grupę p-fluorobenzylową i grupę p-chlorobenzylową.

Stosowany w niniejszym opisie termin „grupa acylowa” odnosi się do alifatycznych grup (C1-C4)acylowych. I tak, na przykład, grupę (C1-C4)acylową może stanowić taka grupa jak grupa formylowa lub grupa acetylowa.

Związki o wzorze II stosowane według wynalazku mogą występować w różnych postaciach stereoizomerycznych.

Stosowany w niniejszym opisie termin „postać stereoizomeryczna” jest to określenie ogólne, stosowane w odniesieniu do wszelkich izomerów poszczególnych cząsteczek, różniących się jedynie zorientowaniem swych atomów w przestrzeni. Termin ten obejmuje swym zakresem izomery optyczne (enancjomery), izomery geometryczne (cis/trans lub E/Z) i izomery związków z jednym, lub więcej niż jednym centrum chiralności, nie będące wzajemnymi odbiciami lustrzanymi (diastereoizomery).

Stosowne w niniejszym opisie symbole konfiguracyjne „R” i „S” używane są tak, jak się ich powszechnie używa w chemii organicznej w celu określenia specyficznej konfiguracji centrum chiralności. Symbol „R” (łac. rectus, prawy) odnosi się do konfiguracji centrum chiralności z uszeregowaniem pierwszeństwa grup zgodnym z ruchem wskazówek zegara (od najwyższego do drugiego najniższego) przy obserwacji wzdłuż wiązania w kierunku grupy o najniższym pierwszeństwie. Symbol „S” (łac. sinister, lewy) odnosi się do konfiguracji centrum chiralności z uszeregowaniem pierwszeństwa grup przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (od najwyższego do drugiego najniższego) przy obserwacji wzdłuż wiązania w kierunku grupy o najniższym pierwszeństwie. Pierwszeństwo grup oparte jest na regułach starszeństwa, według których ustalanie szeregu pierwszeństwa jest oparte w pierwszym rzędzie na liczbie atomowej (w kolejności malejących liczb atomowych). Wyszczególnienie i omówienie zasad pierwszeństwa zawarte jest w: „Stereochemistry of Organic Compounds” red. Ernest L. Eliel, Samuel H. Wilen i Lewis N. Mander, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork (1994).

Oprócz systemu (R)-(S), można także posługiwać się starszym od niego systemem D-L w celu określania konfiguracji absolutnej, zwłaszcza w odniesieniu do aminokwasów. W systemie tym, wzór projekcyjny Fischera jest tak zorientowany, że węgiel o numerze 1 łańcucha głównego znajduje się na górze. Przedrostek „D” stosuje się do przedstawienia konfiguracji absolutnej izomeru, w którym grupa funkcyjna (determinująca) znajduje się po prawej stronie węgla w centrum chiralności, a przedrostek „L” w przypadku izomeru, w którym znajduje się ona po lewej stronie.

Stosowany w niniejszym opisie termin „leczyć” lub „leczenie” oznacza jakiekolwiek postępowanie lecznicze i obejmuje swym zakresem, ale bez ograniczania się tylko do tych sformułowań: łagodzenie objawów, eliminowanie przyczyn objawów, czy to chwilowo, czy na stałe, albo zapobieganie lub spowalnianie pojawiania się objawów i postępu wspomnianej choroby, zaburzenia lub stanu chorobowego.

Jak to podano w powyższej części niniejszego opisu, termin „pacjent” odnosi się do ludzi oraz do zwierząt ciepłokrwistych, takich jak ssaki, dotkniętych konkretną chorobą, zaburzeniem lub stanem chorobowym. Rozumie się przy tym jednoznacznie, że termin ten obejmuje swym zakresem tak ludzi, jak i, przykładowo, świnki morskie, psy, koty, szczury, myszy, konie, bydło i owce.

Związki stosowane według wynalazku mogą występować w postaci ich soli farmaceutycznie dopuszczalnej. Stosowany w niniejszym opisie termin „sól dozwolona farmaceutycznie” w zamierzeniu dotyczy jakiejkolwiek soli (czy to już znanej czy też mającej być odkrytą w przyszłości) stosowanej przez specjalistę w tej dziedzinie techniki, która to sól jest nietoksyczną organiczną lub nieorganiczną solą addycyjną, nadającą się do użycia jako lek. Do przytoczonych dla objaśnienia zasad, które mogą tworzyć odpowiednie sole, należą: wodorotlenki metali alkalicznych lub wodorotlenki metali ziem alkaPL 218 070 B1 licznych, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia lub wodorotlenek magnezu; amoniak i aminy alifatyczne, cykliczne lub aromatyczne, takie jak metyloamina, dimetyloamina, trietyloamina, dietyloamina, izopropylodietyloamina, pirydyna i pikolina. Do przytoczonych dla objaśnienia kwasów, które mogą tworzyć odpowiednie sole, należą kwasy nieorganiczne, takie jak, na przykład, kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy i kwasy podobne, oraz kwasy organiczne, takie jak, na przykład, kwas octowy, kwas propionowy, kwas glikolowy, kwas mlekowy, kwas pirogronowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kwas fumarowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas askorbinowy, kwas maleinowy, kwas hydroksymaleinowy i kwas dihydroksymaleinowy, kwas benzoesowy, kwas fenylooctowy, kwas 4-aminobenzoesowy, kwas 4-hydroksybenzoesowy, kwas antranilowy, kwas cynamonowy, kwas salicylowy, kwas 4-amino-salicylowy, kwas 2-fenoksybenzoesowy, kwas 2-acetoksybenzoesowy, kwas migdałowy i kwasy podobne, a także organiczne kwasy sulfonowe, takie jak kwas metanosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy.

Termin „nośnik farmaceutyczny” odnosi się do znanych zaróbek farmaceutycznych użytecznych przy formułowaniu związków farmaceutycznie czynnych w postacie nadające się do podawania pacjentom, które to zaróbki są zasadniczo nietoksyczne i nie uczulające w warunkach stosowania leku. Dokładny udział ilościowy tych zaróbek wyznaczony jest rozpuszczalnością i właściwościami chemicznymi związku czynnego, wybraną drogą podawania, jak również typową praktyką farmaceutyczną.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek o wzorze (II) stosowany według wynalazku można podawać potrzebującemu tego pacjentowi wykorzystując rozmaite sposoby podawania, w tym doustnie, miejscowo, pozajelitowo, na przykład dożylnie, podskórnie lub doszpikowo. Następnie, kompozycje związków stosowanych według wynalazku można stosować donosowo, w postaci czopków doodbytniczych lub stosując kompozycje „szybkie (typu „flash), to znaczy umożliwiające rozpuszczenie się leku w ustach bez potrzeby użycia wody.

W lekach wytwarzanych ze związków stosowanych zgodnie z wynalazkiem mogą być stosowane same związki o wzorze II, jako substancje czynne lub w kombinacji z farmaceutycznie dozwolonymi nośnikami, podłożami lub rozcieńczalnikami, albo jako dawkę pojedynczą, albo jako dawki wielokrotne. Do odpowiednich farmaceutycznych nośników, podłoży i rozcieńczalników należą obojętne stałe rozcieńczalniki lub wypełniacze, jałowe roztwory wodne i rozmaite rozpuszczalniki organiczne. Kompozycje farmaceutyczne utworzone przez skombinowanie ze sobą substancji czynnych stanowiących związki stosowane według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dozwolonych nośników, podłoży i rozcieńczalników można następnie łatwo stosować jako najrozmaitsze postacie dawkowania, takie jak tabletki, proszki, pastylki do ssania, syropy, roztwory do wstrzykiwań itp. Jeżeli jest to pożądane, omawiane kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać składniki dodatkowe, takie jak środki aromatyzujące, środki wiążące, zaróbki itp.

I tak, w przeznaczeniu do stosowania doustnego, można stosować tabletki zawierające rozmaite zaróbki, takie jak cytrynian sodu, węglan wapnia i fosforan wapnia, razem z różnymi środkami rozsadzającymi, takimi jak skrobia, kwas alginowy i pewne złożone krzemiany, w połączeniu ze środkami wiążącymi, takimi jak poliwinylopirolidon, sacharoza, żelatyna i guma arabska.

Poza tym, przy tabletkowaniu częstokroć okazują się przydatne środki smarujące, takie jak stearynian magnezu, dodecylosiarczan sodu i talk.

Stałych kompozycji podobnego typu można używać także do wypełniania miękkich i twardych kapsułek żelatynowych. Do korzystnych materiałów nadających się do tego należą: laktoza lub cukier mlekowy, a także wielkocząsteczkowe glikole polietylenowe. Gdy przy stosowaniu doustnym pożądane są wodne zawiesiny lub eliksiry, wtedy zasadniczy czynny ich składnik można połączyć z rozmaitymi środkami słodzącymi lub aromatyzującymi, środkami koloryzującymi lub barwnikami oraz, jeżeli jest to pożądane, emulgatorami lub środkami utrzymującymi w zawiesinie, razem z rozcieńczalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol propylenowy, gliceryna i ich kombinacje.

Do stosowania pozajelitowego można używać kompozycje zawierające związki stosowane zgodnie z wynalazkiem w postaci roztworów w oleju sezamowym lub arachidowym, uwodnionym glikolu propylenowym, lub jałowych roztworów wodnych.

Takie roztwory wodne powinny być, jeżeli jest to konieczne, odpowiednio zbuforowane, a płynnemu rozcieńczalnikowi powinna być wpierw nadana izotoniczność przy użyciu użytego w wystarczającej ilości wodnego roztworu chlorku sodu lub glukozy.

Te poszczególne roztwory wodne w sposób szczególny nadają się do podawania drogą dożylną, domięśniową, podskórną i dootrzewnową. W związku z tym można dodać, że wszystkie

PL 218 070 B1 zastosowane tu jałowe środowiska wodne stają się łatwo dostępne dzięki wykorzystaniu typowych metod ich sporządzania znanych specjalistom w tej dziedzinie techniki.

Ogólnie, kompozycje zwierające związki stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem podaje się doustnie, pozajelitowo (na przykład dożylnie, domięśniowo, podskórnie lub doszpikowo) albo miejscowo.

W przypadku stosowania donosowego lub podawania przez wziewanie, jeden, lub większą ilość związków według wynalazku dogodnie dostarcza się, w postaci roztworu lub zawiesiny, wyciskanej lub pompowanej przez pacjenta z pojemnika wyposażonego w pompkę rozpylającą, albo w postaci aerozolu dozowanego z pojemnika pod ciśnieniem lub nebulizera, z odpowiednim propelentem, na przykład dichlorodifluorometanem, trichlorofIuorometanem, dichlorotetrafluoroetanem, ditlenkiem węgla lub innym stosownym gazem.

W przypadku aerozolu pod ciśnieniem, dawkę jednostkową można ustalić przez wyposażenie urządzenia w zawór dozujący, umożliwiający dostarczanie odmierzonej ilości. Pojemnik pod ciśnieniem lub nebulizer może zawierać roztwór lub zawiesinę związku czynnego. Kapsułki lub naboje (wykonane, na przykład z żelatyny) do użycia w inhalatorze lub insuflatorze można sformułować tak, że będą zawierać mieszaninę proszków złożoną ze związku według wynalazku i odpowiedniej podstawy proszkowej, takiej jak laktoza lub skrobia.

W przypadku stosowania przezskórnego (na przykład miejscowego) sporządza się rozcieńczone jałowe roztwory wodne lub częściowo wodne (zazwyczaj o stężeniu mieszczącym się w zakresie od 0,1% do 5%), skądinąd podobne do powyżej opisanych roztworów do podawania pozajelitowego.

Sposoby wytwarzania rozmaitych kompozycji farmaceutycznych zawierających określoną ilość składnika czynnego są znane specjalistom w tej dziedzinie techniki lub staną się im oczywiste w świetle niniejszego ujawnienia.

W celu zapoznania się z przykładowymi sposobami wytwarzania kompozycji farmaceutycznych patrz: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., wydanie XIX (1995).

Nefropatia

Nefropatia jest to przewlekła choroba określana jako nienormalność występująca w wydalaniu albuminy z moczem u cukrzyków i niecukrzyków. U ludzi zdrowych, ilość albuminy wydalanej z moczem wynosi 40 mg/24 godziny, lub jest mniejsza. Klinicznymi stanami nefropatii są: mikroalbuminuria, kliniczna nefropatia (albuminuria) i krańcowe stadium choroby nerek (ESRD).

Zwykłą postacią nefropatii jest nefropatia cukrzycowa. Nefropatia cukrzycowa rozwija się u 35-40% chorych na cukrzycę typu I i u 10-60% chorych na cukrzycę typu II, w zależności od poddawanej badaniu puli etnicznej, a w Stanach Zjednoczonych Ameryki jest najczęstszym powodem krańcowego stadium choroby nerek. Przyjmuje się, że nefropatia cukrzycowa stanowi rezultat hiperglikemii, czy to samej, czy w kombinacji z innymi czynnikami, takimi jak nadciśnienie i genetycznie uwarunkowana skłonność do choroby nerek.

Wykazano, że właściwa terapia przeciwciśnieniowa powoduje znaczące obniżenie współczynnika śmiertelności nerkowej i, być może, sercowo-naczyniowej u chorych na cukrzycę typu I z albuminurią, jak również zahamowanie tempa zmniejszania się prędkości filtracji kłębuszkowej u niektórych chorych z upośledzoną czynnością nerek [Lewis i in., N. Engl. J. Med., 329, 1456-1462 (1993)].

Tak więc, typowa opieka nad chorymi na nefropatię cukrzycową polega na intensywnej kontroli glikemicznej i normalizacji ciśnienia krwi przy użyciu przede wszystkim inhibitorów enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE), takich jak ramipryl.

Wykazano, że pewne inhibitory wazopeptydazy, takie jak omapatrylat, będący jednym z najwcześniej opracowanych i najwszechstronniej ocenionych inhibitorów wazopeptydazy zapewniają lepsze skutki działania ochronnego w stosunku do nerek niż same inhibitory ACE [Molinaro i in., Curr. Opin. Pharmacol., 2, 131-141 (2002)]. Chen i in. [Hypertension, 38, 187-191 (2001)] określili czynność nerek w ostrych warunkach leczenia przy użyciu omapatrylatu i fozynoprylanu, inhibitora ACE, i stwierdzili, że omapatrylat dawał silniejszą odpowiedź natriuretyczną niż inhibitor ACE. W innych badaniach, inhibitor wazopeptydazy CGS 30440 (Novartis, Szwajcaria) okazał się bardziej efektywny pod względem działania ochronnego w stosunku do nerek niż inhibitor ACE benazepryl [Cohen i in., J. Cardiovasc. Pharmacol., 32, 87-95 (1998)].

Obecnie stwierdzono, że inhibitory wazopeptydazy o wzorze (II) dają lepszy skutek działania ochronnego w stosunku do nerek jeśli chodzi o natężenie wydalania albuminy, a tym samym są użyteczne w leczeniu i/lub zapobieganiu nefropatii u cukrzyków i niecukrzyków, włącznie z nefropatią cukrzycową, zapaleniem kłębuszków nerkowych, stwardnieniem kłębuszków nerkowych, zespołem

PL 218 070 B1 nerczycowym, miażdżycopochodnym stwardnieniem nerki, mikroalbuminurią i krańcowym stadium choroby nerek.

Efekt działania związku (II-B) jest 6-8-razy większy od efektu działania zaobserwowanego dla inhibitora ACE, a mianowicie ramiprylu.

P r z y k ł a d 1

Zredukowanie proteinurii przez leczenie związkiem o wzorze (II-B).

Oznaczono wydalanie białka i kreatyniny w moczu szczurów ZDF, samców (ZDF Gmi fa/fa), i heterozygotycznych zwierząt kontrolnych (ZDF Gmi -/+), w wieku 10, 17, 27 i 37 tygodni. W innych grupach, szczurom z cukrzycą podawano w sposób ciągły albo ramipryl (1 mg/kg/dzień, woda do picia) albo związek o wzorze (II-B) (30 mg/kg/dzień, szczury karmione) w okresie od 10 do 37 tygodnia. Zwierzęta uśmiercono po upływie 37 tygodni i ich nerki przebadano histologicznie.

T a b e l a 1

Wydalanie z moczem albuminy i kreatyniny przez szczury otyłe, szczury chude, szczury traktowane ramiprylem i szczury traktowane związkiem o wzorze (II-B)

Wydaliny w moczu	Albumina mg/kg/h	Albumina/kreatynina mg/mmol
Tygodnie	0	7	17	27	0	7	17	27
				Grupa 1
				Otyłe
Średnia	0,35	1,78	9,24	14,23	55,27	404,78	975,60	1543,25
S	0,24	1,09	6,70	7,69	41,58	349,65	714,38	819,04
SEM	0,06	0,28	2,02	2,32	10,74	90,28	215,40	246,95
N	15	15	11	11	15	15	11	11
				Grupa 2
				Chude
Średnia	0,121	0,090	0,070	0,079	12,828	9,573	5,754	7,313
S	0,041	0,069	0,033	0,51	4,206	6,010	2,772	4,541
SEM	0,009	0,015	0,008	0,014	0,940	1,344	0,693	1,260
N	20	20	16	13	20	20	16	13
Test t	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000
				Grupa 4
				Ramipryl
Średnia	0,24	1,36	6,26	10,71	37,31	207,35	694,20	1077,88
S	0,12	1,28	4,71	7,20	17,20	198,42	510,20	742,86
SEM	0,03	0,33	1,42	2,17	4,44	51,23	153,83	223,98
N	15	15	11	11	15	15	11	11
Test t	0,122	0,338	0,242	0,209	0,133	0,067	0,300	0,178
				Grupa 7
				Związek (II-B)
Średnia	0,27	0,09	0,41	1,39	48,56	14,30	44,63	152,71
S	0,18	0,04	0,18	1,67	28,69	5,38	16,47	174,93
SEM	0,05	0,01	0,05	0,50	7,41	1,39	4,97	52,74
N	15	15	11	11	15	15	11	11
Test t	0,293	0,000	0,000	0,000	0,611	0,000	0,000	0,000

PL 218 070 B1

Wyniki badania histologicznego

W załączonych tabelach wyszczególniono podsumowanie stwierdzonych zmian w nerkach po leczeniu trwającym 6 miesięcy. Badaniu poddano następujące grupy zwierząt:

C1:	kontrola	szczury ZDF	chude
C2:	kontrola	szczury ZDF	otyłe
D1:	ramipryl	szczury ZDF	otyłe	1,0 mg/kg
D4:	związek (II-B)	szczury ZDF	otyłe	30 mg/kg

Stwierdzone zmiany histopatologiczne

- Komórki Armanni'ego-Ebsteina: w kanalikach nerkowych, wskazuje to na cukrzycowy stan metaboliczny.

- Stwardnienie kłębuszków nerkowych: wskazuje to na przewlekłe uszkodzenie nerek wynikłe z cukrzycowego stanu metabolicznego.

- Zanik: kanalik nerkowy: pospolite samoistne uszkodzenie zwyrodnieniowe nerek.

- Wałeczki krwinkowe: kanalik nerkowy - pospolite samoistne uszkodzenie nerek.

- Rozszerzenie: miedniczka nerkowa - pospolite samoistne uszkodzenie nerek. Uważa się, że jest to dziedziczna anomalia rozwojowa.

W chudych kontrolnych szczurach ZDF nie było komórek Armanni'ego-Ebsteina, natomiast były one obecne w każdej grupie potraktowanych otyłych szczurów ZDF.

Stwardnienia kłębuszków nerkowych nie stwierdzono w chudych kontrolnych szczurach ZDF i nie występowało ono także u zwierząt potraktowanych związkiem (II-B). Odpowiednio, u zwierząt tych, stwierdzono, występowanie z niewielką częstością, uszkodzeń zwyrodnieniowych, zaniku kanalików nerkowych i obecność wałeczków nerkowych w kanalikach.

Przy porównaniu z otyłymi kontrolnymi szczurami ZDF potraktowanymi ramiprylem lub MDL 100.240 nie wystąpiły żadne różnice pod względem częstości występowania stwardnienia kłębuszków nerkowych lub towarzyszących mu uszkodzeń zwyrodnieniowych. Wyniki te pokazują, ze leczenie przy użyciu związku (II-B) może zapobiegać rozwojowi „cukrzycowego” stwardnienia kłębuszków nerkowych i towarzyszących mu uszkodzeń zwyrodnieniowych. Uszkodzenia u otyłych kontrolnych szczurów ZDF miały charakter stanu raczej mniej ciężkiego.

Oprócz tego, u zwierząt potraktowanych związkiem (II-B) stwierdzono wystąpienie, z dużą częstością, rozszerzenia miedniczek nerkowych.

Objaśnienie kodów i symboli

Kody i symbole używane na poziomie zwierząt:

KO = grupa terminalna uśmiercana

PL 218 070 B1

T a b e l a 2

Stwierdzone zmiany histologiczne
Liczba zwierząt ze zmianami stwierdzonymi w badaniu mikroskopowym: narząd/grupa/płeć Stan nekropsji: grupa terminalna uśmiercana (KO)
Płeć	Samce
1	2	3	4	5
Grupa z dawkowaniem	C1	C2	D1	D4
Liczba zwierząt/grupa z dawkowaniem	12	6	9	9
Nerki Liczba badanych	12	6	9	8
- Komórki Armanni'ego-Ebsteina	-	6	7	8
- Stwardnienie kłębuszków nerkowych	-	6	6	1
- Zanik: kanalik nerkowy	-	6	9	2
- Wałeczki krwinkowe: kanalik nerkowy	1	6	8	3
- Rozszerzenie: miedniczka nerkowa	3	2	5	7
Sumaryczna częstość zakwalifikowania: narząd/grupa/płeć Stan nekropsji: grupa terminalna uśmiercana (KO)
Płeć	Samce
Grupa z dawkowaniem	C1	C2	D1	D4
Liczba zwierząt/grupa z dawkowaniem	12	6	9	9
Nerki Liczba badanych	12	6	9	8
- Komórki Armanni'ego-Ebsteina
Stopień 1	-	2	1	-
2	-	3	6	5
3	-	1	-	5
Ogółem dotkniętych:	-	6	7	8
Średnia ciężkość:	-	1,8	1,9	2,4
- Stwardnienie kłębuszków nerkowych
Stopień 1	-	1	-	1
2	-	3	4	-
3	-	2	2	1
Ogółem dotkniętych:	-	6	6	1
Średnia ciężkość:	-	2,2	2,3	1,0
- Zanik: kanalik nerkowy
Stopień 1	-	2	4	1
2	-	2	4	-
3	-	1	1	1
4	-	1	-	-
Ogółem:	-	6	9	2
Średnia ciężkość:		2,2	1,7	2,0

PL 218 070 B1 cd. Tabeli 2

1	2	3	4	5
-Wałeczki krwinkowe: kanalik nerkowy
Stopień 1	1	1	1	2
2	-	4	7	1
3	-	1	-	-
Ogółem	1	6	8	3
Średnia ciężkość	1,0	2,0	1,9	1,3
- Rozszerzenie: miedniczka nerkowa
Stopień 2	3	-	1	1
3	-	1	2	5
4	-	1	2	1
Ogółem	3	2	5	7
Średnia ciężkość	2,0	3,5	3,2	3,0

T a b e l a 3

Wydalanie albuminy i kreatyniny w moczu przez szczury ZDF (Zucker Diabetic Fatty), szczury traktowane ramiprylem i szczury traktowane związkiem (II-B), zaczynając od wieku zwierząt wynoszącego 6 miesięcy.

Szczury ZDF są modelem cukrzycy typu II

	Albumina - kreatynina
mg/ml Podstawowe	Traktowanie 6 tygodni	Traktowanie 12 tygodni
Placebo
Szczury ZDF
Średnia	1330,99	1068,25	1193,47
S	797,55	778,81	633,10
SEM	230,23	224,82	182,76
N	12	12	12
Związek (II-B)
Szczury ZDF
Średnia	1330,99	135,08	100,86
S	797,55	40,28	59,27
SEM	230,23	11,63	17,11
N	12	12	12
Ramipryl
Szczury ZDF
Średnia	1330,99	1249,59	841,69
S	797,55	1036,03	1124,24
SEM	230,23	299,07	324,54
N	12	12	12

PL 218 070 B1

P r z y k ł a d 2

Oznaczono wydalanie albuminy i kreatyniny przez szczury Goto-Kakizaki (GK). Szczury GK są modelem cukrzycy typu II. Jedną grupę zwierząt pozostawiono bez potraktowania, inną potraktowano inhibitorem ACE/NEP o wzorze (II-B), a jeszcze inną potraktowano inhibitorem ACE w postaci ramiprylu.

T a b e l a 4

Wydalanie z moczem albuminy i kreatyniny przez szczury GK, szczury traktowane ramiprylem i szczury traktowane związkiem o wzorze (II-B), zaczynając od wieku zwierząt wynoszącego 6 miesięcy

	Albumina - kreatynina
mg/ml Podstawowe	Traktowanie 6 tygodni	Traktowanie 12 tygodni
Placebo
Szczury GK
Średnia	103,95	329,37	1183,19
S	71,42	230,17	637,71
SEM	20,62	66,44	184,09
N	12	12	12
Związek (II-B)
Szczury GK
Średnia	103,95	17,70	24,28
S	71,42	6,01	14,41
SEM	20,62	1,74	4,16
N	12	12	12
Ramipryl
Szczury GK
Średnia	103,95	161,71	244,89
S	71,42	112,42	146,00
SEM	20,62	32,5	44,0
N	12	12	12

Oznaczono wydalanie albuminy i kreatyniny przez szczury Wistar. Jedną grupę zwierząt pozostawiono bez potraktowania, inną potraktowano inhibitorem ACE/NEP o wzorze (II-B), a jeszcze inną potraktowano inhibitorem ACE w postaci ramiprylu. Szczury Wistar nie mają cukrzycy i w dorosłym życiu rozwija się u nich albuminuria oraz dochodzi do strukturalnych uszkodzeń nerek. Stąd też, szczury Wistar są modelem nefropatii niecukrzycowej.

Fig. 1 przedstawia związaną z wiekiem nefropatię niecukrzycową u szczurów Wistar potraktowanych placebo [nerka szczura potraktowanego placebo ukazująca umiarkowane uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowe (białkowe wałeczki krwinkowe w kanalikach nerkowych, zapalne nacieczenie komórek, zasadochłonne kanaliki nerkowe)].

PL 218 070 B1

T a b e l a 5

Wydalanie z moczem albuminy i kreatyniny przez szczury Wistar, traktowane ramiprylem i szczury traktowane związkiem o wzorze (II-B), zaczynając od wieku zwierząt wynoszącego 6 miesięcy

	Albumina - kreatynina
mg/ml Podstawowe	Traktowanie 6 tygodni	Traktowanie 12 tygodni
Placebo
Szczury Wistar
Średnia	130,45	149,82	290,10
S	285,53	321,12	265,69
SEM	90,29	64,10	73,69
N	10	13	13
Związek (II-B)
Szczury Wistar
Średnia	130,45	48,07	21,21
S	285,56	17,64	29,49
SEM	90,29	1,89	8,18
N	10	13	13
Ramipryl
Szczury Wistar
Średnia	130,45	84,27	28,40
S	285,53	171,87	146,47
SEM	90,29	49,62	42,28
N	10	13	12

W modelu niecukrzycowym związek o wzorze (II-B) wykazuje skutek działania ochronnego w stosunku do nerek znacząco lepszy od skutku działania ramiprylu, jak to wykazano porównaniem rozmiarów proteinurii.

Choroby związane z AGE Inkubacja białek lub lipidów z cukrami typu aldozy skutkuje nieenzymatyczną glikacją (glikozylowaniem) i utlenieniem grup aminowych, z utworzeniem adduktów Amadori'ego. Z upływem czasu, addukty te ulegają dodatkowym przegrupowaniom, odwodnieniom i sieciowaniu, z utworzeniem kompleksów znanych jako końcowe produkty zaawansowanej glikozylacji (AGE). Tworzenie AGE można opisać także jako reakcję Maillarda. Do czynników sprzyjających tworzeniu się AGE należą: opóźniony obrót metaboliczny białka (jak, na przykład, w amyloidozach), nagromadzanie się makrocząsteczek o wysokiej zawartości lizyny i wysoki poziom glukozy we krwi (jak, na przykład, w cukrzycy) [Hori i in., J. Biol. Chem., 270, 25752-25761 (1995)]. Sądzi się, że AGE są zaangażowane w szeregu zaburzeń, włączając w to komplikacje związane z cukrzycą i normalnym starzeniem się.

AGE wykazują zdolność wybiórczego i nasycalnego wiązania się z receptorami powierzchniowymi komórki usytuowanymi na komórkach śródbłonka układu mikronaczyniowego, monocytach i makro- fagach, włóknach mięśniowych gładkich, komórkach mezangium w kłębuszku i neuronach. Receptor końcowych produktów zaawansowanej glikozylacji (Advaced Glycated Endproducts, RAGE) jest członkiem nadrodziny immunoglobulin wśród cząsteczek powierzchniowych komórki.

Podwyższony poziom RAGE znajdowany jest w starzejących się tkankach [Schleicher i in., J. Glin Invest, 99, 457-468 (1997)] oraz w cukrzycowej siatkówce, układzie naczyniowym i nerce [Schmidt i in., Nature Med., 1002-1004 (1995)]. Zaktywowanie RAGE w różnych tkankach i narządach prowadzi do szeregu następstw patofizjologicznych. Sądzi się, że RAGE uczestniczy w szeregu różnych stanów, włączając w to: ostre i przewlekłe zapalenie [Hofmann i in., Cell, 97, 889-901 (1999)], rozwój późnych powikłań cukrzycowych, takich jak zwiększona przepuszczalność naczyń, nefropatia, miażPL 218 070 B1 dżyca tętnic i retynopatia w wyniku nagromadzania się AGE w nerkach i innych tkankach [Singh i in.,

Diabetologia, 44, 129-146 (2001)], jak również chorobę Alzheimera [Yan i in., Nature, 382, 685-691 (1996)], dysfunkcję zdolności do erekcji, nacieczenia przez nowotwór i przerzuty nowotworu [Taguchi i in., Nature, 405, 354-357 (2000)].

Ramipryl, będący inhibitorem AGE, znany jest z tego, że oddziaływuje na poziom końcowych produktów zaawansowanej glikacji w surowicy u pacjentów wysokiego ryzyka cierpiących na chorobę wieńcową; wynika to z badań stowarzyszenia HOPE („Zdrowie dla ludzi z całego świata”) (B. Kihovd, E.M. Hjerkinn, I. Seljeflot, T.J. Berg, A.A. Reikvam).

Obecnie stwierdzono, że związki o wzorze (II) znacząco redukują nagromadzanie się AGE w nerkach i w sercu. Stąd też, związki o wzorze (II) są również użyteczne, co nie jest istotą wynalazku, pod względem zapobiegania i/lub leczenia chorób metabolicznych związanych z końcowymi produktami zaawansowanej glikacji, a zwłaszcza powikłaniami cukrzycowymi, takimi jak neuropatia cukrzycowa, nefropatia cukrzycowa, retynopatia cukrzycowa, zawał mięśnia sercowego i kardiomiopatia cukrzycowa. Wartości AGE dla nerki oznaczono z zastosowaniem analizy przeprowadzonej metodą „dot biot” (testu kroplowego) [Stracke i in., Exp. Clin. Endocrinol. Diabets 109, 330-336 (2002) oraz metodą chromatografii cieczowej wysokosprawnej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) [Drusch i in., Food Chem., 65, 547-553 (1999)].

Traktowanie szczurów z cukrzycą związkiem o wzorze (II-B) powoduje znormalizowanie wartości AGE(CML) dla nerki, a traktowanie MDL100.240 znacząco obniża wartość CML.

P r z y k ł a d 4

Analiza „dot plot” (test kroplowy)

Próbki nerek do analizy „dot plot” pozyskiwano od szczurów samców w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych przez 7 tygodni związkiem (II-B) użytym w dawce 30 mg/kg/dzień i MDL 100.240 użytym w dawce 35 mg/kg/dzień. Z każdej grupy uśmiercono po trzy zwierzęta i pobrano z nich nerki, które natychmiast zamrożono w ciekłym azocie. Rozkruszenie nerek przeprowadzono w środowisku ciekłego azotu przy użyciu młynka zamrażalniczego (Freezer 6750, CS Analysetechnik GmbH).

W 1 ml wodnego roztworu chlorku soli buforowanego fosforanem (PBS zawierający 0,5 g/litr Tween 20, 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml) rozpuszczono 10 mg próbkę nerki. Otrzymany roztwór poddano dwukrotnie działaniu ultradźwiękowego dezintegratora komórek (45% mocy, Bandolin Sonoplus HD 2070), po czym wirowano w ciągu 20 minut przy 4000 obr/min. Supernatantu użyto do analizy „dot plot”.

Błonę nitrocelulozową umieszczono w aparacie do analizy „dot plot” i przemyto 2 razy po 100 μΐ TBS/studzienkę. W przypadku każdej próbki, 10 μg białka rozcieńczono w 100 μΐ TBS i wprowadzono na błonę nitrocelulozową (Amersham) (stężenie białka w próbkach oznaczano stosując DC Protein Assay, Bio Rad). Błonę inkubowano w temperaturze 4°C, przez noc, w TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% obj/obj Tween 20) z 5% odtłuszczonego mleka w proszku, a następnie w ciągu godziny w temperaturze pokojowej przy następującym stężeniu przeciwciała: anty-CML Oll (Biologo) 0,25 μg/ml, anty-CEL (Biologo) 0,25 μg/ml i anty-pentozydyna 012 (Biologo) 0,25 μg/ml. Po wyczerpującym przemyciu w TBST z 5% odtłuszczonego mleka w proszku, błony eksponowano, w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej, na znakowane peroksydazą alkaliczną przeciwciała przeciw IgG myszy (Dianova). Błony ponownie przemyto i eksponowano na system detekcyjny o wzmożonej chemofIuorescencji (Amersham), zgodnie z instrukcją wytwórcy. Fluorescencję względną oznaczono przy użyciu aparatu Fluor-Imager 595 (Molecular Dynamics) i skwantyfikowano z zastosowaniem oprogramowania ₅

Image-Quant. Otrzymane wyniki wyrażono jako fIuorescencję względną (rf) x 10⁵.

T a b e l a 6

Wartości dla AGE-podtyp CML w nerce szczurów w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240

Nerki szczurów anty-CML 011 w wieku 17 tygodni	n	Średnia rf x 10⁵	SEM rf x 10⁵	Test t	Wartość znacząca
Chude, kontrolne	3	32,20	1,22
Szczury ZDF	3	45,14	3,23	0,0199	*
ZDF, związek (II-B)	3	32,62	0,34	0,0182	*
ZFD, MDL 100.240	3	38,67	1,38	0,1389

PL 218 070 B1

T a b e l a 7

Wartości dla AGE-podtyp CEL w nerce szczurów w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240

Nerki szczurów anty-CEL w wieku 17 tygodni	n	Średnia rf x 10⁵	SEM rf x 10⁵
Chude, kontrola	3	54,49	2,55
Szczury ZDF	3	61,30	1,12
Szczury ZDF, związek (II-B)	3	50,24	0,46
ZDF, MDK 100.240	3	52,60	1,16

T a b e l a 8

Wartości dla AGE-podtyp pentozydyna w nerce szczurów w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240

Nerki szczurów anty-pentozydyna 012 w wieku 17 tygodni	n	Średnia rf x 10⁵	SEM rf x 10⁵
Chude, kontrola	3	52,78	1,65
Szczury ZDF	3	56,01	1,24
ZDF, związek (II-B)	3	44,99	1,61
ZDF, MDL 100.240	3	40,70	2,75

Wartości AGE-podtyp CML są znacząco wyższe w przypadku nerek szczurów ZDF w porównaniu ze szczurami kontrolnymi (P<0,05). Nie można było wykazać żadnych różnic między szczurami ZDF i szczurami kontrolnymi pod względem AGE-podtyp CEL i Age-podtyp pentozydyna. Szczury ZDF potraktowane związkiem o wzorze (II-B) wykazywały wartości AGE znacząco mniejsze w przypadku podtypów AGE CML, CEL i pentozydyna (P<0,05) w porównaniu ze szczurami ZDF nie potraktowanymi. Niższe wartości AGE dla podtypów CEL i pentozydyna można także stwierdzić u szczurów ZDF potraktowanych MDL 100.240 (P<0,01).

P r z y k ł a d 5

Chromatografia cieczowa wysokosprawna z odwróconymi fazami

Próbki nerek i serc do analizy metodą RP-HPLC pozyskiwano od szczurów samców w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych przez 7 tygodni związkiem (II-B) użytym w dawce 30 mg/kg/dzień i MDL 100.240 użytym w dawce 35 mg/kg/dzień. Z każdej grupy poddawano analizie po dwa zwierzęta. Rozkruszenie nerek i serc przeprowadzono w środowisku ciekłego azotu przy użyciu młynu zamrażalniczego (Freezer 6750, C3 Analysetechnik GmbH). Hydrolizy próbek narządów dokonano z udziałem 6 M kwasu chlorowodorowego (HCl), W temperaturze 110°C, w ciągu 12 godzin. Derywatyzację próbek przeprowadzono z zastosowaniem aldehydu ftalowego (OPA) i RP-HPLC, jak to opisali Drusch i In. [Food Chem., 65, 547-553 (1999)].

T a b e l a 9

Wartości AGE-podtypy CML w nerce szczurów w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240

RP-HPLC Nerki szczurów w wieku 17 tygodni	n (zwierząt)	Średnie stężenie CML (%)	SEM (%)
ZFD, placebo	2	100	0,27
Chude, kontrola	2	84	1,19
Związek (II-B)	2	55	3,83
MDL 100.240	2	60	10,15

PL 218 070 B1

T a b e l a 10

Wartości AGE-podtypy CML w nerce szczurów w wieku 37 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240. Wartości z P<0,05 uważano jako znaczące (*P<0,05; **P<0,01)

RP-HPLC Nerki szczurów w wieku 37 tygodni	n (zwierząt)	Średnie stężenie CML (%)	SEM (%)	Test t	Wartość znacząca
ZDF, placebo	2	100	2,00	0,010	*
Chude, kontrola	2	79	0,17
ZDF, związek (II-B)	2	58	4,46	0,014	*
ZFD, MDL 100.240	2	53	4,77	0,298

T a b e l a 11

Wartości AGE podtypy CML w nerce szczurów w wieku 17 tygodni, a mianowicie szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B) lub MDL 100.240. Wartości z P<0,05 uważano jako znaczące (*P<0,05; **P<0,01)

RP-HPLC Nerki szczurów w wieku 177 tygodni	n (zwierząt)	Średnie stężenie CML (%)	SEM (%)	Test t	Wartość znacząca
ZDF, placebo	2	100	3,74	0,015	*
Chude, kontrola	2	32	7,28
ZDF, związek (II-B)	2	26	10,95	0,025	*
ZFD, MDL 100.240	2	66	3,29	0,022	*

Szczury ZDF wykazują znacząco większe stężenie CML w nerce osobników w wieku 17 i 37 tygodni, i w sercu osobników w wieku 17 tygodni, w porównaniu ze szczurami kontrolnymi (P<0,05). Traktowanie związkiem o wzorze (II-B) powoduje zmniejszenie stężenia CML w nerce szczurów ZDF w wieku 17 i 37 tygodni, jak również stężenia CML w sercu szczurów wieku 17 tygodni. Także MDL 100.240 powoduje zmniejszenie stężenia CML w nerce i sercu szczurów ZDF w wieku 17 tygodni, ale nie w nerce szczurów ZDF w wieku 37 tygodni.

Oporność na insulinę

Związki o wzorze (II) wykazują także aktywność polegająca na uwrażliwianiu na insulinę. Działanie profilaktyczne związków o wzorze (II) w odniesieniu do nefropatii wskazuje także na to, że można spodziewać się czynnika uwrażliwiającego na insulinę z zapobieżeniem, odwróceniem, ustabilizowaniem lub opóźnieniem rozwoju mikroalbuminurii do albuminurii. Staje się tak, ponieważ mikroalbuminuria zwiastuje, jak się uważa, późniejszą nefropatię, zwłaszcza u chorych z klinicznymi dowodami zespołu przedcukrzycowej oporności na insulinę, alternatywnie zwanego zespołem X.

Jak dotychczas, nie badano zastosowania inhibitorów ACE lub wazopeptydazy do leczenia oporności na insulinę.

Obecnie stwierdzono, że związki o wzorze (II) znacząco obniżają poziom stężenia glukozy we krwi i wartości HbA1c a tym samym zmniejszają oporność na insulinę. HbA1c jest miarą długoterminowych wartości glukozy. Glikowana HbA1c stanowi wczesny AGE, tak zwany produkt Amadori'ego.

Wpływ związku o wzorze (II-B) na wartość HbA1c i glukozy we krwi jest podobny do działania MDL100.240 i obie te substancje wykazują niższe wartości niż inhibitor ACE ramipryl.

P r z y k ł a d 6

Analiza glukozy i HbA1c we krwi szczurów ZDF

Glukozę i HbA1c we krwi mierzono u szczurów samców wieku 10 i 17 tygodni, a mianowicie Zucker Diabetic Fatty (Genetic Model Inc.) i szczurów kontrolnych (Genetic Model Inc.) oraz szczurów ZDF, samców, traktowanych w ciągu 1 tygodni związkiem o wzorze (II-B) użytym w dawce 30 mg/kg/dzień, MDL 100.240 użytym w dawce 35 mg/kg/dzień i ramiprylem użytym w dawce 1 mg/kg/dzień. Z każdej grupy poddawano analizie po 15 zwierząt.

Próbki krwi do oznaczenia glukozy pobierano od szczurów ZDF przy użyciu typowych probówek do pobierania próbek. Po upływie 30 minut od pobrania próbek, oddzielono komórki za pomocą

PL 218 070 B1 wirowania i oznaczono ilościowo glukozę krwi w surowicy z zastosowaniem enzymatycznego in vitro testu z firmy Roche Diganostics GmbH (Gluco-quant, Roche Diagnostics GmbH), przy użyciu zautomatyzowanego analizatora dla chemii klinicznej (Boehringer Mannheim/Hitachi 912).

Do otrzymania próbek krwi do oznaczania HbA1c posłużono się rurkami kapilarnymi jednorazowego użytku. Wartości HbA1c otrzymano z hemolizowanych próbek pełnej krwi przy zastosowaniu turbidymetrycznego inhibicyjnego testu odporności (Tinaquant, Roche Diagnostics GmbH), a stężenie hemoglobiny oznaczono w drugim kanale zautomatyzowanego analizatora dla chemii klinicznej (Boehringer Mannheim/Hitachi 912). Stężenie HbA1c w procentach obliczano ze stosunku HbA1c do całej hemoglobiny.

T a b e l a 12

Stężenie glukozy we krwi 10- i 17-tygodniowych szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B), MDL 100.240 i ramiprylem

Glukoza we krwi	Szczury ZDF	Kontrola	ZDF Związek (II-B)	ZDF Ramipryl	ZDF MDL 100.200
Wiek (tygodnie)	10	17	10	17	10	17	10	17	10	17
Średnia (mM)	11,92	29,68	7,32	8,04	10,67	21,09	11,74	27,33	10,37	19,74
SEM (mM)	1,74	1,32	0,15	0,34	1,49	2,78	1,48	1,75	1,40	2,10
n (zwierząt)	15	15	20	20	15	15	15	15	15	15

T a b e l a 13

Wartości HbA1c u 10- i 17-tygodniowych szczurów ZDF, szczurów kontrolnych i szczurów ZDF traktowanych związkiem (II-B), MDL 100.240 i ramiprylem

HbA1c	Szczury ZDF	Kontrola	ZDF Związek (II-B)	ZDF Ramipryl	ZDF MDL 100.200
Wiek (tygodnie)	10	17	10	17	10	17	10	17	10	17
Średnia (mM)	6,14	9,96	4,49	4,62	5,69	8,24	5,66	9,48	5,60	7,19
SD (mM)	0,22	0,42	0,02	0,02	0,16	0,71	0,14	0,52	0,15	0,46
n (zwierząt)	15	15	20	20	14	15	15	15	15	15

Wartości stężenia glukozy i HbA1c we krwi są znacząco niższe u zwierząt kontrolnych w porównaniu ze szczurami ZDF (P<0,01). Szczury ZDF, samce, w wieku 17 tygodni, potraktowane MDL 100.240 lub związkiem (II-B) wykazują także znacząco niższe wartości stężenia glukozy i HbA1c we krwi w porównaniu ze szczurami ZDF nie potraktowanymi. Nie można było wykazać żadnej znaczniejszej różnicy pod względem glukozy lub HbA1c we krwi szczurów ZDF w wieku 17 tygodni potraktowanych ramiprylem i nie potraktowanych ramiprylem.

Zaburzenie czynności śródbłonka i płytki miażdżycowe

Na miażdżycorodnym modelu króliczym (króliki White New Zealand, karmione 0,25% cholesterolu + 3% oleju kokosowego) pokazano, że nawet krótki okres diety miażdżycorodnej, trwającej 6 tygodni, prowadzi do przewlekłego zaburzenia czynności śródbłonka, chociaż potem zwierzęta były utrzymywane w ciągu 3 miesięcy na normalnej diecie. We wszystkich eksperymentach znanych dotychczas zwierzęta karmiono w sposób ciągły przez cały czas dietą miażdżycorodną i wykazywały one niefizjologiczny, nadzwyczaj wysoki poziom cholesterolu, nieporównywalny z sytuacją u ludzi.

Zaburzeniom czynności śródbłonka, jak również zmianom miażdżycorodnym w naczyniach krwionośnych zapobiega, a także odwraca je, działanie inhibitora ACE/NEP w postaci związku o wzorze (II-B), po raz pierwszy poddanego badaniu i pokazanego w bezpośrednim porównaniu z inhibitorem ACE, ramiprylem. Jako miara zaburzenia czynności śródbłonka służyło zależne od śródbłonka zwiotczenie na wyizolowanych pierścieniach aorty królika, jak również uwalnianie tlenku azotu i ponadtlenku z komórek śródbłonka.

PL 218 070 B1

P r z y k ł a d 7

Wpływ długotrwałego traktowania inhibitorem ACE/NEP w postaci związku o wzorze (II-B) na zaburzenie czynności śródbłonka i płytki miażdżycowe u królików karmionych dietą miażdżycorodną

Grupy:

Standardowa (dn): 18-tygodniowa dieta normalna.

Miażdżycorodna (dm): 18-tygodniowa dieta miażdżycorodna (3% oleju kokosowego + 0,25% cholesterolu).

Dieta zmienna (dzm.): 6-tygodniowa dieta miażdżycorodna + 12- tygodniowa dieta normalna. Dieta zmienna + ramipryl (dzm+r): 6-tygodniowa dieta miażdżycorodna + 12-tygodniowa dieta normalna + ramipryl.

Dieta zmienna + związek (II-B) (dzm+zw): 6-tygodniowa dieta miażdżycorodna + 12-tygodniowa dieta normalna + związek (II-B).

T a b e l a 14

Zwiotczenie pierścieni aorty spowodowane acetylocholiną (ACh) w 4 wzrastających stężeniach (10^-8 mol/litr, 10^-7 mol/litr, 10^-6 mol/litr, 10^-5 mol/litr) po poprzedniej stymulacji fenylefryną (10^-7 mol/litr) (dane w %; x ± SEM)

ACh	10'⁸	10'⁷	10'⁶	10'⁵
Grupy	mol/litr	mol/litr	mol/litr	mol/litr
dn	11,65 ±1,55	52,68 ± 3,06	75,64 ± 2,83	83,81 ± 3,3
dm	2,18 ± 1,23	7,07 ± 2,76	11,82 ± 3,88	12,49 ± 4,1
	10,76 ± 2,29	* # ° ΐ	* # ⁰ ΐ	* # ° ΐ
dzm		43,33 ± 3,57	63,48 ± 2,89	69,41 ± 2,82
	13,08 ± 2,22	ΐ	ΐ # °	ΐ # °
dzm+r	19,9 ± 3,48	51,86 ± 4,43	77,34 ± 3,7	83,73 ± 4,03
dzm+zw		59,62 ± 6,43	76,4 ± 6,38	80,89 ± 6,82

* #

o ΐ

dm p<0,05 vs. dzm (dieta zmienna);

p<0,05 vs. dn (dieta normalna);

p<0,05 vs. dzm+r (dieta zmienna + ramipryl); p<0,05 vs. dzm+zw (dieta zmienna + związek II-B); (dieta miażdżycorodna).

T a b e l a 15

Dane dotyczące NO i ponadtlenku (O2) w nmol/litr; x ± SEM)

Grupy	NO (nM)	O2' (nM)
Dieta normalna (dn)	306,71 ± 36,16 *	29,41 ± 5,89
Dieta miażdżycorodna (dm)	167,77 ± 30,65	52,12 ± 7,06 #
Dieta zmienna (dzm)	174,39 ± 25,44	35,86 ± 7,49
Dieta zmienna + Ramipryl (dzm+r)	368,31 ± 42,25 *	48,09 ± 7,91 #
Dieta zmienna + związek (II-B) (dzm+zw)	329,19 ± 30,10 *	30,18 ± 6,00

* : p<0,05 vs. dzm, vs, dm;

# : p<0,05 vs. dzm, vs. dn, vs dzm+zw;

NO i O2^- stanowią diagnostyczne markery czynności śródbłonka; zwiększone zwiotczenie i podwyższenie poziomu NO są korzystne, podczas gdy wzmożone tworzenie się O2^- zahamowuje dobroczynne skutki działania NO.

Claims

1. Zastosowanie inhibitorów wazopeptydazy o wzorze (II):

w którym:

R1 oznacza wodór, grupę -CH2OC(O)C(CH3)3 lub grupę C1-C4-acylową;

R2 oznacza wodór, grupę -CH2O-C(O)C(CH3)3, grupę C1-C4-alkilową, grupę arylową, grupę -(C1-C4-alkilo)arylową, lub grupę difenylometylową;

X oznacza grupę o wzorze -(CH2)n, w której n oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1,

B1 i B2 oznaczają, niezależnie od siebie, wodór, grupę hydroksylową, grupę o wzorze -OR5, w którym R5 oznacza grupę C1-C4-alkilową, grupę arylową lub grupę -(C1-C4-alkilo)arylową, albo gdy B1 i Β2 są przyłączone do sąsiednich atomów węgla, wtedy B1 i B2 razem ze wspomnianymi sąsiednimi atomami węgla tworzą pierścień benzenowy lub grupę metylenodioksylową, przy czym termin grupa arylowa odnosi się do grupy fenylowej lub grupy naftylowej niepodstawionej lub podstawionej 1-3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej grupę metylenodioksylową, grupę hydroksylową, grupę C1-C4-alkoksylową, fluor i chlor, do wytwarzania leku:

do leczenia i/lub zapobiegania nefropatii u chorych na cukrzycę.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 oznacza acetyl.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 oznacza wodór.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że B1 i/lub B2 oznaczają wodór.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że X oznacza grupę -CH2.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze (II-A):

SR,

O OH (ll-A) w którym:

R1 oznacza grupę acetylową lub wodór,

PL 218 070 B1

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze (II-B):

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze (II-C):