PL216683B1

PL216683B1 - Sposób wytwarzania D-tagatozy z laktozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris wytwarzającego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus i izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c

Info

Publication number: PL216683B1
Application number: PL390076A
Authority: PL
Inventors: Marta Wanarska; Piotr Łukasz Hildebrandt; Józef Wojciech Kur
Original assignee: Blirt Spółka Akcyjna
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2014-05-30
Also published as: PL390076A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania D-tagatozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus i izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c.

D-tagatoza jest to naturalny, choć bardzo rzadko występujący w przyrodzie, monocukier wykazujący 92% słodkości sacharozy oraz 37,5% jej kaloryczności. Ponadto, D-tagatoza nie powoduje szybkiego wzrostu poziomu glukozy we krwi po spożyciu, zatem jest bezpieczna dla diabetyków, wykazuje właściwości prebiotyczne, nie powoduje próchnicy oraz redukuje płytkę nazębną. Wszystkie wymienione cechy sprawiają, że może być ona wykorzystywana jako substytut sacharozy w przemyśle spożywczym, m.in. do produkcji słodyczy, napojów bezalkoholowych oraz dietetycznej i prozdrowotnej żywności, jako środek słodzący dodawany do leków, a także kosmetyków, np. past do zębów, płynów do płukania ust i pomadek. Obecnie prowadzone są również badania kliniczne mające na celu potwierdzenie przydatności D-tagatozy do leczenia cukrzycy typu 2. Niewątpliwie największym problemem, uniemożliwiającym powszechne wykorzystanie D-tagatozy, jest wysoki koszt jej wytwarzania.

Znanych jest kilka sposobów wytwarzania D-tagatozy. Jednym z nich jest chemiczna izomeryzacja D-galaktozy w środowisku silnie alkalicznym (w obecności wodorotlenku wapnia) i w obecności katalizatora, np. CaCl2, według opisów patentowych amerykańskich, nr US5002612, US5078796.

W tych warunkach tworzy się nierozpuszczalny kompleks tagatozy z wodorotlenkiem wapnia. Reakcja ta jest silnie egzotermiczna i wymaga intensywnego chłodzenia, ponieważ w wysokiej temperaturze i zasadowym środowisku powstają niepożądane produkty uboczne. Uwolnienie D-tagatozy z kompleksu Ca(OH)₂!agatoza^H₂O zachodzi pod wpływem kwasu. Również na tym etapie mieszanina reakcyjna wymaga chłodzenia, aby zapobiec powstawaniu produktów ubocznych reakcji.

W kolejnym etapie roztwór tagatozy jest odsalany i zagęszczany. D-tagatozę otrzymuje się z zagęszczonego roztworu na drodze krystalizacji. W opisanej metodzie substrat do produkcji D-tagatozy - D-galaktoza otrzymywany jest na drodze enzymatycznej hydrolizy laktozy do D-glukozy i D-galaktozy z wykorzystaniem β-D-galaktozydazy i chromatograficznego rozdzielania cukrów.

W technologiach opartych na enzymatycznej konwersji D-galaktozy do D-tagatozy wykorzystuje się termostabilne izomerazy arabinozowe, np. izomerazę arabinozową Thermoanaerobacter mathranii o optymalnej temperaturze działania 65°C (US7052898, US6991923), czy izomerazę arabinozową Thermotoga neapolitana o optymalnej temperaturze działania 85°C (US6933138). Reakcja izomeryzacji wymaga zatem znacznych nakładów energetycznych na ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. Enzymy te wykazują maksymalną aktywność w granicach pH od 7 do 8 oraz wymagają obecności jonów Co²⁺ lub Mn²⁺ dla zachowania stabilności termicznej i wysokiej aktywności. D-galaktoza do reakcji izomeryzacji otrzymywana jest na drodze enzymatycznej hydrolizy laktozy. Mieszanina D-glukozy i D-galaktozy jest następnie rozdzielana chromatograficznie lub bezpośrednio poddawana reakcji z izomerazą arabinozową. Hydroliza laktozy i izomeryzacja D-galaktozy do D-tagatozy mogą też być prowadzone w jednej mieszaninie reakcyjnej, jednak w tym przypadku wymagane jest zastosowanie termostabilnej β-D-galaktozydazy, która zachowuje wysoką aktywność w warunkach optymalnych dla izomerazy arabinozowej (temperatura, pH) oraz nie podlega inhibicji w obecności jonów Mn²⁺ lub/i Co²⁺, jak również wysokiego stężenia D-glukozy (US6991923). D-galaktoza może być też otrzymywana poprzez enzymatyczną hydrolizę laktozy zawartej w permeacie serwatkowym i selektywną fermentację D-glukozy z wykorzystaniem drożdży Saccharomyces cerevisiae. Tak otrzymana galaktoza jest następnie izomeryzowana do D-tagatozy w reakcji katalizowanej przez izomerazę arabinozową (US6057135). Wszystkie opisane metody otrzymywania D-tagatozy są wieloetapowe oraz wymagają dużych ilości energii na chłodzenie lub ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. Ponadto, w metodach polegających na enzymatycznej izomeryzacji D-galaktozy do D-tagatozy wykorzystywane są dwa preparaty enzymatyczne, co znacznie podwyższa koszty całego procesu. Stąd, poszukuje się nowych prostych, wydajnych i tanich metod produkcji D-tagatozy.

Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty zgodnie z technologią według niniejszego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest jednoetapowy sposób otrzymywania D-tagatozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus i izomerazy arabinozowej Arthrohacter sp.22c.

Według wynalazku, sposób wytwarzania D-tagatozy z laktozy charakteryzuje się tym, że stosuje się rekombinantowy szczep drożdży produkujący β-D-galaktozydazę i preparat izomerazy arabinozowej.

PL 216 683 B1

Hodowlę rekombinantowego szczepu drożdży produkującego β-D-galaktozydazę prowadzi się w pożywce zawierającej laktozę, w obecności izomerazy arabinozowej.

Według wynalazku stosuje się laktozę zawartą w ubocznych produktach przemysłu mleczarskiego, korzystnie w serwatce lub permeacie serwatkowym.

Zgodnie z wynalazkiem, rekombinantowy szczep drożdży zdolny jest do metabolizowania D-glukozy i nie posiada zdolności metabolizowania D-galaktozy.

β-D-galaktozydazę wydziela się do pożywki hodowlanej lub pozostawia się w obrębie ściany komórkowej rekombinantowych drożdży, przy czym β-D-galaktozydaza wykazuje wysoką aktywność w warunkach wzrostu rekombinantowych drożdży. W rozwiązaniu według wynalazku, stosuje się β-D-galaktozydazę pochodzącą z bakterii Arthrobacter chlorophenolicus.

Według wynalazku przewidziano, że rekombinantowym szczepem drożdży jest rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchI. Według wynalazku może być także wykorzystany rekombinantowy szczep drożdży Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-p-galAohii.

W warunkach technologii według wynalazku, izomeraza arabinozowa wykazuje wysoką aktywność w warunkach wzrostu rekombinantowych drożdży. Stosuje się tu korzystnie izomerazę arabinozową z bakterii Arthrobacter sp.22c.

Nieoczekiwanie okazało się, że rekombinantowy szczep drożdży Pichia pastoris produkujący β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus otrzymany zgodnie ze sposobem wytwarzania D-galaktozy z laktozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris wytwarzająoego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus, zdolny jest do wzrostu w pożywce zawierającej laktozę jako jedyne źródło węgla. Korzystnie laktoza jest hydrolizowana do D-glukozy i D-galaktozy, przy ozym jedynie D-glukoza jest metabolizowana, zaś D-galaktoza pozostaje w pożywce hodowlanej. Korzystnie również, izomeraza arabinozowa Arthrobacter sp.22c wykazuje wysoką aktywność w temperaturze i pH wzrostu drożdży Pichia pastoris. Szczególnie korzystnie, hydroliza laktozy, utylizaoja D-glukozy i izomeryzaoja D-galaktozy do D-tagatozy mogą być prowadzone w jednej mieszaninie reakcyjnej, w temperaturze ok. 30°C.

Realizację wynalazku stanowi metoda otrzymywania D-tagatozy z laktozy charakteryzująca się tym, że prowadzi się hodowlę rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa^-galAchI, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris GS115 zawierające pod kontrolą promotora konstytutywnego gen kodujący β-D-galaktozydazę Arthrohacter chlorophenolicus oznaczoną jako i w postaci fuzji translacyjnej z sekwencją sekrecji a-faktora S. cerevisiae zintegrowany z genomem drożdżowym, otrzymanego według sposobu otrzymywania D-galaktozy z laktozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus, w pożywce zawierającej laktozę, na przykład w serwatce lub w permeacie serwatkowym. Do hodowli dodaje się również preparat izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c. Hodowlę prowadzi się w temperaturze ok. 30°C, a następnie izoluje się i oczyszcza D-tagatozę z płynu pohodowlanego.

Realizację wynalazku stanowi także metoda otrzymywania D-tagatozy z laktozy charakteryzująca się tym, że prowadzi się hodowlę rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-ji-galAchII, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris GS115 zawierające pod kontrolą promotora konstytutywnego gen kodujący β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus oznaczoną jako ii w postaci fuzji translacyjnej z sekwencją sekrecji a-faktora S. cerevisiae zintegrowany z genomem drożdżowym, otrzymanego na drodze sposobu wytwarzania D-galaktozy z laktozy, z wykorzystaniem rekombinatowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus, w pożywce zawierającej laktozę, np. w serwatce lub permeacie serwatkowym. Do hodowli dodaje się również wymieniony wyżej preparat izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c. Hodowlę prowadzi się w temperaturze ok. 30°C, a następnie izoluje się i oczyszcza D-tagatozę z płynu pohodowlanego.

Rozwiązanie według wynalazku pozwoliło opracować nową jednoetapową metodę otrzymywania D-tagatozy z laktozy zawartej w ubocznych produktach przemysłu mleczarskiego, przy czym hydroliza laktozy, utylizacja D-glukozy i izomeryzacja D-galaktozy do D-tagatozy przebiegają w jednej mieszaninie reakcyjnej.

Przedmiot wynalazku objaśniony został bliżej w poniższych przykładach wykonania.

PL 216 683 B1

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchI

W celu otrzymania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchI, uzyskuje się plazmid ekspresyjny o symbolu pGAPZa-3-galAchI i sekwencji nukleotydowej SEQ ID No.: 4. W pierwszym etapie amplifikuje się fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze SEQ ID No.: 1 i symbolu FAchBSal (0,2 μΜ) oraz o wzorze SEQ ID No.: 2 i symbolu RAchBXbH (0,2 μΜ), na matrycy genomowego DNA wyizolowanego z komórek Arthrohacter chlorophenolicus (DSM No.: 12829), w buforze zawierającym: 10 mM Tris-HCl pH = 8,8, 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,15% Triton Χ-100, 200 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., stosując następujący profil temperaturowo-czasowy: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 68°C - 1 min, 72°C - 2 minuty) 30 cykli, 72°C - 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze SEQ ID No.: 3, który oczyszcza się na drodze precypitacji alkoholowej i trawi enzymami restrykcyjnymi SalI i XbaI, po czym liguje z DNA wektora plazmidowego pGAPZa β (Invitrogen) trawionym enzymami restrykcyjnymi XhoI i XbaI, z wykorzystaniem ligazy DNA faga T4 w temperaturze 16°C przez 1 godzinę. Mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki kompetentne Escherichia coli TOP10F' i wysiewa na niskosolne podłoże LA (1%^pepton K, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 1,5% agar) o pH = 7,5 z dodatkiem zeocyny (25 μg/ml). Następnie izoluje się DNA plazmidowe z hodowli płynnej rekombinantowego szczepu Escherichia coli uzyskując plazmid ekspresyjny o symbolu pGAPZa-β-galAchI i sekwencji SEQ ID No.; 4. W kolejnym etapie wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji SEQ ID No.: 4 i symbolu pGAPZa^-galAchI powstałą w wyniku trawienia DNA tego plazmidu enzymem restrykcyjnym AvrII. Komórki drożdży wysiewa się na podłoże YPDS (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% agar, 2% D-glukoza, 1 M sorbitol) zawierające 100 μg/ml zeocyny. Następnie otrzymane kolonie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pGAPZa^-galAchI przesiewa się na podłoże YPD (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% agar, 2% D-glukoza) z dodatkiem 100 ąg/ml zeocyny. W celu sprawdzenia obecności genu β-D-galaktozydazy A. chlorophenolicus w obrębie genomu Pichia pastoris GS115 pGAPZa^-galAchl wykonuje się izolację genomowego DNA z komórek drożdży, po czym amplifikuje się DNA z zastosowaniem starterów o sekwencjach SEQ ID No.: 1 i 2 oraz o symbolach odpowiednio FAchBSal i RAchBXbH otrzymując produkt PCR o wielkości 2045 pz.

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa^-galAchII

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pGAPZa^-galAchll, otrzymuje się plazmid ekspresyjny o symbolu pGAPZa^-galAchII i sekwencji nukleotydowej SEQ ID No.: 8. W pierwszym etapie amplifikuje się fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze SEQ ID No.: 5 i symbolu F1004Sal (0,2 μΜ) oraz o wzorze SEQ ID No.: 6 i symbolu R1004Xba (0,2 μΜ), na matrycy genomowego DNA wyizolowanego z komórek Arthrobacter chlorophenolicus (DSM No.: 12829), w buforze zawierającym: 10 mM Tris-HCl pH = 8,8, 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 200 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., stosując następujący profil temperaturowo-czasowy: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 69°C - 1 minuta, 72°C - 3 minuty) 30 cykli, 12°C - 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje sie fragment DMA o wzorze SEQ ID No.: 7, który oczyszcza się na drodze precypitacji alkoholowej i trawi enzymami restrykcyjnymi SalI i XbaI, po czym liguje z DNA wektora plazmidowego pGAPZa β (Invitrogen) trawionym enzymami restrykcyjnymi XhoI i XbaI, z wykorzystaniem ligazy DNA faga T4 w temperaturze 16°C przez 1 godzinę. Mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki kompetentne Escherichia coli TOP10F' i wysiewa na niskosolne podłoże LA (1% pepton K, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 1,5% agar) o pH = 7,5 z dodatkiem zeocyny (25 ąg/ml). Następnie izoluje się DNA plazmidowe z hodowli płynnej rekombinantowego szczepu Escherichia coli uzyskując plazmid ekspresyjny o symbolu pGAPZa^-galAchll i sekwencji SEQ ID No.: 8. W kolejnym etapie wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji SEQ ID No.: 8 i symbolu pGAPZa^-galAchll powstałą w wyniku trawienia DNA tego plazmidu enzymem restrykcyjnym AvrII. Komórki drożdży wysiewa się na podłoże YPDS (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% agar, 2% D-glukoza, 1 M sorbitol) zawierające 100 ąg/ml zeocyny. Następnie otrzymane kolonie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris

PL 216 683 B1

GS115 pGAPZa-3-galAchll przesiewa się na podłoże YPD (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% agar, 2% D-glukoza) z dodatkiem 100 ąg/ml zeocyny. W celu sprawdzenia obecności genu β-D-galaktozydazy A. chlorophenolicus w obrębie genomu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchII wykonuje się izolację genomowego DNA z komórek drożdży, po czym amplifikuje się DNA z zastosowaniem starterów o sekwencjach SEQ ID No.: 5 i 6 oraz o symbolach odpowiednio F1004Sal i R1004Xba otrzymując produkt PCR o wielkości 3039 pz.

P r z y k ł a d 3

Otrzymywanie izomerazy arabinozowej Arthrohacter sp.22c

W celu otrzymania izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c, w pierwszym etapie uzyskuje się plazmid ekspresyjny o symbolu pET30araA22c i sekwencji SEQ ID No.: 12. W tym celu amplifikuje się fragment DNA kodujący izomerazę arabinozową Arthrobacter sp.22c z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach F22cNdemut i wzorze SEQ ID No.: 9 oraz R22cHind i wzorze SEQ ID No.: 10, na matrycy genomowego DNA Arthrobacter sp.22c w buforze zawierającym: 10 mM Tris-HCl pH = 8,8, 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 200 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., stosując następujący profil temperaturowo-czasowy reakcji: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 60°C 1 minuta, 72°C - 1,5 minuty) 30 cykli, 72°C - 5 minut. W wyniku reakcji PCR uzyskuje się fragment DNA o wzorze SEQ ID No.: 11, który oczyszcza się na drodze precypitacji etanolowej, trawi enzymami restrykcyjnymi NdeI i HindIll, a następnie liguje z DNA wektora plazmidowego pET-30 Ek/LIC (Novagen) trawionym, tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki kompetentne E. coli TOP10F' i wysiewa na szalki Petriego z podłożem LA (1% pepton K, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% NaCl, 1,5% agar) zawierającym 25 μg/ml kanamycyny. W wyniku izolacji plazmidowego DNA z otrzymanych kolonii bakteryjnych uzyskuje się plazmid ekspresyjny o symbolu pET30araA22c i wzorze SEQ ID No.: 12, co potwierdza się przez sekwencjonowanie DNA metodą Sangera. W następnym etapie otrzymuje się rekombinantowy szczep Escherichia coli o symbolu Escherichia coli BL21(DE3)pLysS pET30araA22c na drodze transformacji komórek Escherichia coli BL21(DE3)pLysS kolistą formą DNA plazmidu ekspresyjnego o sekwencji SEQ ID No.: 12 i symbolu pET30araA22c. Komórki bakterii wysiewa się na podłoże LA zawierające 25 ąg/ml kanamycyny i 34 μg/ml chloramfenikolu, a następnie uzyskane kolonie rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21(DES)pLysS pET30araA22c wykorzystuje się do biosyntezy izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c. W tym celu prowadzi się hodowlę komórek Escherichia coli BL21(DE3)pLysS pET30araA22c w pożywce LB (1% pepton K, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% NaCl) zawierającej 25 μg/ml kanamycyny i 34 μg/ml chloramfenikolu w 37°C przez 16-18 h. Następnie tą hodowlą zaszczepia się pożywkę o identycznym składzie w stosunku 1:50. Hodowle prowadzi sie w 30°C do uzyskania gęstości optycznej OD600 = 0,3-0,4 i indukuje się ekspresję genu izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c przez dodanie IPTG (izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozydu) do 1 mM końcowego stężenia w pożywce. Hodowlę prowadzi się dalej w tych samych warunkach przez 6 h, po czym oddziela się komórki bakterii od pożywki na drodze wirowania. Osad komórkowy zawiesza się w 20 mM roztworze buforowym K2HPO4/KH2PO4; o pH = 6,0 zawierającym 50 mM KCl i zamraża w ok. -20°C. Następnie zawiesinę komórek rozmraża się w temperaturze pokojowej i poddaje dezintegracji za pomocą ultradźwięków. Przeprowadza się 4 cykle dezintegracji trwające po 0,5 minuty przy amplitudzie drgań 5 ąm. Izomerazę arabinozową Arthrohacter sp.22c oczyszcza się metodą chromatografii jonowymiennej z wykorzystaniem słabego i silnego anionitu. Białko wymywa się z kolumny gradientem stężenia KCl. Otrzymane frakcje zawierające oczyszczony enzym dializuje się wobec 100 mM roztworu NH4HCO3, a następnie suszy ze stanu zamrożenia pod obniżonym ciśnieniem.

P r z y k ł a d 4

Otrzymywanie D-tagatozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZα-β-galAchl i izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c

Uzyskuje sie rekombinantowy szczep drożdży Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchI zgodnie z przykładem 1, według sposobu otrzymywania D-galaktozy z laktozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydazę Arthrobaeter chlorophenolicus. Następnie otrzymuje się izomerazę arabinozową Arthrobaeter sp.22c według przykładu 3. W kolejnym etapie prowadzi się hodowlę komórek drożdży Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchI w pożywce YPD (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% D-glukoza) przez 30-36 h w 30°C. Otrzymaną hodowlą zaszczepia się permeat serwatkowy w ilości 15%y/v. Hodowle prowadzi się w 30°C z wytrząsaniem. Po 48 h dodaje sie preparat izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c do końco6

PL 216 683 B1 wego stężenia w mieszaninie 0,2 mg/ml i dalej prowadzi hodowlę, pobierając co 24 h próbki i określając w nich stężenie laktozy, galaktozy i tagatozy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem kolumny Aminex HPX-87C (Bio-Rad) i detektora refraktometrycznego. W przypadku 6,5% początkowego stężenia laktozy w permeacie serwatkowym, po upływie 144 h otrzymuje się 0,5% stężenie laktozy 1,7% stężenie galaktozy i 0,74% stężenie tagatozy w mieszaninie pohodowlanej.

P r z y k ł a d 5

Otrzymywanie D-tagatozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-e-galAchll i izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c

Uzyskuje się rekombinantowy szczep drożdży Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchll według przykładu 2, zgodnie ze sposobem otrzymywania D-galaktozy z laktozy z wykorzystaniem rekombinantowego szczepu drożdży Pichia pastoris produkującego β-D-galaktozydaze Arthrohacter chlorophenolicus. Następnie otrzymuje się izomerazę arabinozowa Arthrobacter sp.22c zgodnie z przykładem 3. W kolejnym etapie prowadzi się hodowlę komórek drożdży Pichia pastoris GS115 pGAPZa-3-galAchll w pożywce YPD (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% D-glukoza) przez 30-36 h w 30°C. Otrzymaną hodowla zaszczepia się permeat serwatkowy w ilości 15% v/v. Hodowlę prowadzi się w 30°C z wytrząsaniem. Po 48 h dodaje się preparat izomerazy arabinozowej Arthrobaeter sp.22c do końcowego stężenia w mieszaninie 0,2 mg/ml i dalej prowadzi hodowlę, pobierając co 24 h próbki i określając w nich stężenie laktozy, galaktozy i tagatozy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem kolumny Aminex HPX-87C (Bio-Rad) i detektora refraktometrycznego. W przypadku 6,5% początkowego stężenia laktozy w permeacie serwatkowym, po upływie 144 h otrzymuje się 0,3% stężenie laktozy, 1,5% stężenie galaktozy i 0,78% stężenie tagatozy w mieszaninie pohodowlanej, w której obecne są również galaktooligosacharydy.

PL 216 683 B1

Lista sekwencji

SEQ ID No.: I

Symbol: FAchBSal

Starter DNA

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' ATAGTCGACAAAAGAATGGCAACGCAGGAAATTAACCGTCCG 3'

SEQ ID No.: 2

Symbol: RAchBXbH

Starter DNA

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' CTGAAGCTTCTAGACTAGCCCTCCCTGATCACCGCAATGC 3'

SEQ ID No.: 3

Symbol: sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA otrzymanego w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o symbolach FAchBSal i RAchBXbH

Długość: 2045 pz

Topologia: cząsteczka liniowa dsDNA

ATAGTCGACAAAAGAATGGCAACGCAGGAAATTAACCGTCCGGCAAGTGTTTGGAGCAACGTCGAA

GGCCTCGGTTTCGGCGGCGACTACAACCCCGAACAGTGGCCCGTGAGCGTGCGGCTGGAGGACCTC

GAGCTGATGCAGGAAGCCGGCGTGAACTTCCTGAGCGTGGGCATCTTTTCCTGGGCCCTGCTGGAA

CCGGTTGAGGGCCAGTACGATTTCGGCTGGCTTGATGAGGTGCTGGACAACCTCGCAGGCATCGGC

GTCAGGGTTGCCCTCGCCACCGCCACCGCCGCTCCCCCGGCGTGGCTGGTCCGCAAGCATCCGGAA

ATCCTGCCGGTCACCGCTGACGGAACCGTGCTGGGACCGGGCTCACGGCGGCACTACACGCCGTCG

TCGGCCGCCTACCGGCGCTACGCCACGGGCATCACGCGGGTCCTCGCCGAACGATACAAGGACCAT

CCGGCGCTGGCGCTCTGGCACGTGGACAACGAGCTGGGTTGCCACATTTCCGAGTTCTACGGCAAA

GAGGACGCAGCCGCTTTCCGCAGTTGGCTGGAACGGCGTTACGGGAGCATTGACGCCCTCAACGCG

TCCTGGGGCACCGCGTTCTGGAGCCAGAACTACGCATCGTTCGAAGAAATCCTGCCGCCCTCAGTT

GCCCCCAGCACGCTGAACCCGGGGCAGCAGCTCGATTTCCAGCGCTTCAATTCGTGGGCGCTGATG

GATTACTACCGCGAACTCGTGGCAGTGCTCCGCGAGGTGACCCCGGAGGTTCCCTGCACCACCAAC

CTCATGGCCTCCAGCGCCACGAAGTCCATGGACTACTTCAGCTGGGCCAAGGATCTTGACGTCATC

GCCAACGACCACTACCTCGTGGCTGCCGACCCCGAACGGCACATCGAACTCGCGTTCAGCGCGGAC

CTGACCCGGGGCATTGCGGGCGGTGACCCGTGGATCCTAATGGAACATTCGACGTCGGCCGTCAAC

TGGCAACCCCGCAACCAGCCGAAGATGCCCGGCGAAATGCTCCGGAACTCGCTGGCGCACGTGGCC

CGCGGCGCGGATGCCGTGATGTTCTTCCAGTGGCGGCAGAGCTTCGCGGGGTCCGAAAAGTTCCAC

TCCGCCATGGTGCCGCACGGCGGCCGGGACACGCGCGTGTGGCGCGAGGTGGTGGACCTCGGGGCG

GCGCTGAAGCTGCTCGAACCGGTCCGCGGTTCCCGGGTGGAGTCCCGCGCGGCCATCGTCTTCGAT

TACGAGGCGTGGTGGGCCAGCGAGATCGATTCCAAGCCGAGCATCGACGTGAAGTACCTGGACCTG

CTGCGGGCCTTCCACCGTTCGCTGTTCCTGAAGGGCGTTTCCGTGGACATGGTCCACCCGTCTGCG

CCGCTCGAGGGCTACGACCTGGTGCTCGTCTGCACGCTCTACGCCGTATCCGACGCCGACGCCGGC

AACATCGCCGCGGCCGCCTCCGCTGGCGCCACCGTCCTGGTCAGCTACTTCAGCGGGATCGCGGAC

CCGCAGGACCACATTCGGCTCGGCGGGTATCCGGGCGCATTCCGGGACCTCCTTGGCGTGCGGGTG

GAAGAGTTCCACCCGCTGCTGGCCGGATCGCAGCTGAAGCTCGACGACGGCACCGTTGCCTCGGTC

TGGAGCGAGCACGTGCACCTCGCCGGCGCCGAAGCGGTCCAGGCGTTCACGGAGTATCCGCTGGAA

GGCGTCCCGGCCCTGACCCGCCGCTCCGTGGGCGCCGGCGCTGCCTGGTACCTGGCCACCTTCCCG

GACAGCGACGGCATTGATGCGTTGGTGGAACGGCTGCTCGCCGAATCGGGCGTCTCCCCCGCGGCT

GCCGCCGACACCGGCGTCGAACTGGTCCGTCGGCGCTCGGCCGATGGGCAGCGCTTCCTGTTCGCC

PL 216 683 B1

ATCAACCACACCCGCTCCTCCGCCGCCGTCTCGGCCACAGGAACCGATTTGCTGACCGGGGAGCCC TTTGGCGGGTCCGTTCCGGCGGGCAGCATTGCGGTGATCAGGGAGGGCTAGTCTAGAAGCTTCAG SEQ ID No.: 4

Symbol: pGAPZa-p-galAchl

Wielkość: 5088 pz

Topologia: cząsteczka kolista dsDNA, plazmidowe

TCGACAAAAGAATGGCAACGCAGGAAATTAACCGTCCGGCAAGTGTTTGGAGCAACGTCGAAGGCC

TCGGTTTCGGCGGCGACTACAACCCCGAACAGTGGCCCGTGAGCGTGCGGCTGGAGGACCTCGAGC

TGATGCAGGAAGCCGGCGTGAACTTCCTGAGCGTGGGCATCTTTTCCTGGGCCCTGCTGGAACCGG

TTGAGGGCCAGTACGATTTCGGCTGGCTTGATGAGGTGCTGGACAACCTCGCAGGCATCGGCGTCA

GGGTTGCCCTCGCCACCGCCACCGCCGCTCCCCCGGCGTGGCTGGTCCGCAAGCATCCGGAAATCC

TGCCGGTCACCGCTGACGGAACCGTGCTGGGACCGGGCTCACGGCGGCACTACACGCCGTCGTCGG

CCGCCTACCGGCGCTACGCCACGGGCATCACGCGGGTCCTCGCCGAACGATACAAGGACCATCCGG

CGCTGGCGCTCTGGCACGTGGACAACGAGCTGGGTTGCCACATTTCCGAGTTCTACGGCAAAGAGG

ACGCAGCCGCTTTCCGCAGTTGGCTGGAACGGCGTTACGGGAGCATTGACGCCCTCAACGCGTCCT

GGGGCACCGCGTTCTGGAGCCAGAACTACGCATCGTTCGAAGAAATCCTGCCGCCCTCAGTTGCCC

CCAGCACGCTGAACCCGGGGCAGCAGCTCGATTTCCAGCGCTTCAATTCGTGGGCGCTGATGGATT

ACTACCGCGAACTCGTGGCAGTGCTCCGCGAGGTGACCCCGGAGGTTCCCTGCACCACCAACCTCA

TGGCCTCCAGCGCCACGAAGTCCATGGACTACTTCAGCTGGGCCAAGGATCTTGACGTCATCGCCA

ACGACCACTACCTCGTGGCTGCCGACCCCGAACGGCACATCGAACTCGCGTTCAGCGCGGACCTGA

CCCGGGGCATTGCGGGCGGTGACCCGTGGATCCTAATGGAACATTCGACGTCGGCCGTCAACTGGC

AACCCCGCAACCAGCCGAAGATGCCCGGCGAAATGCTCCGGAACTCGCTGGCGCACGTGGCCCGCG

GCGCGGATGCCGTGATGTTCTTCCAGTGGCGGCAGAGCTTCGCGGGGTCCGAAAAGTTCCACTCCG

CCATGGTGCCGCACGGCGGCCGGGACACGCGCGTGTGGCGCGAGGTGGTGGACCTCGGGGCGGCGC

TGAAGCTGCTCGAACCGGTCCGCGGTTCCCGGGTGGAGTCCCGCGCGGCCATCGTCTTCGATTACG

AGGCGTGGTGGGCCAGCGAGATCGATTCCAAGCCGAGCATCGACGTGAAGTACCTGGACCTGCTGC

GGGCCTTCCACCGTTCGCTGTTCCTGAAGGGCGTTTCCGTGGACATGGTCCACCCGTCTGCGCCGC

TCGAGGGCTACGACCTGGTGCTCGTCTGCACGCTCTACGCCGTATCCGACGCCGACGCCGGCAACA

TCGCCGCGGCCGCCTCCGCTGGCGCCACCGTCCTGGTCAGCTACTTCAGCGGGATCGCGGACCCGC

AGGACCACATTCGGCTCGGCGGGTATCCGGGCGCATTCCGGGACCTCCTTGGCGTGCGGGTGGAAG

AGTTCCACCCGCTGCTGGCCGGATCGCAGCTGAAGCTCGACGACGGCACCGTTGCCTCGGTCTGGA

GCGAGCACGTGCACCTCGCCGGCGCCGAAGCGGTCCAGGCGTTCACGGAGTATCCGCTGGAAGGCG

TCCCGGCCCTGACCCGCCGCTCCGTGGGCGCCGGCGCTGCCTGGTACCTGGCCACCTTCCCGGACA

GCGACGGCATTGATGCGTTGGTGGAACGGCTGCTCGCCGAATCGGGCGTCTCCCCCGCGGCTGCCG

CCGACACCGGCGTCGAACTGGTCCGTCGGCGCTCGGCCGATGGGCAGCGCTTCCTGTTCGCCATCA

ACCACACCCGCTCCTCCGCCGCCGTCTCGGCCACAGGAACCGATTTGCTGACCGGGGAGCCCTTTG

GCGGGTCCGTTCCGGCGGGCAGCATTGCGGTGATCAGGGAGGGCTAGTCTAGAACAAAAACTCATC

TCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTTAGCCTTAGAC

ATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGA

GGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACC

TATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTA

TCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTT

GGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCA

CACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCA

TCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGT

GTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCG

TCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTT

CTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTT

CATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTA

ATCTAAGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGT

PL 216 683 B1

GAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGG

AGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGG

TGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACAC

CCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCAC

GAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTT

CGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTCCG

ACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAAT

TAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTA

GACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTA

TATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCT

TGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATGTGAGCAA

AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCC

CCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA

GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCG

GATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATC

TCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACC

GCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG

CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGT

GGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTA

CCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTT

TTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTA

CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATGAGATCAGAT _{CTTTTTTGTAGAAA}r_{rGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCC}

GTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAA

TGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTT

ACTCTGCTGGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGG

TAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAA

TAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAAC

ACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACTTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCA

ATCAATTGAACAACTATTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAG

CATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTG

AAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACA

GCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGG

TATCTC

SEQ ID No.: 5

Symbol: F1004Sal

Starter DNA

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' ATAGTCGACAAAAGAATGCCTGTCCAGTCCCCCACAACGG 3'

SEQ ID No.: 6

Symbol: Rl004Xba

Starter DNA

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' GTCTCTAGACTACGGACGGACCCGCAGCACTACCG 3'

SEQ ID No.: 7

Symbol: sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA otrzymanego w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o symbolach F1004Sal i R1004Xba

PL 216 683 B1

Długość: 3039 pz

Topologia: cząsteczką liniowa dsDNA

ATAGTCGACAAAAGAATGCCTGTCCAGTCCCCCACAACGGTGTCGAATGCTGCTGCAAGTGATGCC

TCCGACTCTGTGCCGCGCAATCTTGAACTCGGCGCAGGAGGCGTTCTCGAGCTCTCCTCAGTGGCT

CCGGGGCGGGGTGCGCTTGCTCCCCGGGCCTATCTCGCCAGCGATGCGCCGCGGCTGTCCCTGAAC

GGCGACTGGCAGTTCCGCCTCAGCCCGGGCATCCGCAGCGCCCCCGCCGAGGGGTGGCAGCTGGGC

CAGGATCTGGACGGCTTCGAAACCCTGCCCGTTCCGTCCAGCTGGCCCATGCACGGGCACGGCGCA

CCGGCGTACACCAACATCCAGTTTCCGTTTGCCGTGGAACCCCCGCATGTGCCGGAAGCCAACCCT

ATTGGTGACCACCTCCTGACGTTCCACGCCGGCCCGGAGTTCTTCCCCAACGCACTGCTGCGTTTC

GACGGCATCGACTCCGCCGGCACGGTGTGGCTGAACGGCGTCGAACTCGGCACCACCCGCGGCAGC

CGCCTTGCCCACGAATTCGACGTCTCAGGAATCCTTACGGAAGGCAGCAACACCCTCGCCGTGCGG

GTGGCGCAGTTCTCGGCCGCCAGCTACGTGGAGGACCAGGACATGTGGTGGCTCCCGGGGATCTTC

CGGGACGTCACCCTTCAAGCCCGCCCTGCGGACGGCATAGACGACGTCTTCGTCCACGCTGACTAC

GACGCCGGCACAGGCGAAGGTGTGCTGCGCGTGGAGGCGAGCCGGGGCGGAAAAGCGATTGACGCC

GTCGTACGCGTTCCCGAACTGGACCTGGAGCTTAAGGCCGGCCAGGAGCACCGCCTGCCATCCGTA

GCGCCGTGGTCGGCAGAGGAGCCCCGCCTGTACGAAGCCACGGTCAGCACCCCGGCCGAAACGGTG

TCCTTGCAGCTGGGATTCCGCAGCATCACCATCGAAGACTCCCAGTTCAAGGTGAACGGGCGGCGG

ATCCTGCTGCGCGGGGTGAACCGCCACGAGCACCATCCCCGGCTGGGGCGCGTGGTTCCGCAGGAG

GTGATGGAGGCGGAGCTCAAGCTCATGAAGCAGCACAACATCAACGCAATCCGCACATCGCACTAC

CCGCCCCACCCAAAATTCCTTGCCCTGGCTGACCAGCTTGGTTTCTACGTCGTGCTCGAGTGCGAC

CTGGAAACGCACGGGTTCGAGAGCGCCGGCTGGGCCCAGAACCCGAGCGATGATCCCCAATGGGAG

GACGCCCTGCTGGACCGGATGCGCCGGACGGTGGAGCGGGACAAGAACCATGCAGCCGTCGTGATG

TGGTCGCTGGGCAACGAATCCGGGACCGGCCGGAACCTGGCCGCGATGTCGCGCTGGACCAAGGAC

CGCGACCCGTCCCGCCCCATCCACTACGAGGGTGACTGGTCCTCACCCTACGTTGACGTGTACTCC

CGCATGTACGCCAACCAGGCCGAGACTGCACTGATTGGACAGGGAACTGAGCCTCCACTCGATGAC

CCCGAGCTGGATGCCCGGCGCCGTGCCATGCCCTTCGTGCTGTGCGAATATGTTCACGCCATGGGC

AATGGCCCGGGAGGAATGACCGAGTACCAGGAACTCTTTGAACGCCACCCCAGGCTGATGGGCGGC

TTCGTCTGGGAGTGGCTGGAACACGGAATCGCCGTCCCCACGCCGGGTGGCGGTGAGCACTTCGCC

TATGGCGGTGATTTCGGTGAGGAAATTCACGACGGCAACTTCGTCACCGACGGACTGGTGGACGCC

AATCGCCAACCCCGGCCCGGCCTCCTCGACTTCAAGCGCGTCGTGGCGCCGCTGCGGATCCAGGTT

GCCGGGGACTGGTCCGGCTTCACCGTCCACAACGGACACGATTTCACCGACACGTCCCCGTTCAGC

TTCCAGTACACGGTGGAGGCCGACGGCGACACTATCGACGGCGGCACGGTGGAGGTTCCGCGCGTC

GCGCCGCAGTCCGCGGCCACAGTTGCGTTGCCCGCCGGCCTTCCGCACACGGACGGGCCGGCAGTC

CTCACCGTCAGCGCCGTTCTCACCGCTGCGACGTCCTGGGCCGGCACCGGCCACGAGATCGCCTGG

GGCCAGTCCGTCCGTGGCGTCGCGCGTGTTGAAGAGCCCCGCGCTGCTGAATCCGTGGCCGCCACT

GACGATGAGCTGCGGCTGGGCCCGGCGGTGTTCAGCAGGCTGACGGGGATGCCCACACGCATAGGC

GGCATCAGTGTGGCAAAGCTGGGGCTCTCGCTGTGGTGGCCCCCCACCGACAATGACCTGGGCAGG

GAATGGGGCGGCGCCGACCTCCGGCCCCTGGCCACCCAATGGAAGGATGCAGGGCTTGACCGGCTC

CATACCCGGCTGCTTGGCATTAGCGCTGAACGCACCGACGATGGCGGGGAGCGGCTCGTCACGAGG

ACCAGGGTGGGTGCCGCGGACAAACAGTTCGGGGTCCTTGTGGACTACACGTGGACCAGTGACGGG

GAATCGCTGGCGCTCCGAACCCAGGTCCGGCCGCAGGGATCCTGGGTCAACGCCGGATTTGAGGTG

GAGTGGGCCCGGATCGGCCTGGAACTGGTGCTGGACGGCGGGACGTCAGCGGTGAGCTGGTTCGGG

CAGGGACCGCACCAGGCTTATCCGGATACGGGGCAAGGCACGCGGACGGGATGGTTTTCCATGCCC

TTGGGTGACCTCGATGTTGAGTATGCGCGGCCCCAGGAGTCCGGTGCCCGCGCCGGTGTCCGCTCG

GCTGCCCTTGAGGTGGATGGCGCCACGTTGGACATCGCCGGCGAGCCCTTTGCCCTGACGGTACGC

CCCTACAGCCAGGCCGCACTCAACGAAGCAACCCACCGGCCTGACCTGGCAGCCGACGGGCGGACC

TACATCTACCTCGACAACGCCATGCGTGGTGTGGGCACCGGAGCCTGCGGTCCGGGTGTCCTCGAT

CCGTACCGCCTGCAGCCACGGGATGCCGACTTCACGGTAGTGCTGCGGGTCCGTCCGTAGTCTAGA

GAC

PL 216 683 B1

SEQ ID No.: 8

Symbol: pGAPZo-p-galAchll

Wielkość: 6087 pz

Topologia: cząsteczka kolista dsDNA, plazmidowe

TCGACAAAAGAATGCCTGTCCAGTCCCCCACAACGGTGTCGAATGCTGCTGCAAGTGATGCCTCCG

ACTCTGTGCCGCGCAATCTTGAACTCGGCGCAGGAGGCGTTCTCGAGCTCTCCTCAGTGGCTCCGG

GGCGGGGTGCGCTTGCTCCCCGGGCCTATCTCGCCAGCGATGCGCCGCGGCTGTCCCTGAACGGCG

ACTGGCAGTTCCGCCTCAGCCCGGGCATCCGCAGCGCCCCCGCCGAGGGGTGGCAGCTGGGCCAGG

ATCTGGACGGCTTCGAAACCCTGCCCGTTCCGTCCAGCTGGCCCATGCACGGGCACGGCGCACCGG

CGTACACCAACATCCAGTTTCCGTTTGCCGTGGAACCCCCGCATGTGCCGGAAGCCAACCCTATTG

GTGACCACCTCCTGACGTTCCACGCCGGCCCGGAGTTCTTCCCCAACGCACTGCTGCGTTTCGACG

GCATCGACTCCGCCGGCACGGTGTGGCTGAACGGCGTCGAACTCGGCACCACCCGCGGCAGCCGCC

TTGCCCACGAATTCGACGTCTCAGGAATCCTTACGGAAGGCAGCAACACCCTCGCCGTGCGGGTGG

CGCAGTTCTCGGCCGCCAGCTACGTGGAGGACCAGGACATGTGGTGGCTCCCGGGGATCTTCCGGG

ACGTCACCCTTCAAGCCCGCCCTGCGGACGGCATAGACGACGTCTTCGTCCACGCTGACTACGACG

CCGGCACAGGCGAAGGTGTGCTGCGCGTGGAGGCGAGCCGGGGCGGAAAAGCGATTGACGCCGTCG

TACGCGTTCCCGAACTGGACCTGGAGCTTAAGGCCGGCCAGGAGCACCGCCTGCCATCCGTAGCGC

CGTGGTCGGCAGAGGAGCCCCGCCTGTACGAAGCCACGGTCAGCACCCCGGCCGAAACGGTGTCCT

TGCAGCTGGGATTCCGCAGCATCACCATCGAAGACTCCCAGTTCAAGGTGAACGGGCGGCGGATCC

TGCTGCGCGGGGTGAACCGCCACGAGCACCATCCCCGGCTGGGGCGCGTGGTTCCGCAGGAGGTGA

TGGAGGCGGAGCTCAAGCTCATGAAGCAGCACAACATCAACGCAATCCGCACATCGCACTACCCGC

CCCACCCAAAATTCCTTGCCCTGGCTGACCAGCTTGGTTTCTACGTCGTGCTCGAGTGCGACCTGG

AAACGCACGGGTTCGAGAGCGCCGGCTGGGCCCAGAACCCGAGCGATGATCCCCAATGGGAGGACG

CCCTGCTGGACCGGATGCGCCGGACGGTGGAGCGGGACAAGAACCATGCAGCCGTCGTGATGTGGT

CGCTGGGCAACGAATCCGGGACCGGCCGGAACCTGGCCGCGATGTCGCGCTGGACCAAGGACCGCG

ACCCGTCCCGCCCCATCCACTACGAGGGTGACTGGTCCTCACCCTACGTTGACGTGTACTCCCGCA

TGTACGCCAACCAGGCCGAGACTGCACTGATTGGACAGGGAACTGAGCCTCCACTCGATGACCCCG

AGCTGGATGCCCGGCGCCGTGCCATGCCCTTCGTGCTGTGCGAATATGTTCACGCCATGGGCAATG

GCCCGGGAGGAATGACCGAGTACCAGGAACTCTTTGAACGCCACCCCAGGCTGATGGGCGGCTTCG

TCTGGGAGTGGCTGGAACACGGAATCGCCGTCCCCACGCCGGGTGGCGGTGAGCACTTCGCCTATG

GCGGTGATTTCGGTGAGGAAATTCACGACGGCAACTTCGTCACCGACGGACTGGTGGACGCCAATC

GCCAACCCCGGCCCGGCCTCCTCGACTTCAAGCGCGTCGTGGCGCCGCTGCGGATCCAGGTTGCCG

GGGACTGGTCCGGCTTCACCGTCCACAACGGACACGATTTCACCGACACGTCCCCGTTCAGCTTCC

AGTACACGGTGGAGGCCGACGGCGACACTATCGACGGCGGCACGGTGGAGGTTCCGCGCGTCGCGC

CGCAGTCCGCGGCCACAGTTGCGTTGCCCGCCGGCCTTCCGCACACGGACGGGCCGGCAGTCCTCA

CCGTCAGCGCCGTTCTCACCGCTGCGACGTCCTGGGCCGGCACCGGCCACGAGATCGCCTGGGGCC

AGTCCGTCCGTGGCGTCGCGCGTGTTGAAGAGCCCCGCGCTGCTGAATCCGTGGCCGCCACTGACG

ATGAGCTGCGGCTGGGCCCGGCGGTGTTCAGCAGGCTGACGGGGATGCCCACACGCATAGGCGGCA

TCAGTGTGGCAAAGCTGGGGCTCTCGCTGTGGTGGCCCCCCACCGACAATGACCTGGGCAGGGAAT

GGGGCGGCGCCGACCTCCGGCCCCTGGCCACCCAATGGAAGGATGCAGGGCTTGACCGGCTCCATA

CCCGGCTGCTTGGCATTAGCGCTGAACGCACCGACGATGGCGGGGAGCGGCTCGTCACGAGGACCA

GGGTGGGTGCCGCGGACAAACAGTTCGGGGTCCTTGTGGACTACACGTGGACCAGTGACGGGGAAT

CGCTGGCGCTCCGAACCCAGGTCCGGCCGCAGGGATCCTGGGTCAACGCCGGATTTGAGGTGGAGT

GGGCCCGGATCGGCCTGGAACTGGTGCTGGACGGCGGGACGTCAGCGGTGAGCTGGTTCGGGCAGG

GACCGCACCAGGCTTATCCGGATACGGGGCAAGGCACGCGGACGGGATGGTTTTCCATGCCCTTGG

GTGACCTCGATGTTGAGTATGCGCGGCCCCAGGAGTCCGGTGCCCGCGCCGGTGTCCGCTCGGCTG

CCCTTGAGGTGGATGGCGCCACGTTGGACATCGCCGGCGAGCCCTTTGCCCTGACGGTACGCCCCT

ACAGCCAGGCCGCACTCAACGAAGCAACCCACCGGCCTGACCTGGCAGCCGACGGGCGGACCTACA

TCTACCTCGACAACGCCATGCGTGGTGTGGGCACCGGAGCCTGCGGTCCGGGTGTCCTCGATCCGT

ACCGCCTGCAGCCACGGGATGCCGACTTCACGGTAGTGCTGCGGGTCCGTCCGTAGTCTAGAACAA

PL 216 683 B1

AAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTTA

GCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTC

TAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTA

TTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTG

ATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGAT

GTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCG

GATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGA

CTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTC

CTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCT

TTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTT

AGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAG

TTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCAT

AGCAATCTAATCTAAGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATA

CGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGA

CGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGA

CTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCC

GGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGT

CGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGG

GCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTG

ACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATA

TCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGG

AAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAA

CGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATAC

TGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACA

TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATA

GGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG

GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGC

CGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCT

GTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC

AGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTAT

CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT

TCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGA

AGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG

GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGA

TCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATG

AGATCAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATA

TCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAAT

GTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTA

GGAAATTTTACTCTGCTGGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTA

CGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGT

CGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAA

AAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACTTTAAATTTAATTTATTTGTC

CCTATTTCAATCAATTGAACAACTATTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTT

TATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAA

TTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCAT

TTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAG

AAGAAGGGGTATCTC

SEQ ID No.: 9

Symbol: F22cNdemut

Starter DNA

PL 216 683 B1

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' ATACATATGAGCAAAGCCTATGAATCCAAGGA 3'

SEQ ID No.: 10

Symbol: R22cHind

Starter DNA

Cząsteczka jednoniciowa DNA

5' CTGAAGCTTACAGGCCCTGCGCCAGACGGTAGTACGCCTGG 3'

SEQ ID No.: 11

Symbol: sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o symbolach F22cNdemut i R22cHind Długość: 1525 pz

Topologia: cząsteczka liniowa dsDNA

ATACATATGAGCAAAGCCTATGAATCCAAGGAAATCTGGTTTTTCACCGGAAGCCAAGACCTCTAT

GGGGAAGAAACCCTGCGTCAGGTCGCCGAGCAGTCACGCGAGGTGGCCCAGGCGCTGGGAGATTCC

GAACAGGTTCCCGCAAAGGTGATCTGGAAACCGGTACTCAAGGATGCCGAATCGATTCGTCGGGCC

ATGCTGGACGCAAATTCGGATGACAATGTGCTCGGTGTGATTACCTGGATGCATACCTTCAGCCCA

GCCAAAATGTGGATCTCTGGTCTGAAAGCACTGGCTAAGCCATTGTTGCACCTGCATACTCAGGCC

AATGTTGAACTTCCTTGGGACACCATTGACTTCGATTTCATGAACCTGAACCAGGCCGCACACGGT

GACCGTGAATACGCGTACCTAGCAACCCGTATCGGTGCCACCCGCACCACGGTGGTTGGTCACGTT

TCCAACCCGGCGGTAGCCGGGCGTATCGGTAACTGGGTGCGAGGCGCCGCAGGCTGGAACGCCACC

CAGACGATGAAATTGGTTCGATTCGGTGACAATATGCGCAACGTTGCGGTGACCGAGGGGGATAAG

ACCGAAGCAGAACTACGCTTCGGTGTTTCAGTGAACACCTGGGCGGTCAACGACCTCGTGGAAGCC

GTGGAAGCAGTTTCCGAGCCTGCCGTGGATGAACTGGTTGCAGAATATGAGCGAGAATACGACGTC

TCCGCCGAGTTGCGTGCCGGTGCAGAGCGTCACGAGTCGCTACGTTATGCGGCTCGTCAGGAACTG

GCCATCGAGTCCTTCCTACGAGAACTAGGTGCGTGGGCCTTCACCACCAACTTTGAAGATCTCGGT

GGGCTGAAGCAGCTACCTGGCCTCGCCGTACAACGTCTGATGGGTAAGGGCTACGGCTTCGGTGCC

GAGGGTGACTGGAAGACCGCGGTGCTGGTACGCGCGGCCAAGGTAATGGGAGCAGGGCTCCCCGGT

GGTGCCTCGCTGATGGAGGATTACACCTATGACCTGACCCCGGGCAAGGAACTGATCCTCGGCGCG

CACATGCTTGAGGTGTGCCCGTCGTTGACCACTACCAAGCCACGAATCGAGATTCACCCGCTGGGC

ATTGGCGGCCGTGAAGATCCGGTACGCATGGTCTTTAACGCGGACGCGACCACGGGCGCGGTAGTT

GTTTCCATGGCCGATATGCGTGAGCGTTTCCGGTTGACGGCCAACGTAGTGGACGTGGTTACTCCG

CCACAGGACCTGCCAAACTTGCCGGTGGCACGCGCCGTATGGCAGCCACGACCAGACTTCTCCACC

TCGGCCGAATCCTGGTTGACCGCCGGTGGAGCGCACCACACGGTGATGTCTACGGCCGCCGGCATT

GAGGCTTTTGAGGTCTTTGCAGAAATCGCTGGAACCGAATTGCTAGTCATCGATGAGAACACTACG

CGTCGCGGATTCGCCGAACAGGTGCGACTGAACCAGGCGTACTACCGTCTGGCGCAGGGCCTGTAA

GCTTCAG

SEQ ID No.: 12

Symbol: pET30araA22c

Wielkość: 6763 pz

Topologia: cząsteczka kolista dsDNA, plazmidowe

TATGAGCAAAGCCTATGAATCCAAGGAAATCTGGTTTTTCACCGGAAGCCAAGACCTCTATGGGGA

AGAAACCCTGCGTCAGGTCGCCGAGCAGTCACGCGAGGTGGCCCAGGCGCTGGGAGATTCCGAACA

GGTTCCCGCAAAGGTGATCTGGAAACCGGTACTCAAGGATGCCGAATCGATTCGTCGGGCCATGCT

GGACGCAAATTCGGATGACAATGTGCTCGGTGTGATTACCTGGATGCATACCTTCAGCCCAGCCAA

AATGTGGATCTCTGGTCTGAAAGCACTGGCTAAGCCATTGTTGCACCTGCATACTCAGGCCAATGT

TGAACTTCCTTGGGACACCATTGACTTCGATTTCATGAACCTGAACCAGGCCGCACACGGTGACCG

PL 216 683 B1

TGAATACGCGTACCTAGCAACCCGTATCGGTGCCACCCGCACCACGGTGGTTGGTCACGTTTCCAA

CCCGGCGGTAGCCGGGCGTATCGGTAACTGGGTGCGAGGCGCCGCAGGCTGGAACGCCACCCAGAC

GATGAAATTGGTTCGATTCGGTGACAATATGCGCAACGTTGCGGTGACCGAGGGGGATAAGACCGA

AGCAGAACTACGCTTCGGTGTTTCAGTGAACACCTGGGCGGTCAACGACCTCGTGGAAGCCGTGGA

AGCAGTTTCCGAGCCTGCCGTGGATGAACTGGTTGCAGAATATGAGCGAGAATACGACGTCTCCGC

CGAGTTGCGTGCCGGTGCAGAGCGTCACGAGTCGCTACGTTATGCGGCTCGTCAGGAACTGGCCAT

CGAGTCCTTCCTACGAGAACTAGGTGCGTGGGCCTTCACCACCAACTTTGAAGATCTCGGTGGGCT

GAAGCAGCTACCTGGCCTCGCCGTACAACGTCTGATGGGTAAGGGCTACGGCTTCGGTGCCGAGGG

TGACTGGAAGACCGCGGTGCTGGTACGCGCGGCCAAGGTAATGGGAGCAGGGCTCCCCGGTGGTGC

CTCGCTGATGGAGGATTACACCTATGACCTGACCCCGGGCAAGGAACTGATCCTCGGCGCGCACAT

GCTTGAGGTGTGCCCGTCGTTGACCACTACCAAGCCACGAATCGAGATTCACCCGCTGGGCATTGG

CGGCCGTGAAGATCCGGTACGCATGGTCTTTAACGCGGACGCGACCACGGGCGCGGTAGTTGTTTC

CATGGCCGATATGCGTGAGCGTTTCCGGTTGACGGCCAACGTAGTGGACGTGGTTACTCCGCCACA

GGACCTGCCAAACTTGCCGGTGGCACGCGCCGTATGGCAGCCACGACCAGACTTCTCCACCTCGGC

CGAATCCTGGTTGACCGCCGGTGGAGCGCACCACACGGTGATGTCTACGGCCGCCGGCATTGAGGC

TTTTGAGGTCTTTGCAGAAATCGCTGGAACCGAATTGCTAGTCATCGATGAGAACACTACGCGTCG

CGGATTCGCCGAACAGGTGCGACTGAACCAGGCGTACTACCGTCTGGCGCAGGGCCTGTAAGCTTG

CGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAG

CTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCT

TGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGG

CGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGC

GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCT

AAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGA

TTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGA

GTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTA

TTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA

AAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA

TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTA

ATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC

CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGG

CAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCT

CGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCA

AAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCAC

TCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGT

TAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAA

TATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGG

TGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCG

TCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCA

GAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACAT

TATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGC

AAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTT

TTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAA

AAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAA

CCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACT

GGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTC

AAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGT

GGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCG

GGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC

CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTA

AGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTAT

AGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGG

PL 216 683 B1

AGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCT

CACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCT

GATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGC

CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCA

GTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGT

CATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGC

ATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATC

ACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTC

TGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAA

GCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCT

GTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGA

ACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAG

AAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCA

GCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACT

TTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCA

GTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCC

TAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAAT

GGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAA

GATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAA

AATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGC

GGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCAT

CGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGC

TTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG

TTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCT

TCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAAT

CCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTA

CCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCT

GATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAA

AACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGAT

ATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGA

TTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAA

TAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAG

CTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCG

CGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCA

CGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGG

CCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGT

TGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGC

TGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATA

ACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGC

GAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATT

AGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAG

GAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTC

ATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACC

GCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGAT

CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA

ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACA

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania D-tagatozy z laktozy, znamienny tym, że stosuje się rekombinantowy szczep drożdży Pichia pastoris produkujący β-D-galaktozydazę Arthrobacter chlorophenolicus i preparat izomerazy arabinozowej Arthrobacter sp.22c.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę rekombinantowego szczepu drożdży produkującego β-D-galaktozydazę w pożywce zawierającej laktozę, w obecności izomerazy arabinozowej.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się laktozę zawartą w ubocznych produktach przemysłu mleczarskiego, korzystnie w serwatce lub permeacie serwatkowym.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że rekombinantowy szczep drożdży zdolny jest do metabolizowania D-glukozy i nie posiada zdolności metabolizowania D-galaktozy.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że β-D-galaktozydazę wydziela się do pożywki hodowlanej.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że β-D-galaktozydazę pozostawia się w obrębie ściany komórkowej rekombinantowych drożdży.
7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że β-D-galaktozydaza wykazuje wysoką aktywność w warunkach wzrostu rekombinantowych drożdży.
8. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 4, albo 5, znamienny tym, że rekombinantowym szczepem drożdży jest rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa- β-galAchI.
9. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 4, albo 6, znamienny tym, że rekombinantowym szczepem drożdży jest rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAPZa-β-galAchII.
10. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że izomeraza arabinozowa wykazuje wysoką aktywność w warunkach wzrostu rekombinantowych drożdży.