PL214229B1 - Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie - Google Patents

Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number
PL214229B1
PL214229B1 PL360413A PL36041301A PL214229B1 PL 214229 B1 PL214229 B1 PL 214229B1 PL 360413 A PL360413 A PL 360413A PL 36041301 A PL36041301 A PL 36041301A PL 214229 B1 PL214229 B1 PL 214229B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
bvh
seq
isolated
polynucleotide
Prior art date
Application number
PL360413A
Other languages
English (en)
Other versions
PL360413A1 (pl
Inventor
Joseé Hamel
Catherine Ouellet
Nathalie Charland
Denis Martin
Bernard Brodeur
Original Assignee
Id Biomedical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Id Biomedical Corp filed Critical Id Biomedical Corp
Publication of PL360413A1 publication Critical patent/PL360413A1/pl
Publication of PL214229B1 publication Critical patent/PL214229B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 360413 (22) Data zgłoszenia: 19.06.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
19.06.2001, PCT/CA01/000908 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
27.12.2001, WO01/98334 (11) 214229 (13) B1 (51) Int.Cl.
C07K 14/315 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) A61K 39/09 (2006.01)
Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie
(30) Pierwszeństwo: 20.06.2000, US, 60/212,683 (43) Zgłoszenie ogłoszono: (73) Uprawniony z patentu: ID Biomedical Corporation of Quebec, Laval, CA (72) Twórca(y) wynalazku: JOSEE HAMEL, Sillery, CA CATHERINE OUELLET,
06.09.2004 BUP 18/04 St. Jean-Chrysostome, CA
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: NATHALIE CHARLAND, Charny, CA DENIS MARTIN, St-Augustin, CA BERNARD BRODEUR, Sillery, CA
31.07.2013 WUP 07/13 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Królikowska
PL 214 229 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy antygenów, epitopów i skierowanych przeciw tym epitopom przeciwciał, dokładniej polipeptydowych antygenów patogenu paciorkowca zapalenia płuc Streptococcus pneumoniae, które mogą być użyteczne do zapobiegania, diagnozowania lub leczenia zakażenia paciorkowcem.
U człowieka, w szczególności u noworodków, osób starszych i o osłabionym układzie odpornościowym S. pneumoniae jest ważnym czynnikiem chorobotwórczym. Jest to bakteria często wyizolowana od pacjentów z chorobami zakaźnymi takimi jak bakteriemia/posocznica, zapalenie płuc, zapalenie mózgu, powodującymi wiele przypadków chorobowych i śmiertelnych na całym świecie. Nawet przy odpowiednim leczeniu antybiotykami zarażenia paciorkowcem nadal prowadzą do licznych przypadków śmiertelnych. Chociaż stosowanie leków przeciwbakteryjnych ogranicza ogólnie śmiertelność spowodowaną chorobami wywołanymi przez paciorkowce, to obecnie występujące oporne pneumokoki stają się istotnym problemem współczesnego świata. Skuteczne szczepionki przeciw pneumokokom mogą mieć ogromny wpływ na przypadki chorobowe i zejścia spowodowane wywołaną przez S. pneumoniae chorobą. Szczepionki takie będą również potencjalnie użyteczne w zapobieganiu zapaleniu ucha środkowego u noworodków i małych dzieci.
Wysiłki, celem opracowania szczepionki przeciw pneumokokom, ogólnie koncentrują się na wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej przeciw polisacharydom otoczki pneumokoka. Na podstawie różnic w antygenach zidentyfikowano ponad 80 serotypów otoczek pneumokoka. Obecnie dostępna szczepionka przeciw pneumokokom, zawierająca 23 polisacharydy otoczki bakterii najczęściej powodujących chorobę, posiada znaczące ograniczenia dotyczące głównie niskiej immunogeniczności niektórych polisacharydów otoczki, zmienności serotypów i różnic w rozprzestrzenieniu serotypów w czasie, przestrzeni i grupach wiekowych. W szczególności niepowodzenia istniejących szczepionek i szczepionek opartych na koniugatach otoczki, które są obecnie opracowywane dla ochrony małych dzieci, przeciw wszystkim serotypom wymagają oceny innych składników S. pneumoniae. Chociaż immunogeniczność polisacharydów otoczki może być zwiększona, to serotypowa specyficzność będzie nadal stanowiła główne ograniczenie szczepionek opartych na polisacharydach. Zastosowanie antygenowo konserwatywnego immunogenicznego antygenu białkowego pneumokoka zarówno jako samego lub w kombinacji z dodatkowymi składnikami stwarza możliwość szczepionki opartej na białku pneumokoka.
W zgłoszeniu PCT WO 98/18930 opublikowanym 7 maja 1998 pod tytułem.,Streptococcus pneumoniae antygens and vaccines'' opisano takie polipeptydy, które zastrzeżono jako antygenowe. Jednakże, nie doniesiono o biologicznej aktywności tych polipeptydów. Podobnie, nie doniesiono o sekwencji konserwatywnej, która jest niezbędna w przypadku kandydata na szczepionkę o szerokim spektrum działania.
W zgłoszeniu PCT WO 00/39299 opisano polipeptydy i polinukleotydy kodujące te polipeptydy. W zgłoszeniu PCT WO 00/39299 pokazano, że polipeptydy oznaczone jako BVH-3 i BVH-11 dostarczają ochrony przeciw śmiertelnym doświadczalnym zarażeniom pneumokokiem.
Co za tym idzie j niezrealizowana zostaje potrzeba uzyskania antygenów Streptococcus, które mogą być użyte jako składniki do zapobiegania, diagnostyki i/lub leczenia zakażeń Streptococcus.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną przez SEQ ID NO:258, gdzie polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae.
Korzystnie wyizolowany polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez SEQ ID NO:258.
Korzystnie wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu.
Korzystnie wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd określony powyżej.
Korzystnie wyizolowany polinukleotyd stanowi DNA lub RNA.
Korzystnie wyizolowany polinukleotyd jest komplementarny do dowolnego z określonych powyżej polinukleotydów.
PL 214 229 B1
Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera polinukleotyd określony powyżej, przy czym polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z obszarem kontrolującym ekspresję.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony powyżej.
Wyizolowana komórka gospodarza korzystnie jest komórką bakteryjną lub komórką grzyba.
Korzystnie również wyizolowana komórka gospodarza jest wyizolowaną komórką eukariotyczną.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu określonego powyżej charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny według wynalazku, w warunkach dogodnych do ekspresji polipeptydu, oraz izolowanie polipeptydu.
Korzystnie w sposobie wytwarzania określonym powyżej wytworzony polipeptyd stanowi polipeptyd rekombinowany.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka charakteryzująca się tym, że zawiera polipeptyd według wynalazku i farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
Korzystnie szczepionka zawiera dodatkowo farmaceutycznie akceptowalny adiuwant.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywołanym paciorkowcami, zwłaszcza paciorkowcami Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae Iub Streptococcus uberis.
Zastosowanie polipeptydu zwłaszcza w przypadku infekcji, którą stanowi zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemia lub zapalenie płuc.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polipeptyd charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z pozycjami 497-838 sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8 oraz wyizolowany polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae, korzystnie wyizolowany polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez pozycje 497-838 SEQ ID NO:8. Również korzystnie wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu. Także korzystnie ten wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany polipeptyd, który stanowi fragment polipeptydu określonego przez SEQ ID NO:8, charakteryzujący się tym, że fragment polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasową określoną w pozycjach 227- 838 SEQ ID NO:8, oraz który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na Streptococcus pneumoniae.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany polipeptyd, który stanowi fragment polipeptydu składający z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną w pozycjach 227-838 SEQ ID NO:8, który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na Streptococcus pneumoniae. Korzystnie fragment polipeptydu składa się z sekwencji aminokwasowej określonej w pozycjach 227-838 sekwencji SEQ ID NO:8. Korzystnie taki wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu. Także korzystnie wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polipeptyd charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną przez SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 lub SEQ ID NO:23, oraz wyizolowany polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae. Korzystnie ten wyizolowany polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 lub SEQ ID NO:23. Korzystnie ten wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu. Także korzystnie ten wyizolowany polipeptyd jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polinukleotyd, który koduje dowolny polipeptyd według wynalazku z polipeptydów określonych powyżej. Korzystnie wyizolowany polinukleotyd stanowi DNA lub RNA.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polinukleotyd, który jest komplementarny do dowolnego z polinukleotydów określonych powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera dowolny polinukleotyd określony powyżej, przy czym polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z obszarem kontrolującym ekspresję.
PL 214 229 B1
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony powyżej. Korzystnie komórka gospodarza jest komórką bakteryjną lub komórką grzyba. Także korzystnie wyizolowana komórka gospodarza jest wyizolowaną komórką eukariotyczną.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej powyżej, w warunkach dogodnych do ekspresji polipeptydu, oraz izolowanie polipeptydu.
Korzystnie w sposobie wytwarzania polipeptydu według wynalazku wytworzony polipeptyd stanowi polipeptyd rekombinowany.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka zawierająca polipeptyd określony powyżej i farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
Szczepionka korzystnie zawiera dodatkowo farmaceutycznie akceptowalny adiuwant.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywołanym paciorkowcami, zwłaszcza infekcji wywołanej jest przez Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae Iub Streptococcus uberis.
Zastosowanie powyżej określonego polipeptydu zwłaszcza w przypadku infekcji stanowiącej zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemię lub zapalenie płuc.
Opis rysunku:
Fig. 1 jest sekwencją DNA genu SP64 BVH-3; SEQ ID NO:1.
Fig. 2 przedstawia sekwencję DNA zawierającą pełen gen SP64 BVH-3 od nukleotydu 1777 do 4896; SEQ ID NO:2.
Fig. 3 jest sekwencją DNA genu SP64 BVH-11; SEQ ID NO:3.
Fig. 4 przedstawia sekwencję DNA zawierającą pełen gen SP64 BVH-11 od nukleotydu 45 do 2567; SEQ ID NO:4.
Fig. 5 przedstawia sekwencję DNA zawierającą pełen gen SP64 BVH-11-2 od nukleotydu 114 do 2630; SEQ ID NO:5.
Fig. 6 jest sekwencją aminokwasową polipeptydu SP64 BVH-3; SEQ ID NO:6.
Fig. 7 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu SP64 BVH-11; SEQ ID NO:7.
Fig. 8 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu SP64 BVH-11-2; SEQ ID NO:8.
Fig. 9 przedstawia sekwencję DNA genu SP63 BVH-3; SEQ ID NO:9.
Fig. 10 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu SP63 BVH-3; SEQ ID NO:10.
Fig. 11 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 4D4.9; SEQ ID NO:11.
Fig. 12 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 7G11.7; SEQ ID NO:12.
Fig. 13 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 7G11.9; SEQ ID NO:13.
Fig. 14 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 4D3.4; SEQ ID NO: 14.
Fig. 15 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 8E3.1; SEQ ID NO:15.
Fig. 16 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 1G2.2; SEQ ID NO:16.
Fig. 17 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 10C12.7; SEQ ID NO: 17.
Fig. 18 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 14F6.3; SEQ ID NO:18.
Fig. 19 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu B12D8.2; SEQ ID NO:19.
Fig. 20 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 7F4.1; SEQ ID NO:20
Fig. 21 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 10D7.5; SEQ ID NO:21.
Fig. 22 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 10G9.3, polipeptydu 10A2.2 i polipeptydu B11B8.1; SEQ ID NO:22.
Fig. 23 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu 11B8.4; SEQ ID NO:23.
Fig. 24 przedstawia sekwencję aminokwasową docelowego epitopu Mab H11B-11B8; SEQ ID NO:163.
Fig. 25 jest schematycznym przedstawieniem genu BVH-3 jak również lokalizacją sekwencji genu kodujących polipeptydy pełnej długości i skrócone. Zależności pomiędzy fragmentami DNA są przedstawione w związku z każdym z nich.
Fig. 26 jest schematycznym przedstawieniem genu BVH-11 jak również lokalizacją sekwencji genu kodujących polipeptydy pełnej długości i skrócone. Zależności pomiędzy fragmentami DNA są przedstawione w związku z każdym z nich.
Fig. 27 jest schematycznym przedstawieniem genu BVH-11-2 jak również lokalizacją sekwencji genu kodujących polipeptydy pełnej długości i skrócone. Zależności pomiędzy fragmentami DNA są przedstawione w związku z każdym z nich.
PL 214 229 B1
Fig. 28 jest schematycznym przedstawieniem białka BVH-3 i lokalizacji wewnętrznych i powierzchniowych epitopów rozpoznawanych przez określone przeciwciała monoklonalne.
Fig. 29 jest schematycznym przedstawieniem białka BVH-11-2 i lokalizacji ochronnych epitopów powierzchniowych rozpoznawanych przez określone przeciwciała monoklonalne.
R
Fig. 30 jest mapą plazmidów pURV22.HIS.KanR, obszaru kodującego odporność na kanamycynę; cI857, gen cI857 kodujący represor wrażliwy na temperaturę z bakteriofaga λ cI857; lambda pL, promotor bakteriofaga λ; znacznik histydynowy, obszar kodujący sześć histydyn; terminator, T1 terminator transkrypcji; ori, miejsce inicjacji replikacji colE1.
Fig. 31 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowych BVH-3M (sp64) i BVH-3 (Sp63) przy pomocy programu Clustal W pochodzącego z pakietu oprogramowania dla analizy sekwencji MacVector (wersja 6.5.3). Poniżej przyrównania znajduje się wers określający najwyższą zgodność, w którym * i . oznaczają odpowiednio identyczne i podobne aminokwasy.
Fig. 32 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowych białek BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 przy pomocy programu Clustal W pochodzącego z pakietu oprogramowania dla analizy sekwencji MacVector (wersja 6.5.3). Poniżej przyrównania znajduje się wers określający najwyższą zgodność, w którym * i . oznaczają odpowiednio identyczne i podobne aminokwasy.
Fig. 33 przedstawia sekwencję DNA genu NEW43 (SEQ ID NO:257).
Fig. 34 przedstawia wydedukowaną sekwencję aminokwasową polipeptydu NEW43 (SEQ ID NO:258).
Określono, że części polipeptydu BVH-3 i BVH-11 były wewnętrzne. Inne części nie występowały w ważnych szczepach takich jak powodujące chorobę szczepy tworzących otoczki S. pneumoniae. Byłoby korzystnym posiadanie polipeptydu zawierającego część, która nie jest wewnętrzną. Gdy znaczne części polipeptydu są wewnętrzne to nie są one prezentowane na bakterii. Jednakowoż części te mogą być bardzo immunogeniczne w zrekombinowanym polipeptydzie i nie będą wywoływały ochrony przed infekcjami. Korzystne będzie również posiadanie polipeptydu zawierającego część występującą w większości szczepów.
Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów, w których niepożądane części zostały usunięte i/lub zmodyfikowane w celu uzyskania specyficznej odpowiedzi immunologicznej.
Wynalazek stanowią również polipeptydy lub polinukleotydy kodujące takie polipeptydy, które zawierają domeny zapewniające ochronę.
Zaskakującym jest, że gdy niepożądane części polipeptydów są usunięte lub zmodyfikowane to polipeptydy posiadają pożądane właściwości biologiczne. Jest to zaskakujące w świetle faktu, że niektóre z tych fragmentów opisano jako fragmenty zawierające epitop, w zgłoszeniu patentowym PCT WO 98/18930. W innych publikacjach takich jak PCT WO 00/37105 fragmenty zidentyfikowano jako triady histydynowe i rejony helikalne, o których wiadomo że są ważne. Stwierdzono, że warianty polipeptydu BVH-3 i BVH-11, w którym określone części były usunięte i/lub zmodyfikowane i chimery tych polipeptydów posiadają właściwości biologiczne i wywołują specyficzną odpowiedź immunologiczną.
Przeciwciało, które „wiąże się specyficznie” jest przeciwciałem rozpoznającym i wiążącym wybrany polipeptyd, lecz które zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże się z innymi cząsteczkami w próbce, takiej jak próbka biologiczna. Specyficzne wiązanie może być zmierzone przy pomocy oznaczenia ELISA, w którym jako antygen użyty jest wybrany polipeptyd.
Jeśli nie jest to określone inaczej, wszystkie użyte tu techniki i terminy naukowe mają to samo znaczenie jak to powszechnie rozumiane przez naukowców o przeciętnej wiedzy z zakresu, którego dotyczy wynalazek. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne wspomniane tu odnośniki literaturowe są włączone w całości przez ich cytowanie. Zarówno materiały, metody jak i przykłady podane są jedynie w celu zilustrowania i nie mają wprowadzać ograniczeń.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem „ochrona” w badaniach biologicznych jest określona przez znaczący wzrost w krzywej przeżywalności, stopnia lub okresu przeżycia. Analizy statystyczne przeprowadzone przy pomocy „Log rank test” dla porównania krzywych przeżycia i testu zgodności Fishera dla porównania odpowiednio stopni przeżycia i liczby dni do śmierci, mogą być użyteczne do obliczenia wartości P i określenia czy różnice między dwoma grupami są istotne statystycznie. Wartości P 0,05 są uznawane za nieistotne.
W użytym tu znaczeniu „fragmenty”, „pochodne” lub „analogi” polipeptydów według wynalazku obejmują te polipeptydy, w których jeden lub więcej aminokwasów jest podstawionych konserwatywnym lub nie konserwatywnym aminokwasem (korzystnie konserwatywnym), który może być naturalny lub nienaturalny. W korzystnym rozwiązaniu polipeptydy będą posiadały większą niż 95% homologię.
PL 214 229 B1
Pochodne i analogi polipeptydów mogą zawierać mniej niż 20 podstawień aminokwasowych, modyfikacji lub delecji, korzystnie mniej niż 10.
Korzystnymi podstawieniami są te, które nauce znane są jako konserwatywne tj. podstawienia aminokwasami posiadającymi takie same właściwości fizyczne lub chemiczne jak hydrofobowość, wielkość, ładunek lub grupy funkcyjne.
Biegły naukowiec dostrzeże, że analogi lub pochodne białek lub polipeptydów według wynalazku znajdą również zastosowanie w kontekście niniejszego wynalazku, np. jako materiał antygenowo/immunogeniczny. Tak więc, przykładowo możliwe są białka lub polipeptydy obejmujące jedną lub więcej addycji, delecji, substytucji lub im podobnych. Ponadto, może być możliwe zastąpienie jednego aminokwasu innym podobnego „typu”. Przykładowo, zastąpienie jednego hydrofobowego aminokwasu innym hydrofobowym aminokwasem.
Może zostać użyty program, taki jak program CLUSTAL dla porównania sekwencji aminokwasowych. Program ten porównuje sekwencje aminokwasowe i znajduje optymalne przyrównanie przez wbudowanie w odpowiedni sposób luk w obu sekwencjach. Jest możliwym obliczenie identyczności lub podobieństwa (identyczność plus zachowanie typu aminokwasu) aminokwasów dla optymalnego przyrównania. Program taki jak BLASTx będzie przyrównywał dłuższe ciągi podobnych sekwencji i określał wartość dopasowania. Co za tym idzie jest możliwym przeprowadzenie porównania w przypadku, gdy wykrywa się kilka obszarów podobieństwa, każdy oceniony w różny sposób. Oba rodzaje analizy podobieństwa są rozważane w niniejszym wynalazku.
W alternatywnym podejściu analogi lub pochodne mogą być fuzjami białkowymi, wbudowującymi cząsteczki czyniące oczyszczanie łatwiejszym, przykładowo przez wydajne znakowanie pożądanego białka lub polipeptydu. Może być niezbędnym usunięcie „znacznika” lub może to być przypadek, w którym sama fuzja białkowa użyteczna będzie w celu uzyskania dostatecznej antygenowości. W kolejnym rozwiązaniu wynalazku dostarczono antygenowe/immunogeniczne fragmenty białek lub polipeptydów według wynalazku lub ich analogów lub pochodnych.
Fragmenty z niniejszego wynalazku powinny zawierać jeden lub więcej takich epitopowych obszarów lub być dostatecznie podobne do takich obszarów dla zachowania ich właściwości antygenowych/immunogenicznych. Tak więc, dla fragmentów według niniejszego wynalazku stopień identyczności jest być może nieistotny, bowiem mogą być one w 100% identyczne z określoną częścią białka lub polipeptydu, analogu lub pochodnej jaką tu opisano. Ponownie kluczową sprawą jest aby fragment zachował właściwości antygenowo/immunogeniczne.
Co za tym idzie ważnym w przypadku analogów, pochodnych i fragmentów jest, aby posiadały one przynajmniej właściwości antygenowo/immunogeniczne w stopniu odpowiadającym białku lub peptydowi, którego są pochodną.
Polipeptydy według wynalazku mogą stanowić zarówno polipeptydy jak i polipeptydy chimerowe.
Uwzględnione są również polipeptydy, do których przyłączono inne związki zmieniające właściwości biologiczne lub farmakologiczne polipeptydów tj. glikol polietylenowy (PEG) dla zwiększenia półokresu trwania; liderową lub sekrecyjną sekwencję aminokwasową dla łatwiejszego oczyszczenia; sekwencje prepro- i pro-; i (poli)sacharydy.
Ponadto, w tych sytuacjach gdzie stwierdzono polimorfizm obszarów aminokwasowych może być pożądaną zmiana jednego lub większej liczby aminokwasów dla skuteczniejszego naśladowania różnych epitopów różnych szczepów paciorkowców.
Ponadto, polipeptydy z niniejszego wynalazku mogą być zmodyfikowane przez acetylowanie końca -NH2 (np. przez acetylowanie lub amidowanie kwasem tioglikolowym, amidowanie końca karboksylowego, np. amoniakiem lub metyloaminą) dla zapewnienia stabilności, zwiększonej hydrofobowości dla związania lub połączenia ze złożem lub inną cząsteczką.
Rozważane są również homopolipeptydowe multimery fragmentów polipeptydu. analogów i pochodnych. Te polimerowe postacie obejmują przykładowo jeden lub więcej polipeptydów. które zostały usieciowane substancjami sieciującymi, takimi jak awidyna/biotyna. aldehyd glutarowy lub dimetylosuperimidyt. Takie postacie polimerowe obejmują również polipeptydy zawierające dwa lub więcej powtórzeń lub odwróconych powtórzonych sekwencji, wytworzonych z wielocistronowego mRNA wytworzonego sposobem rekombinowania DNA.
Fragment, analog lub pochodna polipeptydu według wynalazku powinien zawierać przynajmniej jeden obszar antygenowy tj. przynajmniej jeden epitop.
Celem utworzenia antygenowych polimerów (np. syntetycznych multimerów) wykorzystane mogą być polipeptydy posiadające grupy bihalogenoacetylowe, nitrarylohalogenowe, lub im podobne,
PL 214 229 B1 gdzie odczynniki są specyficzne dla grup tiolowych. Tak więc, wiązanie pomiędzy dwoma grupami merkaptanowymi różnych peptydów może być pojedynczym wiązaniem lub może być zbudowane z grupy łącznikowej o przynajmniej dwóch, typowo przynajmniej czterech i nie więcej niż 16, lecz zazwyczaj nie więcej niż 14 atomach węgla.
W szczególnym rozwiązaniu fragmenty polipeptydu, analogi i pochodne według wynalazku nie zawierają początkowej metioniny (Met). Korzystnie, polipeptydy nie posiadają sekwencji liderowej lub skrecyjnej (sekwencja sygnałowa). Sygnałowa część polipeptydu według wynalazku może być określona zgodnie z ustalonymi sposobami biologii molekularnej. Ogólnie, interesujący polipeptyd może być wyizolowany z hodowli paciorkowców, a następnie zostanie określona jego sekwencja dla ustalenia pierwszego aminokwasu dojrzałego białka i co za tym idzie sekwencji dojrzałego białka.
W przypadku szczepionki według wynalazku i stosowanych w niej adjuwantów, użyteczne adjuwanty obejmują oleje np. pełny lub niepełny adjuwant Freunda; sole np. AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AINH4(SO4)2, krzemionkę, kaolin, węgiel, polinukleotydy np. poli IC i poli AU. Korzystne adjuwanty obejmują QuilA i Alhydrogel. Szczepionki według wynalazku mogą być podane dootrzewnowo przez zastrzyk, szybką wlewkę, przez absorpcję w nosogardzieli, absorpcję przez skórę lub dopoliczkowo lub doustnie. Farmaceutycznie akceptowalne nośniki obejmują również toksoid tężcowy.
Termin szczepionka jest pomyślany również aby obejmował przeciwciała. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczone jest również zastosowanie jednego lub większej liczby przeciwciał specyficznie wiążących polipeptydy z niniejszego wynalazku, do leczenia lub profilaktyki infekcji paciorkowcowych i/lub chorób i objawów związanych z zarażeniem paciorkowcami.
Kompozycje szczepionek według wynalazku są użyte do leczenia lub profilaktyki spowodowanej paciorkowcami infekcji i/lub chorób i objawów wywołanych infekcją paciorkowcami, jak opisali P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover i R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASN Press, Waszyngton, D.C., szóste wydanie, 1995, str. 1482 włączona tu przez cytowanie. W pewnym rozwiązaniu kompozycje szczepionki z niniejszego wynalazku są użyte do leczenia lub zapobiegania zapaleniu mózgu, zapaleniu ucha środkowego, bakteriemii lub zapaleniu płuc. W pewnym rozwiązaniu kompozycje szczepionki według wynalazku są użyte do leczenia lub profilaktyki spowodowanych przez paciorkowce zakażeń i/lub chorób i objawów zależnych od zakażeń paciorkowcami, w szczególności S. pneumoniae, paciorkowców grupy A (pyogenes), paciorkowców z grupy B (GBS lub agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia jak również Staphylococcus aureus. W kolejnym rozwiązaniu zarażenie paciorkowcami jest spowodowane S. pneumoniae.
W szczególnym rozwiązaniu szczepionki są podawane tym osobnikom, które są zagrożone zarażeniem paciorkowcami, jak noworodki, ludzie starzy lub osoby z upośledzoną odpornością.
W niniejszym zgłoszeniu termin „osobnicy” jest użyty w znaczeniu obejmującym ssaki. W kolejnym rozwiązaniu ssakiem jest człowiek.
Kompozycje szczepionki są korzystnie w postaci jednostkowych dawek około 0,001 do 100 μg/kg (przeciwciało/waga ciała) korzystniej 0,001 do 10 μg/kg i najkorzystniej 0,1 do 1 μg/kg, 1 do 3 razy w odstępach wynoszących około 1 do 6 tygodni pomiędzy immunizacjami.
Kompozycje szczepionki są korzystnie w postaci jednostkowych dawek około 0,1 μg do 10 mg i korzystniej 1 μg do 1 mg i najkorzystniej 10 do 100 μg, 1 do 3 razy w odstępach wynoszących około 1 do 6 tygodni pomiędzy immunizacjami.
Powinno być dostrzeżone, że sekwencje polinukleotydowe przedstawione na rysunku mogą być zmienione poprzez zdegenerowane kodony i nadal będą kodowały polipeptydy według wynalazku. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ponadto dostarczone są polinukleotydy hybrydyzujące z sekwencjami polinukleotydów, które opisano powyżej (lub sekwencjami do nich komplementarnymi).
Warunki hybrydyzacji o dogodnej ostrości mogą być łatwo określone przez naukowca (patrz przykładowo Sambrook i wsp., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wyd., Cold Spring Harbor N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) wyd. przez Ausubel F.M. i wsp., John Wiley & Sons Inc., N.Y.).
Polinukleotydy kodujące polipeptydy według wynalazku lub ich fragmenty, analogi lub pochodne mogą być użyte w metodzie immunizacji DNA. Mogą być one wbudowane do wektora, który replikuje się i ulega ekspresji po wstrzyknięciu i co za tym idzie wytwarzany jest in vivo polipeptyd będący antygenem. Przykładowo, polinukleotydy mogą być wyłączone do wektora plazmidowego pod kontrolę promotora CMV, który jest funkcjonalnym w komórkach eukariontów. Korzystnie, wektor jest wstrzyknięty domięśniowo. Proces wytwarzania polipeptydów według wynalazku może być przeprowadzony technikami rekombinacji przez ekspresję polinukleotydu kodującego wspomniany polipeptyd w komórce
PL 214 229 B1 gospodarza i odzyskiwaniu polipeptydu będącego produktem ekspresji. Alternatywnie, polipeptydy mogą być wytworzone zgodnie z ustalonymi technikami syntezy chemicznej np. syntezy polipeptydu w roztworze lub na fazie stałej, gdzie oligopeptydy są łączone w celu wytworzenia polipeptydu pełnej długości (łączenie z blokowaniem).
Ogólnie sposoby otrzymywania i oceny polinukleotydów i polipeptydów są opisane w poniższych pracach: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wyd., Cold Spring Harbor N.Y., (1989); Current Protocols in Molecular Biology, wyd. przez Ausubel F.M. i wsp., John Wiley & Sons Inc., Nowy Jork; PCR Cloning Protocols z Molecular Cloniong to Genetic Engineering, wyd. przez White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, str. 490; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, Nowy Jork, 3 wyd., 1993, str. 380; Current Protocols in Immunology, wyd. przez Coligan J.E. i wsp., John Wiley & Sons Inc., Nowy Jork, które są włączone tu przez cytowanie.
W celu rekombinacyjnego wytwarzania, komórki gospodarza są transfekowane wektorami kodującymi polipeptydy, a następnie hodowane w pożywkach hodowlanych zmodyfikowanych odpowiednio do aktywowania promotorów, wyboru transformantów lub amplifikacji genów. Użytecznymi wektorami są te, które są żywotne i mogą się replikować w wybranym gospodarzu i zawierają chromosomowe, nie chromosomowe, i syntetyczne sekwencje DNA np. plazmidy bakteryjne, fagowy DNA, bakulowirusy, plazmidy drożdżowe, wektory będące pochodną łącznie DNA plazmidowych i faga. Sekwencja polipeptydowa może być włączona do wektora w odpowiednie miejsce przy pomocy enzymów restrykcyjnych tak, że jest połączona funkcjonalnie z obszarem kontrolującym ekspresję zawierającym promotor, miejsce wiązania rybosomu (obszar o najwyższej zgodności lub sekwencja Shine-Dalgarno) i warunkowo operator (element kontrolujący). Mogą być dobrane poszczególne składniki obszaru kontrolującego ekspresję, które są odpowiednie dla danego gospodarza i wektora zgodnie z ustalonymi zasadami biologii molekularnej (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wyd., Cold Spring Harbor N.Y., (1989); Current Protocols in Molecular Biology, wyd. przez Ausubel F.M. i wsp., John Wiley & Sons Inc., Nowy Jork, włączone tu przez cytowanie). Użyteczne promotory obejmują, lecz nie są ograniczone do promotorów LTR lub SV40, promotorów E.coli Lac, Tac lub Trp i promotora PL z faga lambda. Wektory będą korzystnie posiadały miejsce inicjacji replikacji jak również markery selekcyjne np. gen odporności na ampicylinę. Użyteczne wektory bakteryjne obejmują pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 i eukariotyczne wektory pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSGI, pSVL. Komórki gospodarza mogą być bakteriami np. E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; grzybami np. Aspergillus niger, Aspergillus nidulans; drożdżami np. Saccharomyces lub komórkami eukariotycznymi np. CHO, COS.
W przypadku ekspresji polipeptydu w hodowli komórki są typowo zebrane przez wirowanie, następnie rozbite w sensie fizycznym lub chemicznym (jeśli eksprymowany polipeptyd nie jest wydzielony do pożywki) i otrzymany nie oczyszczony ekstrakt zachowany dla wyizolowania interesującego polipeptydu. Oczyszczanie polipeptydu z pożywki hodowlanej lub lizatu może być osiągnięte przez zastosowanie technik w zależności od właściwości polipeptydu np. przez wytrącanie siarczanem amonu lub etanolem, kwaśną ekstrakcję, chromatografię jonowymienną anionową lub kationową, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię oddziaływania hydrofobowego, chromatografię na hydroksyapatycie i chromatografię na lektynie. Końcowe oczyszczenie może być osiągnięte przy pomocy HPLC.
Polipeptyd może być eksprymowany z lub bez sekwencji liderowej lub służącej do sekrecji. W tym przypadku lider może być usunięty przez post translacyjną obróbkę (patrz US 4,431,739; US 4.425,437 i US 4,338,397 włączone tu przez cytowanie) lub usunięty chemicznie po oczyszczeniu eksprymowanego peptydu.
Polipeptydy według wynalazku mogą być użyte w teście diagnostycznym do infekcji paciorkowcami, w szczególności infekcji S. pneumoniae. Możliwe jest zastosowanie szeregu metod diagnostycznych, przykładowo wykrywających paciorkowce w próbce biologicznej, poniższe procedury mogą być przeprowadzone:
a) otrzymanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubowanie przeciwciała lub jego reaktywnego fragmentu z polipeptydem paciorkowców według wynalazku z próbką biologiczną w postaci mieszaniny i
c) wykrycie specyficznie związanego przeciwciała lub fragmentu związanego w mieszaninie, co wskazuje na obecność paciorkowców.
PL 214 229 B1
Sposób wykrycia przeciwciała specyficznego dla antygenu paciorkowców w próbce biologicznej zawierającej lub podejrzanej o to. ze zawiera wspomniane przeciwciało może być przeprowadzony jak następuje:
a) otrzymanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubowanie w postaci mieszaniny jednego lub większej ilości polipeptydów paciorkowców według wynalazku lub jego fragmentów z próbką biologiczną i
c) wykrycie w mieszaninie specyficznie związanego antygenu lub fragmentu, co wskazuje na obecność przeciwciała specyficznego przeciw paciorkowcom.
Naukowiec dostrzeże, że ten test diagnostyczny może przybrać szereg postaci obejmujących test immunologiczny taki jak oznaczenie immunosorbcji ze związanym enzymem (ELISA), oznaczenie radioimmunologiczne lub oznaczenie aglutynacji z lateksem, zasadniczo dla określenia czy w organizmie występują przeciwciała specyficzne względem polipeptydu.
Sekwencje DNA kodujące polipeptydy według wynalazku mogą być również użyte do projektowania sond DNA do zastosowania do wykrywania występowania paciorkowców w próbce biologicznej podejrzanej, że zawiera takie bakterie.
Sposób wykrywania według wynalazku obejmuje:
a) otrzymanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubowanie jednej lub większej liczby sond DNA posiadających sekwencję DNA kodującą polipeptyd według wynalazku lub jego fragment z próbką biologiczną w postaci mieszaniny i
c) wykrycie specyficznie związanej sondy DNA w mieszaninie co dowodzi obecności bakterii paciorkowców.
Sondy DNA mogą być również użyte do wykrycia krążących paciorkowców np. kwasów nukleinowych S. pneumoniae w próbce, przykładowo przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy jako sposobu diagnozowania infekcji paciorkowcowych. Sonda może być zsyntetyzowana przy pomocy tradycyjnych sposobów i może być unieruchomiona na fazie stałej lub może być wyznakowana wykrywalnym znacznikiem. Sondą DNA korzystną dla tego zastosowania jest oligomer o sekwencji komplementarnej z przynajmniej około 6 kolejnymi nukleotydami kodującymi polipeptydy Streptococcus pneumoniae według wynalazku.
Kolejny sposób diagnostyczny do wykrycia u pacjenta paciorkowców obejmuje:
a) znakowanie przeciwciała reaktywnego względem polipeptydu według wynalazku lub jego fragmentu możliwym do wykrycia znacznikiem;
b) podanie pacjentowi wyznakowanego przeciwciała lub wyznakowanego fragmentu oraz
c) wykrycie specyficznie związanego przeciwciała lub wyznakowanego fragmentu u pacjenta co wskazuje na obecność paciorkowców.
Polipeptydy paciorkowców według wynalazku mogą być stosowane jako immunogeny do wytwarzania specyficznych przeciwciał do diagnostyki i w szczególności do leczenia infekcji paciorkowcowych. Użyteczne przeciwciała mogą być określane przy pomocy odpowiednich sposobów przesiewowych, przykładowo przez pomiar zdolności określonego przeciwciała do biernej ochrony przeciw infekcjom paciorkowcowym w modelu testowym. Jednym przykładem modelu zwierzęcego jest model mysi opisany w przedstawionych tu przykładach. Przeciwciało może być pełnym przeciwciałem lub jego fragmentem wiążącym antygen i może należeć do którejkolwiek z klas immunoglobulin. Przeciwciało lub jego fragment może być pochodzenia zwierzęcego, specyficznie pochodzić od ssaka, a dokładniej myszy, szczura lub człowieka. Może być naturalnym przeciwciałem lub jego fragmentem, lub jeśli pożądane zrekombinowanym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Termin zrekombinowane przeciwciało lub fragment przeciwciała oznacza przeciwciało lub fragment przeciwciała, które wyprodukowano przy pomocy sposobów biologii molekularnej. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała mogą być poliklonalne, lub korzystnie monoklonalne. Mogą być specyficzne względem szeregu epitopów towarzyszących polipeptydom Streptococcus pneumoniae lecz korzystnie są specyficzne względem jednego.
Przeciw paciorkowcowym polipeptydom według wynalazku mogą zostać użyte przeciwciała do biernej immunizacji. Mogą zostać użyte przeciwciała opisane w obecnym dokumencie. Użyteczne przeciwciała mogą być określone przy pomocy odpowiednich sposobów wyszukiwania, przykładowo przez pomiar zdolności określonego przeciwciała do biernej ochrony przeciw paciorkowcowym infekcjom w modelu testowym. Jednym przykładem modelu zwierzęcego jest model mysi opisany tu w przykładach. Przeciwciało może być pełnym przeciwciałem lub jego fragmentem wiążącym antygen i może należeć do każdej klasy immunoglobulin. Przeciwciało lub jego fragment może być pochodzenia
PL 214 229 B1 zwierzęcego, szczególnie pochodzenia ssaczego i szczególniej pochodzić od myszy, szczura lub człowieka. Może być naturalnym przeciwciałem lub jego fragmentem, lub jeśli jest to pożądane zrekombinowanym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Termin zrekombinowane przeciwciało lub fragment przeciwciała oznacza przeciwciało lub fragment przeciwciała wytworzone przy pomocy sposobów biologii molekularnej. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała mogą być poliklonalne lub korzystnie monoklonalne. Może być ono specyficzne względem szeregu epitopów towarzyszących polipeptydom Streptococcus pneumoniae lecz korzystnie specyficzne względem jednego.
Poniżej przedstawiono tabele z odnośnikami podsumowujące sekwencje ujawnione w niniejszym zgłoszeniu:
Tabele A, B i C. Warianty i epitopy BVH-3
T a b e l a A
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
BVH-3
NEW21 aa 396-1039 z SEQ ID. 6
NEW25 aa 233-1039 z SEQ ID. 6
NEW40 aa 408-1039 z SEQ ID. 6
T a b e l a B
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
BVH-3
NEW1mut1** 235
NEW35A 236
NEW42 349
NEW49 350
NEW50 351
NEW51 352
NEW52 353
NEW53 354
NEW54 355
NEW55 356
NEW56 357
NEW56-mut2** 358
NEW56-mut3** 359
NEW57 360
NEW63 361
NEW64 362
NEW65 363
NEW66 364
NEW76 365
NEW105 366
NEW106 367
NEW107 368
mutacja cicha, np. polipeptyd jest taki sam jak New1 lub New56.
PL 214 229 B1
T a b e l a C - epitopy BVH-3
7G11.7 12
7G11.9 13
B12D8.2 19
7F4.1 20
14F6.3 18
4D3.4 14
10C12.7 17
8E3.1 15
1G2.2 16
Tabela D, E i F. Warianty i epitopy BVH-11 T a b e l a D
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
BVH-11
New19 aa 497 - 838 z SEQ ID 8
New24 aa 227 - 838 z SEQ ID 8
T a b e l a E
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
BVH-11
New43 258
NEW60 293
NEW61 294
NEW62 295
NEW80 296
NEW81 297
NEW82 298
NEW83 299
NEW84 300
NEW85 301
NEW88D1 302
NEW88D2 303
NEW88 304
T a b e l a F. Epitopy BVH-11
10D7.5 21
10G9.3 22
B11B8.1 22
10A2.2 22
11b8.4 23
3A4.1 24
PL 214 229 B1
Tabela G i H. Chimery
T a b e l a G
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
Chimery z BVH-11 i BVH-3
New17 M*NEW5-G*P*-NEW1 (376)
New20 M*NEW1-G*P*-NEW5 (377)
New26 M*NEW10-G*P*-NEW25 (378)
New27 M*NEW19-G*P*-NEW25 (379)
New28 M*NEW10-G*P*-NEW1 (380)
New29 M*NEW5-G*P*-NEW25 (381)
New30 M*NEW4-G*P*-NEW25 (382)
New31 M*NEW4-G*P*-NEW1 (383)
New32 M*NEW19-G*P*-NEW1 (384)
* optymalny aminokwas
T a b e l a H
Rodzina Polipeptyd SEQ ID NO
Chimery z BVH-11 i BVH-3
VP89 369
VP90 370
VP91 371
VP92 372
VP93 373
VP94 332
VP108 333
VP109 334
VP110 335
VP111 336
VP112 337
VP113 338
VP114 339
VP115 340
VP116 341
VP117 342
VP119 343
VP120 344
VP121 345
VP122 346
VP123 347
VP124 348
PL 214 229 B1
P r z y k ł a d 1.
Przykład ten opisuje szczepy bakterii, plazmidy, startery do PCR, zrekombinowane białka i przeciwciała z hybrydom, których tu użyto.
S. pneumoniae SP64 (grupa serologiczna 6) i SP63 (grupa serologiczna 9) izolaty kliniczne, były dostarczone przez Laboratoire de la Sante Publique du Quebec, Sainte-Anne-de-Bellevue; szczep Rx1, pozbawiona otoczki pochodna typu 2 szczepu D39 i typu 3 szczepu WU2 były dostarczone przez David'a E. Briles z University of Alabama, Birmingham, i typ 3 będący klinicznym izolatem P4241 był dostarczony przez Centre de Recherche en Infectiologie du Centre Hospitalier de l'Universite Laval, Sainte-Foy. Szczepy E.coli DH5a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD); AD494 ^DE3) (Novagen, Madison, WI) i BL21 ^DE3) (Novagen) podobnie jak wektor plazmidowy z superlinkerem pSL301 (Invitrogen, San Diego, CA); wektor pCMV-GH (dar od dr Stephen'a A. Johnston'a, Department for Biochemistry, University of Texas, Dallas, Texas); wektory ekspresyjne pET32 i pET21 (Novagen) i pURV22.HIS (fig. 30) były używane w niniejszych badaniach. Wektor pURV22.HIS zawiera kasetkę bakteriofaga λ cI857 z genem kodującym termowrażliwy receptor, z którego usunięto funkcjonalny promotor PR. Inaktywację represora cI857 przez temperaturę zwiększoną z zakresu 30 - 37°C do 37 - 42°C powoduje indukcję genu znajdującego się pod kontrolą promotora λΡL. Startery do PCR użyte w celu wytworzenia zrekombinowanych plazmidów posiadają na 5' końcu miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej, co za tym idzie pozwala to na bezpośrednie klonowanie produktu amplifikacji w strawionym wektorze plazmidowym. Użyte do PCR oligonukleotydowe startery wyszczególniono w poniższej Tabeli 1. Lokalizację sekwencji genu kodującej BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 przedstawiono odpowiednio na fig. 25, fig. 26 i fig. 27.
PL 214 229 B1
Tabela 1, Lista oligonukleotydowych starterów do PCR
| Starter i SEQ ID NO j Sekwencja 5’-3’ Pozycja nukleotydu Miejsce restrykcyjne
i OCRR 479 25 j cagtagatctgtgcctatgcactaaac SEQ ID 1: i 61-78 SEQ ID 9: 1-18 Bglll
OCRR 480 26 gatctctagactaetgctattccttacg ctatg SEO ID 2: 4909-4887 SEQ ID 9: 2528-2519 Xbal
OCRR 497 27 atcactcgagcattaectggataatcc tgt SEQ ID 1: 1525-1506 Xhol
OCRR 498 28 ctgctaagcttatgaaagatttagat SEQ ID 1: 1534-1548 HindlH
OCRR 499 29 gatactcgagctgctattccttac SEQ ID 2: 4906-4893 Xhol
HAMJ 172 30 gaatctcgagttaagctgctgctaatt c SEQ ID 1: 675-661 Xhol
HAMJ 247 31 gacgctcgagcgctatgaaatcagat aaattc SEQ ID i: 3117-3096 Xhol
HAMJ 248 32 gacgctcgagggcattacctggataa tcctgttcatg SEQ ID 1: 1527-1501 Xhol
HAMJ 249 33 cagtagatctcttc atoatttattgaaaa gagg SEQ ID 2: 1749-1771 Bglll
HAMJ 278 34 ttatttcttccatatggactigacagaa gagcaaattaag SEQ ID 1: 1414-1437 Ndel
HAMJ 279 35 cgccaagcttcgctatgaaatcagat aaattc SEQ ID 1: 3117-3096 Hindlll
HAMJ 280 36 cgccaagcttttccacaatataagte g attgatt SEQ ID 1: 2400-2377 Hindlll
HAMJ 281 37 ttatttcttccatatggaagtacctatctt ggaaaaagaa SEQ ID 1: 2398-2421 Ndel
HAMJ 300 38 Uatttcttccatatggtgcetatgeact aaaccagc SEQ ID 1: 62-82 Ndel
HAMJ 313 39 ataagaatgcggccgcttccacaata taagtcgattgatt SEQ ID 1: 2400-2377 Notl
OCRR 487 40 cagtagatctgtgcttatgaactaggtt tgc SEQ ID 3: 58-79 Bglll
OCRR 488 41 gatcaagcttgctgctacctttacttac tctc SEQ ID 4: 2577-2556 Hindlll
HAMJ 171 42 ctggagtatccgttatcgttcaaacc SEQ ID 3: 1060-1075 EcoRV
HAMJ 251 43 ctgcaagcttttaaaggggaataatac g SEQ ID 3: 1059-1045 Hindlll
HAMJ 264 44 cagtagatctgcagaagccttcctatc tg SEQ ID 3: 682-700 Bglll
HAMJ 282 | 45 tcgeeaagcttcgttatcglteaaace a«ggg SEQ ID 3: 1060-1081 Hindlll
PL 214 229 B1
HAMJ 283 46 ataagaatgcggccgccttactctcct ttaataaagceaatagtt SEQ ID 3: 2520-2492 Notl
HAMJ 284 47 catgccatggacattgatagtctcttg aaacagc SEQ ID 3: 856-880 Ncol
HAMJ 285 48 cgccaagcttcttactctcctttaataa agccaatag SEQ ID 3: 2520-2494 Hindill
HAMJ 286 49 cgacaagcttaacaiggtcgctagcg ttacc SEQ ID 3: 2139-2119 SEQ ID 5: 2210-2190 ΗίικΗΙΙ
HAMJ 287 50 cataccatgggcctttatgaggcacct cUlg SEQ ID 3: 2014-2034 Ncol
HAMJ 288 51 cgacaagcttaagtaaatcttcagcct ctctcag SEQ ID 3: 2376-2353 Hindill
HAMJ 289 52 gataccatggctagcgaceatgttca aagaa SEQ ID 3: 2125-2146 Ncol
HAMJ 290 53 cgccaagcttatcatccactaacttga ctttatcac SEQ ID 3; 1533-1508 HindlH
HAMJ 291 54 cataccatggatattcttgccttcttąg ctccg SEQ ID 3: 1531-1554 Ncol
HAMJ 301 55 catgccatggtgcttatgaactaggttt ES SEQ ID 3: 59-79 Ncol
HAMJ 302 56 cgccaagctttagcgttaccaaaacc attatc SEQ ID 3: 2128-2107 Hindill
HAMJ 160 57 gtattagatctgttcctatgaacttggtc gtcacca SEQ ID 5: 172-196 BgUI
HAMJ 186 58 cgcctctagactactgiataggagcc gg . SEQ ID 5: 2613-2630 Xbal
HAMJ 292 59 catgccatggaaaacatttcaagcctt ttacgtg SEQ ID 5: 925-948 Ncol
HAMJ 293 60 cgacaagcttctgtataggagccggt tgactttc SEQ ID 5: 2627-2604 Hindill
HAMJ 294 61 catgccatggttcgtaaaaataaggc agaccaag SEQ ID 5: 2209-2232 Ncol
HAMJ 297 62 catgccatggaagcctattggaatgg gaag SEQ ID 5: 793-812 Ncol
HAMJ 352 63 catgccatggaagcctattggaatgg gaagc SEQ ID 5: 793-813 Ncol
HAMJ 353 64 cgccaagcttgtaggtaatttgcgcat ttgg SEQ ID 5: 1673-1653 Hindill
HAMJ 354 65 cgccaagcttctgtataggagccggt tgac SEQ ID 5: 2627-2608 Hindill
HAMJ 355 66 catgccatggatattcttgccttcttag ctec SEQ ID 5: 1603-1624 Ncol
HAMJ 404 67 ttaittcttccatatgcatggtgatcattt ccattaca SEQ ID 1: 1186-1207 Ndel
HAMJ 464 68 Gatgcatatgaatatgcaaccgagtc agttaagc SEQ ID 1: 697-720 Ndel
PL 214 229 B1
HAMJ 465 69 1 gatgctcgagagcatcaaatccgtat ccatc SEQ ID 1; 1338-1318 Xhol
HAMJ 466 70 gatgcatatggatcatttccattacatt cca SEQ ID 1: 1192-1212 Ndel
HAMJ 467 71 gacaagcttggcattacctggataatc ctg SEQ ID 1: 1527-1507 HindHI
HAMJ 352 72 catgccatggaagcctattggaatgg gaagc SEQ ID 5: 793-813 Ncol
HAMJ 470 73 ataagaatgcggccgccgctatgaa atcagataaattc SEQ ID 1: 3096-3117 Notl .........
HAMJ 471 168 atatgggcccctgtataggagccggt tgactttc SEQ ID 5: 2626-2604 Apal
HAMJ 472 169 atatgggcccaatatgcaaccgagtc agttaagc SEQ ID 1: 720-697 Apal
HAMJ 350 170 atatgggcccaacatggtcgctagcg ttacc SEQ ID 3: 2139-2119 Apal
HAMJ 351 171 tcccgggcccgacttgacagaagag caaattaag SEQ ID 1: 1414-1437 Apal
HAMJ 358 172 catgccatgggacttgacagaagag caaattaag SEQ ID 1: 1415-1437 Ncol
HAMJ 359 173 tcccgggcccgctatgaaatcagata aattc SEQ ID 1: 3116-3096 Apal
HAMJ 403 174 atatgggeccgacattgatagtctctt gaaacagc SEQ ID 3: 856-880 Apal
HAMJ 361 175 cgccaagcttaacatggtcgctagcg ttacc SEQ ID 3: 2139-2119 HindHI
HAMJ 483 176 atatgggccccttactctcctttaataa agccaatag SEQ ID 3: 2520-2494 Apal
Sposobami biologii molekularnej posługiwano się zgodnie z typową metodyką.
Patrz dla przykładu, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., „Molecular Cloning. A Laboratory
Manual” tom 1-2-3 (drugie wydanie) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nowy Jork, która jest włączona tu w całości. Produkty amplifikacji PCR trawiono endonukleazami restrykcyjnymi i łączono przez ligację zarówno z liniowym plazmidem pSL301, pCMV-GH, pET lub pURV22.HIS będącymi wektorami ekspresyjnymi strawionymi tymi samymi enzymami lub enzymami wytwarzającymi zgodne lepkie końce. Zrekombinowane plazmidy pSL301 i pCMV-GH strawiono enzymami restrykcyjnymi dla klonowania w ramce w wektorze ekspresyjnym pET. Gdy użyto wektorów pET klony najpierw stabilizowano w E. coli DH5a przed wprowadzeniem do E.coli BL21 ^DE3) dla ekspresji pełnej długości lub skróconych cząsteczek BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2. Każdy z otrzymanych konstruktów plazmidowych był potwierdzony przez analizę sekwencji nukleotydowych. Zrekombinowane białka eksprymowano jako N-końcowe fuzje z tioredoksyną i znacznikiem His (system ekspresji pET32); jako C-końcowe fuzje ze znacznikiem His (system ekspresji pET21) lub jako N-końcowe fuzje ze znacznikiem His (pURV22.HIS system ekspresji). Eksprymowane zrekombinowane białka oczyszczono przy pomocy chelatowania żywicą z metalem wiążącym His (Quiagen, Chatsforth CA), z frakcji nadsączu otrzymanej po wirowaniu rozbitych ultradźwiękami E.coli indukowanych IPTG (systemy pET) lub termicznie (pURV22.HIS). Produkty genu wytworzone przez S. pneumoniae SP64 są wyszczególnione w poniższej tabeli 2. Fragment genu kodujący białko BVH-3-Sp63 (aminokwasy od 21 do 840 w SEQ ID NO: 10) wytworzono z S. pneumoniae SP63 przy pomocy zestawów starterów do PCR OCRR479 OCRR480 i wektora do klonowania pSL301. Zrekombinowane pSL301-BVH-3Sp63 strawiono w celu klonowania w ramce w wektorze pET32 do ekspresji cząsteczki BVH-3-Sp63.
PL 214 229 B1
T a b e l a 2.
Lista skróconych BVH-3, BVH-11, BVH-11-2 i chimerowych produktów genu wytworzonych z S. pneumoniae SP64.
Zestawy starterów do PCR Oznaczenie białka Identyfikacja Kodowane sekwencje aminokwasowe (SEQ ID No 6) Wektor do klonowania
OCRR479-OCRR480 BVH-3M BVH-3w/oss 21-1039 PSL301
OCRR479-OCRR497 BVH-3AD BVH-3 koniecN’w/oss 21-509 5857 pSLSOl
HAMJ248-HAMJ249 L-BYH-3AD BVH-3 koniecN’ Ϊ-509 pET-2i(+)
OCRR498-OCRR499 BVH-3B BVH-3 koniecC’ 512-1039 PSL301
OCRR479-HAMJ172 BVH-3C BVH-3 koniecN7oss 21-225 pET-32c(+)
OCRR487-OCRR488 BVH-11M BVH-1 1 w/oss 20-840 pCMV-GH
HAMJ251-OCRR487 BVH-11A BVH-11 koniecN’w/oss 20-353 p£T-32c(+)
HAMJ171-OCRR488 BVH-11 koniecC’ 354-840 pET-32a(+)
HAMJ264-OCRR488 BYH-11C BVH-lł koniecN’ 228-840 pET-32a{+)
HAMJ278-HAMJ279 HAMJ 278-HAMJ 279 NEW1 BVH-3 koniecC’ 472-1039 pET-21b(+)
HAMJ278-HAMJ280 HAMJ 278-HAMJ 280 NEW2 BVH-3 koniecC’ 472-800 pET-21b(+)
HAMJ281-HAMJ279 NEW3 BVH-3 koniecC’ 800-1039 pET-21b(+)
HAMJ284-HAMJ285 NEW4 BVH~t 1 koniecC’ 286-840 pET-2!d(+)
HAMJ284-HAMJ286 NEWS BVH-11 wewn. 286-713 pET-21d(+)
HAMJ287-HAMJ288 NEWó BVH-t1 wewn. 672-792 pET-21d(+)
HAMJ285-HAMJ289 NEW? BVH-ll koniecC’ 709-840 pET-2ld(+)
HAMJ284-HAMJ290 NEW8 BVH-ll wewn. 286-511 72 pET-21d{+)
HAMJ286-HAMJ291 NEW9 BVH-ł 1 wewn. 511-713 pET-2ld(+)
HAMJ 160-HAMJ186 BVH- BVH-11-2 w/o 20-838 pSL301
HAMJ292-HAMJ293 NEW10 BVH-łi-2 koniecC’ 271-838 pET-2fd(+)
HAMJ293-HAMJ294 NEW 11 BVH-l1-2 koniecC’ 699-838 pET-21d(+)
HAMJ282-HAMJ283 NEW 13 BVH-1 i koniecC’ 354-840 pET~21b(+)
HAMJ286-HAMJ297 NEW 14 BVH-1 i-2 wewn. 227-699 pET-21d(4)
HAMJ3OO-HAMJ313 NEW15 BVH-3koniecN’ '-v'o $s 21-800 pET-21b(+)
i HAMJ301-HAMJ302 NEWló BVH-11 koniecN'w/oss 20-709 pET-21d(+)
HAMJ352-HAMJ353 NEW 18 BVH-11-2 wewn. 227-520 PET-21d(+j
HAMJ354-HAMJ355 NEW19 BVH-11-2 koniecC’ 497-838 pET-2ld(+)
HAMJ404-HAMJ279 NEW21 BVH-3 koniecC’ 396-1039 pET-21b(+)
HAMJ464-HAMJ465 NEW22 BVH-3 wewn. 233-446 pET-21a(+)
HAMJ466-HAMJ467 NEW23 BVH-3 wewn. 398-509 PET-21b(+)
HAMJ352-HAMJ293 NEW24 BVH-11-2 koniecC’ 227-838 pET-21d(+)
HAMJ464-HAMJ470 NEW25 BVH-3 koniecC’ 233-1039 pET-21b(+)
HAMJ278-HAMJ279 (NEW 1) HAMJ282- HAMJ283(NEW 13) NEW 12 Chimera’ M-NEW 1 -KL NEW 13 pET-21b(+)
HAMJ284-HAMJ350 (NEW 5) HAMJ351HAMJ279(NEW 1) NEW1 7 Chimera' M-NEW 5 -GP NEW 1 pET-21d(+)
HAMJ358-HAMJ359 (NEW I) HAMJ403HAMJ36I (NEW 5) NEW20 Chimera' M-NEW I GP NEW 5 pET-21d(+)
PL 214 229 B1
HAMJ292-HAMJ471 (NEW 10) HAMJ472-HAMJ470 (NEW 25) NEW26 Chimera* M-NEW 10 -GP NEW 25 pET-21d{+)
HAMJ355-HAMJ471 (NEW 19) MAMJ472-HAMJ470 (NEW 25) NEW27 Chimera* M-NEW 19-GENEW 25 pET-21d(+)
HAMJ292-HAMJ471 (NEW 10) HAMJ351-HAMJ279 (NEW 1) NEW28 Chimera’ M-NEW 10 GP NEW 1 pET-21d(+)
HAMJ284-HAMJ350 (NEW 5) HAMJ472HAMJ470 (NEW 25) NEW29 Chimera' M-NEW 5 -GP NEW 25 pET-21d(+)
HAMJ284-HAMJ483 (NEW 4) HAM.M72HAMJ47O (NEW 25) NEW30 Chimera’ M-NEW 4 -GP NEW 25 pET-2fd{+)
HAMJ284-HAMJ483 (NEW 4) HAMJ351HAMJ279 (NEW 1) NEW31 Chimera* M-NEW 4 -GP NEW 1 pET-21d(+)
HAMJ355-HAMJ47) (NEW 19) HAMJ351-HAMJ279 (NEW 1) NEW32 Chimera* M-NEW 19 -GPNEW 1 pET-2ld(+)
w/o ss: bez sekwencji sygnałowej. Analiza białka BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 sugeruje obecność potencjalnych hydrofobowych sekwencji liderowych.
* kodowane aminokwasy chimer są eksprymowane jako produkt genu, ponadto były dodane nieistotne aminokwasy, M metionina, K lizyna, L leucyna, G glicyna i P prolina.
Hybrydomy wydzielające przeciwciało monoklonalne (Mab) otrzymano przez fuzje komórek śledziony z immunizowanych myszy i nie wydzielających komórek SP2/0 szpiczaka myszy z niedoborem HGPRT sposobami opisanymi przez Fazekas De St-Groth i Scheiddegier (J. Immunol. Methods 35: 1-21, 1980) z modyfikacjami (J. Hamel i wsp., J. Med. Microbiol. 23: 163-170, 1987). Samice myszy BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Kanada) immunizowano zarówno BVH-3M (fuzja białkowa tioredoksyna-znacznikHis-BVH-3M/pET32), BVH-11M (fuzja białkowa tioredoksyna-znacznikHis-BVH-11Μ/ρΕΤ32), BVH-11-2M (fuzja białkowa tioredoksyna-znacznikHis-BVH-11-2M/pET32), BVH-11B (fuzja białkowa tioredoksyna-znacznikHis-BVH-11B/pET32), BVH-3M (fuzja białkowa tioredoksyna-znacznikHis-BVH-3/pURV22.HIS) lub NEW1 (fuzja białkowa NEW1-znacznikHis/pET21) produkty genu ze szczepu S. pneumoniae SP64 do wytworzenia Mab odpowiednio serii H3-, H11-, H112-, H11B-, H3V- i HN1-. Nadsącze z hodowli hybrydom początkowo sprawdzano oznaczeniem immunologicznym ze związanym enzymem (ELISA) zgodnie z procedurą opisaną przez Hamela i wsp. (powyżej) stosując szalki opłaszczone preparatami oczyszczonych, zrekombinowanych białek BVH-3, BVH-11 i/lub BVH-11-2 lub zawiesinami zabitych termicznie komórek S. pneumoniae. Hybrydomy wydzielające Mab wybrane do dalszego charakteryzowania są wyszczególnione w tabeli 3 i tabeli 4 z poniższego przykładu 2. Klasy i podklasy immunoglobulin Mab określono przez ELISA stosując komercyjnie dostępne odczynniki (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL).
Ponadto opisano klonowanie i ekspresję chimerowego genu(ów) kodującego chimerowe polipeptydy i ochronę obserwowaną po szczepieniu tymi chimerowymi peptydami. Fragmenty genu BVH-3 i BVH-11 odpowiadające 3' końcowi genów zamplifikowano metodą PCR stosując pary oligonukleotydów skonstruowanych w celu amplifikacji fragmentów genów, które będą włączone do chimerowych genów. Użyte startery posiadają miejsce dla enzymu restrykcyjnego na 5' końcu pozwalające na bezpośrednie klonowanie w ramce namnożonego produktu do strawionych wektorów plazmidowych (tabela 1 i tabela 2). Namnożone przez PCR produkty strawiono endonukleazami restrykcyjnymi i wbudowano przez ligację do zlinearyzowanych wektorów plazmidowych pET21 lub pSL301. Otrzymane
PL 214 229 B1 konstrukty plazmidu potwierdzono przez analizę sekwencji nukleotydowych. Zrekombinowane plazmidy pET21 zawierające produkt PCR zlinearyzowano trawiąc enzymem restrykcyjnym w celu klonowania w fazie drugiego fragmentu DNA i wytworzenia chimerowego genu kodującego chimerową cząsteczkę białka paciorkowca. Zrekombinowane plazmidy pSL301 zawierające produkt PCR, w celu uzyskaniawbudowanych wstawek DNA strawiono enzymami restrykcyjnymi. Otrzymane wbudowane fragmenty DNA oczyszczono i wstawki odpowiadające danemu genowi chimerowemu wbudowano przez ligację do wektora pET21 aby wytworzyć chimerowy gen. Zrekombinowane polipeptydy chimerowe wyszczególniono w tabeli 2 jako fuzję C-końcową ze znacznikiem His. Eksprymowane zrekombinowane białka oczyszczono z frakcji nadsączy otrzymanych przez wirowanie rozbitych ultradźwiękami zaindukowanych IPTG hodowli E. coli, przy pomocy żywicy wiążącej metalem znacznik His (Qiagen, Chatsworth, CA).
Grupy 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie dwukrotnie w trzy tygodniowych odstępach czasu 25 μg zarówno oczyszczonej przez powinowactwo fuzji białkowej ze znacznikiem His zidentyfikowanej w obecności 15-20 μg adjuwanta QuilA. W 10-14 dni po ostatniej immunizacji myszom podano dożylnie 10E5-10E6 CFU bakterii S. pneumoniae typu 3 szczepu WU2. Polipeptydy i fragmenty są zdolne do wywołania obronnej odpowiedzi immunologicznej.
T a b e l a 2A
Doświadczenie Immunogen Żywe : Martwe Dni do śmierci po zarażeniu
1 Brak 0 : 8 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
NEW1 2 : 6 1, 2, 2, 2, 2, 2, >14, >14
NEW13 1 : 7 1, 1, 3, 3, 4, 5, 5, >14
NEW12 6 : 2 3, 11,6 x >14
BVH-3M 1 : 7 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, >14
2 Brak 0 : 8 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
NEW17 7 : 1 4, 7 x >14
NEW12 3 : 5 3, 3, 3, 4, 5, 3 x >14
3 Brak 0 : 8 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2
NEW18 1 : 7 2, 2, 2, 2, 3, 3, 3, 3
NEW19 8 : 0 8 x >14
NEW10 8 : 0 8 x >14
BVH-11-2 8 : 0 8 x >14
P r z y k ł a d 2
Przykład ten opisuje identyfikację domen peptydu niosących docelowe epitopy przy pomocy Mabs i zrekombinowanych skróconych białek opisanych w Przykładzie 1.
Hybrydomy testowano przez ELISA względem skróconych produktów genów BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2 celem scharakteryzowania epitopów rozpoznanych przez Mabs. Skrócone produkty genu wytworzono ze szczepu SP64 S. pneumoniae z wyjątkiem BVH-3-Sp63, który wytworzono z S. pneumoniae szczepu SP63. Jako kontrolę pozytywną badano reaktywność każdego przeciwciała względem pełnej długości zrekombinowanych białek BVH-11 lub BVH-11-2. W niektórych przypadkach reaktywność Mab oceniano metodą immunoblotów Westerna, po rozdzieleniu produktu genu przez SDS-PAGE i przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy. Zaobserwowane reaktywności podano poniżej w tabeli 3 i w tabeli 4.
PL 214 229 B1
T a b e l a 3.
Reaktywność w teście ELISA Mabs reaktywnych względem BVH-3 z zestawem 11 produktów genu BVH-3 i cząsteczki BVH-1 IM.
Badane produkty genu
Mabs (izotyp IgG) BVH-3M BVH- 3AD BVH-3B BVH- 3C NEW1 NEW2 NEW3 NEW21 NEW22 NEW23 BVH-3 Sp63 BVH- 11M
H3-4F9 (1) + + - + - - - - - - + +
H3-4D4 (1) + + - + - - - - - - + +
H3-9H12 (1) + + - + - - - - - - + +
H3-7G2 (1) + + - - - - - - + - - -
H3-10A1 (1) + + - - - - - + - + + -
H3-4D3 (1) + - + - + - + + - - + -
H11-6E7 (1) + + - + - - - NT NT NT + +
H11-10H10 (2a) + + - + - - - NT NT NT + +
H11-7G11 (2b) + + + + + + - NT NT NT + +
H3V-4F3 (1) + - + - + - - + - - + -
H3V-2F2 (1) + - + - + + - + - - + -
H3V-7F4 (1) + - + - + + - + - - + -
H3V-7H3 (1) + - + - + - + + - - + -
H3V-13B8 (1) + - + - + - + + - - + -
H3V-9C2 (1) + + - +/- - - - - + - +/- +/-
H3V-9C6 (1) + + - - - - - - + - - -
H3V-16A7 (1) + + - - - - - + - + - -
H3V-15A10 (1) + + + +/- + + - + + + + +/-
H3V-6B3 (1/2) + + NT NT + + - + + - NT -
HN1-5H3 (2b) + - + NT + - - + - - + -
HN1-8E3 (2a) + - + NT + - - + - - + -
HN1-14F6 (2a) + - + NT + - - + - - + -
HNI-2G2 (1) + - + NT + + - + - - + -
HN1-12D8 (2a) + - + NT + + - + - - + -
HN1-14B2 (2a) + - + NT + + - + - - + -
HN1-1G2 (2a) + - + NT + - + + - - + -
HN1-10C12 (1) + - + NT + - + + - - + -
HN1-3E5 (1) + + - - + + - + - + + -
NT: nie badano +/-: bardzo niska reaktywność lecz wyższa niż tło, możliwe niespecyficzne wiązanie Mab.
PL 214 229 B1
T a b e l a 4.
Reaktywność w teście ELISA Mabs reaktywnych względem BVH-11 i/lub BVH-11-2 z zestawem 14 produktów genu BVH-11 i BVH-11-2 i cząsteczki BVH-3N.
Badane produkty genu
Mabs (izotyp IgG) BVH -11N BVH- 11A BVH- 11B BVH- 11C NEW5 NEW6 NEW7 NEW8 NEW9 NEW 10 NEW 11 NEW 14 NEW 18 NEW 19 BVH -11- 2-M BVH- 3M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
H3-4F9 (1) + + + +
H3-4D4 (1) + + + +
H3-9H12 (1) + + + +
H11-6E7 (1) + + + +
H11-10H10 (2a) + + + +
H11-7G11 (2b) + + + +
H11 -1B12 (1) + + + -
H11-7B9 (2a) + + + -
H11-3H5 (1) + - + + + - - * - + - + + - + -
H11 -10B8 (1) + - + + + - - * - + - + + - + -
H11-1A2 (1) + - +/- + + - - * - + - + + - + -
H112-3A1 (1) + - + NT + - - + - + - + + - + -
H112-13C11 (1) + +/- + NT + - - + - + - + + - + -
H112-10H10 (1) + + - NT + - - + - + - + + - + -
H112-1D8 (2a) + + - NT + - - + - + - + + - + -
H112-10G9 (2b) + - + NT + - - - + + - + - + + -
H112-10A2 (1) + - + NT + - - +/- + + - + - + + -
H112-3E8 (2a) + - + NT + - - +/- - + - + - + + -
H112-10D7 (2a) + - + NT + - - - - + - + - - + -
H112-2H7 (2a) + + - NT + „
PL 214 229 B1 ciąg dalszy Tabeli 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
H112-6H7 (1) + + - NT + -
H112-3A4 (2a) - - - NT - - - - - + + - - + + -
H112-10C5 (1) - - - NT - - - - - + + - - + + -
H112-14H6 (1) - - - NT - - - - - + + - - + + -
H112-7G2 (1) - - - NT - - - - - + - + + - + -
H112-13H10 (2a) - - - NT - - - - - - - + + - + -
H112-7E8 (2b) +/- - - NT - - - - - - - - +/- - + -
H112-7H6 (1) +/- - - NT - - - - - +/- - - - - + -
H11B-5F10 (1) + - + + + - - + - + - + + - + -
H11B-15G2 (1) + - + + + - - + - + - + + - + -
H11B-13D5 (2) + - + + + - - - + + - + - + + -
H11B- 11B8 (1) + - + + + - - - + + - + - + + -
H1-1B7E11 (1) + - + + + - - - - + - + - - + -
H11B-1C9 (1) + - + + + - - - - + - + - - + -
H11B-5E3 (2) + - + + - - + - - - - - - - - -
H11B-6E8 (1) + - + + - - + - - - - - - - - -
NT : nie badano +/- : bardzo niska reaktywność, lecz wyższa niż tło, możliwe niespecyficzne wiązanie Mab * : wykryto bardzo silny sygnał gdy badano Western blotem immunologicznym
Wydedukowane lokalizacje epitopów są podsumowane na Fig. 28 i Fig. 29. Jak można wywnioskować z danych w tabeli 3 Mabs reaktywne względem BVH-3 mogą być podzielone na dwie grupy: Mabs reaktywnych względem BVH-3A i względem BVH-3B z wyjątkiem Mab H11-7G11 i H3V-15A10 reagujących zarówno z cząsteczkami BVH-3A i BVH-3B. Mab reaktywne względem BVH-3A mogą być dalej podzielone na dwie podgrupy przeciwciał w zależności od ich reaktywności lub braku reaktywności ze zrekombinowanym białkiem BVH-3C. Mab reaktywne z białkiem BVH-3C rozpoznawały epitopy wspólne zarówno dla białek BVH-3 i BVH-11. Jak można dostrzec w tabeli 4 te Mab reaktywne krzyżowo z BVH-3- i BVH-11 rozpoznają również zrekombinowane białka BVH-11A i BVH-11-2M. Mab reaktywne z BVH-3B mogą być podzielone na trzy podgrupy zgodnie z ich reaktywnością względem zrekombinowanych białek NEW1, NEW2 i NEW3. Niektóre Mab były reaktywne jedynie z białkiem
PL 214 229 B1
NEW1 podczas gdy inne były reaktywne zarówno ze zrekombinowanymi białkami NEW1 i New2 lub NEW1 i NEW3.
Mab H11-7G11 i H3V-15A10 reagują z epitopami w więcej niż jednym miejscu BVH-3. Reaktywność H11-7G11 z BVH-3AD, BVH-3B, BVH-3C, BVH-11A i BVH-11-2M sugeruje, że epitop H11-7G11 może zawierać sekwencję HXXHXH. Sekwencja ta jest powtórzona odpowiednio sześć i pięć razy w sekwencjach białka BVH-3 i BVH-11/BVH-11-2. Brak reaktywności Mab H11-7G11 z cząsteczką NEW10 sugeruje, że epitop obejmuje sekwencję HGDHXH. Wielomiejscowe mapowanie epitopu H3V-15A10 na BVH-3 sugerowane reaktywnością Mab z dwoma fragmentami BVH-3, które na siebie nie zachodzą.
Co interesujące, Mab H3-7G2, H3V-9C6 i H3V-16A7 nie były reaktywne względem BVH-3 Sp63 co pozwala na umiejscowienie odpowiednich dla niego epitopów w 177 aminokwasowym fragmencie zawartym pomiędzy aminokwasami 244 i 420 w cząsteczce BVH-3 z S. pneumoniae SP64 (Fig. 31).
Jak można dostrzec z danych przedstawionych w tabeli 4 Mab, które są aktywne względem BVH-11 - i/lub BVH-11-2 i które nie rozpoznają cząsteczek BVH-3 mogą być podzielone na trzy grupy, zależnie od ich reaktywności ze zrekombinowanymi białkami BVH-11A i NEW10. Niektóre Mab reagowały wyłącznie z białkiem BVH-11A lub NEW10, podczas gdy inne Mab reagowały zarówno ze zrekombinowanym białkiem BVH-11A jak i NEW10.
P r z y k ł a d 3
Przykład ten opisuje konstrukcję bibliotek genu BVH-3 i BVH-11-2 do mapowania epitopów.
Biblioteki genu BVH-3 i BVH-11-2 skonstruowano przy pomocy zrekombinowanego DNA plazmidu pCMV-GH i PSL301 zawierających odpowiednio sekwencję genu BVH-3 ciągnącą się od nukleotydu 1837 do 4909 (SEQ ID NO:2) lub sekwencję genu BVH-11-2 ciągnącą się od nukleotydu 172 do 2630 (SEQ ID NO:5) i konstrukcję biblioteki Novatope® i systemu wyszukiwania (Novagen). Zrekombinowane plazmidy zawierające fragment genu BVH-3 lub BVH-11-2 oczyszczono przy pomocy zestawu QIAgen (Chatsworth, CA) i strawiono odpowiednio enzymami restrykcyjnymi BglII i XbaI. Otrzymane fragmenty DNA BglII-XbaI oczyszczono przy pomocy zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick z QIAgen i strawiono DNAzą I w celu wytworzenia losowo pociętego DNA. Fragmenty DNA o długości 50 do 200 par zasad oczyszczono, poddano działaniu T4 DNA polimerazy celem otrzymania docelowego DNA z tępymi końcami i dodania pojedynczej reszty 3'dA i wbudowano przy pomocy ligazy do pSCREEN-T-Vector (Novagen) postępując zgodnie z procedurą sugerowaną przez producenta (Novatope® System, Novagen). Biblioteki genowe klonów E. coli, z których każdy eksprymował mały peptyd otrzymane dla genów BVH-3 lub BVH-11-2 przeszukiwano typowymi sposobami badania kolonii stosując jako sondy immunologiczne Mab. Przeszukiwanie kolonii przy pomocy Mab nie zakończyło się sukcesem, bowiem uzyskiwano bardzo wysokie tło filtra. Ponadto, w niektórych przypadkach Mab nie wykrywały kolonii eksprymujących epitop. Utrata reaktywności przypuszczalnie może być wytłumaczona małą ilością zrekombinowanych białek, które wytwarzano, lub rozpoznawaniem epitopów zależnych od konformacji zawierających różne domeny białka. Oznaczanie sekwencji nukleotydowej wstawek DNA z pozytywnych klonów określiło lokalizację segmentu kodującego docelowy epitop. Wyniki są przedstawione w tabeli 5. Peptydy kodowane przez DNA wbudowany do zrekombinowanego wektora pSCREEN-T mogą być oczyszczone i użyte jako immunogeny jak to opisano poniżej w Przykładzie 6.
Sekwencje peptydu otrzymane w wyniku przeszukania bibliotek genu BVH-3 i BVH-11-2 przy pomocy Mab są zgodne z reaktywnościami Mab w ELISA względem skróconych produktów genu. Jak oczekiwano sekwencje aminokwasowe otrzymane z H11-7G11 zawierały sekwencję HGDHXH. Odkrycie to dostarczyło dodatkowych dowodów lokalizujących w Mab rozpoznane epitopy. Co interesujące, choć Mab H112-10G9, H112-10A2 i H11B-11B8 były reaktywne względem tej samej sekwencji polipeptydu (aminokwas 594 do 679 z sekwencji białka BVH-11-2), klony odpowiadające sekwencji od aminokwasu 658 do 698 były jedynie wykrywane przez H11B-11B8 w konsekwencji ujawniając lokalizacje epitopu dla H11B-11B8 pomiędzy aminokwasami 658 do 679 (SEQ ID NO:163). Mab H112-10G9, H112-10A2 i H11B-11B8 są skierowane przeciw 3 niezależnym, nie zachodzącym na siebie epitopom umiejscowionym blisko siebie na sekwencji polipeptydu odpowiadającej aminokwasom 594 do 679 (SEQ ID NO:22).
PL 214 229 B1
T a b e l a 5.
Sekwencje peptydowe otrzymane przez przeszukiwanie bibliotek genów BVH-3 i BVH-11-2 przy pomocy Mab.
Mab Oznaczenie klonu/białka Pozycja nukleotyd Pozycja aminokwas Sekwencja aminokwasowa SEQ ID NO
H3- 4D4 4D4.9 SEQ ID 1: 226-509 SEQ ID 6: 76-169 DQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDALFS EELLMKDPNYQLKDADIVNEVKGGYIIK VDGKYYVYLKDAAHADNVRTKDEINR QKQEHVKDNEKVNS 11
HI I7G11 7G11.7 SEQ ID 1: 193-316 SEQ ID 6: 64-105 GIQAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYN GKVPYDALFSEELL 12
HI l- 7G11 7G11.9 SEQID 1: 11711284 SEQ ID 6: 390-428 TAYIVRHGDHFHYIPKSNQIGQPTLPNNS LATPSPSLPI 13
H3- 4D3 4D3.4 SEQID 1: 12652670 SEQ ID 6: 855-890 T$NSTLEEVPTVDPVQEKVAKFAESYG MKLENVLFN 14
HN1- 8E3 8E3.1 SEQID 1: 30043120 SEQ ID 6: 1016-1039 MDGTIELRLPSGEVIKKNLSDFIA 15
HN1- 1G2 1G2.2 SEQ ID 1: 30173120 SEQ SD 6: 1005-1039 YGLGLDSVIFNMDGTIELRLPSGEVIKK NLSDFIA 16
HN1- 10C1 2 10CI2.7 SEQ ID 1: 29363120 SEQ ID 983-1039 6: PALEEAPAVDPVQEKLEKFTASYGLGLD SVIFNMDGTIELRLPSGEVIKKNLSDFIA 17
HN1- 14F6 I4F6.3 SEQ ID 1: 25012618 SEQ ID 833-872 6: KVEEPKTSEKVEKEKLSETGNSTSNSTL EEVPTVDPVQEK 18
HN1- 12D8 B12D8.2 SEQ ID 1: 14331767 SEQ ID 512-589 6: MKDLDKKIEEKIAGIMKQYGVKRESIVV NKEKNAIIYPHGDHHHADPIDEHKPVGI GHSHSNYELFKPEEGVAKKEGN 19
H3V- 7F4 7F4.1 SEQ ID I: 16331785 SEQ ID 545-595 6: AIIYPHGDHHHADPIDEHKPVGIGHSHS NYELFKPEEGVAKKEGNKVYTGE 20
HI 12 10D7 10D7.5 SEQ ID 5: 16851765 SEQ ID 525-553 8; 1QVAKLAGKYTTEDGYIFDPRD1TSDEG D 21
H112 10G9 I0G9.3 SEQ ID 5: 18932150 SEQ ID 594-679 8; DHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVP LDRMP YNLQYTVEVKNG SLIIPH YDH Y HNIKFEWFDEGLYEAPKGYSLEDLLATV KYYV 22
HI 12 10A2 10A2.2 SEQ ID 5: 18932150 SEQ ID 594-679 8: DHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVP LDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHY HNIKFEWFDEGLYEAPKGYSLEDLLATV KYYV 22
H11B 11B8 B11B8.1 SEQ ID 5: 18932150 SEQ ID 594-679 8: DHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVP LDRMPYNLQYTVEVKNGSL1IPHYDHY HNIKFEWFDEGLYEAPKGYSLEDLLATV KYYV 22
H11B 1 IBS 11B8.4 SEQ ID 5: 20852217 SEQ ID 658-698 8: GLYEAPKGYSLEDLLATVKYYVEHPNE RPHSDNGFGNASDH 23
H112 -3A4 3A4.1 SEQ ID 5: 24212626 SEQ ID 769-837 8: VENSVINAKIADAEALLEKVTDTSIRQN AMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDS LLALLKESQPAPI 24
PL 214 229 B1
P r z y k ł a d 4
Przykład ten opisuje immunizację zwierząt zrekombinowanymi białkami w celu wytworzenia przeciwciała reaktywnego z BVH-3, BVH-11 i/lub BVH-11-2.
Króliki NZW (Charles River Laboratories, St-Constant, Quebec, Kanada) immunizowano podskórnie w wiele miejsc 50 lub 100 μg oczyszczonego zrekombinowanego białka BVH-3N, L-BVH-3AD, NEW1, NEW13 lub L-BVH-11 w obecności 80 μg adjuwanta QuillA (Cederlane Laboratories Ltd., Hornby, Kanada). Króliki dwukrotnie doszczepiano w 3 tygodniowych odstępach czasu tym samym antygenem i próbki krwi zbierano przed każdą immunizacją i 6 do 28 dni po ostatniej immunizacji. Próbki surowicy oznaczono przed immunizacją, po 1szym, 2gim lub 3cim zastrzyku. Odpowiedź immunologiczną królika na immunizację oceniano przez ELISA stosując zrekombinowane białka BVH-3M (białko fuzyjne BVH-3M-His^znacznik/system pET21) lub BVH-11M (białko fuzyjne BVH-11MHis^znacznik/system pET21) lub zawiesiny zabitych termicznie komórek S. pneumoniae Rx-1 jako opłaszczający antygen. Miano ELISA określono jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, dla którego wartość absorbancji A410 była 0,1 powyżej wartości tła. Przeciwciała reaktywne z epitopami BVH-3 i/lub BVH-11 były wytworzone po immunizacji u wszystkich zwierząt jak to pokazano w poniższej tabeli 6. Przeciwciało reaktywne wobec zrekombinowanego lub paciorkowcowego antygenu nie występowało w surowicy przed immunizacją. Odpowiedź immunologiczna na immunizację była wykrywalna w surowicy każdego królika po pojedynczym wstrzyknięciu zrekombinowanego antygenu. Odpowiedź w postaci przeciwciał po drugim wstrzyknięciu badanego antygenu charakteryzowała się silnym, wzrostem miana przeciwciała, interesujące, ze dobre miana przeciwciała reaktywnego z komórkami S. pneumoniae, o średnim mianie 52,000 otrzymano po trzeciej immunizacji co określa, że naturalne epitopy paciorkowca są prezentowane w zrekombinowanych produktach genu z E. coli. Dane te świadczą za potencjalnym zastosowaniem produktu genu BVH-3, BVH-11 i/lub BVH-11-2 i przeciwciała otrzymanego przeciw produktom genu BVH-3, BVH-11 i/lub BVH-11-2 jako szczepionek odpowiednio do zapobiegania i leczenia chorób wywołanych paciorkowcem.
T a b e l a 6.
Odpowiedź królika w formie przeciwciał na immunizację produktami genu BVH-3 i BVH-11.
Miano w ELISA z opłaszczeniem antygenem
Królik Immunogen Próbka surowicy BVH-3M BVH-11M S. pneumoniae
1 2 3 4 5 6
#15 BVH-3M (50 pg) Przed immunizacją NT NT 200
Po 1szej NT NT 1,600
Po 2giej NT NT 20,000
Po 3ciej 512,000 NT 40,000
#16 BVH-3M (100 pg) Przed immunizacją NT NT 200
Po 1szej NT NT 1,600
Po 2giej NT NT 40,000
Po 3ciej 106 NT 80,000
#112 L-BVH-3AD (50 pg) Przed immunizacją <100 NT NT
Po 1szej 16,000 NT NT
Po 2giej 512,000 NT NT
Po 3ciej 2x106 NT 32,000
#113 New1 (50 pg) Przed immunizacją <100 NT NT
Po 1szej 16.000 NT NT
Po 2giej 512,000 NT NT
Po 3ciej 2x106 NT 64,000
PL 214 229 B1 ciąg dalszy Tabeli 6
1 2 3 4 5 6
#114 New13 (50 pg) Przed immunizacją NT <100 NT
Po 1szej NT 16,000 NT
Po 2giej NT 64,000 NT
Po 3ciej NT 256,000 32,000
#116 L-BVH-11 (50 pg) Przed immunizacją NT <100 NT
Po 1szej NT 64,000 NT
Po 2giej NT 106 NT
Po 3ciej NT 2x106 64,000
NT : nie badano
P r z y k ł a d 5
Przykład ten opisuje ochronę zwierząt przed ciężkim, doświadczalnym zarażeniem paciorkowcem przez podanie przeciwciała rozwiniętego przeciw produktom genu BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2.
Preparaty Mab o wysokim mianie otrzymano z płynu surowiczego myszy zaszczepionych dootrzewnowo komórkami hybrydowymi wydzielającymi Mab, zgodnie ze sposobem opisanym przez Brodeur i wsp. (J. Immunol. Methods 71: 265-272, 1984). Próbki surowicy zebrano od szczurów immunizowanych BVH-3M, jak opisano w Przykładzie 4. Surowicę królika zebrano po trzeciej immunizacji i płyn surowiczy użyto dla oczyszczenia przeciwciał przez wytrącenie siarczanem amonu do nasycenia 45 do 50%. Preparaty przeciwciała rozcieńczono i dializowano wobec buforu fosforanowo-solankowego (PBS).
Myszy CBA/N (xid) (National Cancer Institute, Frederick, MA) nastrzyknięto dootrzewnowo zarówno 0,1 ml oczyszczonych przeciwciał króliczych lub 0,2 ml płynu surowiczego przed dożylnym podaniem około 200 CFU S. pneumoniae typu 3 szczepu WU2. Myszy kontrolne otrzymały jałowy PBS Iub przeciwciała oczyszczone z surowicy królików przed immunizacją lub surowicy z królików immunizowanych nie pokrewnym zrekombinowanym antygenem białkowym N. meningitidis. Jednej grupie myszy podano S. pneumoniae przed podaniem przeciwciała anty-BVH-3. Próbki podawanych bakterii S. pneumoniae szczepiono na szalki z agarem czekoladowym dla określenia wartości CFU i zweryfikowania podawanej dawki. Myszy CBA/N wybrano z uwagi na ich wysoką wrażliwość na zarażenie S. pneumoniae. LD50 dla WU2 wstrzykniętych dożylnie myszom CBA/N oszacowano na <10 CFU. Zejścia odnotowywano co 24 godziny przez przynajmniej 7 dni.
Dane dotyczące ochrony otrzymane dla myszy nastrzykniętych króliczym przeciwciałem anty-BVH-3 zebrano w poniższej tabeli 7. Dziewięć z 10 myszy, które otrzymały przeciwciało anty-BVH-3 przeżyło zarażenie w przeciwieństwie do 10 myszy nastrzykniętych przeciwciałem kontrolnym lub buforem PBS, z których nie przeżyła żadna. Obserwacja, że przeciwciało rozwinięte przeciw cząsteczce BVH-3M chroni biernie, nawet gdy podano je po zarażeniu, demonstrowało zdolność przeciwciała anty-BVH-3 do zapobiegania śmierci nawet w wyniku wcześniej istniejącego zarażenia.
T a b e l a 7.
Ochronne działanie króliczego przeciwciała przeciw genowi BVH-3M u myszy CBA/N zarażonych dożylnie paciorkowcem WU2.
Preparat przeciwciała Czas podania przeciwciała Żywe : Martwe Dni od zarażenia do śmierci
Anty-BVH3M 1 godz. przed zarażeniem 5 : 0 >14, >14, >14, >14, >14
Anty-N. meningitidis 1 godz. przed zarażeniem 0 : 5 2 ,2, 2, 2, 2
Anty-BVH-3M 0,5 godz. po zarażeniu 4 : 1 2, >14, >14, >14, >14
Nic (PBS) 1 godz. przed zarażeniem 0 : 5 1, 2, 2, 2, 2
PL 214 229 B1
Myszy CBA/N zarażono 1000 CFU bakterii S. pneumoniae WU2 przed lub po dootrzewnowym podaniu 0,1 ml króliczego przeciwciała.
W innym doświadczeniu 0,1 ml króliczego przeciwciała przygotowanego z surowicy przed immunizacją i surowicy po immunizacji podano dootrzewnowo myszom CBA/N na cztery godziny przed donosowym podaniem 280 CFU szczepu S. pneumoniae P4241 typu 3. Jak widać poniżej w tabeli 8 wszystkie immunizowane myszy przeżyły zarażenie podczas gdy żadna z 9 myszy, które otrzymały surowicę przedimmunizacyjną lub sam bufor nie przeżyła szóstego dnia po zarażeniu. U wszystkich myszy, które przeżyły hodowle S. pneumoniae z krwi pobranej 11 dnia po zarażeniu były ujemne. Ponadto, zaobserwowano 100% obronę u myszy, które otrzymały monoklonalne przeciwciała H112-10G9 lub mieszaninę H112-10G9 i H11B-7E11 skierowanych przeciw BVH-11/BVH-11-2.
T a b e l a 8.
Ochronne działanie biernego przeniesienia króliczego przeciwciała względem produktu genu BVH-3-M lub Mab specyficznych anty-BVH-11/BVH-11-2 u myszy CBA/N zarażonych donosowo paciorkowcem P4241.
Preparat przeciwciała Żywe : Martwe Śmierć w dniu po infekcji
Anty-BVH-3M 5 : 0 >11, >11, >11, >11, >11
Przeciwciało z surowicy przed immunizacją 0 : 5 3, 3, 3, 6, 6
H112-10G9 4 : 0 >11, >11, >11, >11
H112-10G9 + H11-B-7E11 5 : 0 >11, >11, >11, >11, >11
Nic (PBS) 0 : 4 3, 3, 3, 3
Łącznie wyniki z tabeli 7 i Tabeli 8 jasno określają, że immunizacja zwierząt produktem genu BVH-3 takiego jak BVH-3M wywołuje ochronne przeciwciała zdolne zapobiegać doświadczalnej bakteriemii i zapaleniu płuc. Dane dotyczące ochrony uzyskane dla myszy nastrzykniętych płynem surowiczym podano poniżej w tabeli 9. Podanie objętości 0,2 ml płynu surowiczego z 0,2 ml pewnych zestawów płynu surowiczego zapobiega śmierci w wyniku doświadczalnego zarażenia. Przykładowo zestawy dwóch Mab H112-3A4 + H112-10G9 i H112-10G2 + H112-10D7 ustalają pełną ochronę przed doświadczalnym zarażeniem. Dane te dowodzą, że przeciwciało skierowane przeciw epitopom BVH-11 i/lub BVH-11-2 zapewnia wydajną ochronę. Mab H112-3A4, H112-10G9, H112-10D7, H112-10A2, H112-3E8, H112-10CS, H11B-11B8, H11B-15G2, H11B-1C9, H11B-7E11, H11B-13D5 i H11-10B8 występują w przynajmniej jednej ochronnej parze Mab i działają ochronnie będąc reaktywnymi przeciw ochronnym epitopom. Umiejscowienie epitopów warunkujących ochronę na cząsteczkach BVH-11-2 podsumowano w tabeli 10 i Tabeli 29. Ochronne Mab H112-3A4, H112-10G9, H112-10D7, H11210A2, H112-3E8, H112-10C5, H11B-11B8, H11B-15G2, H11B-1C9, H11B-7E11, H11B-13D5 i H1110B8 wszystkie reagują z białkiem New10 odpowiadającym aminokwasom 271 do 838 cząsteczki BVH-11-2. Sześć z tych dwunastu Mab było skierowanych przeciw epitopom występującym w białku NEW19 i 3 chroniące Mab rozpoznawały NEW14. Co interesujące, Mab H112-3A4 i H112-10C5 reagowały z różnymi epitopami wyłącznie z BVH-11-2 umiejscowionymi na końcu karboksylowym i zawartymi pomiędzy aminokwasami 769 i 837. Również Mab H11-7G11, H11-6E7 i H3-4F9 reagowały z epitopami wspólnymi dla cząsteczek BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 z paciorkowca nie powodując ochrony nawet gdy podawano je w połączeniu z ochronnymi Mab H112-10G9 lub H112-11B8. Te Mab rozpoznawały epitopy umiejscowione na aminowym końcu cząsteczek BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 obejmujące odpowiednio pierwsze 225, 228 i 226 aminokwasów. Porównanie sekwencji białek BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 ujawniło, ze znaczna liczba aminokwasów była konserwatywna w amino-końcowej części obejmującej te 225-228 aminokwasów o łącznie 72,8% identyczności (Fig. 32).
Łącznie wyniki podane poniżej w tabeli 9 i tabeli 10 sugerują, że ochrona wywołana epitopami BVH-11- i BVH-11-2 jest związana z karboksylowym końcem obejmującym aminokwasy 229 do 840 i 227 do 838 z odpowiednio białek BVH-11 i BVH-11-2.
PL 214 229 B1
T a b e l a 9.
Bierna immunizacja Mab specyficznymi dla BVH-11- i/lub BVH-11-2 może chronić myszy przed doświadczalnym zarażeniem śmiertelną dawką paciorkowca.
Doświadczenie Mab Żywe : Martwe Dni do śmierci po zarażeniu
1 H112-3A4 + H112-10G9 6 : 0 6 x >10
H112-3A4 + H112-10D7 5 : 1 4, 5 x >10
Brak 0 : 6 2, 2, 2, 2, 2, 6
2 H112-10A2 + H112-10D7 5 : 1 3, 5 x >10
H112-3E8 + H112-10G9 6 : 0 6 x >10
Brak 0 : 6 2, 2, 2, 2, 1, 2
3 H112-10D7 + H11B-11B8 6 : 0 6 x >10
H112-10G9 - H11B-15G2 3 : 3 2, 6, 6, 3 x >10
Brak 0 : 6 2, 2, 2, 2, 2, 2
4 H112-10G9 + H112-10D7 5 : 0 5 x >11
Brak 0 : 5 2, 2, 2, 2, 2
5 H112-10G9 - H11-10B8 4 : 1 8, 4 x >14
H112-10G9 + H11B-7E11 5 : 0 5 x >14
Brak 0 : 3 1, 2, 2
6 H112-10G9 - H11B-1C9 4 : 1 4, 4 x >14
Brak 0 : 3 2, 2, 2
7 H112-10C5 + H11B-13D5 5 : 0 5 x >14
Brak 3 : 3 2, 2, 2
Myszy CBA/N nastrzyknięto dootrzewnowo łącznie 0,2 ml płynu surowiczego na 4 godz. przed dożylnym podaniem S. pneumoniae WU2.
T a b e l a 10.
Wydedukowana lokalizacja warunkujących ochronę epitopów cząsteczek BVH-11-2.
Mab Ochrona Produkty genu niosące epitopy dla Mab
1 2 3
H112-3A4 + NEW19 i NEW11
H112-10G9 + NEW19
H112-10D7 + NEW14 i NEW10
H112-10A2 + NEW19
H112-3E8 + NEW19
H11B-11B8 + NEW19
H11B-15G2 + NEW18
H11B-7E11 + NEW14 i NEW10
H11-10B8 + NEW18
H11B-1C9 + NEW14 i NEW10
H112-3A1 - NEW18 i NEW8
H112-10H10 - NEW18 i NEW8
H112-2H7 - BVH-11-2M
PL 214 229 B1 ciąg dalszy Tabeli 10
H112-6H7 - BVH-11-2M
H11-7G11 - BVH-11A i BVH-3C
H11-6E7 - BVH-11A i BVH-3C
H112-10C5 + NEW19, NEW11 i 3A4.1
H11B-13D5 + NEW19
H112-7G2 - NEW18
H112-7E8 - BVH-11-2M
H3-4F9 - BVH-11A i BVH-3C
Łącznie dane przedstawione w tych przykładach określają potencjalne zastosowanie przeciwciał rozwiniętych przeciw cząsteczkom BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2 w sensie leczniczym do zapobiegania, diagnozowania i leczenia chorób wywołanych S. pneumoniae.
P r z y k ł a d 6.
Przykład ten opisuje lokalizację prezentowanych na powierzchni domen peptydu przy pomocy opisanych w Przykładzie 1 Mab.
S. pneumoniae typu 3 szczepu WU2 hodowano w pożywce Todd Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Ditroit, MI) wzbogaconej 0,5% ekstraktem z drożdży (Difco Laboratories) w 37°C w atmosferze z 8% CO2 co dało hodowlę o OD600 0,260 (~108 CFU/ml). Tę zawiesinę bakterii rozdzielono następnie na 1 ml próbki i komórki S. pneumoniae osadzono przez wirowanie i zawieszono w nadsączach z hodowli hybrydom. Następnie zawiesiny bakterii inkubowano przez 2 godz. w 4°C. Próbki płukano dwukrotnie w buforze do blokowania [PBS zawierający 2% albuminę z surowicy bydlęcej (BSA)] i następnie dodano 1 ml kozich przeciwciał, skoniugowanych z fluoresceiną (FITC) przeciw mysim IgG + IgM w buforze do blokowania. Po dalszym inkubowaniu przez 60 min. w temperaturze pokojowej próbki płukano dwukrotnie w buforze do blokowania i utrwalono 0,25% formaldehydem w buforze PBS i zawieszono w 500 μl buforu PBS. Komórki trzymano w ciemności w 4°C aż do chwili badania przez cytometrię przepływową (Epics® XL; Beckman Coulter, Inc.). W przypadku każdej próbki analizowano 10 tysięcy (10 000) komórek i wyniki wyrażono jako % fluorescencji i wartości indeksu fluorescencji (FI). Procent fluorescencji to liczba wyznakowanych fluoresceiną komórek S. pneumoniae podzielona przez 100 i wartość FI jest wartością średnią fluorescencji paciorkowców poddanych działaniu nadsączu Mab podzieloną przez wartość fluorescencji paciorkowców poddanych działaniu samego konigatu lub z kontrolnym nie pokrewnym Mab. Wartość FI wynosząca 1 dowodzi, że Mab nie były wykryte na powierzchni bakterii, podczas gdy wartość FI wyższa niż 2 jest traktowana jako pozytywna gdy przynajmniej 10% komórek paciorkowców wyznakowano i wskazywała, że Mab były reaktywne z epitopami prezentowanymi na powierzchni komórki. Poniższa Tabela 11 podsumowuje dane dla Mab badanych przez cytometrię przepływową.
Badania przez cytometrię przepływową ujawniły, że Mab reaktywne z cząsteczkami BVH-3C i/lub BVH-11A nie wiążą się z powierzchnią komórki. Przeciwnie, z wyjątkiem Mab H3V-9C6 i H3V16A7, Mab reaktywne z NEW1, NEW2, NEW3, NEW22 lub NEW23 będących produktami genu BVH-3 były wykrywane na powierzchni paciorkowca. Dane te dowodzą, że pierwszych 225 aminokwasów umiejscowionych na aminowym końcu BVH-3 to aminokwasy wewnętrzne. Utrata wiązania Mab H3V9C6 i H3V-16A7 sugeruje, że pewna część sekwencji odpowiadająca 177 aminokwasom nie występującym w cząsteczce BVH-3 z S. pneumoniae SP63 wydaje się nie być dostępna dla przeciwciał.
Wyniki dotyczące reaktywności Mab z BVH-11 i/lub BVH-11-2 ujawniły istnienie dobrej zależności pomiędzy prezentacją na powierzchni i ochroną. Wszystkie Mab reaktywne z wew-nętrznymi epitopami, co określono oznaczeniem cytometrii przepływowej, nie posiadały właściwości ochronnych, podczas gdy wszystkie Mab opisane w Przykładzie 5 jako ochronne, dają pozytywny sygnał w cytometrii przepływowej. Choć wartość FI wynosząca 9,0 i procent fluorescencji 81,2 otrzymano dla Mab H11-7G11, to takie Mab nie ujawniało właściwości ochronnych. Dodatkowe oznaczenia mogą być użyte dla dalszej oceny czy to Mab i odpowiadające mu epitopy mogą uczestniczyć w odporności na infekcję.
PL 214 229 B1
T a b e l a 11.
Wyniki wiązania Mab na powierzchni S. pneumoniae uzyskane analizą cytometrii przepływowej.
Mab % fluorescencji FI Wiązanie Niosące epitop Mab produkty genu
1 2 3 4 5
H3-4F9 3,4 1,2 - BVH-3C i BVH-11A
H3-4D4 3,4 1,2 - BVH-3C i BVH-11A
H3-9H12 2,5 1,1 - BVH-3C i BVH-11A
H3-7G2 66,2 6,3 + NEW22
H3-10A1 58,8 5,6 + NEW23
H3-4D3 33,2 3,5 + NEW3
H3V-4F3 24,4 2,9 + NEW1
H3V-2F2 15,6 2,4 + NEW2
H3V-7F4 58,7 5,6 + NEW2
H3V-7H3 68,8 6,9 + NEW3
H3V-13B8 75,0 7,7 + NEW3
H3V-902 66,4 6,2 + NEW22
H3V-906 2,9 1,0 - NEW22
H3V-16A7 6,6 1,7 - NEW23
H3V-15A10 58,7 5,7 + NEW22 i NEW23
HN1-5H3 43,4 5,3 + NEW1
HN1-8E3 57,4 6,6 + NEW1
HN1-14F6 57,8 6,7 + NEW1
HN1-2G2 54,8 6,3 + NEW2
HN1-12D8 14,3 3,0 + NEW2
HN1-14B2 11,5 2,7 + NEW2
HN1-1G2 59,9 7,0 + NEW3
HN1-10C12 13,6 2,8 + NEW3
H11-6E7 4,9 1,2 - BVH-3C i BVH-11A
H11-10H10 6,5 1,6 - BVH-3C i BVH-11A
H11-7G11 81,2 9,0 + BVH-3C i NEW2
H11-1B12 3,1 1,2 - BVH-11A
H11-7B9 2,4 1,1 - BVH-11A
H11-10B8 81,1 9,1 + NEW18 i NEW8
H11-1A2 84,4 10 + NEW18 i NEW8
H11-3H5 84,0 9,8 + NEW18 i NEW8
H12-13C11 49,3 5,9 + NEW18 i NEW8
H112-10H10 0,4 1,0 - BVH-11A i NEW18
H112-1D8 0,4 1,0 - BVH-11A i NEW18
H112-10G9 78,9 10,4 + NEW19
H112-10A2 75,5 9,6 + NEW19
PL 214 229 B1 ciąg dalszy Tabeli 11
H112-3E8 62,5 7,5 + NEW19
H112-10D7 64,5 7,7 + NEW14
H112-2H7 0,7 1,1 - BVH-11A
H112-6H7 0,3 1,0 - BVH-11A
H112-3A4 70,1 8,9 + NEW11
H112-10C5 86,3 9,2 + NEW11 i 3A4,1
H112-14H6 89,6 11 + NEW11
H112-14H6 0,8 1,4 - NEW11
H112-7G2 4,7 2,0 - NEW18
H112-13H10 0,5 1,0 - NEW18
H112-7E8 0,4 1,0 - BVH-11-2M
H112-7H6 0,2 1,0 - BVH-11-2M
H11B-5F10 3,1 1,1 - NEW18
H11B-15G2 60,2 5,7 + NEW18 i NEW8
H11B-13D5 75,7 8,3 + NEW19
H11B-11B8 78,4 8,3 + NEW19
H11B-7E11 32,3 3,5 + NEW14
H11B-1C9 25,3 5,5 + NEW14
H11B-5E3 1,8 1,0 - NEW7
H11B-6E8 2,4 1,0 - NEW7
P r z y k ł a d 7
Przykład ten opisuje immunizację zwierząt epitopami peptydowymi BVH-3 i BVH-11-2.
Zrekombinowanym wektorem pSCREEN-T (Novagen, Madison, WI) zawierającym fragment DNA (nukleotydy 2421 do 2626 z SEQ ID NO:5) kodujący epitop 3A4 dla Mab (SEQ ID NO:24) transformowano, przez elektroporację (aparat Gene Pulser II BIORAD Labs, Mississauga, Kanada) bakterie E. coli Turner ^DE3) pLysS [BL21 (F' ompT hsdSB (rBmB) gal dcm IacYI pLysS (Cmr)] (Novagen). W szczepie tym ekspresja białka fuzyjnego jest kontrolowana przez promotor T7 rozpoznawany przez T7 RNA polimerazę (kodowaną przez profaga λDΕ3, która sama znajduje się pod kontrolą promotora Iac indukowanego przez izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Plazmid pLysS ogranicza poziom ekspresji podstawowego białka fuzyjnego kodując lizozym T7 będący naturalnym inhibitorem T7 RNA polimerazy.
Transformanty hodowano w 37°C wytrząsając przy 250 obr./min. w pożywce LB (pepton 10 g/l, ekstrakt z drożdży 5 g/l, NaCl 5 g/l) uzupełniony 50 mM glukozy, 100 pg/ml karbenicyliny i 34 pg/ml chloramfenikolu aż do momentu, gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie wartość 0,7. Nadekspresja genu T7 dla fuzji białko-znacznik His-3A4.1 była następnie indukowana przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 nM i dalej inkubację prowadzono przez 3 godziny w 25°C wytrząsając przy 250 obr./min. Zaindukowane komórki z 800 ml hodowli osadzono przez wirowanie i zamrożono w -70°C. Białko fuzyjne oczyszczono z rozpuszczalnej frakcji komórkowej przez chromatografię powinowactwa opartą na wiązaniu sekwencji sześciu histydyn (His-Tag) z dwu wartościowymi kationami (Ni2+) unieruchomionymi na żywicy chelatującej metal Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Kanada). Krótko, osadzone komórki strawiono i zawieszono w zbuforowanym Tris roztworze sacharozy (50 mM Tris, 25% (wag/obj) sacharoza) i zamrożono przez 15 minut w 70°C. Komórki inkubowano 15 minut w lodzie w obecności 2 mg/ml lizozymu przed rozbiciem przy pomocy ultradźwięków. Lizat żwirowano przy 12 tysiącach obr/min przez 30 minut i do nadsączu dodano żywicę NTA ze związanym niklem prowadząc inkubację przez noc w 4°C wytrząsając przy 100 obr/min. Po przepłukaniu żywicy buforem zawierającym 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol pH 7,9, fuzję białkową 3A4.1 wypłukano tym samym
PL 214 229 B1 buforem uzupełnionym 250 mM imidazolem. Usunięcie soli i imidazolu przeprowadzono przez dializę wobec PBS w 4°C. Stężenie białka określono przy pomocy zestawu BCA dla oznaczania białka (Pierce, Rockford, IL) i ustalono na 760 pg/ml.
Dla oszacowania czy immunizacja sekwencją epitopu peptydowego może ustanowić ochronę przeciw chorobie grupy sześciu samic myszy CBA/N (xid) (National Cancer Institute) trzykrotnie, w odstępach 3 tygodniowych, immunizowano podskórnie oczyszczonym przez powinowactwo białkiem fuzyjnym białko-His^Tag-3A4.1 produktem genu T7gene10 lub jako kontrolą samym adjuwantem QuilA w PBS. Dwanaście do czternastu dni po trzeciej immunizacji myszom podano donaczyniowo S. pneumoniae szczepu WU2 lub donosowo szczep P4241. Stanowiące inokulum próbki S. pneumoniae szczepiono na szalki z agarem czekoladowym celem określenia CFU i zweryfikowania podanej dawki. Podana dawka wynosiła w przybliżeniu 300 CFU. Zgony odnotowywano codziennie przez okres 14 dni i dnia 14 po zarażeniu. Myszy, które przeżyły zabito i próbki krwi badano z uwagi na występowanie S. pneumoniae. Białko 3A4.1 lub inne badane białka są określane jako chroniące gdy liczba myszy, która przeżyła zarażenie lub średnia liczba dni do śmierci jest znacząco większa u grupy immunizowanej 3A4.1 w porównaniu z grupą kontrolną immunizowaną ślepą próbą.
P r z y k ł a d 8
Przykład ten ilustruje poprawę odpowiedzi w formie przeciwciała przeciw paciorkowcowi przy pomocy fragmentów BVH-3 i jego wariantów.
Połączone wyniki uzyskane z badań nad reaktywnością Mab ze skróconymi produktami genu, koloniami prezentującymi epitop i żywymi, nie uszkodzonymi paciorkowcami przedstawione w Przykładach 2, 3 i 6 pozwalają na powiązanie epitopów powierzchniowych i epitopów wewnętrznych. Epitopy wykryte przez Mab wydajnie wiążącymi się z komórkami paciorkowców mapują się w obszarach obejmujących aminokwasy 223 do 1039 z BVH-3 opisanego jako SEQ ID NO:6. Występowanie chroniących epitopów w karboksylowej połowie BVH-3 potwierdzono pokazując, że myszy immunizowane cząsteczką NEW1 były chronione przed ciężkim zarażeniem szczepem P4241.
Porównanie sekwencji genu ujawnia, że w pewnych szczepach brak jest obszaru BVH-3 kodującego aminokwasy 244 do 420 jak opisano w SEQ ID NO:6, co sugeruje brak wykorzystywania tej sekwencji w szczepionce zapobiegającej chorobie powodowanej przez takie szczepy (SEQ ID NO:9 versus SEQ ID NO:1). Ponadto fragmenty lub warianty BVH-3 zaprojektowano celem opracowania uniwersalnej wysoce skutecznej szczepionki adresującej odpowiedź immunologiczną przeciw ochronnym epitopom prezentowanym na powierzchni. Fragmenty genu BVH-3 oznaczone NEW1 (kodujące aminokwasy 472 do 1039 z SEQ ID NO:6) i NEW40 (kodujące aminokwasy 408 do 1039 z SEQ ID NO;6) namnożono przez PCR ze szczepu SP64 S. pneumoniae stosując pary oligonukleotydów zaprojektowane dla amplifikacji odpowiedniego fragmentu genu. Każdy ze starterów zawiera na 5' końcu miejsce dla enzymu restrykcyjnego umożliwiające bezpośrednie klonowanie w ramce produktów amplifikacji w strawionym wektorze plazmidowym. Strawione endonukleazą restrykcyjną produkty namnożone przez PCR wbudowano przy pomocy ligazy do zlinearyzowanego przez podobne trawienie plazmidowego wektora ekspresyjnego pET21 (Novagen). Startery oligonukleotydowe HAMJ489 (ccgaattccatatgcaaattgggcaaccgactc; NdeI) i HAMJ279 (cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc; HindIII) użyto dla konstrukcji NEW40. Klony najpierw ustabilizowano w E. coli DH5a przed wprowadzeniem dla ekspresji skróconych produktów genu do E. coli BL21 ^DE3). Warianty od NEW1 do NEW40 wytworzono przez mutagenezę przy pomocy zestawu Quickchange Site Directed Mutagenesis ze Stratagene i oligonukleotydów zaprojektowanych dla włączenia odpowiedniej mutacji. Obecność sześciohistydynowego znacznika na C końcach zrekombinowanych cząsteczek ułatwia oczyszczanie białek przez chromatografię na niklu. Poniższe tabele 12 i 13 opisują odpowiednio sekwencje starterów użytych w doświadczeniach z mutagenezą i wytworzone warianty będące produktami genu.
Doświadczenia z mutagenezą przy pomocy zestawów starterów 39, 40, 46, 47 lub 48 doprowadziły do cichych zmian i były wykonane celem poprawy ekspresji pożądanego genu lub fragmentu genu bowiem zaobserwowano, że podczas ekspresji genu BVH-3 i jego fragmentów, współekspresji ulegają krótsze, wtórne produkty translacji.
PL 214 229 B1
T a b e l a 12.
Lista zestawów oligonukleotydowych starterów do PCR użytych dla miejscowo specyficznej mutagenezy skróconych genów BVH-3.
Zestaw startera Oznaczenie startera SEQ ID NO Sekwencja startera 5’->3’
9 HAMJ513 HAMJ514 177 178 GAATCAGGITTTGTCATGAGTTCCGGAGACCACAATCATT ATTTC GAAATAATGATTGTGGTCTCCGGAACTCATGACAAAACC TGATTC
10 HAMJ515 HAMJSl 6 179 180 GTCATGAGTTCCGGAGACTCCAATCATTATTTCTTCAAGA AGG CCTTCTTGAAGAAATAATGATTGGAGTCTCCGGAACTCAT GAC
tl HAMJ517 HAMJSl 8 181 182 ATGAGTTCGGAGACTCCAATTCTTATTTCTTCAAGAAGGA CTTG CAAGTCCTTCTTGAAGAAATAAGAATTGGAGTCTCCGGA ACTCAT
14 CHAN51 CHAN52 183 184 GCGATTATTTATCCGTCTGGAGATCACCATCATGC GCATGATGGTGATCTCCAGACGGATAAATAATCGC
17 CHAN53 CHAN54 185 186 CCGTCTGGAGATGGCCATCATGCAGATCCG CGGATCTGCATGATGGCCATCTCCAGACGG
19 CHAN47 CHAN48 187 188 CCGCAGGGAGATAAGCGTCATGCAGATCCGATTG CAATCGGATCTGCATGACGCTTATCTCCCTGCGG
20 CHAN55 CHAN56 189 190 CCGTCTGGAGATGGCACTCATGCAGATCCGATTG CAATCGGATCTGCATGAGTGCCATCTCCAGACGG
22 CHAN57 CHAN58 191 192 CCGTCTGGAGATGGCACTTCTGCAGATCCGATTGATG CATCAATCGGATCTGCAGAAGTGCCATCTCCAGACGG
23 HAMJ523 HAMJ524 193 194 CCGCATGGAGATGGCCATCATGĆAGATCCG CGGATCTGCATGATGGCCATCTCCATGCGG
24 HAMJ526 HAMJS27 195 196 GTCATGAGTCACGGAGACTCCAATCATTATTTCTTCAAGA AGG CCTTCTTGAAGAAATAATGATTGGAGTCTCCGTGACTCAT GAC
25 HAMJ528 HAMJ529 197 198 ATGAGTCACGGAGACCAĆAATTTCTTATTTCT'TCAAGAAGG ACTTG CAAGTCCTTCTTGAAGAAATAAGAATTGTGGTCTCCGTGA CTCAT
29 HAMJ569 HAMJ570 199 200 TACCTCATTATGACTCTTACTCTAACATCAAATTTGAGTG GTTTG CAAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAAGAGTCATAAT GAGGTA
30 HAMJ571 HAMJ572 20 Ϊ 202 TACCTTCTTATGACCATTACTCTAACATCAAATTTGAGTG GTTTG AAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAATGGTCATAAGA AGGTA
31 HAMJ573 HAMJ574 203 204 AACGGTAGTTTAATCATACCTTCTAAAGACCATTACCATA ACATC GATGTTATGGTAATGGTCTTTAGAAGGTATGATTAAACTA CCGTT
32 HAMJ575 HAMJ576 205 206 CGGTAGTTTAATCATACCTCATAAGGACTCTTACCATAAC ATCAAA TTTGATGTTATGGTAAGAGTCCTTATGAGGTATGATTAAA CTACCG
33 HAMJ577 HAMJ578 207 208 AACGGTAGTTTAATCATACCTGACCATTACCATAACATCA AATTTG CAAATTTGATGTTATGGTAATGGTCAGGTATGATTAAACT ACCGTT
PL 214 229 B1
34 HAMJ579 HAMJ58O 209 210 AACGGTAGTTTAATCATACCTTACCATAACATCAAATTTG AGTGG CCACTCAAATTTGATGTTATGGTAAGGTATGATTAAACTA CCGTT
35 HAMJ581 HAMJ582 21ł 212 ACCGGTAGTTTAATCATACCTAACATCAAATTTGAGTGGT TTGAC GTCAAACCACTCAAATTTGATGTTAGGTATGATTAAACTA CCGTT
37 HAMJ536 HAMJ537 213 214 CCTATGTAACTCCACATATAACCCATAGCCACTGG CCAGTGGCTATGGGTTATATGTGGAGTTACATAGG
39 ΗΑΜ1550 HAMJ551 215 216 CGTGAAAGTATTGTCGTAAATAAAGAAAAAAATGCG CGCATTTTTTTCTTTATTTACGACAATACTTTCACG
40 HAMJ586 HAMJ587 217 218 CATGAAGAAGATGGTTACGGTTTCGATGĆTAAĆĆGTATTA TCGCTGAAG CTTCAGCGATAATACGGTTAGCATCGAAACCGTAACCAT CTTCTTCTG
41 HAMJ588 HAMJ589 219 220 GAATCAGGTTTTGTCATGAGTGACCACAATCATTATTTCT TC GAAGAAATAATGATTGTGGTCACTCATGACAAAACCTGA TTC
42 HAMJ590 HAMJ591 222 GAAGATGAATCAGGTirTGfCATGAGTAATCATTATTTCT TCAAG CTTGAAGAAATAATGATTACTCATGACAAAACCTGATTC ATCTTC
43 HAMJ592 HAMJ593 223 224 GAAGATGAATCAGGTTTTGTCATGAGTTATTTCTTCAAGA AGGAC GTCCTTCTTGAAGAAATAACTCATGACAAAACCTGATTCA TCTTC
44 HAMJ594 HAMJ595 225 226 AAAATGCGATTATTTATCCGCACCATCATGCAGATCCGAT TG CAATCGGATCTGCATGATGGTGCGGATAAATAATCGCAT TTT
45 HAMJ600 HAMJ601 227 228 AAAATGCGATTATTTATCĆGGĆAGATCCGATTGATGAAC ATAAAC GTTTATGTTCATCAATCGGATCTGCCGGATAAATAATCGC ATTTT
46 HAMJ604 HAMJ605 229 230 GATGCTAACCGTATAATCGCCAAGACGAATCAGGTTTTGT CATG CATGACAAAACCTGATTCGTCTTCGGCGATTATACGGTTA GCATC
47 HAMJ606 HAMJ607 231 232 CGCCGAAGACGAATCCGGCTTTGTAATGAGTCACGGAGA CTCC GGAGTCTCCGTGACTCATTACAAAGCCGGATTCGTCTTCG GCG
48 HAMJ608 HAMJ609 233 234 CATCTCATGAACAGGATTATCCCGGCAACGCCAAAGAAA TGAAAG CTTTCATTTCTTTGGCGTTGCCGGGATAATCCTGTTCATGA GATG
PL 214 229 B1
T a b e l a 13.
Lista skróconych wariantów produktów genu BVH-3 wytworzonych przez S. pneumoniae SP64
Oznaczenie białka Gen/bialko SEQiDNO Oznaczenie białka Zestaw startera do PGR (patrz tabela 12) Gen użyty w mutagenezie
NEW1- mut** 255 NEW1 39 NEW1
NEW35A 256 NEW1 550-SGDGTS-555 14, 17,20, 22 NEW1
NEW42 349 NEW40 55-SGD.SNS-60 144-SGPGTS-149 9, 10, 11, 14, 17,20,22 NEW40
NEW49 350 NEW40 55-SGDHNH-60 9 NEW40
NEW50 351 NEW40 55-SGDSNH-60 10 NEW49
NEW51 352 NEW40 55-SGDHNH-60 144-SGDHHH149 14 NEW49
NEW52 353 NEW40 55-SGD.SNH-60 144-SGDGHH-149 10, 17 NEW51
NEW53 354 NEW40 55-HGDHNH-60 144-SGDHHH149 14 NEW40
NEW54 355 NEW40 55-HGDHNH-60 144-SGDGHH149 17 NEW53
NEW55 356 NEW1 55G-HGDGHH-555 23 NEW1
NEW56 357 NEW40 55-HGDSNH-óO 144-SGDHHH149 24 NEW53
NEW56- mut2** 358 NEW56 40 NEW56
NEW56- mut3 * 359 NEW56 46,47,48 NEW56
NEW57 360 NEW40 55-HGDHNS-óG 144-SGDHHH149 25 NEW53
NEW63 361 NEW40 55-HGDSNH-óO 144-HGDHHH149 24 NEW40
NEW64 362 NEW40 55-HGDHNS-60 144-HGDHHH- 25 NEW40
149
NEW65 363 NEW40 55-HGDSNH-60 149 144-HGDGHH- 23 NEW63
NEW66 364 NEW40 55-HGDHNS-60 149 144-HGDGHH- 23 NEW64
NEW76 365 NEW40 55-HGDHNS-60 149 144-SGDGHH- 17 NEW64
NEW105 366 NEW40 55- -60 41,42,43 NEW40
NEW106 367 New40 144- -149 44,45 NEW40
NEW107 368 NEW40 55- -60 144- -149 44, 45 NEW 105
*podkreślone aminokwasy obrazują modyfikację w sekwencji białka.
Nukleotydy/aminokwasy uległy delecji w konstruktach NEW105, nEW106 i NEW107. **mutacja cicha, tj. polipeptyd jest taki sam jak New1.
Grupy 7 lub 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowanych jak to opisano wcześniej w przykładzie 1 użyto w doświadczeniach badających ochronę przeciw donosowemu zarażeniu wirulentnym szczepem S. pneumoniae P4241. Myszy obserwowano przez 10 do 14 dni po zarażeniu. Dane z tabeli 15 jasno wskazują, że cząsteczka NEW35A była równoważnikiem rodzicielskiej NEW1, w kategoriach ochrony. Co ciekawe, wysoki poziom przeżywalności otrzymano dla grup immunizowanych NEW40 i NEW56, w których przeżyło odpowiednio 7 i 8 z 8 zwierząt. Podobnie, NEW25 zawierający aminokwasy 233 do 1039 ochronił 7 z 8 zwierząt przed śmiertelnym zarażeniem.
PL 214 229 B1
T a b e l a 14.
Ochrona zależna od fragmentów lub wariantów BVH-3 w doświadczalnym zapaleniu mózgu.
Dośw. Immnunogen Żywe : Martwe Śmierć w dniu po zarażeniu
1 Quil A 0 8 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4. 4
NEW1 5 3 5, 7, 7, >14, >14, >14, >14, >14
NEW35A 5 2 9, 10, >14, >14, >14, >14, >14
NEW40 7 1 13, >14, >14, >14, >14, >14, >14, >14
BVH-3M 4 4 7, 8, 10, 12, >14, >14, >14, >14
2 Quil A 0 8 3, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4
NEW52 4 4 7, 7, 8, 9, >10, >10, >10, >10
NEW56 8 0 8 x > 10
NEW40 7 1 6, >10, >10, >10, >10, >10, >10, >10
3 Quil A 0 8 3, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4
NEW25 7 1 6, >13, >13, >13, >13, >13, >13, >13
Ponadto, analizy przez cytometrię przepływową zdolności do wiązania surowicy z przeciwciałami z zaszczepionych zwierząt ujawniła, że przeciwciała NEW40 i NEW56 znakują żywe, nie uszkodzone paciorkowce wydajniej niż przeciwciała rozwinięte przeciw BVH-3M (Tabela 15).
T a b e l a 15.
Wiązanie mysiej surowicy z przeciwciałami na powierzchni S. pneumoniae typu 3 szczepu WU2 jak zmierzono przez cytometrię przepływową.
Surowica odpornościowa Indeks fluorescencji
Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Doświadczenie 4
BVH-3M 9,2 11,4 14,5 11.7 ± 1,5
NEW1 11,5 10,1 nd* 10,8 ± 0,7
NEW35A 14,3 12,9 nd 13,6 ± 0,7
NEW40 20,4 19,1 20,2 19,9 ± 0,4
NEW56 nd 16,7 20,2 18,5 ± 1,8
NEW52 nd 16.6 19,3 18,0 ± 1,4
Sam adjuwant 1,9 1,6 1,2 1,6 ± 0,2
* nd: nie wykonano.
Wyniki cytometrii są wyrażone jako wartość indeksu fluorescencji, gdzie indeks fluorescencji jest wartością średnią fluorescencji paciorkowców poddanych działaniu badanej surowicy podzieloną przez wartość fluorescencji tła paciorkowców poddanych działaniu samego fluorescencyjnego koniugatu. W tych oznaczeniach cytometrii przepływowej wszystkie surowice użyto w rozcieńczeniu 1:50 i surowica z myszy immunizowanych fragmentem BVH-3C lub samym adjuwantem QuilA dały wartość podobną do wartości tła.
Choć ochrona i dane o wiązaniu paciorkowców przeciwciałem wykazują, ze szczepienie przy pomocy cząsteczek NEW1 lub NEW40 i ich wariantów kierują odpowiedź immunologiczną przeciw konserwatywnym ochronnym epitopom prezentowanym na powierzchni.
P r z y k ł a d 9
Przykład ten opisuje klonowanie i ekspresję chimerowego genu BVH-11-2 z delecją, kodującego chimerowy polipeptyd odpowiadający konserwatywnym ochronnym epitopom BVH-11-2 prezentowanym na powierzchni występującym u większości jeśli nie u wszystkich szczepów S. pneumoniae.
Fragmenty genu BVH-11-2 odpowiadające 4 obszarom genu zamplifikowano przez PCR stosując pary oligonukleotydów skonstruowane dla amplifikacji fragmentów pochodzących z SEQ ID NO:5 i obejmujących nukleotydy 1662 do 1742, 1806 do 2153, 2193 do 2414 i 2484 do 2627 z genu BVH11-2 pochodzącego ze szczepu Sp64 S. pneumoniae.
Użyto starterów HAMJ490-491, HAMJ492-HAMJ493, HAMJ494-HAMJ495, HAMJ496HAMJ354 posiadających na 5' końcu miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej, które pozwala na bezpośrednie klonowanie w fazie zamplifikowanych produktów w strawionym wektorze plazmidowym
PL 214 229 B1 pET21b (+) (Tabela 16). Produkty namnożone przez PCR strawiono endonukleazami restrykcyjnymi i wbudowano przy pomocy ligazy do zlinearyzowanego wektora plazmidowego pSL301 strawionego w podobny sposób, z wyjątkiem namnożonego przez PCR fragmentu otrzymanego przy pomocy pary starterów HAMJ490-HAMJ491. Produkty amplifikacji przez PCR przy pomocy HAMJ490-HAMJ491 oczyszczono z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z QIAgen (Chatsforth, CA) i wbudowano przy pomocy ligazy do wektora plazmidowego pGEM-T bez uprzedniego trawienia jakąkolwiek endonukleazą restrykcyjną. Otrzymane konstrukty plazmidów potwierdzono przez analizę sekwencji nukleotydowej. Zrekombinowane plazmidy zawierające każdy z czterech powyższych strawiono endonukleazą restrykcyjną odpowiadającą 5' końcom każdej pary starterów użytych dla amplifikacji PCR. Fragmenty oczyszczono z żelu agarozowego, podobnie jak to opisano wcześniej i wszystkie wybudowano przy pomocy ligazy do zlinearyzowanego plazmidu pET21b (+) strawionego enzymami restrykcyjnymi NdeI i HindIII dla klonowania w fazie czterech różnych obszarów genu BVH11-2. Klony najpierw stabilizowano w E. coli DH5a przed wprowadzeniem do E. coli BL21 ^DE3) dla ekspresji chimerowej cząsteczki białka paciorkowca.
Otrzymana sekwencja genu NEW43 (SEQ ID NO 257) jest opisana na fig. 33.
Wydedukowana sekwencja aminokwasowa białka NEW43 (SEQ ID NO 258) jest opisana na fig. 34.
T a b e l a 16.
Lista oligonukleotydowych starterów do PCR użytych do konstrukcji NEW43, VP43S i NEW86.
Starter SEQ ID NO Sekwencja 5’-3’ Pozycja nukleotydu Miejsce restrykcyjne
HAMJ490 259 ccgaattccatatgcaaattacctacactgatgatg SEQ ID 5: 1662-1683 Ndel
HAMJ491 260 ggactagtatcaaagatataaccgtcttc SEQID5: 1742-1722 Spel
HAMJ492 261 ggactagttggattaaaaaagatagtttgtctg SEQID5: 1806-1830 Spel
HAMJ493 262 ttcccgcggttcgacatagtacttgacagtcg SEQID 5:2153-2131 SacII
HAMJ494 263 ttcccgcggaacgctagtgaccatgttcg SEQ ID 5: 2193-2212 SacII
HAMJ495 264 cggggtaccaggaatttcagcctcatctgtg SEQID5: 2414-2393 KpnI
HAMJ496 265 cccggtacccctagtattagacaaaatgctatggag SEQ ID 5: 2484-2510 KpnI
HAMJ354 65 cgccaagcttctgtataggagccggttgac SEQ ID 5: 2627-2608 Hindlll
HAMJ583 266 ggatcccgggaggtatgattaaactaccg SEQ ID 5: 2039-2021 Smal
HAMJ584 267 catgcccgggaacatcaaatttgagiggtttgac SEQ ID 5: 2058-2081 Smal
HAMJ6I0 268 cttgatcgacatatgttggcaggcaagtacacaacag SEQID5: 1701-1722 Ndel
T a b e l a 17.
Lista skróconych fragmentów genu BVH-11-2 wytworzonych z S. pneumoniae SP64 dla konstrukcji NEW43.
Zestaw starterów do PCR Zaprojektowany fragment genu Odpowiadające mu aminokwasy z SEQ ID NO: 8 Wektor do klonowania
HAMJ490-HAMJ491 NEW43a 517 - 543 pGEM-T
HAMJ492-HAMJ493 NEW43b 565 - 680 pSL301
HAMJ494-HAMJ495 NEW43c 694 - 767 pSL301
HAMJ496-HAMJ354 NEW43d 791 - 838 pSL301
T a b e l a 18.
Właściwości genów NEW86 i VP43S wytworzonych z genu NEW3.
Zestaw starterów do PCR Oznaczenie genu/białka Identyfikacja
HAMJ610-HAMJ354 VP43S NEW43 C' koniec odpowiada resztom 15-272 (SEQ ID NO:374)
HAMJ490-HAMJ583 HAMJ584-HAMJ354 NEW86 NEW43 109-_PG_-114. (SEQ ID NO:375)
Cząsteczki pochodne NEW43 oznaczone jako VP43S i NEW86 zostały wytworzone w doświadczeniach z amplifikacją i klonowaniem genu przy pomocy starterów opisanych w Tabelach 16 i 18 i plazmidowego wektora ekspresyjnego pET21. Warianty NEW43 zostały wytworzone przez mutagenezę
PL 214 229 B1 przy pomocy zestawu Quickchange Site-Directed Mutagenesis z firmy Stratagene i oligonukleotydów zaprojektowanych dla wbudowania odpowiedniej mutacji. Obecność sześcio-histydynowego znacznika na C-końcach zrekombinowanych cząsteczek ułatwia oczyszczanie białek przez chromatografię na niklu. Poniższe tabele 19 i 20 opisują sekwencje odpowiednio starterów użytych w doświadczeniach z mutagenezą i wytworzonych wariantów genu NEW43.
T a b e l a 20.
lista zestawów oligonukleotydowych starterów do PCR użytych w miejscowo specyficznej mutagenezie genu NEW43.
Zestaw starterów Oznaczenie startera SEQ ID NO Sekwencja startera 5’-----> 3’
1 HAMJ 497 HAMJ 498 269 270 AACGGTAGTTTAATCATACĆTTĆTTATGACĆATTACCATAAĆ ATC GATGTTATGGTAATGGTCATAAGAAGGTATGATTAAACTACC GTT
2 HAMJ499 HAMJ500 271. 272 AATCATACCTTCTTATGACTCTTACCATAACATCAAATTTGA GTG CACTCAAATTTGATGTTATGGTAAGAGTCATAAGAAGGTATG ATT
3 HAMJ50I HAMJ502 273 274 TACCTTCTTATGACTCTTACTCTAACATCAAATTTGAGTGGTT TG CAAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAAGAGTCATAAGAA GGTA
26 HAMJ530 HAMJ531 276 AATCATACCTCATTATGACTCTTACCATAACATCAAATTTGA GTG CACTCAAATTTGATGTTATGGTAAGAGTCATAATGAGGTATG ATT
27 HAMJ532 HAMJ533 277 278 TACCTCATTATGACCATTACTCTAACATCAAATTTGAGTGGT TTG CAAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAATGGTCATAATGAG GTA
29 HAMJ569 HAMJ570 279 280 TACCTCATTATGACTCTTACTCTAACATCAAATTTGAGTGGTT TG CAAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAAGAGTCATAATGG GTA
30 HAMJ571 HAMJ572 281 282 TACCTTCTTATGACCATTACTCTAACATCAAATTTGAGTGGTT TG AAACCACTCAAATTTGATGTTAGAGTAATGGTCATAAGAAG GTA
31 HAMJ573 HAMJ574 283 284 AACGGTAGTTTAATCATACCTTCTAAAGACCATTACCATAAC ATC GATGTTATGGTAATGGTCTTTAGAAGGTATGATTAAACTACC GTT
32 HAMJ575 HAMJ576 285 286 CGGTAGTTTAATCATCCCTCATAAGGACTCTTACCATAACAT CAAA TTTGATGTTATGGTAAGAGTCCTTATGAGGTATGATTAAACT ACCG
33 HAMJ577 HAMJ578 287 288 AACGGTAGTTTAATCATACCTGCACATTACCATAACATCAAA CAAATTTGATGTTATGGTAATGGTCAGGTATGATTAAACTAC CGTT
34 HAMJ579 HAMJ580 289 290 AACGGTAGTTTAATCATACCTTACCATAACATCAAATTTGAG TGG CCACTCAAATTTGATGTTATGGTAAGGTATGATTAAACTACC GTT
35 HAMJ581 HAMJ582 291 292 accggtagtttaatcataććtaaćatćaaatttgagtggitt GAC GTCAAACCACTCAAATTTGATGTTAGGTATGATTAAACTACC GTT
PL 214 229 B1
T a b e l a 20.
Lista produktów wariantu genu NEW43 wytworzonych z S. pneumoniae SP64.
Oznaczenie polipeptydu Polipeptyd SEQ ID NO Identyfikacja polipeptydu* Zestaw starterów do PCR (patrz tabela 22) Gen użyty dla mutagenezy
NEW60 293 NEW43 109-SYDHYH-l 14 1 NEW43
NEWói 294 NEW43 109-HYDSYH-l 14 26 NEW43
NEW62 295 NEW43 109-HYDHYS-i 14 27 NEW43
NEW80 296 NEW43 109-SYDSYH-l 14 2 NEW60
NEW81 297 NEW43 109-SYDSYS-l 14 3 NEW80
NEW82 298 NEW43 109-HYDSYS-l 14 29 NE Wól
NEW83 299 NEW43 109-S YDHYS-114 30 NEW60
NEW84 300 NEW43 109-SKDHYH-114 31 NEW60
NEW85 301 NEW43 109-HKDSYH-l 14 32 NE Wól
NEW88D1 302 NEW43 109- DHYH-114 33 NEW43
NEW88D2 303 NEW43 109- YH-114 34 NEW88D1
NEW88 304 NEW43 109- -114 35 NEW88D2
* podkreślone aminokwasy przedstawiają modyfikację sekwencji białka. W konstruktach NEW88D1, NEW88D2 i NEW88 są usunięte nukleotydy/aminokwasy.
Grupy 7 lub 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowane jak opisano wcześniej w przykładzie 1 użyto w doświadczeniu badającym ochronę przeciw donosowemu zarażeniu wirulentnym szczepem S. pneumoniae P4241. Dane z tabeli 21 jasno wskazują, że NEW19, NEW43 i ich warianty dostarczają ochrony przeciw eksperymentalnemu zapaleniu płuc.
T a b e l a 21
Ochrona zależna od fragmentów NEW19 i NEW43 lub ich wariantów doświadczalnym zapaleniu płuc.
Dośw. Immnunogen Żywe:Martwe Śmierć w dniu po zarażeniu
1 Quil A 0:8 44444445
NEW 19 7:1 5,7x>14
NEW 43 8:0 8x>14
2 Quil A 0:8 4,4, 4, 4,4, 5, 5, 5
NEW 43 7:1 8, 7x>14
NEW 80 6:2 5, 6, 6 x >14
NEW 83 6:2 8, 10, 6 x >14
3 QuilA 0:8 4, 4,4, 4,5,5,5,5
NEW 43 7:1 5, 7 x >8
NEW 88D1 5:3 5, 6, 6, 6 x >8
NEW 88D2 5:3 6, 6,6, 6 x >8
NEW 88 7:1 6, 7 x >8
3 Quif A 0:8 4, 4, 4,5,5,5,5,6
NEW 60 8:0 8 x >8
NEW 84 8:0 8 x >8
NEW 85 5:3 5, 7, 7, 5 x >8
NEW 86 5:3 5,6, 6, 5 x >8
P r z y k ł a d 10
Przykład ten opisuje klonowanie i ekspresję chimerowych genów kodujących chimerowe białko odpowiadające obszarowi karboksylowego końca BVH-3 i jego warianty jako fuzje zarówno z karboksylowym końcem lub końcem aminowym NEW43 lub jego wariantów.
Geny chimerowe obejmujące skrócony wariant genu BVH-3 i wariant genu NEW43 lub NEW43 zostały zaprojektowane zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1. Polipeptydy kodowane przez te chimerowe geny są podane w tabeli 22. Krótko, fragmenty genów uwzględnione w genie chimerowym są amplifikowane przez PCR przy pomocy par starterów oligonukleotydowych skonstruowanych tak, że startery posiadają na 5' końcu miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej co pozwala na bezpośrednie klonowanie w fazie zamplifikowanego produktu do strawionych wektorów plazmidowych (tabela 23 i tabela 24). Zamplifikowane przez PCR produkty strawiono endonukleazami restrykcyjnymi i wbudowano przy pomocy ligazy do zlinearyzowanych wektorów plazmidowych pSL301. Otrzymany konstrukt
PL 214 229 B1 plazmidu potwierdzono przez analizę sekwencji nukleotydowej. Zrekombinowane plazmidy pSL301 zawierające produkt PCR ponownie strawiono tą samą endonukleazą restrykcyjną w celu uzyskania wstawki DNA. Uzyskane wstawki będące fragmentami DNA oczyszczono i wstawki odpowiadające danym chimerowym genom wbudowano przy pomocy ligazy do wektora pURV22-NdeI w celu uzyskania chimerowego genu. Wyrażone zrekombinowane białka oczyszczono z frakcji nadsączy uzyskanych przez wirowanie rozbitych ultradźwiękami indukowanych termicznie hodowli E. coli stosując wielokrotne etapy oczyszczania przez chromatografię.
T a b e l a 22.
Lista polipeptydów kodowanych przez chimerowe geny zawierające skrócony wariant genu BVH-3 i wariant genu NEW43 lub NEW43.
Oznaczenie polipeptydu SEQ fD NO identyfikacja
VP 89 369 M-New56-GP-New43*
VP 90 370 M-New43-GP- New56
VP91 371 M-New52-GP- New43
VP 92 372 M-New43 -GP- New52
VP 93 373 M-New56 -GP- New60
VP94 332 M-New60 GP- New56
VP 108 333 M-New56-GP- New88
VP 109 334 M-New88 —GP- New56
VP1IO 335 M-New60 GP-New i 05
VP i 11 336 M-NewóO -GP-Newl 07
VP112 337 M-New88 -GP- Newl05
VP113 338 M-New88 -GP- Newl 07
VPi 14 339 M-New80A3P- Newl 05
VP115 340 M-New80-GP- Newl 07
VP116 341 M-New83 -GP-New 105
VPH7 342 M-New83 -GP- New 107
VPI19 343 M-New43S -GP- Newl05
VPI20 344 M-New43S-GP-New107
VPI2I 345 M-New80S -GP- Newl 05
VP122 346 M-New80S -GP- New 107
VP123 347 M-New88S-GP-NewlOS
VP124 348 M-New88S -GP- New 107
* kodowane aminokwasy chimer są eksprymowane jako produkt genu, dodano dodatkowe aminokwasy. M-metionina, G-glicyna i P-prolina.
T a b e l a 23.
Lista oligonukleotydowych starterów do PCR zaprojektowanych w celu wytworzenia chimerowych genów kodujących polipeptydy wyszczególnione w tabeli 22.
Zestaw startera Identyfikacja startera do PCR Gen użyty w amplifikacji przez PCR Odpowiednia część fragmentu genu na chimerowej cząsteczce białka.
49 HAMJ490-HAMJ471 wariant New43 N-końca
50 HAMJ564-HAMJ556 wariant New43 C-końca
51 IIAMJ489-HAMJ359 wariant New40 N-końca
52 HAMJ559-HAMJ557 wariant New40 C-końca
53 HAMJ610-HAMJ471 wariant New43S N-końca
PL 214 229 B1
T a b e l a 24.
Lista oligonukleotydowych zaprojektowanych w celu wytworzenia chimerowych genów kodujących polipeptydy podane w tabeli 22.
Starter SEQ ID NO Sekwencja 5’ - 3’ Miejsce restrykcyjne
HAMJ490 259 ccgaattccatatgcaaattacctacactgatgatg Ndel
HAMJ471 168 atatgggcccctgtataggagceggttgactttc Apal
HAMJ564 327 atatgggccccaaattacctacactgatgatgagattcagg Apal
HAMJ556 328 ataagaatgcggccgcctactgtataggagccggttgactttc Notl
HAMJ489 329 ccgaattccatatgeaaattgggcaaccgactc Ndel
HAMJ359 173 tcccgggccccgctatgaaatcagataaattc Apal
HAMJ559 330 atatgggccccaaattgggcaaccgactc Apal
HAMJ354 65 cgccaagcttctgtataggagccggttgac Hindili
HAMJ610 268 cttgatcgacatatgttggcaggcaagtacacaacag Ndel
HAMJ557 331 ataagaatgcggccgcttacgctatgaaatcagataaattc Notl
HAMJ279 35 cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc Hindili
PL 214 229 B1
LISTA SEKWENCJI <110> SHIRE BIOCHEM INC.
HAMEL, Josee GUELLET, Catherine CHARLAND, Nathalie MARTIN, Denis BRODEUR, Bernard <120> ANTIGENY PACIORKOWCÓW <130> 12806-19PC.T <140> PCT/CA01/00908 <141> 2001-06-19 <150> US 60/212,683 <151> 2000-06-20 <160> 384 <170> FastSEO for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3120 <212> DNA <213> BVH-3 <400 1 atgaaattta tgtgcctatg tatgtggatg cagaaagaag acgtcacacg agtgaagaac gaagtcaagg gcagctcatg gtcaaagata acgacaaatg tatatcgtfcc gaattagcag tattcttcaa ccagcaaata gcccaacgtt acaccaaatg ctttctgctt gtttctacaa ccttcttctt ccaaaagata cattacattc acaccttctc ggatacggat cacggagacc gcgcaaaaac catgaacagg gaaaaaattg aaagaaaaaa gtaaaaaata cactaaacca gcagccagtc gaattcaggc gtgaccacta tcttgatgaa gtggttatat ctgataatgt atgagaaggt atggttatgt ctcatggagg cagctaaagc cagctagtga aatctgaaaa acagtgaatc gagttgcgat tagaagaaaa atgcaaaacc taacgacaag tcgttgaaga caaaatcaaa catctcttcc ttgatgctaa acaatcatta atttagagga attatccagg ctggcattat atgcgattat tatagcagct gcatcgttcg aagtcagaaa tgagcaaatt tcattactat ggatccaaac catcaaggtc tcgaactaaa taactctaat ctttaatcca tcactatcac acatctggct caataacacg tctccagagt agatggcctg tccgcatggc gattgccaga taatgaagta taaggagctc aacggctaca tcaaattggg aatcaatcca tcgtattatc tttcttcaag agttaaaact taatgccaaa gaaacaatat ttatccgcat ggatcagctg caggaaaata agtgaaaact gtaatcaaaa aatgggaaag tatcaactta gatggaaaat gatgaaatca gttgctgtag gctgatatta tacattccca ggaaaaaata caatctgtag cttttgaagg gtctttgacc gaccattacc atggtgccta gtgtctagtc tcttcagcat gcttatattg caaccgactc ggaacttcac gctgaagatg aaggact.tga agtcataatg gaaatgaaag ggtgtcaaac ggagatcacc ttatcgtatc aggacaataa tgacaccaga ttacagatca ttccttatga aagacgctga attatgtcta atcgtcaaaa caaggtctca tcgaagatac aaagcgattt tgcaaccgag caaaaggatc aactctatga ctgctaagat actttattcc tcagtggaac taggcagtct ctgatggtta taagacatgg ttccaaacaa atgagaaaca aatcaggttt cagaagagca gattagattc atttagataa gtgaaagtat atcatgcaga cttgagtcta tcgtgtctct ccaggttagc gggctatgta tgccctcttt tattgtcaat cctgaaagat acaagaacat gggacgatat gggtaatgct atctgctagt tcagttaagc aactagcaag ttcacctagc tatcagtcgt ttacagcaag tggttctaca ttcaagcaat tatttttaat tgatcatttc tagtctagca tgaagaagat tgtcatgagt aattaaggct tttgtcatct aaaaatcgaa tgtcgtgaat tccgattgat
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114 0 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680
PL 214 229 B1 gaacataaac cggttggaat tggtcattct cacagtaact atgaactgtt taaacccgaa 1740 gaaggagttg ctaaaaaaga agggaataaa gtttatactg gagaagaatt aacgaatgtt 1BOO gttaat-ttigt. Łaaaaaatag· tacgfcttaat aatcaaaacŁ ttactctagc caatęrgtcaa 186 0 aaacgcgttt ctfcttagttt tccgcctgaa Łtggagaaaa aattaggtat caatsatgcta 1920 gtaaaattaa taacaccaga tggaaaagta ttggagaaag tatctggtaa agtatttgga 198 0 gaaggagtag ggaatattgc aaactttgaa ttagatcaac cttatttacc aggacaaaca 2040 tttaagtata ctatcgcttc aaaagattat ccagaagtaa gttatgatgg tacatttaca 2100 gttccaacct ctttagctta caaaatggcc agtcaaacga ttttctatcc tttccatgca 2160 ggct a t ac tt sit fc fc aa cja.g fc cja ac c c fc caa. fc fc fc c agfc ej c c fca.aa^j^jas. c t g a fc c fc fc fc a 222 0 gtcagagtgt ttgatgaatt tcatggaaat gcttatttag aaaataacta taaagttggt 2280 gaaatcaaat taccgattcc gaaattaaac caaggaacaa ccagaacggc cggaaataaa 2340 attcctgtaa ccfcfccatggc aaatgcfctat ttggacaatc aatcgactta tattgtggaa 2400 gtacctatct fcggaaaaaga aaatcaaact gataaaccaa gtattetacc acaattfcaaa 2460 aggaataaag cacaagaaaa ctcaaaactt gatgaaaagg tagaagaacc aaagactagt 252 0 gagaaggtag aaaaagaaaa actttcfcgaa actgggaata gtactagtaa ttcaacgtta 2580 gaagaagttc ctacagtgga tcctgtacaa gaaaaagtag caaaatttgc tgaaagttat 2640 gggatgaagc tagaaaatgt cttgtttaat atggacggaa caattgaatt atattfcacca 2700 tcaggagaag tcattaaaaa gaatatggca gattttacag gagaagcacc tcaaggaaat 2760 ggtgaaaata aaccatctga aaatggaaaa gtatctactg gaacagttga gaaccaacca 2820 acagaaaata aaccagcaga ttcfcfctacca gaggcaccaa acgaaaaacc tgtaaaacca 2880 gaaaactcaa cggataatgg aatgttgaat ccagaaggga atgtggggag tgaccctatg 2940 ttagatccag cattagagga agctccagca gtagatcctg tacaagaaaa afctagaaaaa 3000 tttacagcta gttacggatt aggcttagat agtgttatat tcaatatgga tggaacgatt 3060 gaatfcaagat tgccaagtgg agaagtgata aaaaagaatt tatctgattt catagcgtaa 3120 <210> 2 <211> 5048 <212> DNA <213> SVH3 <400> 2 aattccttgt cgggtaagtt ccgacccgca cgaaaggcgt aatgatttgg gcactgtctc 60 aacgagagac tcggtgaaat tttagtacct gtgaagatgc aggttacccg cgacaggacg 120 gaaagacccc atggagcttfc actgcagttt gatattgagt gtctgtacca catgtacagg 180 ataggtagga gtctaagaga tcgggacgcc agtttcgaag gagacgctgt tgggatacta 240 cccttgtgtt atggccactc Caacccagat aggtgatccc tatcggagac agtgtctgac 300 gggcagtttg actggggcgg tcgcctccta aaaggtaacg gaggcgccca aaggtfcccct 360 cagaatggtt ggaaatcatt cgcagagtgt aaaggtataa gggagcttga ctgcgagagc 420 tacaactcga gcagggacga aagtcgggct fcagfcgatccg gtggttccgt atggaagggc 460 catcgctcaa cggataaaag ctaccctggg gataacaggc ttatctcccc caagagfctca 540 catcgacggg gaggtttggc acctcgatgt cggctcgtcg catcctgggg ctgtagtcgg 600 tcccaagggt tgggctgttc gcccattaaa gcggcacgcg agctgggttc agaacgtcgt 660 gagacagttc ggtccctatc cgtcgcgggc gtaggaaatfc tgagaggatc tgctcctagt 720 acgagaggac cagagfcggac ttaccgctgg tgtaceagtt gfccttgccaa aggcatcgct 780 gggtagctat gtagggaagg gataaacgct gaaagcatcfc aagtgtgaaa cccacctcaa 840 gatgagattt cccatgatta tatatcagta agagccctga gagatgatca ggtagatagg 900 ttagaagtgg aagtgtggcg acacatgtag cggactaata ctaatagctc gaggacttat 960 ccaaagtaac tgagaatatg aaagcgaacg gttttcttaa attgaataga tattcaattt 1020 tgagtaggta ttactcagag ttaagtgacg atagcctagg agatacacct gtacccatgc 1080 cgaacacaga agttaageec tagaacgccg gaagtagfctg ggggttgccc cctgtgagat 1140 agggaagtcg cttagctcta gggagtttag ctcagctggg agagcatctg ccttacaagc 1200 agagggtcag cggttcgatc ccgttaactc ccaaaggtcc cgtagtgtag cggttatcac 1260 gtcgccctgt cacggcgaag atcgcgggtt cgattcccgt cgggaccgtt taaggtaacg 1320 caagttattt tagactcgtt agctcagttg gtagagcaat tgacttttaa fccaatgggtc 1380 actggtfccga gcccagtacg ggtcatatat gcgggtttgg cggaattcta afcctctttga 1440 aatcatcttc tctcactttc caaaactcta ttacctctta ttataccaca tttcaatctt 1500 caacttccca gtaafcataag cacctctggc gaaagaagtt tcaatgtcct aaagtaataa 1560 gtgaatccaa ttcaggaact ccaagaacaa aagaaacatc tggtgtcaca agtattggat 1620
PL 214 229 B1 ggcacagagt cacgtggtag tctgacccta gcagaaattt taaatagtaa actatttact 1680 ggttaattaa atggttaaat aaccggttta gaaaactatt taataaagta aaagaagttg 1740 agaaaaaact tcatcattta ttgaaatgag ggatttatga aatttagtaa aaaatatata 1800 gcagctggat cagctgttat cgtatccttg agtctatgtg cctatgcact aaaccagcat 1860 cgttcgcagg aaaataagga caataatcgt gtctcttatg tggatggcag ccagtcaagt 1920 cagaaaagtg aaaacttgac accagaccag gttagccaga aagaaggaat tcaggctgag 1980 caaattgtaa tcaaaattac agatcagggc tatgtaacgt cacacggtga ccactatcat 2040 tactataatg ggaaagttcc ttatgatgcc ctctttagtg aagaactctt gatgaaggat 2100 ccaaactatc aacttaaaga cgctgatatt gtcaatgaag tcaagggtgg ttatatcafcc 2160 aaggtcgatg gaaaatatta tgtctacctg aaagatgcag ctcatgctga taatgttcga 2220 actaaagatg aaatcaatcg tcaaaaacaa gaacatgtca aagataatga gaaggttaac 2280 tctaatgttg ctgtagcaag gtctcaggga cgatatacga caaatgatgg ttatgtcttt 2340 aatccagctg atattatcga agatacgggt aatgcttata tcgttcctca tggaggtcac 2400 tatcactaca ttcccaaaag cgatttatct gctagtgaat tagcagcagc taaagcacat 2460 ctggctggaa aaaatatgca accgagtcag ttaagctatt cttcaacagc tagtgacaat 2520 aacacgcaat ctgtagcaaa aggafccaact agcaagccag caaataaatc tgaaaatctc 2580 cagagtcttt tgaaggaact ctatgattca cctagcgccc aacgttacag tgaatcagat 2640 ggcctggtct ttgaccctgc taagattatc agtcgtacac caaatggagt tgcgattccg 2700 catggcgacc attaccactt tattccttac agcaagcttt ctgctttaga agaaaagatt 2760 gccagaatgg tgcctatcag tggaactggt tctacagttt ctacaaatgc aaaacctaat 2820 gaagtagtgt ctagtctagg cagtctttca agcaatcctt cttctttaac gacaagtaag 2880 gagctctctt cagcatctga tggttatatt tttaatccaa aagatatcgt tgaagaaacg 2940 gctacagctt atattgtaag acatggtgat catttccatt acattccaaa atcaaatcaa 3000 attgggcaac cgactcttcc aaacaatagt ctageaacac cttctccatc tcttccaatc 3060 aatccaggaa cttcacatga gaaacatgaa gaagatggat acggatttga tgctaatcgt 3120 attatcgctg aagatgaatc aggttttgtc atgagtcacg gagaccacaa tcattatttc 3180 ttcaagaagg acttgacaga agagcaaatt aaggctgcgc aaaaacattt agaggaagtt 3240 aaaactagtc ataatggatt agattctttg tcatctcatg aacaggatta tccaggtaat 3300 gccaaagaaa tgaaagattt agataaaaaa atcgaagaaa aaattgctgg cattatgaaa 3360 caatatggtg tcaaacgtga aagtattgtc gtgaataaag aaaaaaatgc gattatttat 3420 ccgcatggag atcaccatca tgcagatccg attgatgaac ataaaccggt tggaattggt 3480 cattctcaca gtaactatga actgtttaaa cccgaagaag gagttgctaa aaaagaaggg 3540 aataaagttt atactggaga agaattaacg aatgttgtta atttgttaaa aaatagtacg 3600 tttaataatc aaaactttac tctagccaat ggtcaaaaac gcgtttcttt tagttttccg 3660 cctgaattgg agaaaaaatt aggtatcaat atgctagtaa aattaataac accagatgga 3720 aaagt.at.tgg agaaagtatc tggtaaagta tttggagaag gagtagggaa tattgcaaac 3780 tttgaattag atcaacctta tttaccagga caaacattta agtatactat cgcttcaaaa 3840 gattatccag aagtaagtta tgatggtaca tttacagttc caacctcttt agcttacaaa 3900 atggccagtc aaacgatttt ctatcctttc catgcagggg atacttattt aagagtgaac 3960 cctcaatttg cagtgcctaa aggaactgat gctttagtca gagtgtttga tgaatttcat 4020 ggaaatgctt atttagaaaa taactataaa gttggtgaaa tcaaattacc gattccgaaa 4080 ttaaaccaag gaacaaccag aacggccgga ąataaaattc ctgtaacctt catggcaaat 4140 gcttatttgg acaatcaatc gacttatatt gtggaagtac ctatcttgga aaaagaaaat 4200 caaactgata aaccaagtat tcfcaccacaa tttaaaagga ataaagcaca agaaaactca 4260 aaacttgatg aaaaggtaga agaaccaaag actagtgaga aggtagaaaa agaaaaactt 4320 tctgaaactg ggaatagtac tagtaattca acgttagaag aagttcctac agtggatcct 4380 gtacaagaaa aagtagcaaa atttgctgaa agttatggga tgaagctaga aaatgtcttg 4440 ttfcaatatgg acggaacaat tgaattatat ttaccatcag gagaagtcat taaaaagaat 4500 atggcagatt ttacaggaga agcacctcaa ggaaatggtg aaaataaacc atctgaaaat 4560 ggaaaagtat ctactggaac agttgagaac caaccaacag aaaataaacc agcagattct 4620 ttaccagagg caccaaacga aaaacctgta aaaccagaaa actcaacgga taatggaatg 4680 ttgaatccag aagggaatgt ggggagtgac cctatgttag atccagcatt agaggaagct 4740 ccagcagtag atcctgtaca agaaaaatta gaaaaattta cagctagtta cggattaggc 4800 ttagatagtg ttatattcaa tatggatgga acgattgaat taagattgcc aagtggagaa 4860 gtgataaaaa agaatttatc tgatttcata gcgtaaggaa tagcagtaga aaaagtctga 4920 atcaaaaatg aagttctctc aaaagttaga aataaaactc tgactttggg agaatttcat 4980 tttattatta atatataaaa tttcttgaca tacaacttaa aaagaggtgg aatatttact 5040 agttaatt 5048
PL 214 229 B1 <21ϋ> 3 <211> 2523 <212> DNA <213>
<400> 3 atgaaaatca gcttafcgaac atagatggaa cgtgaaggaa tctcatggag gaagagctcc atcaagggtg gctcatgcgg z* es zv z* es Ί* ?“«/“*·$“ r“t G* v L. tej ggacgcfcaca ggcgatgcct tcagctagcg ttaagaacct gtaagcaatc gcaagtcaaa caacgccatg gccagaggtg tctgaattgg gtaccagatt ecgcaacctg aaagaagctg tatatcccag aagcaggaaa cgagaatttt aataaaggtc gtctcaagtg catccagaac gtagccaagt ataaccagtg aaaaaagata ggtttgaccc gaagctatct aatcttcaat taccataaca actcttgagg cattcagata gctgatacca gaagaaaccc gaggaaccag gttgaagaaa aagtccaatg gacaacaata ta a ataaaaaata taggtttgca aacaagcgac tcaacgccga accattatca tcatgaaaga gttatgtcat ataatgtccg aaggagggac ccacagatga „ Ł. X. i.
i^>. L· CL Ł - ^4 ... L, ... .
agttggctgc atcgccgaca caggaactac gtaatgacat tagaatctga tagctgtccc aaaaacgaat caagaccaga caccaaatcc ttcgaaaagt ccaagaatct gtttatctca acaataaggc gacaagttga ataaagtcaa gtttaggaaa tggcaggcaa atgaggggga gtttgtctga ctccttcgac acaaccgcgt atactgtaga tcaaatttga atcttttggc atggttttgg atcaaacgga ctcgagaaga aagaagaatc aactgagaga ccaaagagac ctattatggc tctagctggg tcaagctcaa gcaaaaaacg acaaatcgtc ttactataat
4» ts ł* +* ł taaggtaaac tacaaaagaa ttcagcaaac tggttatatc tcatggagat tgcagaagcc aaatagcgat
CLtSCL tgatagtctc tggccttatt tcatggtaac tgctcgtatt agaaccaagt tcaaccagct aggcgatggt ttcagcagaa taagctagga ttatgactta ttttgaggct gttagtggat accaaatgcg gtacacaaca tgcctatgta agctgagaga agaccatcag gaaagoagct agtcaaaaac gtggtttgac gactgfccaag taacgctagc aaaaccaagc gaaaccacaa accagaggaa ggctgaagat tctcacagga agaagctgaa tcagtagcta actgtaaaag gaga a 111 ga atcaagatta ggcaaggtcc cagttgaagg gj t aa a. t gaaatcaatc gatggtgcgg t tcaatgcat cattaccatt ttcctatctg aacactccaa acaagcaaca ttgaaacagc ttcgacccag cattaccact attccccttc c c c ξι & c c g<ł ccaagcaatc tatgtctttg acagcagcag gctaagaaaa ctagcaagaa t tgga t aac c gatattcttg caaattacct gaagacggtt actccacata gcggcagccc gatfccaggaa aagaaggtgc ggtagtttaa gaaggccttt tactatgtcg gaccatgttc gaggagaaac agcgagaaac tcagaagaac ttacttggaa ttaaaaaata aaactattgg cacttgtttt aaaataatcg ctcctgatga cggatcaagg cttatgatgc afctcagacat ggcaaaaaca tagcctttgc ctgatatcat acattcctaa gtcgggaaaa gaacaaactg acagcaacac tctacaaact cgcaaatcac ttatccctta gttatcgttc etccagaaec caattgatga aggagaatgg gcattgatag ctgacctccc ttcaccaaga tgttggaacg ccttcttagc acactgatga atatctttga tgacccatag aggcttatgc atactgaggc cacttgatcg tcatacctca atgaggcacc aacatccaaa aaagaaacaa ctcagacaga cagagtctcc ctcaggtcga aaatccagga atttactatt ctttattaaa aagtgtctgt tgtttcctat ggttagcaag 11 atgtgacc catcatcagt tgtcaatgaa t cŁTłef cj at g c a. agaacatagt acgtfccacag cgaagatacg gaatgagtta tctgtcaaat ggtaccttct taacagtcaa gcctttgagt aagtcgaacc tgaacaaatg aaaccattgg tagtccaagt gaaattggtc agtttctcgt caaactggcc atctagtgat tttacttgat actcaaggat tccgattcgt tgagattcaa tcctcgtgat ccactggatt taaagagaaa aaaaggagca tatgccttac ttatgaccat taaggggtat cgaacgtccg aaatggtcaa aaaacctgag aaaaccaaca gactgaaaag tccaattatc tggcacccag ggagagtaag
120 180 24 0 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2523 <210> 4 <211> 2647 <212> DNA <213> BVH~11 <400? 4
PL 214 229 B1 cagagatctt aatatctagc tgcatcaagc cgacgcaaaa ccgaacaaat atcattacta aagatccgaa tcattaaggt tccgtacaaa ggacttcagc atgatggtta fc fc o c fc fc gg ctgctgcaga gacaaaatag ctacaaatac acattgatag ctgatggcct tccctcatgg gaattgctcg cagaagaacc atcctcaacc aagtaggcga atctttcagc ctcataagct aggcttatga ttgattttga tcaagttagt gaaaaccaaa gcaagtacac gggatgccta ctgaagctga cgacagacca gcgtgaaagc tagaagtcaa ttgagtggtt tggcgactgt ttggtaacgc cggaaaaacc aagagaaacc aatcaccaga gagaggctga agactctcac tggcagaagc ttctaactcc gttctag agtgaatcaa tgggtcagta tcaaactgta aacggagaat cgtcatcaag taatggcaag ttatcagttg aaacggtaaa agaagaaatc aaacgatggt tatcttcaat agatcattac agccttccta cgataacact taacacaagc tctcttgaaa tattttcgac taaccattac tattattccc aagtccacaa agctccaagc tggttatgtc agaaacagca aggagctaag cttactagca ggctttggat ggatgatatt tgcgcaaatt aacagaagac tgtaactcca gagagcggca tcaggattca agctaagaag aaacggtagt tgacgaaggc caagtactat tagcgaccat aagcgaggag acaaagegag ggaatcagaa agat 11actt aggattaaaa tgaaaaacta taaaaacagg atatacttaa gctacacttg aaagaaaata ttgactcctg attacggatc gtcccttatg aaggattcag tactatgttt aatcggcaaa gcggtagcct gcatctgata cattacattc tctggtcggg ccaagaacaa aacaacagca cagctctaca ccagcgcaaa cactttatcc cttcgttafcc ccgactccag aatccaattg tttgaggaga gcaggcattg aaaactgacc agaattcacc aacctgttgg cttgccttct acctacactg ggttatatct catatgaccc gcccaggctt ggaaatactg gtgccacttg ttaatcatac ctttatgagg gtcgaacatc gttcaaagaa aaacctcaga aaaccagagt gaacctcagg ggaaaaatcc aataatttac ttggctttat ataggagaac gaaaagagga ttttaagtgt atcgtgtttc atgaggttag aaggttatgt atgccatcat acattgtcaa accttaagga aacaagaaca ttgcacgttc tcatcgaaga ctaagaatga aaaatctgtc actgggtacc acactaacag aactgccttt tcacaagtcg cttatgaaca gttcaaacca aacctagtcc atgagaaatt atggagtttc atagcaaact tcccatctag aagatttact aacgactcaa tagctccgat atgatgagat ttgatcctcg atagccactg atgctaaaga aggcaaaagg atcgtatgcc ctcattatga cacctaaggg caaacgaacg acaaaaatgg c ci 3.©. a a c c ctccaaaacc tcgagactga aggatccaat tatttggcac taaaggagag gggaaaacga aagaatgaaa ctgtgcttat ctatatagat caagcgtgaa gacctctcat cagtgaagag tgaaatcaag tgcagctcat tagtcagcat acagggacgc tacgggcgat gttatcagct aaatttaaga ttctgtaagc tcaagcaagt gagtcaacgc aaccgccaga aatgtctgaa ttgggtacca aagtccgcaa ggtcaaagaa tcgttatatc ggccaagcag tgatcgagaa tgataataaa ggatgtctca tcgtcatcca tcaagtagcc tgatataacc gattaaaaaa gaaaggtttg agcagaagct ttacaatctt ccattaccat gtatactctt tccgcattca tcaagctgat tgaggaagaa aacagaggaa aaaggttgaa tatcaagtcc ccaggacaac taagtaaagg aaaatgagag atcaataaaa gaactaggtt ggaaaacaag ggaatcaacg ggagaccatt ctcctcatga ggtggttatg gcggataatg cgtgaaggag tacaccacag gcctatatcg agcgagttgg acctatcgcc aatccaggaa caaagtaatg catgtagaat ggtgtagctg ttggaaaaac gattcaagac cctgcaccaa gctgttcgaa ccagccaaga gaaagtttat ttCtacaata ggtcgacaag agtgataaag gaacgtttag aagttggcag agtgatgagg gatagtttgt acccctcctt atctacaacc caatatactg aacatcaaat gaggatctfct gataatggtt accaatcaaa acccctcgag ccagaagaag gaaaaactga aatgccaaag aatactatta tagcagcatt cagaatgtga
120 ISO 240 3 00 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2647 c210> 5 <211> 2639 <212> DNA <213> BVH-ll-2 <400> 5 gggtcttaaa aaatctggaa tcaataaaaa aacttggtcg atggtgatca aggggatcaa actctgaatc gaaaatatga atatctagca tcaccaagct ggctggtcaa cgccgaacaa ctttagaggc gtgttctagc ggttcagtgg ggtcaggtta
s.a.gcjcs<j3aćł attgttatca agacccacaa agaagaatta cagtccttgc agaaagagtc atttgacacc agattacgga aatgacaaga aagtgaggaa cctaagtgtt taatcgagtt agatgaagtc tcaaggttat cctatttaga agaatgaaaa tgttcctatg tcttatatag agtaagagag gtgacctctc
120
180
240
300
360
PL 214 229 B1 atggagacca ttatcattac tataatggca aggfctcctta tgatgeeate atcagtgaag 420 aacttctcat gaaagatccg aattatcagt tgaaggattc agacafcfcgtc aatgaaatca 480 agggtggcta tgtgattaag gtagacggaa aatactatgt ttaccttaaa gatgcggccc 540 atgcggacaa tattcggaca aaagaagaga etaaacgtca gaagcaggaa cacagtcata 600 atcataactc aagagcagat aatgctgttg ctgcagccag agcccaagga cgttatacaa 660 cggatgatgg gtatatcttc aatgcatctg atatcattga ggacacgggt gatgcttata 720 tcgttcctca cggcgaccat taccattaca ttcctaagaa tgagfcfcafcca gctagcgagt 7B0 tagctgctgc agaagcctat tggaatggga agcagggatc tcgtccttct tcaagttcta 840 gttataatgc aaatccagtt caaccaagat tgtcagagaa ccacaatctg actgtcactc 900 caacttatca tcaaaatcaa ggggaaaaca tttcaagcct tttacgtgaa ttgtatgcta 960 aacccttatc agaacgccat gtagaatctg atggccttat tttcgaccca gcgcaaatca 1020 caagtcgaac cgccagaggt gtagctgtcc ctcatggtaa ccattaccac tttatccctt 1080 atgaacaaat gtctgaattg gaaaaacgaa ttgctcgtat tattcccctt cgttatcgtt 1140 caaaccattg ggtaccagat tcaagaccag aacaaccaag tccacaatcg actccggaac 1200 ctagtccaag tctgcaacct gcaccaaatc ctcaaccagc tccaagcaat ccaattgatg 1260 agaaattggt caaagaagct gttcgaaaag taggcgatgg ttatgtcfctfc gaggagaatg 1320 gagtttctcg ttatatccca gccaaggatc tttcagcaga aacagcagca ggcattgata 1380 gcaaactggc caagcaggaa agtttatctc ataagctagg agctaagaaa actgacctcc 1440 catctagtga tcgagaattt tacaataagg cttatgactt actagcaaga attcaccaag 1500 attfcacttga taataaaggt cgacaagttg attttgaggt tttggataac ctgfctggaac 1560 gactcaagga tgtctcaagt gataaagtca agttagtgga tgatattctt gccttcttag 1620 ctccgattcg tcatccagaa cgtttaggaa aaccaaafcgc gcaaattacc tacactgatg 1680 atgagattca agtagccaag ttggcaggca agtacacaac agaagacggt tatatctttg 1740 atcctcgtga tataaccagt gatgaggggg atgcctatgfc aactccacat atgacccata 1800 gccacfcggat taaaaaagat agtttgtctg aagctgagag agcggcagcc caggcttatg 1860 ctaaagagaa aggtttgacc cctccttcga cagaccacca ggattcagga aatactgagg 1920 caaaaggagc agaagctatc tacaaccgcg tgaaagcagc taagaaggtg ccacttgatc 1980 gtatgcctta caatcttcaa tatactgtag aagtcaaaaa cggtagttta atcatacctc 2040 atfcafcgacca ttaccataac atcaaatttg agtggtttga cgaaggcctt tatgaggcac 2100 ctaaggggta tagtcttgag gatcttttgg cgactgtcaa gtactatgtc gaacatccaa 2160 acgaacgtcc gcatfccagat aatggttttg gtaacgctag fcgaccatgtt cgtaaaaata 2220 aggcagacca agatagtaaa cctgatgaag ataaggaaca tgatgaagta agtgagccaa 2280 ctcaccctga atctgatgaa aaagagaatc acgctggttt aaatccttca gcagataatc 2340 tttataaacc aagcactgat acggaagaga cagaggaaga agctgaagat accacagatg 2400 aggcfcgaaat tcctcaagta gagaattctg ttattaacgc taagatagea gatgcggagg 2460 ccttgctaga aaaagtaaca gatcctagta ttagacaaaa tgctatggag acattgactg 2520 gtctaaaaag tagtcttctt ctcggaacga aagataataa cactatttca gcagaagtag 2580 atagfcctctt ggctttgtta aaagaaagtc aaccggctcc tatacagtag taaaatgaa 2639 < 210 > 6 <211> 1039 <212> PRT <213> BVH-3 <400> 6
Met Lys Phe Ser Lys Lys Tyr Ile Ala Ala Gly Ser Ala Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Cys Ala Tyr Ala Leu Asn Gin His Arg Ser Gin Glu
20 25 30
Asn Lys Asp Asn Asn Arg Val Ser Tyr Val Asp Gly Ser Gin Ser Ser
35 40 45
Gin Lys Ser Glu Asn Leu Thr Pro Asp Gin Val Ser Gin Lys Glu Gly
50 55 60
Ile Gin Ala Glu Gin Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gin Gly Tyr Val
65 70 75 80
Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr
85 90 95
Asp Ala Leu Phe Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gin
PL 214 229 B1
100 105 110
Leu Lys Asp Ala Asp Ile Val Asn Glu Val Lys Gly oiy Tyr Ile Ile
115 120 125
Lys val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Al a
130 135 140
Asp Asn Val Arg Thr Lys Asp Glu Ile Asn Arg Gin Lys Gin Glu His
145 150 155 160
Val Lys Asp Asn Glu Lys Val Asn Ser Asn Val Ala Val Ala Arg Ser
165 170 175
Gin Gly Arg Tyr Thr Thr Asn Asp Gly Tyr Val Phe Asn Pro Ala Asp
180 135 190
Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asn Ala Tyr Ile Val Pro His Gly Gly His
195 200 205
Tyr His Tyr Ile Pro Lys Ser Asp Leu Ser Cl Ser Glu Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Lys Ala His L©U Ala Gly Lys Asn Met Gin Pro Ser Gin Leu Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Ser Thr Ala Ser Asp Asn Asn Thr Gin Ser Val Ala Lys Gly
245 250 255
Ser Thr Ser Lys Pro Ala Asn. Lys Ser Glu Asn Leu Gin Ser Leu Leu
260 265 270
Lys Glu Leu Tyr Asp Ser Pro Ser Ala Gin Arg Tyr Ser Glu Ser Asp
275 280 285
Gly Leu val Phe Asp Pro Ala Lys Ile Ile Ser Arg Thr Pro Asn Gly
290 295 300
Val Ala Ile Pro His Gly Asp His Tyr HX S Phe Ile Pro Tyr Ser Lys
305 310 3 X£S 320
Leu Ser Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Arg Met val Pro Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Gly Ser Thr Val Ser Thr Asn Ala Lys Pro Asn Glu Val Val Ser
340 345 350
Ser Leu Giy Ser Leu Ser Ser Asn Pro Ser Ser Leu Thr Thr Ser Lys
355 360 365
Glu Leu Ser Ser Ala Ser Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Pro Lys Asp Ile
370 375 380
Val Glu Glu Thr Ala Thr Ala Tyr Ile Val Arg His Gly Asp His Phe
385 3 90 3 95 400
His Tyr Ile Pro Lys Ser Asn Głn Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn
405 410 415
Asn Ser Leu Ala Thr Pro Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr
420 425 430
Ser Hr s Glu Lys His Glu Glu Asp Giy Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg
435 440 445
Ile Ile Ala Glu Asp Glu Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp His
450 455 460
Asn His Tyr Phe Phe Lys Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala
465 470 475 480
Ala Gin Lys His Leu Glu Glu Val Lya Thr Ser His Aan Gly Leu Aap
485 490 495
Ser Leu Ser Ser His Glu Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met
500 505 510
Lya Aap Leu Aap Lys Lys Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys
515 520 525
Gin Tyr Gly Val Lys Arg Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn
530 535 540
Ala Ile Ile Tyr Pro His Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp
545 550 555 560
Glu His Lys Pro Val Gly Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu
PL 214 229 B1
Phe Lys Pro Glu 565 Glu Gly Val Ala Lys 570 Lys Glu Gly Asn Lys 575 Val Tyr
Thr Gly Glu 5Θ0 Glu Leu Thr Asn Val 585 Val Asn Leu Leu Lys 590 Asn Ser Thr
Phe Asn 595 Asn Gin Asn Phe Thr 600 Leu Ala Asn Gly Gin 605 Lys Arg Val Ser
Phe 610 Ser Phe Pro Pro Glu 615 Leu Glu Lys Lys Leu 620 Gly Ile Asn Met Leu
625 Val Lys Leu Ile Thr 630 Pro Asp Gly Lys Val 635 Leu Glu Lys Val Ser 640 Gly
Lys Val Phe Gly 64 5 Glu Gly Val Gly Asn 650 Ile Ala Asn Phe Glu 655 Leu Asp
Gin Pro Tyr 660 Leu Pro Gly Gin Thr 665 Phe Lys TVłT Thr Ile 670 Ala Ser Lys
Asp Tyr 675 Pro Glu Val Ser Tyr 680 Asp Gly Thr Phe Thr 685 Val Pro Thr Ser
Leu 690 Ala Tyr Lys Met Ala 695 Ser Gin Thr Ile Phe 700 Tyr Pro Phe His Ala
705 Gly Asp Thr Tyr Leu 710 Arg Val Asn Pro Gin 715 Phe Ala Val Pro Lys 720 Gly
Thr Asp Ala Leu 725 Val Arg Val Phe Asp 730 Glu Phe His Gly Asn 735 Ala Tyr
Leu Glu Asn 740 Asn. Tyr Lys yal Gly 745 Glu Ile Lys Leu Pro 750 Ile Pro Lys
Leu Asn 755 Gin Gly Thr Thr Arg 760 Thr Ala Gly Asn Lys 765 Ile Pro Val Thr
Phe 770 Met Ala Asn Ala Tyv 775 Leu Asp Asn Gin Ser 780 Thr Tyr Ile ^71 Glu
785 Val Pro Ile Leu Glu 790 Lys Glu Asn Gin Thr 795 Asp Lys Pro Ser Ile 800 Leu
Pro Gin Phe Lys 805 Arg Asn Lys Ala Gin 810 Glu Asn Ser Lys Leu 815 Asp Glu
Lys Val Glu 820 Glu Pro Lys Thr Ser 825 Glu Lys Val Glu Lys 830 Glu Lys Leu
Ser Glu 83 5 Thr Gly Asn Ser Thr 840 Ser Asn Ser Thr Leu 845 Glu Glu Val Pro
Thr 850 Val Asp Pro Val Gin 855 Glu Lys Val Ala Lys 860 Phe Ala Glu Ser Tyr
865 Gly Met Lys Leu Glu 870 Asn Val Leu Phe Asn 875 Met Asp Gly Thr Ile 880 Glu
Leu Tyr Leu Pro 885 Ser Gly Glu Val Ile 890 Lys Lys Asn Met Ala 895 Asp Phe
Thr Gly Glu 900 Ala Pro Gin Gly Asn 905 Gly Glu Asn Lys Pro 910 Ser Glu Asn
Gly Lys 915 Val Ser Thr Gly Thr 920 val Glu Asn Gin Pro 925 Thr Glu Asn Lys
Pro 930 Al a Asp Ser Leu Pro 935 Glu Ala Pro Asn Glu 940 Lys Pro Val Lys Pro
94 5 Glu Asn Ser Thr Asp 950 Asn Gly Met Leu Asn 955 Pro Glu Gly Asn Val 960 Gly
Ser Asp Pro Met 965 Leu Asp Pro Ala Leu 970 Glu Glu Ala Pro Ala 975 Val Asp
Pro Val Gli χ 98 0 Glu Lys Leu Glu Lys 985 Phe Thr Ala Ser Tyr 990 Gly Leu Gly
Leu Asp 995 Ser Val Ile Phe Asn 1000 Met Asp Gly Thr Ile 1005 Glu Leu Arg I&CU
Pro 1010 Ser Gly Glu Val Ile 1015 Lys Lys Asn Leu Ser 1020 Asp Phe Ile Ala
PL 214 229 B1
1025 1030 1035 <210> 7 <211> 840 <212> PRT <213> BVH-11 <400> 7
Met Lys He Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Thr Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser val Cys Ala Tyr Glu Leu Gly Leu His Gin Ala Gin Thr Val
20 25 30
Lys Glu Asn Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Lys Gin Ala Thr Gin
35 40 45
Lys Thr Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly Ile
50 55 60
Asn Ala Glu Gin Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gin Gly Tyr Val Thr
65 70 75 ao
Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr Asp
85 90 95
Ala Ile Ile Ser Glu Glu Leu Leu. Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gin Leu
100 105 110
Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile Lys
115 120 125
Val Asn Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala Asp
130 135 140
Asn Val Arg Thr Lys Glu Glu Ile Asn Arg Gin Lys Gin Glu His Ser
145 150 155 160
Gin His Arg Glu Gly Gly Thr Ser Ala Asn Asp Gly Ala Val Ala Phe
165 170 175
Ala Arg Ser Gin Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn
180 185 190
Ala Ser Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile ^7 .ί Pro His
195 200 205
Gly Asp His Tyi? His Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Glu Ala Phe Leu Ser Gly Arg Glu Asn Leu Ser Asn
225 230 235 240
Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Gin Asn Ser Asp Asn Thr Pro Arg Thr Asn
245 250 255
Trp Val Pro Ser Val Ser Asn Pro Gly Thr Thr Asn Thr Asn Thr Ser
260 265 270
Asn Asn Ser Asn Thr Asn Ser Gin Ala Ser Gin Ser Asn Asp Ile Asp
275 280 285
Ser Leu Leu Lys Gin Leu Tyr Lys Leu Pro Leu Ser Gin Arg His Val
290 295 300
Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gin Ile Thr Ser Arg Thr
305 310 315 320
Ala Arg Gly Vał Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro
325 330 335
Tyr Glu Gin Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro
340 345 350
Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Glu
355 360 365
Pro Ser Pro Gin Pro Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gin Pro Ala
370 375 380
Pro Asn Pro Gin Pro Ala Pro Ser Asn Pro ile Asp Glu Lys Leu Val
385 390 3 95 400
PL 214 229 B1
Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr val Phe Glu Glu 415 Asn
405 410
Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asn Leu Ser Ala Glu Thr Ala
420 425 430
Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gin Glu Ser Leu Ser His Lys
435 440 445
Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr
450 455 460
Asn Lys Ala Tyr ASp Leu Leu Ala Arg Ile His Gin Asp Leu Leu Asp
465 470 475 480
Asn Lys Gly Arg Gin Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu
485 490 495
Arg Leu Lys Asp Val Ser Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp Ile
500 505 510
Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro
515 520 S25
Asn Ala Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu
530 535 54 0
Al a Gly Lys ipy^M Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp
545 550 555 560
Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His
565 570 575
Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala
580 585 590
Al Gin Ala TyT Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp
595 600 605
His Gin Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr
610 615 620
Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr
625 630 63S 640
Asn Leu Gin Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile I le Pro
645 650 655
His Tyr Asp His Tyr His Asn ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly
660 665 670
Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr
675 680 685
Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn
690 695 700
Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Gin Arg Asn Lys Asn Gly Gin
705 710 715 720
Ala Asp Thr Asn Gin Thr Glu Lys Pro Ser Glu Glu Lys Pro Gin Thr
725 730 735
Glu Lys Pro Glu Glu Glu Thr Pro Arg Glu Glu Lys Pro Gin Ser Glu
740 745 750
Lys Pro Glu Ser Pro Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Pro
755 760 765
Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gin Val Glu Thr Glu Lys Val Glu Glu Lys
770 775 780
Leu Arg Glu Ala Glu Asp Leu Leu Gly Lys Ile Gin Asp Pro Ile Ile
785 790 795 800
Lys Ser Asn Ala Lys Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Asn Asn Leu Leu
805 810 815
phe Gly Thr Gin Asp Asn Asn Thr Ile Met Al a Glu Ala Glu Lys Leu
820 825 830
Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Lys
835 840
<210> 8
PL 214 229 B1 <211> 83Θ <212» PRT <213» BVH-ll-2 <400> 8
Met 1 Lys Ile Asn Lys 5 Lys Tyr Leu Ala Gly 10 Ser Val Ala Val Leu 15 Al a
Leu. Ser Val Cys 20 Ser Tyi? Glu Leu Gly 25 Arg His Gin Ala Gly 30 Gin Val
Lys Lys Glu 35 Ser Asn Arg Vał Ser 40 Tyi? Ile Asp GlY Asp 45 Gin Ala Gly
Gin Lys 50 Ala Glu Asn Leu Thr 55 Pro Asp Glu Val Ser 60 Lys Arg Glu Gly
Ile 65 Asn Ala Glu Gin Ile 70 Val Ile Lys Ile Thr 75 Asp Gin Gly Tyr Val 80
Thr Ser His Gly Asp 85 His Tyr Η Tyr Tyr 90 Asn Gly Lys Val Pro 95 Tyr
Asp Ala I le Ile 100 Ser Glu Glu Leu Leu 105 Met Lys Asp Pro Asn 110 Tyr Gin
Leu Lys Asp 115 Ser Asp Ile Val Asn 120 Glu Ile Lys Gly Gly 125 Tyr Val Ile
Lys Val 130 Asp Gly Lys Tyr Tyr 135 val Tyr Leu Lys Asp 140 Ala Ala His Ala
Asp 145 Asn Ile Arg Thr Lys 150 Glu Glu Ile Lys Arg 155 Gin Lys Gin Glu His 160
Ser His Asn His Asn 165 Ser Arg Ala Asp Asn 170 Ala Vał Ala Ala Ala 175 Arg
Ala Gin Gly Arg 180 Jyr Thr Thr Asp Asp 185 Gly Tyr 11 Phe Asn 190 Ala Ser
Asp Ile Ile 195 Glu Asp Thr Gly Asp 200 Ala Tyr Ile Val Pro 205 His Gly Asp
His Tyr 210 His Tyl? Ile Pro Lys 215 Asn Glu Leu Ser Ala 220 Ser Glu Leu Ala
Ala 225 Ala Glu Ala Tyr Trp 230 Asn Gly Lys Gin Gly 235 Ser Arg Pro Ser Ser 240
Ser Ser Ser Tyr Asn 245 Ala Asn Pro Val Gin 250 Pro Arg Leu Ser Glu 255 Asn
His Asn Leu Thr 260 Val Thr Pro Thr Tyr 265 His Gin Asn Gin Gly 270 Glu Asn
Ile Ser Ser 275 Leu Leu Arg Glu Leu 280 Tyr Ala Lys Pro Leu 285 Ser Glu Arg
His Val 290 Glu Ser Asp Gly Leu 295 Ile Phe Asp Pro Ala 300 Gin Ile Thr Ser
Arg 305 Thr Ala Arg Gly Val 310 Ala Val Pro His Gly 315 Asn His Tyr His Phe 320
Ile Pro Tyr Glu Gin 325 Met Ser Glu Leu Glu 330 Lys Arg Ile Ala Arg 335 Ile
Ile Pro Leu Arg 340 Tyr Arg Ser Asn His 345 Trp Val Pro ASp Ser 350 Arg Pro
Glu Gin Pro 355 Ser Pro Gin Ser Thr 360 Pro Glu Pro Ser Pro 365 Ser Leu Gin
Pro Ala 370 Pro Asn Pro Gin Pro 375 Ala Pro Ser Asn Pro 380 Ile Asp Glu Lys
Leu 385 Val Lys Glu Ala Val 390 Arg Lys Val Gly Asp 395 Gly Tyr val Phe Glu 400
Glu Asn Gly val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu
PL 214 229 B1
405 410 415
Thr Ala Ala Gly 420 Ile Asp Ser Lys Leu 425 Ala Lys Gin Glu Ser 430 Leu Ser
His Lys Leu 435 Gly Ala Lys Lys Thr 440 Asp Leu Pro Ser Ser 445 Asp Arg Glu
Phe Tyr 450 Asn Lys Ala Tyr Asp 455 Leu Leu Ala Arg Ile 460 His Gin Asp Leu
Leu 465 Asp Asn Lys Gly Arg 470 Gin Val Asp Phe Glu 475 Val Leu Asp Asn Leu 480
Leu Glu Arg Leu Lys 485 Asp Val Ser Ser Asp 490 Lys Val Lys Leu Val 495 Asp
Asp Ile Leu Ala 500 Phe Leu Ala Pro Ile 505 Arg His Pro Glu Arg 510 Leu Gly
Lys Pro Asn 515 Ala Gin Ile Thr Tyr 520 Thr Asp Asp Glu Ile 525 Gin Val Ala
Lys Leu 530 Ala Gly Lys Tyr Thr 535 Thr Glu Asp Gly Tyr 540 Ile Phe Asp Pro
Arg 545 Asp Ile Thr Ser Asp 550 Glu Gly Asp Ala 555 Val Thr Pro His Met 560
Thr His Ser His Trp 565 Ile Lys Lys Asp Ser 570 Leu Ser Glu Ala Glu 575 Arg
Ala Ala Ala Gin 580 Ala Tyr Ala Lys Glu 585 Lys Gly Leu Thr Pro 590 Pro Ser
Thr Asp His 595 Gin Asp Ser Gly Asn 600 Thr Glu Ala Lys Gly 605 Ala Glu Ala
Ile Tyr 610 Asn Arg Val Lys Ala 615 Ala Lys Lys Val Pro 620 Leu Asp Arg Met
Pro 625 Tyr Asn Leu Gin Tyr 630 Thr Val Glu Val Lys 635 Asn Gly Ser Leu Ile 640
Ile Pro His Tyr Asp 64 5 His Tyr His Asn Ile 650 Lys Phe Glu Trp Phe 655 Asp
Glu Gly Leu Tyr 660 Glu Ala Pro Lys Gly 665 Tyr Ser Leu Glu Asp 670 Leu Leu
Ala Thr Val 675 Lys Tyr Tyr Val Glu 680 His Pro Asn Glu Arg 685 Pro His Ser
Asp Asn. 690 Gly Phe Gly Asn Ala 695 Ser Asp His Val Arg 700 Lys Asn Lys Ala
Asp 705 Gin Asp Ser Lys Pro 710 Asp Glu Asp Lys Glu 715 His Asp Glu Val Ser 720
Glu Pro Thr His Pro 725 Glu Ser Asp Glu Lys 730 Glu Asn His Ala Gly 735 Leu
Asn Pro Ser Ala 74 0 Asp Asn Leu Tyr Lys 745 Pro Ser Thr Asp Thr 750 Glu Glu
Thr Glu Glu 755 Glu Ala Glu Asp Thr 760 Thr Asp Glu Ala Glu 765 Ile Pro Gin
Val Glu 770 Asn Ser Val Ile Asn 775 Ala Lys Ile Ala Asp 780 Ala Glu Ala Leu
Leu 785 Glu Lys Val Thr Asp 790 Pro Ser Tle Arg Gin 795 Asn Ala Met Glu Thr 800
Leu Thr Gly Leu Lys 805 Ser Ser Leu Leu Leu 810 Gly Thr Lys Asp Asn 815 Asn
Thr Ile Ser Ala 820 Glu Val Asp Ser Leu 825 Leu Ala Leu Leu Lys 830 Glu Ser
Gin Pro Ala Pro Ile Gin
335 <210> 9
PL 214 229 B1 <211> 2528 <212> DNA <213> 8VH-3 <400> 9 tgtgccfcatg cactaaacca gcatcgttcg caggaaaafca aggacaafcaa tcgfcgtctct 60 tatgtggatg gcagccagtc aagCcagaaa agtgaaaact tgacaccaga ccaggfctagc 120 cagaaagaag gaattcaggc tgagcaaatt gtaatcaaaa ttacagatca gggctatgta 180 acgtcacacg gtgatcacta tcattactat aatgggaaag ttccttatga tgccctcttt 240 agtgaagaac fcctfcgatgaa ggatccaaac tatcaactta aagacgctga tattgfccaat 300 gaagtcaagg gtggttatat catcaaggtc gatggaaaat attatgtcta cctgaaagat 360 gcagctcatg ctgataatgt tcgaactaaa gatgaaatca atcgtcaaaa acaagaacat 420 gtcaaagata atgagaaggt taactctaat gttgctgtag caaggtctca gggacgatat 480 acgacaaatg atggttatgt ctttaatcca gctgatatta tcgaagatac gggtaatgct 540 tatatcgttc ctcatggagg tcactatcac tacattccca aaagcgattt atctgctagt 600 gaattagcag cagctaaagc acatctggct ggaaaaaata tgcaaccgag tcagttaagc 660 tafctcttcaa caccttctcc atctcttcca atcaatccag gaacttcaca tgagaaacat 720 gaagaagatg gatacggatt tgatgctaat cgtattatcg ctgaagatga atcaggtttt 780 gtcatgagtc acggagacca caatcattat ttcttcaaga aggacttgac agaagagcaa 840 attaaggctg cgcaaaaaca tttagaggaa gttaaaacta gtcataatgg attagattct 900 ttgtcatctc atgaacagga ttatccaagt aatgccaaag aaatgaaaga tttagataaa 960 aaaatcgaag aaaaaattgc tggcattatg aaacaatatg gtgtcaaacg tgaaagtatt 1020 gtcgtgaata aagaaaaaaa tgcgattatt tatccgcatg gagatcacca tcatgcagat 1080 cegattgatg aacataaacc ggttggaatt ggtcattctc acagtaacta tgaactgttt 1140 aaacccgaag aaggagttgc taaaaaagaa gggaataaag tttatactgg agaagaatta 1200 acgaatgttg ttaatttgtt aaaaaatagt acgtttaata atcaaaactt tactctagcc 1260 aatggtcaaa aacgcgtttc ttttagtttt ccgcctgaat tggagaaaaa attaggtatc 1320 aatatgctag taaaattaat aacaccagat ggaaaagtat tggagaaagt atctggtaaa 1380 gtatttggag aaggagtagg gaatattgca aactttgaat tagatcaacc ttatttacca 1440 ggacaaacat ttaagtatac tatcgcttca aaagattafcc cagaagtaag ttatgatggt 1500 acatttacag ttccaacctc tttagcttac aaaatggcca gtcaaacgat tttefcatcct 1560 ttccatgcag gggatactta tttaagagtg aaccctcaat ttgcagtgcc taaaggaact 1620 gatgctttag tcagagtgtt tgafcgaattt catggaaatg cttatttaga aaataactat 1680 aaagttggtg aaatcaaatt accgattccg aaattaaacc aaggaacaac cagaacggcc 1740 ggaaataaaa ttcctgtaac cfctcatggca aatgcttatt tggacaatca atcgacttat 1800 attgtggaag tacctatctfc ggaaaaagaa aatcaaacfcg ataaaccaag tattctacca 1860 caatttaaaa ggaataaagc acaagaaaac tcaaaacttg atgaaaaggt agaagaacca 1920 aagactagtg agaaggtaga aaaagaaaaa ctttctgaaa ctgggaatag tactagtaat 1980 tcaacgttag aagaagttcc tacagtggat cctgtacaag aaaaagtagc aaaatttgcfc 2040 gaaagttatg ggatgaagct agaaaatgtc ttgtttaata tggacggaac aattgaatta 2100 tatttaccat cgggagaagt cattaaaaag aatatggcag attttacagg agaagcacct 2160 caaggaaatg gtgaaaataa accatctgaa aatggaaaag tatctactgg aacagttgag 2220 aaccaaccaa cagaaaataa accagcagat tctttaccag aggcaccaaa cgaaaaacct 2280 gtaaaaccag aaaactcaac ggataatgga atgttgaatc cagaagggaa tgtggggagt 2340 gaccctatgt tagattcagc attagaggaa gctccagcag tagatcctgt acaagaaaaa 2400 ttagaaaaat ttacagctag ttacggatta ggcttagata gtgttatatt caatatggat 2460 ggaacgattg aattaagatt gccaagtgga gaagtgataa aaaagaattfc attgatctca 2520 tagcgtaa 2528 <210> 10 <211> 840 <212 > PRT <213> BVH-3 <400> 10
Cys Ala Tyr Ala Leu Asn Gin His Arg Ser Gin Glu Asn Lys Asp Asn 15 10 15
Asn Arg Val Ser Tyr Val Asp Gly Ser Gin Ser Ser Gin Lys Ser Glu
PL 214 229 B1
Asn Leu Thr 20 Pro Asp Gin Val Ser 25 Gin Lys Glu Gly Ile 30 Gin Ala Glu
Gin Ile 35 Val Ile Lys Ile Thr 40 Asp Gin Gly Tyr Val 45 Thr Ser His Gly
Asp 50 His Tyr His Tyr Tyr 55 Asn Gly Lys Val Pro 60 Tyr Asp Ala Leu Phe
65 Ser Glu Glu Leu Leu 70 Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gin Leu Lys Asp 80 Ala
Asp Ile Val Asn 85 Glu Val Lys Gly Gly 90 Tyr Ile Ile Lys Val 95 Asp Gly
Lys Tyr Tyr 100 Val Tyx Leu Lys Asp 105 Ala Ala His Ala Asp 110 Asn Val Arg
Thr Lys 115 Asp Glu Ile Asn Arg 120 Gin Lys Gin Glu His 125 Val Lys Asp Asn
Glu 130 Lys Val Asn. Ser Asn 13 5 Val Ala Val Ala Arg 140 Ser Gin Gly Arg Tyr
145 Thr Thr Asn Asp Gly 150 Tyr Val Phe Asn Pro 155 Ala Asp Ile Ile Glu 160 Asp
Thr Gly Asn Ala 165 Tyr Ile Val Pro His 170 Gly Gly His Tyr His 175 Tyr I le
Pro Lys Ser 180 Asp Leu Ser Ala Ser 185 Glu Leu Ala Ala Ala 190 Lys Ala His
Leu Ala 195 Giy Lys Asn Met Gin 200 Pro Ser Gin Leu Ser 205 Tyr Ser Ser Thr
Pro 210 Ser Pro Ser Leu Pro 215 Ile Asn Pro Gly Thr 220 Ser His Glu Lys His
225 Glu Glu Asp Gly Tyr 23 0 Gly Phe Asp Ala Asn 235 Arg Ile Ile Ala Glu 240 Asp
Glu Ser Gly Phe 245 Val Met Ser Hx s Gly 250 Asp His Asn His Tyr 255 Phe Phe
Lys Lys Asp 260 Leu Thr Glu Glu Gin 265 Ile Lys Ala Ala Gin 270 Lys Hrs Leu
Glu Glu 275 Val Lys Thr Ser His 280 Asn Gly Leu Asp Ser 285 Leu Ser Ser His
Glu 290 Gin Asp Tyr Pro Ser 295 Asn Ala Lys Głu Met 300 Lys Asp Leu Asp Lys
305 Lys Ile Głu Glu Lys 310 Ile Ala Gly Ile Met 315 Lys Gin Tyr Gly Val 320 Lys
Arg Glu Ser Ile 325 Val Val Asn Lys Glu 330 Lys Asn 1. Ile Ile 335 Tyr Pro
His «ly Asp 340 His His His Ala Asp 345 Pro Ile Asp Glu His 350 Lys Pro Val
Gly Ile 355 Gly His Ser His Ser 360 Asn Tyr Głu Leu Phe 365 Lys Pro Glu Glu
Gly 370 Val Ala Lys Lys Glu 375 Gly Asn Lys Val Tyr 380 Thr Gly Glu Glu Leu
385 Thr Asn Val Val Asn 390 Leu Leu Lys Asn Ser 395 Thr Phe Asn Asn Gin 400 Asn
Phe Thr Leu Ala 405 Asn Gly Gin Lys Arg 410 Val Ser Phe Ser Phe 415 Pro Pro
Glu Leu Glu 420 Lys Lys Leu Gly Ile 425 Asn Met Leu Val Lys 430 Leu I le Thr
Pro Asp 435 Gly Lys Val Leu Glu 440 Lys Val Ser Gly Lys 445 Vał Phe Gly Glu
Gly 450 Val Gly Asn Ile Ala 455 Asn Phe Głu Leu Asp 460 Gin Pro Tyr Leu Pro
465 Gly Gin Thr Phe Lys 470 Tyr Thr Ile Ala Ser 475 Lys Asp Tyr Pro Glu 480 Val
PL 214 229 B1
485 490 495
Ser Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met
500 505 510
Ala Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyx? Leu
515 520 525
Arg Val Asn Pro Gin Phe Al d Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu val
530 535 54 0
Arg Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr
545 550 555 560
Lys Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr
565 570 575
Thr Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala
580 585 590
Tyr Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu
595 600 605
Lys Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg
610 615 620
Asn Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro
625 63 0 635 640
Lys Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn
645 650 655
Ser Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Vał Pro Thr Vał Asp Pro vał
660 665 670
Gin Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu
675 680 685
Asn Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser
690 695 700
Gly Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro
705 710 715 720
Gin Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn. Gly Lys Val Ser Thr
725 730 735
Gly Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu
740 745 750
Pro Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp
755 760 765
Asn Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Giy Ser Asp Pro Met Leu
770 775 780
Asp Ser Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys
785 790 795 800
Leu Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile
SOS 810 815
Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val
820 825 830
Ile Lys Lys Asn Leu Leu Ile Ser
835 840 <210> 11 <211> 94 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> 4D4.9 <400> 11
Asp Gin Gly Tyr Val Thr Ser His Gly Asp His Tyr fiu. s Tyr Tyr Asn
1 5 10 15
Gly Lys Val Pro Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Glu Glu Xi61X Leu Met Lys
PL 214 229 B1
20 25 30
Asp Pro Asn Tyr Gin Leu Lys Asp Ala Asp Ile Val Asn Glu Val Lys
35 40 45
Gly Gly Tyr Ile Ile Lys Val Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Leu Lys
50 55 60
Asp Ala Ala His Ala Asp Asn Val Arg Thr Lys Asp Glu Ile Asn Arg
65 70 75 80
Gin Lys Gin Glu His Val Lys Asp Asn Glu Lys Val Asn Ser
85 90
<210> 12 <2łl> 42 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> 7G11.7 <400> 12
Giy Ile Gin Ala Glu Gin Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gin Gly ΤγΧ
1 5 10 15
Val Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro
20 25 30
Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Glu Glu Łeu Leu
35 40
<210> 13 <211> 39 <212> PR.T <213> Unknown <220>
<223> 7G11.9 <400> 13
Thr Ala Tyr Ile Val Arg His Gly Asp His Phe His Ile Pro Lys
1 5 10 15
Ser Asn Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr
20 25 30
Pro Ser Pro Ser Χιβίΐ Pro Ile
35
<210> 14 <211> 36 <212> PRT < 213 > Unknown <220>
<223> 4D3.4 <400> 14
Thr 1 Ser Asn Ser Thr 5 Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
10 15
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
20 25 30
Val Leu Phe Asn
35
PL 214 229 B1
<210» 15 <211» 24 <212» PRT <213.» Unknown
<220» <223» 8E3.1 <400» 15 Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile Lys
1 Lys Asn Leu Ser 20 5 Asp Phe Ile 10 15
<210» IG <211> 35 <212> PRT <213 > Unknown <220>
<223> 1G2.2 <400» 16
Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile
1 5 10 15
Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val ile Lys Lys Asn Leu Ser Asp
20 25 30
Phe Ile Ala <210» 17 <211> 57 <212> PRT <213> Unknown <220» <223> 10C12.7 <400> 17
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val 10 Gin Glu Lys 15 Leu
1 5
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
20 25 30
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
35 40 45
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
50 55
<210> 18 <211> 40 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» 14F6.3 <400» 18
Łys Val Glu Głu Pro Lys Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu
PL 214 229 B1
1 5 10 15
Ser Glu Thr Gly Asn Ser Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro
20 25 30
Thr Val Asp Pro Val Gin Glu Lys
35 4 0
<210» 19 <211» 78 <212» PRT <213> Unknown <220>
<223» B12D8.2 <400» 19
Met Lys Asp Lsu. Asp Lys Lys He Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met
1 5 10 15
Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg Glu Ser Ile Val val Asn Lys Glu Lys
20 25 30
Asn Ala. Ile 11© Tyr Pro His Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile
3 5 40 45
Asp Glu His Lys Pro Ua 1 Gly Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu
50 55 60
Leu Płie Lys Pro Glu Glu Gly Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn
65 70 75
<210» 20 <211» 51 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» 7F4.1 <400> 20
Ala Ile Ile Tyr Pro His Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp
1 5 10 15
Glu His Lys Pro Val Gly Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu
20 25 30
Phe Lys Pro Glu Glu Gly Val Ala Lys Lys Glu dy Asn Lys Val Tyr
35 40 45
Thr Gly Glu 50 <210» 21 <211> 29 <212> PRT <213» Unknown <220» <223» 10D7.5 <400» 21
Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp
20 25
PL 214 229 B1 <210> 22 <211> 86 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> 10G9.: 3 and 10A2.2 and S11B8.1
<400> 22 Asp His Głn Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile
1 5 10 15
Tyr Asn Arg Vał Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro
20 25 30
Tyr Asn Leu Gin Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile
35 40 45
Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu
50 55 60
Gły Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala
65 70 75 80
Thr Val Lys Tyr Tyr Val
85
<210> 23 <211> 41 <212> PRT
<213 > Unknown
<220>
<223> 11B8.4
<4G0> 23 Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp
20 25 30
Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His
35 40
<210> 24 <211> 69 <212> PRT
<213> Unknown
<220> <223> 3A4.1
<400> 24 Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Glu Lys val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr
20 25 30
Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Aap Asn Asn
35 40 45
Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Liys Glu Ser
55 60
Głn Pro Ala Pro ile 65
PL 214 229 B1 <210» 25 <211» 27 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» OCRR 479 <400» 25 cagtagatct gtgcctatgc actaaac <210» 26 <211» 33 <212> DNA <213» Unknown <220» <223» OCRR 480 <400» 26 gatctctaga ctactgctat tccttacgct atg <210» 27 <211» 30 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» OCRR 497 <400» 27 atcactcgag cattacctgg ataatcctgt <210» 28 <211> 26 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» OCRR 498 <400» 28 ctgctaagct tatgaaagafc ttagat <210» 23 <211» 24 <212» DNA <213» Unknown <220» <223> OCRR 499 <400» 29 gatactcgag ctgctattcc ttac <210» 30 <211» 28 <212» DNA
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1 <220» <223» HAMJ 288 <400» 51 cgacaagctt aagtaaatct tcagcctctc tcag <210» 52 <211> 31 <212> DNA < 213 > Unknown <220» <223» HAMJ 289 <400» 52 gataccatgg ctagcgacca tgtfccaaaga a <210» 53 <211> 36 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 290 <400» 53 cgccaagctt atcatccact aacttgactt tatcac <210» 54 <211» 33 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 291 <400» 54 cataccatgg atattcttgc cttcttagct ccg <210» 55 <211» 30 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 301 <400» 55 catgccatgg tgcttatgaa ctaggtttgc <210» 56 <211> 32 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 302
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1 <220» <223» HAMJ 352 <400» 72 catgccafcgg aagcctattg gaatgggaag c <21Q> 73 <211> 38 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223» HAMJ 470 <400» 73 ataagaatgc ggccgccgct afcgaaatcag ataaattc 38 <210» 74 <400» 74
000 <210» 75 <400» 75
000 <210» 76 <400» 76
000 <210» 77 <400» 77
000 <210» 78 <400» 78
000 <210» 79 <400» 79
000 <210» 80 <400» 80
000 <210» 81 <400» 81
000
PL 214 229 B1
<210> 82
<400> 000 82
<210> 83
<400> 000 83
<210> 84
<400> 000 84
<210> 8 5
<400> 000 85
<210> 86
<400> 000 86
<210> 87
<400> 000 87
<210> 88
<400> 000 88
<210> 89
<400> 000 89
<210> 90
<400> 000 90
<210> 91
<400> 000 91
<210> 92
<4 00:· 000 92
<210> 93
<400> 93
PL 214 229 B1
000
<210» 94
<400» 000 94
<210» 95
<400> 000 95
<210> 96
<400» 000 96
<210» 97
<400> 000 97
<210» 98
<400» 000 98
<210» 99
<400» 000 99
<210> 100
<400» 000 100
<210» 101
<400» 000 101
<210» 102
<400» οοο 102
<210> 103
<400» 000 103
<210» 104
<400» 000 104
<210» 105
PL 214 229 B1
<400> 000 105
<210» 106
<400» 000 106
<210» 107
<400» 000 107
<210» 108
<400» 000 108
<210» 109
<400» 000 109
<210» 110
<400» 000 110
<210» 111
<400» 000 111
<210» 112
<400» 000 112
<210» 113
<400» 000 113
<210> 114
<400» 000 114
<210» 115
<400» 000 115
<210» 116
<400> 000 116
PL 214 229 B1
<210> 117
<400» 000 117
<210> 118
<400> 000 118
<210> 119
<400> 000 119
<210> 120
<400> 000 120
<210> 121
<400> 000 121
<210» 122
<400> ΟΟΟ 122
<210> 123
<400> 000 123
<210> 124
<400> 000 124
<210> 125
<400> 000 125
<210> 126
<400> 000 126
<210> 127
<400> 000 127
<210> 128
PL 214 229 B1
<400» 000 128
<210» 129
<400» 000 129
<210» 130
<400» 000 130
<210» 131
<400> 000 131
<210> 132
<400» 000 132
<210» 133
<400> 000 133
<210> 134
<400» 000 134
<210» 135
<400> 000 135
<210» 13 6
<400» 000 13 6
<210» 137
<400» 000 137
<210» 138
<400» ΟΟΟ 133
<210» 139
<400 » ΟΟΟ 139
PL 214 229 B1
<210» 140
<400» 000 140
<210» 141
<400» 000 141
<210» 142
<400» 000 142
<210» 143
<400» 000 143
<210» 144
<400» 000 144
<210» 14 5
<400» 000 145
<210» 146
<400» 000 146
<210» 14 7
<400» 000 147
<210» 148
<400» 000 148
<210» 149
<400» 000 14 9
<210» 150
<400» 000 150
<210» 151
<400» 151
PL 214 229 B1
000
<210» 152
<400> 000 152
<210» 153
<400» 000 153
<210» 154
<400» 000 154
<210» 155
<400» 000 155
<210» 156
<400> ΟΟΟ 156
<210» 157
<400» ΟΟΟ 157
<210» 158
<40 0> ΟΟΟ 158
<210» 159
<400» ΟΟΟ 159
<210» 160
<400» ΟΟΟ 160
<210» 161
<400» ΟΟΟ 161
<210» 162
<400» ΟΟΟ 162
<210» 163
PL 214 229 B1 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> Mab H11-B-11B8 target epitope <400> 163
Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala 15 10 15
Thr Val Lys Tyr Tyr Val <210> 164 <400> 164
000 <210> 165 <400=. 165
000 <210> 166 <400> 166
000 <210> 167 <400> 167
000 <210> 168 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> HAMJ 471 <4 0 0 > 168 atatgggccc ctgtatagga gccggttgac ttfcc <210> 169 <211> 34 < 212 > DNA <213> Unknown <220>
<223> HAMJ 472 <400> 169 atatgggccc aatatgcaac cgagtcagtt aagc <210> 170 <211> 31 <212> DNA
PL 214 229 B1 < 213 > Unknown <220>
<223> HAMJ 350 <400> 170 atatgggccc aacatggtcg ctagcgttac c <210> 171 <211> 34 <212> DNA <213 > Unknown <220>
<223> HAMJ 351 <400> 171 tcccgggccc gacttgacag aagagcaaat taag <210> 172 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> HAMJ 358 <400> 172 catgccafcgg gacttgacag aagagcaaat taag <210> 173 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> HAMJ 359 <400> 173 tcccgggccc cgcfcatgaaa tcagataaat tc <210> 174 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> HAMJ 403 <400> 174 atatgggccc gacattgata gtctcttgaa acagc <210> 175 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220>
PL 214 229 B1 <223> HAMJ 361 <400> 175 egccaagctt aacatggtcg ctagcgttac c 31 <210> 176 <211> 37 <212 > DNA .
<213 > Unknown <220>
<223> HAMJ 483 <400> 176 atatgggccc cttactctcc tttaataaag ccaatag 37 <210> 177 <400> 177
000 <210> 173 <400> 178
000 <210> 179 <400> 179
000 <210> 180 <400> 180
000 <210> 181 <400> 181
000 <210> 182 <400> 182
000 <210> 183 <400> 183
000 <2ł0> 184 <400> 184
000 <21G> 185
PL 214 229 B1
000
<210» 186
<400» 000 186
<210» 187
<400» 000 187
<210» 188
<400» 000 188
<210> 189
<400» οοο 189
<210> 190
<400» 000 190
<210» 191
<400» 000 191
<210» 192
<400» 000 192
<210> 193
<400» 000 193
<210> 194
<400» 000 194
<210» 195
<400» 000 195
<210» 196
<400» 000 196
PL 214 229 B1
<210» 197
<400» ΟΟΟ 197
<210> 198
<400> ΟΟΟ 198
<210> 199
<400» ΟΟΟ 199
<210» 200
<400» ΟΟΟ 200
<210» 201
<400» ΟΟΟ 201
<210» 202
<400> ΟΟΟ 202
<210» 203
<400» ΟΟΟ 203
<210» 204
<400> ΟΟΟ 204
<210> 205
<400» ΟΟΟ 205
<210> 206
<400» ΟΟΟ 206
<210» 207
<400» ΟΟΟ 207
<210» 208
<400> 208
PL 214 229 B1
οοο
<210> 209
<400> ΟΟΟ 209
<210> 210
<400> ΟΟΟ 210
<210> 211
<400> ΟΟΟ 211
<210> 212
<400> ΟΟΟ 212
<210> 213
<400> ΟΟΟ 213
<210> 214
<40 0> ΟΟΟ 214
<210> 215
<400> ΟΟΟ 215
<210> 216
<400> ΟΟΟ 216
<210> 217
<400> ΟΟΟ 217
<210> 218
<400> ΟΟΟ 218
<210> 219
<400> ΟΟΟ 219
<210> 220
PL 214 229 B1
<400» ΟΟΟ 22 0
<210> 221
<400» ΟΟΟ 221
<210» 222
<400» ΟΟΟ 222
<210» 223
<400» ΟΟΟ 223
<210» 224
<400» ΟΟΟ 224
<210» 225
<400» ΟΟΟ 225
<210» 226
<400» ΟΟΟ 226
<210» 227
<400» ΟΟΟ 227
<210» 22Θ
<400» ΟΟΟ 228
<210» 229
<400» ΟΟΟ 229
<210» 230
<400» ΟΟΟ 230
<210» 231
<400» ΟΟΟ 231
PL 214 229 B1 <210» 232 <400> 232 ΟΟΟ <210» 233 <400» 233 ΟΟΟ <210> 234 <400» 234 ΟΟΟ <210» 235 <211» 569 <212» FRT <213» Unknown <220» <223» NEW 1 <400» 235
Met 1 Asp Leu Thr Glu 5 Glu Gin Ile Lys Ala 10 Ala Gin Lys His Leu 15 Glu
Glu Val Lys Thr 20 Ser His Asn Gly 25 Asp Ser Leu Ser Ser 30 His Glu
Gin Asp Tyr 35 Pro Gly Asn Ala Lys 40 Glu Met Lys Asp Leu 45 Asp Lys Lys
Ile Glu 50 Glu Lys Ile Ala Gly 55 Ile Met Lys Gin Tyr 60 Gly Val Lys Arg
Glu 65 Ser Ile Val Val Asn 70 Lys Glu Lys i. l Ala Ile ile Tyr Pro His 80
Gly Asp His His His 85 Ala Asp Pro Ile Asp 90 Glu His Lys Pro Val 95 Gly
Ile Gly His Ser 100 His Ser Asn Tyr Glu 105 Leu Phe Lys Pro Glu 110 Glu Gly
Val Ala Lys 115 Lys Glu Gly Asn Lys 120 Val Tyr Thr Gly Glu 125 Glu Leu Thr
Asn Val 130 val Asn Leu Leu Lys 135 Asn Ser Thr Phe Asn 140 Asn Gin Asn Phe
Thr 145 Leu Ala Asn Gly Gin 150 Lys Arg Val Ser Phe 155 Ser Phe Pro Pro Glu 160
Leu Glu Lys Lys Leu 165 Gly Ile Asn Met Leu 170 Val Lys Leu Ile Thr 175 Pro
Asp Gly Lys Val 180 Leu Glu Lys Val Ser 185 Gly Lys Val Phe Gly 190 Glu Gly
Val Gly Asn 195 Ile Ala Asn Phe Glu 200 Leu Asp Gin Pro Tyr 205 Leu Pro Gly
Gin Thr 210 Phe Lys Tyr Thr Ile 215 Ala Ser Lys Asp Tyr 220 Pro Glu val Ser
Tyr 225 Asp Gly Thr Phe Thr 230 Val Pro Thr Ser Leu 235 Ala Tyr Lys Met Ala 240
Ser Gin Thr Ile Phe 245 Tyr Pro Phe His Ala 250 Gly Asp Thr Tyr Leu 255 Arg
Val Asn Pro Gin Phe Al a val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
PL 214 229 B1
260 265 270
val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
290 295 300
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met A.la Asn Ala Tyr
305 310 315 320
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro ΤΊ ΛΛ Leu Glu Lys
325 330 335
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
340 34 5 350
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
355 360 365
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
370 375 380
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val 0! In
385 390 395 400
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
405 410 415
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
420 425 430
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
435 440 445
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
450 455 460
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
465 470 475 480
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
485 490 495
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
500 505 510
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
515 520 525
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
530 535 54 0
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
545 550 555 560
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
565
<210> 236
<400> 000 236
<210> 237
<400» 000 237
<210> 238
<400» 000 238
<210> 239
<400» 239
PL 214 229 B1
ΟΟΟ
<210» 240
<4ΟΟ> ΟΟΟ 240
<210> 241
<400> ΟΟΟ 241
<210> 242
<40 Ο> ΟΟΟ 242
<210> 243
<400> ΟΟΟ 243
<210> 244
<400> ΟΟΟ 244
<210> 245
<400> ΟΟΟ 245
<210» 246
<400> ΟΟΟ 246
<210> 247
<400> ΟΟΟ 247
<210> 248
<400> ΟΟΟ 248
<210> 249
<400> ΟΟΟ 249
<210> 250
<400> ΟΟΟ 250
<210> 251
PL 214 229 B1 <400» 251 000 <210» 252 <400» 252 000 <210> 253 <400» 253 000 <210» 254 <400> 254 000 <210» 255 <211» 569 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NSW 1 <400> 255
Met Asp Leu Thr Glu Glu Gin ile Lys Al a Ala Gin Lys His Leu Glu
1 5 10 15
Glu Val Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
20 25 30
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Ly3
35 40 45
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
50 55 60
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His
65 70 75 80
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
85 90 95
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
100 105 110
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
115 120 125
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn. Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
130 13 5 14 0
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
14 5 150 155 160
Leu GlU Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
165 170 175
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
180 185 130
vał Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
195 200 205
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
210 215 220
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
22S 23 0 235 240
PL 214 229 B1
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
245 250 255
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Łys Gly Thr Asp Ala Leu Vai Arg
260 265 270
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyx Lys
275 280 285
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
290 295 300
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
305 310 315 320
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
325 330 335
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
340 345 350
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
355 360 365
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
370 375 380
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
385 390 395 400
Glu Łys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
405 410 415
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Τγιτ Leu Pro Ser Gly
420 425 430
Glu Val 1 le Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
435 440 445
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
450 455 460
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
465 470 475 480
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
485 490 495
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val siy Ser Asp Pro Met Leu Asp
500 505 510
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
515 520 525
Glu Lys Phe Thr Al a Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
530 535 540
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser eiy Glu Val Ile
545 550 555 560
Lys Łys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
565 <210> 256 <211> 569 <212> PRT <213 > Unknown <220>
<223> NEW 35Α <400> 256
Met Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
20 25 30
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn AleŁ Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
40 45
PL 214 229 B1
Ile Glu 50 Glu Lys Ile Ala Giy 55 Ile Met Lys Gin Tyr 60 Gly Val Lys Arg
Glu 65 Ser Ile Val Val Asn 70 Lys Glu Lys Asn Ala 75 Ile ile Tyr Pro Ser 80
Gly Asp Gly Thr Ser 85 Ala Asp Pro Ile Asp 90 Glu His Lys Pro Val 95 Gly
Ile Gly His Ser 100 His Ser Asn Tyr Glu 105 Leu Phe Lys Pro Glu 110 Glu Gly
Val Ala Lys 115 Lys Glu Gly Asn Lys 120 Val Tyr Thr Gly Glu 125 Glu Leu Thr
Asn Val 130 Val Asn Leu Leu Lys 135 Asn Ser Thr Phe Asn 140 Asn Gin Asn Phe
Thr 145 Leu Ala Asn Gly Gin, 150 Lys Arg Val Ser Phe 155 Ser Phe Pro Pro Glu 160
Leu Glu Lys Lys Leu 165 Gly Ile Asn Met Leu 170 Val Lys Leu Ile Thr 175 Pro
Asp Gly Lys Val 180 Leu Glu Lys Val Ser 185 Gly Lys Val Phe Gly 190 Glu Gly
Val Giy Asn 195 Ile Ala Asn Phe Glu 200 Leu Asp Gin Pro Tyr 205 Leu Pro Gly
Gin Thr 210 Phe Lys Τγχ1 Thr Ile 215 Ala Ser Lys Asp Tyr 220 Pro Glu Val Ser
Tyr 225 Asp Gly Thr Phe Thr 230 Val Pro Thr Ser Leu 235 Ala Tyr Lys Met Ala 24 0
Ser Gin Thr Ile Phe 245 Tyr Pro Phe His Ala 250 Giy Asp Thr Tyr Leu 255 Arg
Val Asn Pro Gin 260 Phe Ala Val Pro Lys 265 Gly Thr Asp Ala Leu 270 Val Arg
Val Phe Asp 275 Glu Phe His Gły Asn 280 Ala Tyr Leu Glu Asn 285 Asn Tyr Lys
Val Gly 290 Glu Ile Lys Leu Pro 295 Ile Pro Lys Leu Asn 300 Gin Gly Thr Thr
Arg 305 Thr Ala Gly Asn Lys 310 Ile Pro Val Thr Phe 315 Met Ala Asn Ala Tyr 320
Leu Asp Asn Gin Ser 325 Thr Tyr Ile Val Glu 330 vał Pro Ile Leu Glu 335 Lys
Glu Asn Gin Thr 340 Asp Lys Pro Ser Ile 345 Leu Pro Gin Phe Lys 350 Arg Asn
Lys Ala Gin 355 Glu Asn Ser Lys Leu 360 Asp Glu Lys Val Glu 365 Glu Pro Lys
Thr Ser 370 Glu Lys Vai Glu Lys 375 Glu Lys Leu Ser Glu 380 Thr Gly Asn Ser
Thr 385 Ser Asn Ser Thr Leu 390 Glu Glu val Pro Thr 395 Val Asp Pro Val Gin 400
Glu Lys Val Ala Lys 405 Phe Ala Glu Ser Tyr 410 Gly Met Lys Leu Glu 415 Asn
Val Leu Phe Asn 420 Met Asp Gly Thr Ile 425 Glu Leu Tyr Leu Pro 430 Ser Gly
Glu Val Ile 435 Lys Lys Asn Met Ala 44 0 Asp Phe Thr Gly Glu 445 Ala Pro Gin
Gly Asn 450 Gly Glu Asn Lys Pro 455 Ser Glu Asn Gly Lys 460 Val Ser Thr Gly
Thr 465 Val Glu Asn Gin Pro 470 Thr Glu Asn Lys Pro 475 Ala Asp Ser Leu Pro 480
Glu Ala Pro Asn Glu 485 Lys Pro Val Lys Pro 490 Glu Asn Ser Thr Asp 495 Asn
Gly Met Leu Asn 500 Pro Glu Gly Asn Val 505 Gly Ser Asp Pro Met 510 Leu Asp
PL 214 229 B1
Pro Ala Leu 515 Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
520 525
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
530 535 540
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
545 550 555 560
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
565
<210> 257 <211> 819 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> NEW43 gene <400> 257 atgcaaatta cctacactga tgatgagatt caggtagcca agttggcagg caagtacaca acagaagacg gttatatctt tgatactagt tggattaaaa aagatagttt gtctgaagct gagagagcgg cagcccaggc ttatgctaaa gagaaaggtt tgacccctcc ttcgacagac caccaggatt caggaaatac tgaggcaaaa ggagcagaag cfcatctacaa ccgcgtgaaa gcagctaaga aggtgccact tgatcgtatg ccttacaatc ttcagtatac tgfcagaagtc aaaaacggta gtttaatcat acctcattat gaccattacc ataacatcaa atttgagtgg tttgacgaag gcctttatga ggcacctaag gggtatagtc ttgaggatct tttggcgact gtcaagtact atgtcgaacc gcggaacgct agtgaceatg ttcgtaaaaa taaggcagac caagatagta aacctgatga agataaggaa catgatgaag taagtgagcc aacteaccct gaatctgatg aaaaagagaa tcacgctggt ttaaatcctt cagcagataa tctttataaa ccaagcactg atacggaaga gacagaggaa gaagctgaag ataccacaga tgaggctgaa attcctggta cccctagtat tagacaaaat gctatggaga cattgactgg tctaaaaagt agtcttcttc tcggaacgaa agataataac actatttcag cagaagtaga tagtctcttg gctttgttaa aagaaagtca accggctcct atacagtag
120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 660 720 780 819 <210> 258 <211> 272 <212> PRT <213> Unknown <22 0>
<22 3 > NEW43 polypeptide <400> 258
Met 1 Gin Ile Thr Tyr 5 Thr Asp Asp Glu Ile 10 Gin Val Ala Lys Leu 15 Ala
Gly Lys Tyr Thr 20 Thr Glu Asp Giy Tyr 25 Ile Phe Asp Thr Ser 30 Trp Ile
Lys Lys Asp 35 Ser Leu Ser Glu Ala 40 Glu Arg Ala Ala Ala 45 Gin Ala Tyr
Ala Lys 50 Ci l^i Lys Gly Leu Thr gg Pro Pro Ser Thr Asp 60 His Gin Asp Ser
Giy 65 Asn Thr Glu Ala Lys 70 Gly Ala Glu Ala Ile 75 Tyr Asn Arg Val Lys 80
Ala Ala Lys Lys val 85 Pro Leu Asp Arg Met 90 Pro Tyr Asn Leu Gin 95 TyX
Thr Val Glu Val 100 Lys Asn Gly Ser Leu 105 Ile Ile Pro His Tyr 110 Asp His
Tyr His Asn 115 Ile Lys Phe Glu Trp 120 Phie Asp Glu Gly Leu 125 Tyr Glu Ala
PL 214 229 B1
Pro Lys 130 Gly Tyr Ser Leu Glu 135 Asp Leu Leu Ala Thr Val 14 0 Lys Tyr Tyr
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Vał Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270
<210» 259 <211» 36 <212» DNA <213> Unknown <220» <223> HAMJ 490 <400» 259 ccgaattcca tatgcaaatt acctacactg atgatg 36 <210> 260 <211» 29 <212» DNA <213> Unknown <220» <223» HAMJ 491 <400» 260 ggactagtat caaagatata accgtcttc 29 <210» 261 <211» 33 <212» DNA <213» Unknown <220» < 2 23 > HAMJ 492 <400» 261 ggactagttg gattaaaaaa gatagtttgt ctg 33 <210» 262 <211» 32 <212» DNA <213» Unknown <220»
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1 <211> 45 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 501 <400> 273
taccttctta tgactcttac tctaacatoa aatttgagtg gtttg 45
<210» 274 <211> 45 <212> DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 502 <400» 274 caa.accactc aaatttgatg ttagagtaag agtcataaga aggta 45
<210» 275 <211» 45 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 530 <400» 275 aatcatacct cattatgact cttaccataa catcaaattt gagtg 45
<210» 276 <211» 45 <212» DNA <213» Unknown <220> <223» HAMJ 531 <400» 276 cactcsias.tt t t cf 11 a t ci t ^łactac^ t c a taatcfa.gg^ta tgatt 45
<210» 277 <211> 45 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 532 <400> 277 tacctcatta tgaccattac tctaacatca aatttgagtg gtttg 45
<210» 278 <211» 45 <212» DNA <213» Unknown
PL 214 229 B1
PL 214 229 B1
<400» 283 aacggtagtt taatcatacc ttctaaagac cattaccata acatc 45
<210» 284 <213.» 45 <212? DNA <213» Unknown <220> <223> HAMJ 574 <400> 284 gatgttatgg taatggtctt tagaaggtat gattaaacta ccgtt 45
<210» 285 < 211» 4 6 <212» DNA <213> Unknown <220» <223> HAMJ 575 <400> 285 cggtagttta atcatacctc ataaggactc ttaccataac atcaaa 46
<210» 286 <211» 46 <212> DNA <213> Unknown <220» <223» HAMJ 576 <400» 286 tttgatgtta tggtaagagt ccttatgagg tatgattaaa ctaccg 46
<210» 287 <211» 46 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 577 <400» 287 aacggtagtt taatcatacc tgaccattac cataacatca aatttg 46
<210» 288 <211» 46 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 578 <40Q> 288 caaatttgat gttatggtaa tggtcaggta tgattaaact accgtt 46
PL 214 229 B1 <210» 289 <211> 45 <212> DNA <213» Unknown <220» <223> HAMJ 579 <400> 289 aacggtagtt taatcatacc ttaccataac atcaaatttg agtgg <210> 290 <211> 45 <212» DNA <213> Unknown <220» <223» HAMJ 580 <400» 290 ccactcaaat ttgatgttat ggtaaggtat gattaaacta ccgtt <210> 291 <211> 45 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 581 <400» 291 accggtagtt taatcatacc taacatcaaa tttgagtggt ttgac <210» 292 <211» 45 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 582 <400» 292 gtcaaaccac tcaaatttga tgttaggtat gattaaacta ccgtt <210» 293 <211» 272 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 60 <400» 293
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala 15 10 15
Gly Lya Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
PL 214 229 B1
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gły Ser Leu Ile Ile Pro Ser Tyr Asp His
100 105 110
Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 14 0
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
ISO 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210> 294 <211> 272 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 61 <400> 294
Met 1 Gin ile Thr Tyr 5 Thr Asp Asp Glu Ile 10 Gin Val Ala Lys Leu. 15 ,^ιΐ
Gly Lys Tyr Thr 20 Thr Glu Asp Gly Tyr 25 Ile Phe Asp Thr Ser 30 Trp Ile
Lys Lys Asp 35 Ser Leu Ser Glu Ala 40 Glu Arg Ala Ala Ala 45 Gin Ala Tyr
Ala Lys 50 Glu Lys Gly Leu Thr 55 Pro Pro Ser Thr Asp 60 His Gin Asp Ser
Gly €5 Asn Thr Glu Ala Lys 70 Gly Ala Glu Ala Ile 75 Tyr Asn Arg Val Lys 80
Ala Ala Lys Lys Val 85 Pro Leu Asp Arg Met 90 Pro Tyr Asn Leu Gin 95 Tyr
Thr Vał Glu Val 100 Lys Asn Gły Ser Leu 105 Ile Ile Pro His Tyr 110 Asp Ser
Tyr His Asn 115 Ile Lys Phe Glu Trp 120 Phe Asp Glu Gly Leu 125 Tyr Glu Ala
100
PL 214 229 B1
Pro Lys 130 Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
135 140
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
14 5 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu .^11» ci Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Głn Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
24 5 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Głu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
«« Λ Ί /Τ Π Λ
260 2 /0 <210» 295 <211» 272 <212» PRT < 213 » UrLknt5V7n <220» <223> NEW 62 <400» 295
Met Gin 11 Ci Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Aap Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyir Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His
100 105 110
Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu 1 Cl
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 14 0
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
PL 214 229 B1
101
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
24 5 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210» 296 <211> 272 <212» PRT <213» Unknown <220>
<223» NEW 80 <400» 296
Met 1 Gin Ile Thr Tyr 5 Thr Asp Asp Glu Ile 10 Gin Val Ala Lys Leu 15 Ala
Gly Lys Tyr Thr 20 Thr Glu Asp Gly Tyr 25 Ile Phe Asp Thr Ser 30 Trp Ile
Lys Lys Asp 35 Ser Leu Ser Glu Ala 40 Glu Arg Ala Ala Ala 45 Gin Ala Tyr
Lys 50 Glu Lys Gly Leu Thr 55 Pro Pro Ser Thr Asp 60 His Gin Asp Ser
Gly 65 Asn Thr Glu Ala Lys 70 Gly Ala Glu Ala Ile 75 Tyr Asn Arg val Lys 80
Ala Ala Lys Lys Val 85 Pro Leu Asp Arg Met 90 Pro Tyr Asn Leu Gin 95 Tyr
Thr Val Glu Val 100 Lys Asn Gly Ser Leu 105 Ile Ile Pro Ser Tyr 110 Asp Ser
Tyr His Asn 115 Ile Lys Phe Glu Trp 120 Phe Asp Glu Gly Leu 125 Tyr Glu Ala
Pro Lys 130 Gly Tyr Ser Leu Glu 135 Asp Leu Leu Ala Thr 140 val Lys Tyr Tyr
Val 145 Glu Pro Arg Asn 1 150 Ser Asp His Val Arg 155 Lys Asn Lys Ala Asp 160
Gin Asp Ser Lys Pro 165 Asp Glu Asp Lys Glu 170 His Asp Glu Val Ser 175 Glu
Pro Thr His Pro 180 Glu Ser Asp Glu Lys 185 Glu Asn His Ala Gly 190 Leu Asn
Pro Ser Ala 195 Asp Asn Leu Tyr Lys 200 Pro Ser Thr Asp Thr 205 Glu Glu Thr
Glu Glu 210 Glu Ala Glu Asp Thr 215 Thr Asp Glu Ala Glu 220 Ile Pro Gly Thr
Pro 225 Ser Ile Arg Gin Asn 230 Ala Met Glu Thr Leu 235 Thr Gly Leu Lys Ser 240
Ser Leu Leu Leu Gly 245 Thr Lys Asp Asn Asn 250 Thr Ile Ser Ala Glu 255 Val
Asp Ser Leu Leu 260 Ala Leu Leu Lys Glu 265 Ser Gin Pro Ala Pro 270 I le Gin
<210» 297
<211> 272
<212» PRT
<213» Unknown
<220»
102
PL 214 229 B1 <223> NEW 81 <400» 297
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Al a
1 S 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly ΐπ Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 8 0
Ala ^l1 a. Lys Lys val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu ile Ile Pro Ser Tyr Asp Ser
100 105 110
Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu ASp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 14 0
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys .^31 Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 24 0
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210> 238 <211» 272 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 82 <400» 298
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
PL 214 229 B1
103
Ala Ala Lys Lys Val 85 Pro Leu Asp Arg Met 90 Pro Tyr Asn Leu Gin 95 Tyr
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp Ser
100 105 110
Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Giy Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 14 0
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
16S 170 175
Pro Thr Hrs Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Giy Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyi’ Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu A7a 1
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270
<210> 299 <211> 272 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NSW 83 <400> 299
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyf Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro Ser Tyr Asp His
100 105 110
Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 140
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
14 5 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
104
PL 214 229 B1
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn. Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin. Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu V<$lX
245 250 2S5
Asp Ser Usn Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210» 300 <211> 272 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 84 <400» 300
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Giy Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr val Glu val Lys Asn Gly Ser Leu ile Ile Pro Ser Lys Asp His
100 105 110
Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr
130 135 140
val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270
<210» 301
PL 214 229 B1
105 <211> 272 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223 > NEW 85 <400> 301
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly ίιΐ a Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Lys Asp Ser
100 105 110
Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu dy Leu Tyr Glu Ala
115 120 125
Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys ψγχ* Tyr
130 135 140
Val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp
145 150 155 160
Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu
165 170 175
Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn
180 185 190
Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr
195 200 205
Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Giy Thr
210 215 220
Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser
225 230 235 24 0
Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val
245 250 255
Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210> 302 <211> 270 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 88D1 <400> 302
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
106
PL 214 229 B1
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 6Q
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala I le Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro Asp His His
100 105 110
Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys
115 120 125
Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu
130 135 140
Pro Arg Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp Głn Asp
14 5 150 155 160
Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr
165 170 175
His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser
180 185 190
Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu
185 200 205
Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr Pro Ser
210 215 220
Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr 11 c Ser Ala Glu Val Asp Ser
24 5 250 255
Ii GU Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 270 <210» 303 <211» 268 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 88D2 <400» 303
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Vał Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro Tyr His Asn Ile
100 105 110
Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr
115 120 125
Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu Pro Arg
PL 214 229 B1
107
130 135 140
Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp Gin Asp Ser Lys
145 150 155 160
Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr His Pro
165 170 175
Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp
180 185 190
Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala
195 200 205
Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr Pro Ser Ile Arg
210 215 220
Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu
245 250 255
Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265 <210» 304 <211> 266 <212> PRT <213> Unknown
<220» <223» NEW 88
<400» 304
Met GTn Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp Ile
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro Asn Ile Lys Phe
100 105 110
Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Ser Leu
115 120 125
Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr val Glu Pro Arg Asn Ala
130 135 140
Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp Gin Asp Ser Lys Pro Asp
145 150 155 160
Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser
165 170 175
Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu
180 185 190
Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr Pro Ser Ile Arg Gin Asn
210 215 220
Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr
225 230 235 240
108
PL 214 229 B1
Lys Asp Asn Asn Thr 245 ile Ser Ala Glu Val Asp Ser 250 Leu Leu Ala Leu 255
Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
260 265
<210» 305
<400» 000 305
<210» 306
<400» 000 306
<210» 307
<400» 000 307
<210» 308
<400» 000 308
<210» 3 09
<400» 000 309
<210» 310
<400» 000 310
<210» 311
<400» 000 311
<210» 312
<400» 000 312
<210» 313
<400» 000 313
<210» 314
<400» 000 314
<210» 315
<400» 315
PL 214 229 B1
109
οοο
<210> 316
<4 0 0 > ΟΟΟ 316
<210> 317
<400> ΟΟΟ 317
<21Ο> 313
<400 > οοο 318
<210> 319
<400> ΟΟΟ 319
<210> 32 0
<400> ΟΟΟ 320
<210> 321
<400> ΟΟΟ 321
<210> 322
<400> ΟΟΟ 322
<210> 323
<400> ΟΟΟ 323
<210> 324
<400> ΟΟΟ 324
<210;· 325
<400> ΟΟΟ 325
<210> 326
<400> ΟΟΟ 326
<210> 327
110
PL 214 229 B1 <211» 41 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 564 <400» 327 atatgggccc caaattacct acactgatga tgagattcag g 41 <210» 328 <211» 43 <212> DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 556 <4Q0> 328 afcaagaatgc ggccgcctac tgtataggag ccggttgact ttc 43 <210> 329 <211» 33 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 489 <400> 329 ccgaattcca tatgcaaatt gggcaaccga ctc 33 <210> 330 <211» 29 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 559 <400» 330 atatgggccc caaattgggc aaccgactc 29 <210» 331 <211» 41 <212» DNA <213» Unknown <220» <223» HAMJ 557 <400» 331 ataagaatgc ggccgcttac gctatgaaat cagataaatt c 41 <210» 332 <400» 332
000
PL 214 229 B1
111
<210> 333
<400? 000 333
<210? 334
<400? 000 334
<210? 335
<400? 000 335
<210? 336
<400? 000 336
<210? 337
<400? 000 337
<210? 338
<400? 000 338
<210? 339
<400? 000 339
<210? 340
<400> 000 340
<210? 341
<400? 000 341
<210? 342
<400? 000 342
<210? 343
<400? 343
000
<210? 344
112
PL 214 229 B1 <400» 344 ΟΟΟ <210» 345 <400> 345 ΟΟΟ <210» 346 <400» 346 ΟΟΟ <210» 347 <400> 347 ΟΟΟ <210» 348 <400» 348 ΟΟΟ <210> 343 <211» 633 <212» PRT <213» Unknown <220» <223> NEW 42 <400» 349
Met 1 Gin Ile Gly Gin 5 Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Ser Gly Asp Ser Asn Ser Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 140
Gly Asp Gly Thr Ser Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Vał Gly
14 5 150 155 160
He Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
PL 214 229 B1
113
Asn Val Val 195 Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu. Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Giy Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Al ci Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 28S
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Al a Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 4 95
Glu Val Ile Lya Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
54 5 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Głu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Łys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630
<210> 350
114
PL 214 229 B1 <211 > 633 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 49 <400> 350
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Ser Gly Asp His Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His
130 135 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
14 5 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
16S 170 175
val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Aan Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Sar Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lya Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gły Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Giy Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
L6U Asp Asn β3»Γ1 Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
PL 214 229 B1
115
335 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe a. Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Aap Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
ASU Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210> 351 <211» 633 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 50 <400» 351
Met 1 Gin Ile Giy Gin 5 Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Ser Gly Asp Ser Asn His fpy.£, Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Al a Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
116
PL 214 229 B1
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala He 140 Ile Tyr Pro His
130 135
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lya Lys Glu Gly Asn Lys Vał Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val ^7 cł 1 Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Ty 3? Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr He Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Al a Tyr Lys Met Ala
290 2S5 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Vał Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr ^31 Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala ASp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 5 5 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
PL 214 229 B1
117
Glu Lys Phe 595 Thr Ala Ser Tyr Gly 600 Leu Gly Leu Asp Ser 605 Val Ile Phe
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210? 352 <211> 633 <212? PRT <213> Unknown <220?
<223? NEW 51 <400? 352
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn. Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe val Met Ser Ser Gly Asp His Asn Pi t s Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Vał Lys Arg
115 120 125
Glu Ser 1 le Val Mai Asn Lys Glu tys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 13 5 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 24 0
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Vał Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr tys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu val Arg
118
PL 214 229 B1
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 3 50
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 44 0 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Ty 2? Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 SOS 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Giy Łys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 S35 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro val Gin Glu Lys Leu
580 585 5 90
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210» 353 <211> 633 <212» PRT <213> Unknown <220» <223» NEW 52 <400» 353
Met Gin ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile I le Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe val Met Ser Ser Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
55 60
PL 214 229 B1
119
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys A I. Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 V 5 8 0
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser Hr s Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
ile Glu Glu Lys Ile Al a Gly Ii 1 Met Lys Gin Tyr Gly val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile val val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 14 0
Gly Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
I le Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr W Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu .Ala Tyr Lys Met
290 295 300
Ser Gin Thr I le phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
'^1 1. Gly Glu I le Lys Leu Pro ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu lii fcł
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
120
PL 214 229 B1
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys 535 Pro Ala 540 Asp Ser Leu Pro
530
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210> 354 <211> 633 <212> PRT <213 > Unknown <220>
<223> NEW 53 <400> 354
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp His Asn His Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Al a Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn 1 Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 140
Giy Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu. Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu T ιΡΜ 1 Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys T ΐ Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Oi 1. Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Giy
PL 214 229 B1
121
Gin Thr Phe 260 Lys Tyr Thr Ile Ala 265 Ser Lys Asp Tyr Pro 270 Glu Val Ser
Tyr Asp 275 Gly Thr Phe Thr Val 280 Pro Thr Ser Leu Ala 285 Tyr Lys Met Ala
Ser 230 Gin Thr Ile Phe Tyr 295 Pro Phe His Ala Gly 300 Asp Thr Tyr Leu Arg
305 Val Asn Pro Gin Phe 310 Ala Val Pro Lys Gly 315 Thr Asp Ala Leu Val 320 Arg
Val Phe Asp Glu 325 Phe His Gly Asn Ala 330 Tyr Leu Glu Asn Asn 335 Tyr Lys
Val Gly Glu 340 Ile Lys Leu Pro Ile 345 Pro Lys Leu Asn Gin 350 Gly Thr Thr
Arg Thr 355 Ala Gly Asn Lys Ile 360 Pro Val Thr Phe Met 365 Ala Asn Ala Tyr
Leu 370 Asp Asn Gin Ser Thr 375 Tyr I le Val Glu Val 380 Pro Ile Leu Glu Lys
385 Glu Asn Gin Thr Asp 390 Lys Pro Ser Ile Leu 395 Pro Gin Phe Lys Arg 400 Asn
Lys Ala Gin Glu 405 Asn Ser Lys Leu Asp 410 Glu Lys Val Glu Glu 415 Pro Lys
Thr Ser Glu 420 Lys Val Glu Lys Glu 425 Lya Leu Ser Glu Thr 430 Gly Asn Ser
Thr Ser 435 Asn Ser Thr Leu Glu 4 4 0 Glu Val Pro Thr val 445 Asp Pro Val Gin
Glu 450 Lys Val Ala Lys Phe 455 Ala Glu Ser Tyr Gly 460 Met Lys Leu Glu Asn
465 Vał Leu phe Asn Met 470 Asp Gly Thr Ile Glu 475 Leu Tyr Leu Pro Ser 480 Gly
Glu Val Ile Lys 485 Lys Asn Met Ala Asp 490 Phe Thr Gly Glu Ala 495 Pro Gin
Gly Asn Gly 500 Glu Asn Lys Pro Ser 505 Glu Asn Gly Lys Val 510 Ser Thr Gly
Thr Val 515 Glu Asn Gin Pro Thr 520 Glu Asn Lys Pro Ala 525 Asp Ser Leu Pro
Glu 530 Ala Pro Asn Glu Lys 535 Pro Val Lys Pro Glu 540 Asn Ser Thr Asp Asn
545 Gly Met Leu Asn Pro 550 Glu Gly Asn val Gly 555 Ser Asp Pro Met Leu 560 Asp
Pro Ala Leu Glu 565 Glu Ala Pro Ala Val 570 Asp Pro Val Głn Glu S75 Lys Leu
Glu Lys Phe 580 Thr Ala Ser Tyr Gly 585 Leu Gly Leu Asp Ser 590 Val 11© Phe
Asn Met 595 Asp Gly Thr Ile Glu 600 Leu Arg Leu Pro Ser 605 Gly Glu Val Ile
Lys 625 610 Lys Asn Leu Ser Asp 630 615 Phe Ile Ala 620
<210» 355 <211» 633 <212» PRT <213» Unknown <220» <223» NEW 54 <400» 355
122
PL 214 229 B1
Met 1 Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu 5 Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
3 5 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp His Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp g 0 Έ* Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Giy Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Głn Tyr Gly Val Lys Arg
115 12 0 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile He Tyr Pro Ser
13 0 135 140
Giy Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
14 5 ISO 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyx Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Giy Ile Asn Met Leu Val Lys Leu I le Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn S G 3Γ Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
PL 214 229 B1
123
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
435 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lya Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Giy Glu Val Ile
610 6X5 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210> 356 <211> 569 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 55 <400> 356
Met Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
20 25 30
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
50 55 60
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His
65 70 75 80
Gly Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
85 90 95
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
100 105 110
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
115 120 125
Asn val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
130 135 140
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
145 150 155 160
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
165 170 175
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Łys Val Phe Gly Glu Gly
180 185 190
Val Gly Asn ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
124
PL 214 229 B1
195 200 2 05
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ses? Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
210 215 220
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
225 230 235 240
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
245 250 255
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
260 265 270
Val Phe Asp Glu Phe H I. Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
val Gly Glu Ile Łys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Giy Thr Thr
290 295 300
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
305 310 315 320
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
325 330 335
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
340 345 350
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
355 360 365
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
370 375 380
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
385 390 395 400
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
405 410 415
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
420 425 430
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
435 440 445
aiy Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Łys Val Ser Thr Gly
450 455 460
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
465 470 475 480
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
485 490 495
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Giy Ser Asp Pro Met Leu Aap
500 505 510
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin GlU Łys Leu
520 525
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
530 535 540
Asn Met Asp Giy Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
545 550 555 58 0
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
565
<210» 357
<211» 633
<212» PRT
<213» Unknown
<220»
<223» NEW 56
<400» 357
PL 214 229 B1
125
Met Sin Ile 1 Gly Gin 5 Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Giy Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu vał Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Ε &T1 Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
13 0 135 140
Gly Asp H1 ^5 H 3» ^3 His Ala Asp Pro ile Asp Glu His Lys Pro Val aiy
145 150 155 160
ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
ISO 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Aan Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Vał Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 4 55 460
126
PL 214 229 B1
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro 1/u Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Vał Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser TyT Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210> 356 <211» 633 <212» PRT < 213 » Unknown <220» <223» NEW 56 <400» 358
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu a. Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg I le Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Vał Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
PL 214 229 B1
127
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu val Pro ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 44 5
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met ASP Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn T .ys? Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
54 5 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 8 7 5
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Głu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Giy Leu Giy Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630
<210> 359
128
PL 214 229 B1 <211> 633 <212> PRT <213 > Unknown <220>
<223> NEW 56 <400> 359
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Atg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn ćri Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 24 0
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Al a Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu ^7 <3- 3. Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Τγχ· Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
PL 214 229 B1
129
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser ile Leu 410 Pro Gin Phe Lys Arg 415 Asn
405
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 S40
Glu lr Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Lśni
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser siy Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210> 360 <211> 633 <212> PRT <213 > Unknown <220>
<223> NEW 57 <400> 360
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Hi a Gly Asp His Asn Ser Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyx Pro Ser
130
PL 214 229 B1
130 135 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Giy
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 24 0
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu GlY
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyx Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ais.
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn. Met *SP Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn. Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
53 0 535 54 0
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 S70 575
Pro Ala Łeu Glu Glu Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
PL 214 229 B1
131
595 600 605
Asn Met Asp Giy Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630 <210? 361 <211? 633 <212? PRT <213? Unknown <220?
<223? NEW 63 <400? 361
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn. Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Giy Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin tys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyxr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile 11 e Tyr Pro His
130 135 140
Gly Asp His His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
14 5 150 155 160
Ile Gly His Ser Hrs Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu I le Thr Pro
225 23 0 235 24 0
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys vał Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu ASp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr I le Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 335
132
PL 214 229 B1
Vał Phe Asp Glu 340 Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 54 0
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Giy Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 6 05
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Giy ¢3 lti Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 63 0
<21ΰ> 362 <211> 633 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 64 <400> 362
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr my Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp His Asn Ser Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu I le Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
PL 214 229 B1
133
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Głu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His
130 135 140
dy Asp His His His Al a Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Giy Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 24 0
Asp Gly Lys val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg
325 330 j g
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 350 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu S cs Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr u Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser TyX Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly ΐΧνι Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Giy Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 52 0 5
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
134
PL 214 229 B1
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu <5iy Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lyg Lys Asn Leu Ser Asp Phe ile Ala
625 630 <210? 363 <211> 633 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223? NSW 65 <400? 363
Met 1 Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp Ser Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn 1. Lys Glu Met Lys Asp lj Lr 33 Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile I le Tyr pro His
130 13 5 140
Gly Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Głu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
PL 214 229 B1
135
Gin Thr Phe 275 Lys Tyr Thr Ile Ala 280 Ser Lys Asp Tyr Pro 285 Glu Val Ser
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala Ty i? Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Al a Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Giy Thr Asp Ala luGLl Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Giy Thr Thr
35S 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
335 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser i Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Ly S Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
53 0 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Al a Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630
<210» 364 <211> 633 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 66 <400> 364
Het Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
136
PL 214 229 B1
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly ΤγΥ Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Yal Met Ser His Gly Asp His Asn Ser Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile val val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His
130 135 140
Gly Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Yal Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Yal Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Ty 2? Thr Gly Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn Val Val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
ASp Gly Lys Val Leu Glu Lys Yal Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
24 5 250 255
val Gly Asn I le Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu J^^l. a Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
30S 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Yal Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu val Arg
325 330 335
Yal Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro I le Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr Ile Yal Glu val Pro ile Leu Glu Lys
385 390 3 95 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lyg Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Yal Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
PL 214 229 B1
137
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Giy Glu 1. Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
530 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
Gly Met Leu Asn. Pro Glu Gly Asn val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp
565 570 575
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
625 630
<210> 365 <211> 633 <212» PRT <213> Unknown.
<220>
<223> NEW 76 <400> 365
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu ASP Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser His Gly Asp His Asn Ser Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin. Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu Val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg
115 120 125
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ser
130 135 140
Gly Asp Gly His His Ala Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly
145 150 155 160
Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly
165 170 175
Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Giy Glu Glu Leu Thr
180 185 190
Asn val val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe
195 200 205
138
PL 214 229 B1
Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys 215 Arg Val Ser Phe Ser 220 Phe Pro Pro Glu
210
Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly
260 265 270
Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser
275 280 285
Tyr Asp Gly Thr Phe Thr val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gin Thr Ile Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
305 310 315 320
Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Aap Ala Leu Val Arg
325 330 335
Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn. Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr
355 360 365
Arg Thr Gly Asn Lys Ile Pro val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr
370 375 380
Leu Asp Asn Głn Ser Thr Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn
405 410 415
Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu £>fi 2Γ Glu Thr Gly Asn £3θϊ?
435 440 445
Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin
450 455 460
Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn
465 470 475 480
Val Leu Phe Asn Met Asp Giy Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly
485 490 495
Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin
500 505 510
Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly
515 520 525
Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro
53 0 535 540
Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn
545 550 555 560
siy Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Teu Asp
565 570 5T5
Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe
595 600 605
Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile
610 615 620
Lys Lys Asn Leu. Ser Asp Phe Ile Ala
625 630
<210> 366 <21Ι> 627
PL 214 229 B1
139 <212? PRT <213> Unknown —; '2. 2.
<223> NEW 105 <400? 366
Met 1 Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
5 10 15
Ser Pro S e r Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg I le Ile Ala Glu Asp Głu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Tyr Phe Phe Lys Lys Asp Leu Thr Glu Glu
50 55 60
Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu Glu Val Lys Thr Ser His
65 70 75 80
Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu Gin Asp Tyr Pro Gly Asn
85 90 95
Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys Ile Glu Glu Lys Ile Ala
100 105 110
Gly ile Met Lys Gin Tyr Giy Val Lys Glu Ser Ile Val Val Asn
115 120 125
Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro His Gly Asp His His His Ala
130 135 14 0
Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro val Gly Ile Gly His Ser His Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly val Ala Lys Lys Glu Gly
165 170 175
Asn Lys val Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Thr Asn Val Val Asn Leu Leu
180 185 190
Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe Thr Leu Ala Asn Gly Gin
195 200 205
Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu Leu Glu Lys Lys Leu Gly
210 215 220
Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro Asp Gly Lys Val Leu Glu
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly Val Gly Asn Ile Ala Asn
24 5 250 255
Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Giy Gin Thr Phe Lys Tyr Thr
260 265 270
Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser Tyr Asp Gly Thr Phe Thr
275 280 285
Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala Ser Gin Thr Ile Phe Tyr
290 295 300
Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Val Asn Pro Gin Phe Ala
305 310 315 320
Val Pro Lys Gly Thr Asp Al a Leu Val Arg Val Phe Asp Glu Phe His
325 330 335
Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys Val Gly Glu Ile Lys Leu
340 345 350
Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr Arg Thr Ala Gly Asn Lys
355 360 365
Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Gin Ser Thr
370 375 380
Tyr Ile Val Glu Val Pro Ile Leu Glu Lys Glu Asn Gin Thr Asp Lys
385 390 395 400
Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn Lys ^3l cŁ Gin Glu Asn Ser
140
PL 214 229 B1
405 410 415
Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys Thr Ser Glu Lys Val Glu
420 425 430
Lys Głu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser Thr Ser Asn Ser Thr Leu
435 440 445
Glu Glu Val Pro Thr Val Asp Pro Val Gin Głu Lys Val Ala Lys Phe
450 455 460
Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn Val Leu Phe Asn Met Asp
465 470 475 480
Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile Lys Lys Asn
485 490 495
Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin Giy Asn Gly Glu Asn Lys
500 505 510
Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Gly Thr Val Glu Asn Gin Pro
515 520 525
Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro Glu Ala Pro Asn Glu Lys
530 535 540
Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn Gly Met Leu Asn Pro Glu
545 550 555 560
Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp Pro Ala T Glu Glu Ala
565 570 575
Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu Glu Lys Phe Thr Ala Ser
580 585 590
Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile
595 600 605
Glu Leu Arg Leu Pro Ser Gly Glu Val I le Lys Lys Asn Leu Ser Asp
610 615 620
Phe Ile Ala
625 <210> 367 <211> 627 <212> PRT <213> Unknown <220>
<223> NEW 106 <400> 367
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys His Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Vał Met Ser His Gly Asp His Asn His Tyr Phe Phe Lys
50 55 60
Lys Asp Leu Thr Glu Glu Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu
65 70 75 80
Glu val Lys Thr Ser His Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Głu
85 90 95
Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Ala Lys Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys
100 105 110
Ile Glu Glu Lys Ile Ala Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly val Lys Arg
115 120 12 5
Glu Ser Ile Val Val Asn Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ala
130 135 140
PL 214 229 B1
141
Asp Pro Ile Asp Glu His Lys Pro Val Gly Ile Giy His Ser His Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Glu Leu Phe Lys Pro Glu Glu Gly val Ala Lys Lys Glu Gly
165 170 175
Asn Lys Val Tyr Thr Giy Glu Glu Leu Thr Asn Vał Val Asn Leu Leu
180 185 190
Lys Asn Ser Thr Phe Asn Asn Gin Asn Phe Thr Leu Ala Asn Gly Gin
195 200 205
Lys Arg Val Ser Phe Ser Phe Pro Pro Glu Leu Glu Lys Lys Leu Gly
210 215 220
Ile Asn Met Leu Val Lys Leu Ile Thr Pro Asp Gly Lys Val Leu Glu
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Lys Val Phe Gly Glu Gly iZal Gly Asn Ile Ala Asn
245 250 255
Phe Glu Leu Asp Gin Pro Tyr Leu Pro Gly Gin Thr Phe Lys Tyr Thr
260 265 270
Ile Ala Ser Lys Asp Tyr Pro Glu Val Ser Tyr Asp Gly Thr Phe Thr
275 280 285
Val Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Lys Met Ala Ser Gin Thr Ile Phe Tyr
290 295 300
Pro Phe His Ala Gly Asp Thr Tyr Leu Arg vał Asn Pro Gin Phe Ala
305 310 315 320
Val Pro Lys Gly Thr Asp Ala Leu Val Arg Val Phe Asp Glu Phe His
325 330 335
Gly Asn Ala Tyr Leu Glu Asn Asn Tyr Lys Val Gly Glu Ile Lys Leu
340 345 350
Pro Ile Pro Lys Leu Asn Gin Gly Thr Thr Arg Thr Ala Gly Asn Lys
355 360 365
Ile Pro Val Thr Phe Met Ala Asn Ala Tyr Leu Asp A3n Gin Ser Thr
370 375 380
Tyr Ile Val Glu Val Pro ile Leu Glu Lys Glu Asn Gin Thr Asp Lys
385 390 395 400
Pro Ser Ile Leu Pro Gin Phe Lys Arg Asn Lys Ala Gin Glu Asn Ser
405 410 415
Lys Leu Asp Glu Lys Val Glu Glu Pro Lys Thr Ser Glu Lys Val Glu
420 425 430
Lys Glu Lys Leu Ser Glu Thr Gly Asn Ser Thr Ser Asn Ser Thr Leu
435 44 0 445
Glu Glu Val Pro Thr vał Asp Pro Val Gin Glu Lys val Ala Lys Phe
450 455 460
Ala Glu Ser Tyr Gly Met Lys Leu Glu Asn Val Leu Phe Asn Met Asp
465 470 475 480
Gly Thr Ile Glu Leu Tyr Leu Pro Ser Gly 65 lu Val Ile Lys Lys Asn
485 490 495
Met Ala Asp Phe Thr Gly Glu Ala Pro Gin Gly Asn Gly Glu Asn Lys
500 505 510
Pro Ser Glu Asn Gly Lys Val Ser Thr Giy Thr Val Glu Asn Gin Pro
515 520 525
Thr Glu Asn Lys Pro Ala Asp Ser Leu Pro Glu Ala Pro Asn Glu Lys
53 0 535 540
Pro Val Lys Pro Glu Asn Ser Thr Asp Asn Gly Met Leu Asn Pro Glu
545 550 555 560
Gly Asn Val Gly Ser Asp Pro Met Leu Asp Pro Ala Leu Glu Glu Ala
565 570 575
Pro Ala Val Asp Pro Val Gin Glu Lys Leu Glu Lys Phe Thr Ala Ser
580 585 590
Tyr Gly Leu Gly Leu Asp Ser Val Ile Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile
595 600 605
142
PL 214 229 B1
Glu Leu Arg Leu Pro Ala Ser Gly 615 Glu val Ile Lys Lys 620 Asn Leu Ser Asp
Phe 625 610 Ile
<210> 368
<211> 621
< 212 > PRT
<212 > Unknown
<220>
<223 !> NEW 107
<400> 368
Met Gin Ile Gly Gin Pro Thr Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser Leu Pro Ile Asn Pro Gly Thr Ser His Glu Lys Hi s Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Tyr Gly Phe Asp Ala Asn Arg Ile Ile Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Ser Gly Phe Val Met Ser Tyr Phe Phe Lyg Lys Asp Leu Thr Glu Glu
50 55 60
Gin Ile Lys Ala Ala Gin Lys His Leu Glu Glu Val Lys Thr Ser His
65 70 75 80
Asn Gly Leu Asp Ser Leu Ser Ser His Glu Gin Asp Tyr Pro Gly Asn
8 5 90 95
Ala Glu Met Lys Asp Leu Asp Lys Lys Ile Glu Glu Łys Ile Ala
100 105 110
Gly Ile Met Lys Gin Tyr Gly Val Lys Arg Glu Ser Ile val Val Asn
115 120 125
Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ile Tyr Pro Ala Asp Pro Ile Asp Glu His
130 135 140
Lys Pro Val Gly Ile Gly His Ser His Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys
14 5 150 155 160
Pro Glu Glu Gly Val Ala Lys Lys Glu Gly Asn Lys Val Tyr Thr Gly
165 170 175
Glu Glu Leu Thr Asn Val val Asn Leu Leu Lys Asn Ser Thr Phe Asn
180 185 130
Asn Gin. Asn Phe Thr Leu Ala Asn Gly Gin Lys Arg Val Ser Phe Ser
195 200 205
Phe Pro Pro Glu Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Met Leu Val Lys
210 215 220
Leu ile Thr Pro Asp Gly Lys Val Leu Glu Lys Val Ser Gly Lys Val
225 230 23 5 240
Phe Gly Glu Gly Val Gly Asn Ile Ala Asn Phe Glu Leu Asp Gin Pro
245 250 255
Tyr Leu Pro Gly Gin Thr Phe Lys Tyr Thr Ile Ala Ser Lys Asp Tyr
260 265 270
Pro Glu Val Ser Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Val Pro Thr Ser Leu Ala
275 280 285
Tyr Lys Met Ala Ser Gin Thr Tle Phe Tyr Pro Phe His Ala Gly Asp
290 295 300
Thr Tyr Leu Arg Val Asn Pro Gin Phe Ala Val Pro Lys Gly Thr Asp
305 310 315 320
Ala Leu Val Arg Val Phe Asp Glu Phe His Gly Asn Ala Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Asn Tyr Lys Val Gly Glu Ile Lys Leu Pro Ile Pro Lys Leu Asn
PL 214 229 B1
143
340 345 350
Gin Gly Thr Thr Arg Thr Ala Gly Asn Lys Ile Pro Val Thr Phe Met
355 360 365
Ala Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Gin Ser Thr Tyr I la Val Glu Val Pro
370 375 380
Ile Leu Glu Lys Glu Asn Gin Thr Asp Lys Pro Ser Ile Leu Pro Gin
385 390 395 400
Phe Lys Arg Asn Lys Ala Gin Glu Asn Ser Lys Leu Asp Glu Lys Val
405 410 415
Glu Glu Pro Lys Thr Ser Glu Lys Val Glu Lys Glu Lys Leu Ser Glu
420 425 430
Thr Gly Asn Ser Thr Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Val
435 440 445
Asp Pro Val Gin Glu Lys Val Ala Lys Phe Ala Glu Ser Tyr Gly Met
450 455 460
Lys Leu Glu Asn Val Leu Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Tyr
465 470 475 480
Leu Pro Ser Gly Glu Val Ile Lys Lys Asn Met Ala Asp Phe Thr Gly
485 490 495
Glu Ala Pro Gin Gly Asn Gly Glu Asn Lys Pro Ser Glu Asn Giy Lys
500 505 510
Val Ser Thr Giy Thr Val Glu Asn Gin Pro Thr Glu Asn Lys Pro Ala
515 520 525
Asp Ser Leu Pro Glu Ala Pro Asn Glu Lys Pro Val Lys Pro Glu Asn
530 535 540
Ser Thr Asp Asn Gly Met Leu Asn Pro Glu Gly Asn Val Gly Ser Asp
545 550 555 560
Pro Met Leu Asp Pro Ala Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Asp Pro Val
565 570 575
Gin Glu Lys Leu Glu Lys Phe Thr Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Leu Asp
580 585 590
Ser Val Ile Phe Asn Met Asp Gly Thr Ile Glu Leu Arg Leu Pro Ser
595 600 605
Gly Glu Val Ile Lys Lys Asn Leu Ser Asp Phe Ile Ala
610 615 620
<210> 369
<400> 000 369
<210> 370
<4 00> 000 370
<210> 371
<400> 000 371
<210> 372
<400> 000 372
<210> 373
144
PL 214 229 B1 <400> 373 ΟΟΟ <210> 374 <211> 259 <212> PRT <213» Unknown <220>
<223> VP43S <400> 374
Met Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr
1 5 10 15
Ser Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala
20 25 30
Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His
35 40 45
Gin Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn
50 55 60
Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Gin Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Giy Ser Leu Ile Ile Pro His
85 90 95
Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu
100 105 110
Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Ser Leu Glu ASp Leu Leu Ala Thr val
115 12 0 125
Lys Tyr Tyr val Glu Pro Arg Asn Ala Ser Asp His val Arg Lys Asn
130 135 140
Lys Ala Asp Gin Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu
14 5 150 155 160
Val Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala
165 170 175
Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr
180 185 190
Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile
195 200 205
Pro Gly Thr Pro Ser Ile Arg Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly
210 215 220
Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser
225 230 235 240
Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala
24 5 250 255
Pro Ile Gin
<210> 375
<211> 268
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> NEW 8 6
PL 214 229 B1
145 <400» 375
Met Gin Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gin Val Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Ser Trp 11 ¢3
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gin Ala Tyr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gin Asp Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Glu Ala Lys aiy Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys i» Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gin Tyr
85 90 95
Thr Val Glu Val Lys Asn Giy Ser Leu Ile Ile Pro Pro Gly Asn Ile
100 105 110
Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr
115 120 125
Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr val Glu Pro Arg
130 135 140
Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Ala Asp Gin Asp Ser Lys
145 150 155 160
Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu, Pro Thr His Pro
165 170 175
Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp
180 185 190
Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala
195 200 205
Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gly Thr Pro Ser Ile Arg
210 215 220
Gin Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Al a Glu Val Asp Ser Leu Leu
245 250 255
Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gin Pro Ala Pro Ile Gin
250 265
<210» 376
<400» ooo 376
<210» 377
<400> 000 377
<210» 378
<400> 000 378
<210» 379
<400» 000 379
<210» 380
146
PL 214 229 B1
<400> ΟΟΟ 380
<210> 381
<400> ΟΟΟ 381
<21Ο> 382
<4ΟΟ> ΟΟΟ 382
<210> 383
<4ΟΟ> ΟΟΟ 383
<210> 384
<400> ΟΟΟ 384
PL 214 229 B1
147

Claims (51)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną przez SEQ ID NO:258, gdzie polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae.
  2. 2. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez SEQ ID NO:258.
  3. 3. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest przyłączony do sacharydu.
  4. 4. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
  5. 5. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd określony w zastrz. 1-4.
  6. 6. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz, 5, znamienny tym, że polinukleotyd stanowi DNA.
  7. 7. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz, 5, znamienny tym, że polinukleotyd stanowi RNA.
  8. 8. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że jest komplementarny do polinukleotydu określonego w zastrz. 5 albo 6, albo 7.
  9. 9. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 5 albo 6, przy czym polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z obszarem kontrolującym ekspresję.
  10. 10. Wyizolowana komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny określony w zastrz. 9.
  11. 11. Wyizolowana komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że jest komórką bakteryjną lub komórką grzyba.
  12. 12. Wyizolowana komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że jest wyizolowaną komórką eukariotyczną.
  13. 13. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 - 4, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w jednym z zastrz. 10 - 12, w warunkach dogodnych do ekspresji polipeptydu oraz izolowanie polipeptydu.
  14. 14. Sposób wytwarzania polipeptydów według zastrz. 13, znamienny tym, że polipeptyd stanowi polipeptyd rekombinowany.
  15. 15. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 1 - 4 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
  16. 16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera dodatkowo farmaceutycznie akceptowalny adiuwant.
  17. 17. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 - 4 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywołanym paciorkowcami.
  18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus pneumoniae.
  19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactiae lub Streptococcus dysgalactiae.
  20. 20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus uberis.
  21. 21. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że infekcję stanowi zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemia lub zapalenie płuc.
  22. 22. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z pozycjami 497 - 838 sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8 oraz wyizolowany polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae.
  23. 23. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 22, znamienny tym, że polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez pozycje 497 - 838 SEQ ID NO:8.
  24. 24. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że jest przyłączony do sacharydu.
  25. 25. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
    148
    PL 214 229 B1
  26. 26. Wyizolowany polipeptyd, który stanowi fragment polipeptydu określonego przez SEQ ID NO:8, znamienny tym, że fragment polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasową określoną w pozycjach 227 - 838 SEQ ID NO:8, oraz który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na Streptococcus pneumoniae.
  27. 27. Wyizolowany polipeptyd, który stanowi fragment polipeptydu składający z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną w pozycjach 227 838 SEQ ID NO:8, który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej na Streptococcus pneumoniae.
  28. 28. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 27, znamienny tym, że fragment polipeptydu składa się z sekwencji aminokwasowej określonej w pozycjach 227 - 838 sekwencji SEQ ID NO:8.
  29. 29. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 26 albo 27, albo 28, znamienny tym, że jest przyłączony do sacharydu.
  30. 30. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 26 albo 27, albo 28, znamienny tym, że jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
  31. 31. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 95% identycznej z sekwencją aminokwasową określoną przez SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 lub SEQ ID NO:23, oraz wyizolowany polipeptyd jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem Streptococcus pneumoniae.
  32. 32. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 31, znamienny tym, że polipeptyd składa się z sekwencji aminokwasowej określonej przez SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:22 lub SEQ ID NO:23.
  33. 33. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 31 albo 32, znamienny tym, że jest przyłączony do sacharydu.
  34. 34. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 31 albo 32, znamienny tym, że jest przyłączony do znacznika ułatwiającego oczyszczanie.
  35. 35. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd określony w jednym z zastrz. 22 - 34.
  36. 36. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 35, znamienny tym, że polinukleotyd stanowi DNA.
  37. 37. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 35, znamienny tym, że polinukleotyd stanowi RNA.
  38. 38. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że jest polinukleotydem komplementarnym do polinukleotydu określonego w jednym z zastrz. od 35 do 37.
  39. 39. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 35 albo 36, przy czym polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony z obszarem kontrolującym ekspresję.
  40. 40. Wyizolowana komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny określony w zastrz. 39.
  41. 41. Wyizolowana komórka gospodarza według zastrz. 39, znamienna tym, że jest komórką bakteryjną lub komórką grzyba.
  42. 42. Wyizolowana komórka gospodarza według zastrz. 39, znamienna tym, że jest wyizolowaną komórką eukariotyczną.
  43. 43. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. od 22 do 34, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w jednym z zastrz. 40 - 42, w warunkach dogodnych do ekspresji polipeptydu, oraz izolowanie polipeptydu.
  44. 44. Sposób wytwarzania polipeptydu według zastrz. 43, znamienny tym, że polipeptyd stanowi polipeptyd rekombinowany.
  45. 45. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. od 22 do 34 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
  46. 46. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że zawiera dodatkowo farmaceutycznie akceptowalny adiuwant.
  47. 47. Zastosowanie polipeptydu określonego w jednym z zastrz. od 22 do 34 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcjom wywołanym paciorkowcami.
  48. 48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus pneumoniae.
  49. 49. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactiae lub Streptococcus dysgalactiae.
    PL 214 229 B1
    149
  50. 50. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że infekcja wywołana jest przez Streptococcus uberis.
  51. 51. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że infekcję stanowi zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemia lub zapalenie płuc.
PL360413A 2000-06-20 2001-06-19 Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie PL214229B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21268300P 2000-06-20 2000-06-20
PCT/CA2001/000908 WO2001098334A2 (en) 2000-06-20 2001-06-19 Streptococcus antigens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL360413A1 PL360413A1 (pl) 2004-09-06
PL214229B1 true PL214229B1 (pl) 2013-07-31

Family

ID=22792041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL360413A PL214229B1 (pl) 2000-06-20 2001-06-19 Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP2281891A3 (pl)
JP (2) JP5051959B2 (pl)
KR (1) KR100927767B1 (pl)
CN (2) CN1449446A (pl)
AR (1) AR033980A1 (pl)
AU (2) AU2001270381B2 (pl)
CA (1) CA2413450C (pl)
CZ (1) CZ2003154A3 (pl)
EA (1) EA006232B1 (pl)
HU (1) HU228706B1 (pl)
IL (2) IL153558A0 (pl)
MX (1) MXPA03000103A (pl)
NO (1) NO331103B1 (pl)
NZ (1) NZ553554A (pl)
PL (1) PL214229B1 (pl)
TR (1) TR200704553T2 (pl)
UY (1) UY26783A1 (pl)
WO (1) WO2001098334A2 (pl)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US7074415B2 (en) 2000-06-20 2006-07-11 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
AU2002351623A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
SI2097102T1 (sl) 2006-09-07 2012-09-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Kombinirano cepivo, ki ima zmanjšane količine antigena za poliovirus
PE20090212A1 (es) 2007-05-02 2009-03-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Kit de vacuna para la inmunizacion primaria
KR101579947B1 (ko) 2007-06-26 2015-12-28 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
AU2008280799B2 (en) * 2007-07-23 2013-07-11 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies
WO2009127676A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
JP5722782B2 (ja) 2008-09-26 2015-05-27 ナノバイオ コーポレーション ナノエマルジョン治療用組成物及びその使用方法
EP2424562B1 (en) 2009-04-30 2015-10-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
US20120135037A1 (en) 2009-06-01 2012-05-31 Mizel Steven B Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
KR101512053B1 (ko) 2009-09-03 2015-04-28 화이자 백신스 엘엘씨 Ｐｃｓｋ９ 백신
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003920D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
KR101272351B1 (ko) * 2010-04-23 2013-06-07 이화여자대학교 산학협력단 새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법
US20140004142A1 (en) 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
AU2012257771C1 (en) 2011-05-17 2015-12-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against Streptococcus pneumoniae
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
EP3096783B1 (en) 2014-01-21 2021-07-07 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
SI3583947T1 (sl) 2014-01-21 2024-01-31 Pfizer Inc. Kapsularni polisaharidi streptococcus pneumoniae in njihovi konjugati
KR102157200B1 (ko) 2014-01-21 2020-09-21 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 그의 용도
ES2930318T3 (es) 2014-02-14 2022-12-09 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
IL252915B2 (en) 2015-01-15 2024-04-01 Pfizer Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
IL303998A (en) 2015-07-21 2023-08-01 Pfizer Immunogenic preparations containing conjugated capsular sugar antigens, kits containing them and their uses
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
RU2762723C2 (ru) 2017-01-20 2021-12-22 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции для применения в пневмококковых вакцинах
CN110225757A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
CN110225764A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
EP3585803B1 (en) 2017-02-24 2025-09-24 Merck Sharp & Dohme LLC Pneumococcal conjugate vaccine formulations
RS65893B1 (sr) 2017-09-07 2024-09-30 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumokokni polisaharidi i njihova primena u imunogenim konjugatima polisaharid-proteinski nosač
UA128603C2 (uk) 2017-12-06 2024-08-28 Мерк Шарп Енд Доум Елелсі Полівалентна імуногенна композиція проти пневмококового захворювання
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
WO2020121159A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
SG11202106541WA (en) 2018-12-19 2021-07-29 Merck Sharp & Dohme Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
WO2020208502A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
AU2020323498A1 (en) 2019-07-31 2022-03-03 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
US20230000966A1 (en) 2019-11-01 2023-01-05 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
BR112022015796A2 (pt) 2020-02-21 2022-10-11 Pfizer Purificação de sacarídeos
CN115605498A (zh) 2020-02-23 2023-01-13 辉瑞公司（Us） 大肠杆菌组合物及其方法
EP4232593A1 (en) 2020-10-22 2023-08-30 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
TW202227467A (zh) 2020-10-27 2022-07-16 美商輝瑞大藥廠 大腸桿菌組合物及其方法
WO2022097010A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
JP2024517780A (ja) 2021-05-03 2024-04-23 ファイザー・インク 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2022249107A2 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PH12023553205A1 (en) 2021-05-28 2024-02-19 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
KR20250008122A (ko) 2022-05-11 2025-01-14 화이자 인코포레이티드 보존제를 갖는 백신 제형의 제조 방법
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR20250107930A (ko) 2022-11-22 2025-07-14 화이자 인코포레이티드 접합된 피막 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 그의 용도
KR20250113501A (ko) 2022-12-01 2025-07-25 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 접합체 백신 제형
EP4661911A1 (en) 2023-02-10 2025-12-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN121038808A (zh) 2023-03-30 2025-11-28 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
WO2024214016A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024238731A1 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Merck Sharp & Dohme Llc Compounds and adjuvant formulations useful in pneumococcal vaccines
WO2024241172A2 (en) 2023-05-19 2024-11-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods for eliciting an immune response to respiratory syncycial virus and streptococcus pneumoniae infection
WO2025057078A1 (en) 2023-09-14 2025-03-20 Pfizer Inc. Adjuvanted immunogenic compositions comprising conjugated pneumococcal capsular saccharide antigens and uses thereof
US20250161420A1 (en) 2023-11-16 2025-05-22 Merck Sharp & Dohme Llc Peptide conjugate vaccine compositions and methods for the treatment of alzheimer's disease
WO2025133971A1 (en) 2023-12-23 2025-06-26 Pfizer Inc. Improved methods for producing bacterial capsular saccharide glycoconjugates
WO2025186705A2 (en) 2024-03-06 2025-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2025191415A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated escherichia coli saccharides and uses thereof
WO2025219904A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Improved methods for producing glycoconjugates by reductive amination in aprotic solvent
WO2025219908A2 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Media and fermentation methods for polysaccharide production in bacterial cell culture

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
EP0831894A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Alberta Research Council Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of making and using them
DE69739981D1 (de) * 1996-10-31 2010-10-14 Human Genome Sciences Inc Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe
KR20010024299A (ko) * 1997-09-24 2001-03-26 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3 분해단백질분해효소
EP1100921B1 (en) * 1998-07-27 2007-05-02 Sanofi Pasteur Limited Streptococcus pneumoniae proteins and nucleic acid molecules
CN1263510C (zh) * 1998-08-19 2006-07-12 巴克斯特健康护理股份有限公司 多糖－蛋白质缀合物或寡糖－蛋白质缀合物、其制备方法及其应用
CA2343931A1 (en) * 1998-09-24 2000-03-30 Regents Of The University Of Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
PT1140157E (pt) 1998-12-21 2009-05-06 Medimmune Inc Proteínas de streptococcus pneumoniae e fragmentos imunogénicos para vacinas
CN100398653C (zh) 1998-12-23 2008-07-02 益得生物医学公司 新颖的链球菌抗原

Also Published As

Publication number Publication date
EA200201280A1 (ru) 2003-06-26
WO2001098334A2 (en) 2001-12-27
NO20026121D0 (no) 2002-12-19
IL153558A0 (en) 2003-07-06
JP5051959B2 (ja) 2012-10-17
NO331103B1 (no) 2011-10-10
AR033980A1 (es) 2004-01-21
JP2012187110A (ja) 2012-10-04
WO2001098334A3 (en) 2002-09-06
EP2281891A2 (en) 2011-02-09
CA2413450C (en) 2014-02-18
CN101260149B (zh) 2016-05-11
KR100927767B1 (ko) 2009-11-20
KR20030013450A (ko) 2003-02-14
PL360413A1 (pl) 2004-09-06
AU2001270381B2 (en) 2007-05-24
NO20026121L (no) 2003-02-13
MXPA03000103A (es) 2003-06-19
HU228706B1 (en) 2013-05-28
JP5889103B2 (ja) 2016-03-22
JP2004501618A (ja) 2004-01-22
NZ553554A (en) 2008-11-28
CA2413450A1 (en) 2001-12-27
EP2281891A3 (en) 2011-08-17
CN1449446A (zh) 2003-10-15
HUP0301656A2 (hu) 2003-08-28
TR200704553T2 (tr) 2007-11-21
UY26783A1 (es) 2002-01-31
AU7038101A (en) 2002-01-02
EA006232B1 (ru) 2005-10-27
HUP0301656A3 (en) 2004-10-28
EP1303612A2 (en) 2003-04-23
CN101260149A (zh) 2008-09-10
CZ2003154A3 (cs) 2003-06-18
IL153558A (en) 2011-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL214229B1 (pl) Wyizolowany polipeptyd przeciwko paciorkowcom, sposób jego wytwarzania i zastosowanie
US7262024B2 (en) Streptococcus antigens
KR101078919B1 (ko) 신규한 스트렙토코커스 항원
KR100771148B1 (ko) 그룹 ｂ 스트렙토코커스 항원
AU2001270381A1 (en) Streptococcus antigens
US20120308596A1 (en) Novel streptococcus antigens
US7074415B2 (en) Streptococcus antigens
EP1950302B1 (en) Streptococcus antigens
AU2007207883A1 (en) Streptococcus antigens
HK1122048A (en) Streptococcus antigens
MXPA00008111A (en) Group b streptococcus antigens
HK1118575B (en) Streptococcus antigens