PL213315B1

PL213315B1 - Szczepionka i zastosowanie peptydu do wytwarzania szczepionki

Info

Publication number: PL213315B1
Application number: PL374723A
Authority: PL
Inventors: Jingwu Z. Zhang
Original assignee: Baylor College Medicine; Opexa Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2013-02-28
Also published as: IL206650A; NO20044945L; CN1674931A; AU2003237437A1; JP2010207226A; WO2003104407A2; MXPA04011646A; AU2003237437B2; JP2005528910A; ATE453727T1; IL165194A; ZA200409792B; JP2013126420A; NZ537403A; RU2004139045A; IL206650A0; BR0311578A; WO2003104407A3; CA2485874A1; DE60330780D1

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy szczepionki i zastosowania peptydu do wytwarzania szczepionki. Rozwiązanie dotyczy ogólnie dziedziny leczenia choroby autoimmunologicznej, takiej jak stwardnienie rozsiane (MS). Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy kwasów nukleinowych i peptydów receptora komórek T znajdowanych u niektórych pacjentów z MS, uwzględniając sposoby wykrywania sekwencji oraz zastosowania sekwencji peptydowych receptora komórek T do leczenia choroby autoimmunologiczne j, takiej jak MS.

Kompleksy rozpoznawania międzykomórkowego tworzone przez receptory komórek T (TCR) na cytotoksycznych limfocytach T lub komórkach T pomocniczych oraz kompleksy MHC/peptyd na komórkach prezentujących antygen (APC) są powszechnymi składowymi różnorodnych zestawów oddziaływań komórka-komórka, które aktywują TCR zarówno podczas rozwoju repertuaru komórek T w obrębie indywidualnego organizmu (selekcja pozytywna; selekcja negatywna; przeżywalność obwodowa), jak i podczas etapów kontrolnych (komórki T pomocnicze) oraz efektorowych (komórki T killer) adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej.

W adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, antygeny rozpoznawane są przez hiperzmienne cząsteczki, takie jak przeciwciała lub TCR, które ulegają ekspresji z odpowiednio zróżnicowanymi strukturami tak, aby były zdolne do rozpoznawania dowolnego antygenu. Przeciwciała mogą się wiązać z dowolną częścią powierzchni antygenu. TCR, jednakże, ograniczają się do wyczuwania obecności antygenów przez wiązanie się z krótkimi peptydami antygenów, które prezentowane są na powierzchni APC wiążących się z cząsteczkami klasy I lub klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Rozpoznanie przez TCR kompleksów peptyd/MHC wyzwala aktywację (klonalną ekspansję) komórek T.

TCR są heterodimerami składającymi się z dwóch łańcuchów, którymi mogą być αβ (alfa-beta) lub γδ (gamma-delta). Struktura TCR jest bardzo podobna do struktury immunoglobulin (Ig). Każdy łańcuch posiada domeny zewnątrzkomórkowe, które mają ufałdowanie immunoglobulin. Domena aminokońcowa jest wysoce zmienna i nazywa się ją domeną zmienną (V). Domena bliższa błony komórkowej jest domeną stałą (C). Te dwie domeny są analogiczne do domen immunoglobulin i przypominają fragmenty Fab. Domena V każdego łańcucha posiada trzy regiony determinujące komplementarność (CDR). Proksymalnie do błony komórkowej, każdy łańcuch TCR posiada krótką sekwencję łączącą z resztą cysteiny, która tworzy wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwoma łańcuchami.

Geny kodujące hetorodimery αβ i γδ ulegają ekspresji tylko w linii komórek T. Cztery loci TCR (α,β, γ i δ) wykazują organizację linii zarodkowej bardzo podobną do Ig. Łańcuchy α i γ wytwarzane są przez rearanżację segmentów V i J, podczas gdy łańcuchy β i δ wytwarzane są przez rearanżację segmentów V, D i J. Segmenty genów dla łańcuchów TCR są położone na różnych chromosomach, z wyjątkiem segmentów genów łańcucha δ, które znajdują się pomiędzy segmentami genów V i J łańcucha α. Położenie segmentów genów łańcucha δ jest istotne: w wyniku wydajnej rearanżacji segmentów genów łańcucha a następuje delecja genów C łańcucha δ, tak więc w danej komórce heterodimer αβ nie może ulegać ko-ekspresji z receptorem γδ.

U myszy, jest około 100 segmentów genu Va i 50 Ja i tylko jeden segment Ca. Rodzina genów łańcucha δ posiada około 10 segmentów genu V, 2 D i 2 J. Rodzina genów łańcucha β posiada 20-30 segmentów V i dwa identyczne powtórzenia zawierające jeden Dβ, sześć Jβ i jeden Οβ. Wreszcie, rodzina genów łańcucha γ zawiera 7 V i trzy różne powtórzenia J-C. U ludzi organizacja jest podobna do tej u myszy, ale liczba segmentów jest inna.

Rearanżacja segmentów genów w łańcuchach a i β jest podobna do rearanżacji w Ig. Łańcuch a, podobnie jak łańcuch lekki Ig, jest kodowany przez segmenty genów V, J i C. Łańcuch β, podobnie jak łańcuch lekki Ig, jest kodowany przez segmenty genów V, D i J. Rearanżacje segmentów genów łańcucha a dają w wyniku połączenie VJ, a rearanżacje łańcucńa β dają w wyniku połączenie VDJ. Po transkrypcji genów po rearanżacji, dojrzewaniu RNA i translacji, łańcuchy a i β ulegają ekspresji w postaci związanej wiązaniem disiarczkowym w błonie komórek T.

Segmenty genów TCR są flankowane przez sekwencje rozpoznawania sygnału (RSS), zawierające heptamer i nonamer z wtrąconą sekwencją o długości albo 12 nukleotydów (jeden kierunek) albo nukleotydów (drugi kierunek). Tak jak w Ig, enzymy kodowane przez geny aktywujące rekombinację (RAG-1 i RAG-2) są odpowiedzialne za procesy rekombinacji. RAG1/2 rozpoznaje RSS i łączy segmenty V-J i V-D-J w taki sam sposób jak przy rearanżacjach Ig. W skrócie, enzymy te tną jedną nić

PL 213 315 B1

DNA pomiędzy segmentem genu i RSS, i katalizują tworzenie struktury spinki do włosów w sekwencji kodującej. Sekwencja sygnałowa jest następnie wycinana.

Kombinatoryczne łączenie segmentów V i J w łańcuch a oraz segmentów V, D i J w łańcuch β daje dużą liczbę możliwych cząsteczek, dzięki czemu występuje różnorodność TCR. Różnorodność TRC uzyskuje się również przez alternatywne łączenie segmentów genów. W przeciwieństwie do Ig, segmenty genów β i δ można łączyć w alternatywny sposób. RSS flankujące segmenty genów w segmentach genów β i δ mogą tworzyć VJ i VDJ w łańcuchu β oraz VJ, VDJ i VDDJ w łańcuchu δ. Tak jak w przypadku Ig, różnorodność powstaje również w wyniku zmienności w łączeniu segmentów genów.

Hiperzmienne pętle TCR, znane jako regiony determinujące komplementarność (CDR) rozpoznają złożoną powierzchnię zbudowaną z cząsteczek MHC i wiążą peptyd. Pętle CDR2 a i β kontaktują się tylko z cząsteczką MHC na powierzchni APC, podczas gdy pętle CDR1 i CDR3 kontaktują się zarówno z peptydem i cząsteczką MHC. W porównaniu z Ig, TCR wykazują bardziej ograniczoną różnorodność w CDR1 i CDR2. Jednakże, różnorodność CDR3 w TCR jest wyższa niż w Ig, ponieważ TCR może łączyć więcej niż jeden segment D, co prowadzi do zwiększenia różnorodności połączeń.

Uważa się, że patogeneza wielu chorób autoimmunologicznych jest spowodowana odpowiedzią autoimmunologiczną komórek T na własne antygeny obecne w organizmie. Nie wszystkie autoreaktywne komórki T są usuwane w grasicy, co jest sprzeczne z paradygmatem selekcji klonalnej. Te komórki T z TCR dla szerokiego spektrum własnych antygenów stanowią część normalnego repertuaru komórek T i naturalnie krążą po obwodzie. Jest niejasne dlaczego autoreaktywne komórki T mogą, podczas ich ewolucji, przechodzić różnicowanie w grasicy i gromadzić się na obwodzie. Chociaż ich fizjologiczna rola nie jest zrozumiała, te autoreaktywne komórki T, kiedy zostaną zaktywowane, stanowią potencjalne ryzyko pod względem indukcji autoimmunologicznych stanów patologicznych. Autoreaktywne komórki T można również izolować od normalnych osobników, u których nie pojawiły się konsekwencje w postaci chorób autoimmunologicznych. Ustalono, że rozpoznanie antygenu autoreaktywności samo w sobie nie jest wystarczające do wywołania procesu autodestrukcji. Jednym ze wstępnych warunków, aby autoreaktywne komórki T były patogenne jest to, że muszą być one zaktywowane.

Autoreaktywne komórki T wykazano w patogenezie chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS) i reumatoidalne zapalenie stawów (RA). Patogeneza autoreaktywnych komórek T w MS polega, ogólnie rzecz biorąc, na pojawieniu się odpowiedzi komórek T na antygeny mielinowe, w szczególności zasadowe białko mieliny (MBP). Stwierdzono, że komórki T reaktywne wobec MBP przechodzą aktywację in vivo, i występują przy wyższej częstości prekursora we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów z MS w przeciwieństwie do osobników kontrolnych. Te reaktywne wobec MBP komórki T wytwarzają cytokiny Th1, np. IL-2, TNF i γ-interferon, które ułatwiają migrację komórek stanu zapalnego do ośrodkowego układu nerwowego i powodują zaostrzenie destrukcyjnych wobec mieliny odpowiedzi zapalnych w MS.

Wykazano również, że reaktywne wobec MBP komórki T zaangażowane są w patogenezie doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u zwierząt, które przypomina stwardnienie rozsiane. EAE można indukować aktywnie u podatnych zwierząt przez wstrzyknięcie MBP w postaci zemulgowanej z adiuwantem lub biernie przez wstrzyknięcie linii reaktywnych wobec MBP komórek T i klonów pochodzących od zwierząt uczulanych MBP. Jeśli aktywacja ma miejsce in vitro, do indukcji EAE wymagana jest bardzo mała liczba reaktywnych wobec MBP komórek T, podczas gdy 100 razy więcej komórek T w stanie spoczynku, o tej samej reaktywności, nie jest w stanie pośredniczyć w wywoływaniu choroby.

Wykazano, że szczepienie inaktywowanymi reaktywnymi wobec MBP komórkami T zmniejsza ilość reaktywnych wobec MBP komórek T w EAE; procedurę nazywa się szczepieniem T komórkami i stosuje się ją do zapobiegania i leczenia EAE. Ben-Nun i in., Nature 292: 60-61 (1981). Chociaż mechanizm leżący u podstaw szczepienia komórkami T nie jest w pełni zrozumiały, uważa się, że obejmuje on idiotypowe sieci regulacyjne przez oddziaływania z TCR i tak zwane antyergotypowe odpowiedzi komórek T, które reagują przypuszczalnie z markerami aktywacji komórek T. Uważa się, że idiotypowe i antyergotypowe sieci regulacyjne mają zasadnicze znaczenie dla odporności ochronnej indukowanej przez szczepienie komórkami T, ponieważ odporność ochronna nadawana przez szczepienie komórkami T jest specyficzna dla choroby, którą autoimmunologiczne komórki T stosowane do szczepienia są w stanie zaindukować. Ponadto, antyidiotypowe komórki T izolowane od immunizowanych gryzoni specyficznie rozpoznają klony/linie immunizowanych komórek T, ale nie komórek T eksprymujących odległe

PL 213 315 B1 cechy strukturalne TCR. Uważa się, że determinanty TCR rozpoznawane przez anty- idiotypowe komórki T najprawdopodobniej znajdują się w obrębie CDR3 lub CDR2, jak przewiduje się na podstawie charakterystyki różnorodności sekwencji w obrębie tych regionów.

W EAE, encefalitogenne reaktywne wobec MBP komórki T ograniczają swoje działanie do bardzo ograniczonych epitopów na MBP. Te ograniczenia pod względem różnorodności patogennych odpowiedzi komórek T umożliwiają specyficzną interwencję immunologiczną. Zaprojektowano różne strategie terapeutyczne ukierunkowane na region docelowy νβ TCR do zapobiegania rozwojowi EAE u uczulanych zwierząt. Na przykład, przeciwciała monoklonalne ukierunkowano na produkt genu Vβ, a szczepionki peptydowe oparto na regionie CDR2 odpowiadającym genowi Vβ.

Niektóre badania dotyczące EAE rozciąga się na ludzkie choroby autoimmunologiczne. Na przykład, peptyd odpowiadający Vβ 5.2 TCR stosowano w próbach klinicznych do leczenia pacjentów z MS, a peptyd Vβ 14 stosowano do szczepienia pacjentów z RA. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 614 192 (Vandenbark) ujawnia leczenie choroby autoimmunologicznej przez stosowanie immunogennych peptydów TCR o długości od 15 do 30 aminokwasów, zawierających co najmniej część CDR2. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 303 314 (Zhang) ujawnia leczenie choroby autoimmunologicznej przez stosowanie pewnych immunogennych peptydów TCR w połączeniu z peptydami markerowymi aktywacji immunogennych komórek T.

Jednym z obszarów w jakich można ulepszyć szczepienie peptydami TCR jest określenie który, jeśli w ogóle, powszechny motyw znajduje się w autoreaktywnych TCR pacjentów z chorobą autoimmunologiczną, taką jak MS. Takie powszechnie wy stępujące motywy można stosować albo jako podstawę szczepionki peptydowej do aktywowania antyidiotypowej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów z MS w celu usunięcia komórek T, które posiadają TCR zawierające wspomniane motywy, albo cel dla preparatu przeciwciał, które mogą funkcjonalnie blokować lub bezpośrednio usuwać komórki T, które posiadają TCR zawierające wspomniane motywy.

Dlatego też, pożądane jest określenie sekwencji aminokwasowych powszechnych motywów, szczególnie znajdowanych w TCR autoreaktywnych komórek T od pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Pożądana jest również możliwość wykrywania takich motywów w próbce pacjenta przy zastosowaniu konwencjonalnej metody, takiej jak PCR. Ponadto, pożądane jest stosowanie peptydów identycznych z wykrytymi motywami lub pochodzących od nich do leczenia pacjentów z chorobą autoimmunologiczną. Pożądane jest również stosowanie przeciwciał, które specyficznie wiążą się z wspomnianymi motywami do leczenia pacjentów z chorobą autoimmunologiczną.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 303 314 (Zhang) ujawnia taki powszechny motyw znajdowany w TCR podgrupy komórek T Vβ13.1, motyw LGRAGLTY, który posiada sekwencję aminokwasową Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10), jak również łatwy sposób jego detekcji przez PCR. Motyw ten występuje w niektórych TCR niektórych autoreaktywnych komórek T, które rozpoznają aminokwasy 83-99 MBP (dalej w niniejszym opisie MBP83-99). Peptydy oparte na motywie LGRAGLTY można stosować do szczepienia niektórych pacjentów z celu leczenia lub zapobiegania chorobom autoimmunoiogicznym związanym z Vβ13.1-LGRAGLTY (np., MS).

Ponieważ motyw LGRAGLTY występuje tylko w niektórych TCR, które rozpoznają MBP83-99, pozostaje potrzeba zidentyfikowania innych sekwencji TCR, a zwłaszcza sekwencji CDR ulegających powszechnie ekspresji z reaktywnych wobec MBP komórkach T. Ponadto, pozostaje potrzeba możliwości wykrywania innych sekwencji TCR, włącznie z sekwencjami CDR, które powszechnie ulegają ekspresji w reaktywnych wobec MBP komórkach T. Wreszcie, pozostaje potrzeba rozwijania sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych związanych z innymi sekwencjami TCR, a zwłasz-cza sekwencjami CDR.

Dla ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku, poniżej zdefiniowano niektóre terminy.

PCR oznacza łańcuchową reakcję polimerazy, na przykład, jak opisano ogólnie w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 683 202 (wydanym 28 lipca 1987, Mullis), który włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. PCR jest techniką amplifikacji, w której wybrane oligonukleotydy, czyli startery, mogą hybrydyzować z matrycą kwasu nukleinowego w obecności czynnika polimeryzacji (takiego jak polimeraza DNA lub RNA) oraz trifosforanów nukleotydów, dzięki czemu od starterów mogą powstawać wydłużające się produkty. Produkty te można następnie poddawać denaturacji i stosować jako matryce w cyklicznej reakcji, która amplifikuje ilość występujących kwasów nukleinowych, co może ułatwić ich następne wykrywanie. W nauce znanych jest szereg technik PCR i można je stosować w połączeniu z niniejszym wynalazkiem.

PL 213 315 B1

Peptyd oznacza peptyd, niezależnie czy naturalny, syntetyczny czy jego modyfikacje, zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej wobec specyficznemu peptydowi lub sekwencji polipeptydowej.

Starter oznacza oligonukleotyd, niezależnie czy naturalny, syntetyczny czy jego modyfikacje, zdolny do działania jako punkt inicjacji syntezy nukleotydów odpowiednio komplementarnych do specyficznej sekwencji nukleotydowej na cząsteczce matrycy.

Sonda oznacza oligonukleotyd, niezależnie czy naturalny, syntetyczny czy jego modyfikacje, zdolny do specyficznego wiązania z odpowiednio komplementarną sekwencją nukleotydową.

„Pochodzący z w kontekście sekwencji nukleotydowej oznacza, że sekwencja nukleotydową nie jest ograniczona do opisanej specyficznej sekwencji, ale obejmuje również warianty tej sekwencji, które mogą obejmować addycje, delecje, podstawienia nukleotydowe bądź modyfikacje w takim stopniu, że warianty opisanej sekwencji zachowują zdolność do specyficznego wiązania z komplementem opisanej sekwencji. W kontekście peptydu lub sekwencji polipeptydowych, pochodzący z oznacza, że peptyd lub polipeptyd nie jest ograniczony do specyficznej opisanej sekwencji, ale obejmuje również warianty sekwencji, które mogą obejmować addycje, delecje, podstawienia aminokwasowe bądź modyfikacje w takim stopniu, że warianty w wymienionych sekwencjach zachowują zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej wobec opisanej sekwencji.

Immunogenny, jeśli stosuje się do opisania peptydu lub polipeptydu, oznacza, że peptyd lub polipeptyd jest zdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej, albo za pośrednictwem komórek T, przeciwciał, albo obu.

Antygenowy oznacza, że peptyd lub polipeptyd może być rozpoznawany w wolnej postaci przez przeciwciała i/lub w kontekście cząsteczek MHC w przypadku komórek T specyficznych wobec antygenu.

Choroba związana z układem immunologicznym oznacza chorobę, w której układ immunologiczny bierze udział w patogenezie choroby. Podgrupą chorób związanych z układem immunologicznym są choroby autoimmunologiczne. Choroby autoimmunologiczne obejmują, ale bez ograniczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, miastenia, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (zapalenie tarczycy Hashimoto), choroba Gravesa, zapalna choroba jelit, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej i siatkówki oka, zapalenie wielomięśniowe i pewne typy cukrzycy. W świetle niniejszego wynalazku, specjalista w tej dziedzinie będzie mógł bez trudu uświadomić sobie inne choroby autoimmunologiczne, które można leczyć stosując kompozycje i sposoby według opisanego rozwiązania.

Choroba, w której pośredniczą komórki T oznacza chorobę powstającą w wyniku rozpoznawania przez komórki T peptydów normalnie znajdowanych w organizmie.

Terapia lub leczenie, jeśli odnosi się do ochrony zwierzęcia przed chorobą, oznacza zapobieganie, hamowanie, zatrzymywanie lub całkowitą eliminację choroby. Zapobieganie chorobie obejmuje podawanie zwierzęciu kompozycji według wynalazku przed początkiem choroby. Hamowanie choroby obejmuje podawanie zwierzęciu kompozycji według wynalazku po indukcji choroby, ale przed jej klinicznym pojawieniem się. Zatrzymywanie choroby obejmuje podawanie zwierzęciu kompozycji według wynalazku po klinicznym pojawieniu się choroby.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka, charakteryzująca się tym, że zawiera peptyd mający sekwencję SEQ ID NO: 4 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydu mającego sekwencję SEQ ID NO:4, do wytwarzania szczepionki do leczenia stwardnienia rozsianego.

Rozwiązanie dotyczy peptydu obejmującego około 4 do 20 aminokwasów w długości, zawierającego co najmniej 4 kolejne aminokwasy sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji z nich pochodzących. Peptyd może mieć również długość około 4 do 12 aminokwasów, zawierając albo (i) 4, 5, 6 lub 7 kolejnych aminokwasów sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4 lub 6, bądź sekwencji z nich pochodzących, (ii) 4, 5, 6, 7 lub 8 kolejnych aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5, albo sekwencji z niej pochodzących. Peptyd może mieć również długość około 4 do 20 aminokwasów, zawierając sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje z nich pochodzące. Peptyd może być naturalny, syntetyczny lub stanowić ich pochodną.

Peptyd można stosować jako antygen do wywoływania odpowiedzi immunologicznej wobec peptydu lub polipeptydu zawierającego sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, odpowiedź immunologiczną

PL 213 315 B1 wywołana przez peptyd można wykorzystywać jako podstawę leczenia, wytwarzania przeciwciał, oczyszczania przeciwciał i oznaczeń diagnostycznych.

Peptyd można kowalencyjnie modyfikować na szereg sposobów znanych specjalistom w tej dziedzinie. Wybrane łańcuchy boczne lub reszty terminalne peptydu można modyfikować stosując powszechne czynniki przeprowadzające w pochodne.

Reszty cysteinowe można poddawać reakcji z α-chlorowcooctanami (i odpowiadającymi aminami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid, otrzymując pochodne karboksymetylowe lub karboksyamidometylowe. Reszty cysteinowe można również przeprowadzać w pochodne przez reakcje z bromotrifluoroacetonem, kwasem a-bromo-3-(5-imidozoilo)propionowym, fosforanem chloroacetylowym, N-alkilomaleimidami, disiarczkiem 3-nitro-2-pirydylowym, disiarczkiem metylo-2-pirydylowym, p-chlorortęciobenzoesanem, 2-chlorortęcio-4-nitrofenolem lub chloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolem.

Reszty histydynowe można przeprowadzać w pochodne przez reakcję ze specyficznym dla histydyny odczynnikiem dietyloprowęglanowym przy pH 5,5 - 7,0. Można również stosować bromek para-bromofenacylu w 0,1 M kakodylanie sodowym w pH 6,0.

Reszty lizynowe i aminokońcowe można poddawać reakcji z bezwodnikami kwasu bursztynowego lub innych kwasów karboksylowych. Przeprowadzanie w pochodne z zastosowaniem tych czynników może dać w efekcie zmianę ładunku reszt lizynowych. Inne odczynniki do przeprowadzania w pochodne reszt zawierających grupy α-aminowe obejmują imidoestry, takie jak ester metylowy kwasu pikolinoimidazolowego; fosforan pirydoksalu, pirydoksal; chloroborowodorek; kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metylissmocznik; 2,4 pentanodion; i katalizowane przez transaminazę reakcje z glioksylanem.

Reszty argininowe można modyfikować przez reakcje z jednym lub kilkoma konwencjonalnymi odczynnikami, a wśród nich z fenyloglioksalem, 2,3-butanodionem, 1,2-cykloheksanodionem i ninhydryną. Przeprowadzanie w pochodne reszt argininowych można przeprowadzać w warunkach zasadowych ze względu na wysoką pKa guanidynowej grupy funkcyjnej. Ponadto, odczynniki te mogą reagować z grupami lizynowymi, jak również z grupą epsilon-aminową argininy.

Reszty tyrozynowe można poddawać reakcji z aromatycznymi związkami diazoniowymi lub tetranitrometanem. N-acetyloimidizol i tetranitrometan można stosować do tworzenia, odpowiednio,

125 pochodnych 0-acetylotyrozylowych i 3-nitrowych. Reszty tyrozynowe można jodować stosując ¹²⁵J lub 131 ¹³¹J w celu przygotowania jodowanych białek do stosowania w oznaczeniach radioimmunologicznych.

Boczne grupy karboksylowe kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego można modyfikować przez reakcje z karbodiimidami (R'--N--C--N--R'), takimi jak 1-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-(4-etylo)karbodiimid lub 1-etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylowe i glutamylowe można przekształcać w reszty asparaginylowe i glutaminylowe przez reakcje z jonami amonowymi. Reszty glutaminylowe i asparaginylowe można amidować do odpowiadających reszt glutamylowej i aspartylowej. Alternatywnie, reszty te można poddawać deamidacji w łagodnie kwasowych warunkach.

Przeprowadzanie w pochodne peptydu z zastosowaniem czynników bifunkcyjnych może być użyteczne do sieciowania peptydu w nierozpuszczalną w wodzie macierz nośnikową lub inne makrocząsteczkowe nośniki. Powszechnie stosowane czynniki sieciujące obejmują, ale bez ograniczeń, 1,1bis(diazoacetyl)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksysukcynoimidowe, estru kwasu 4azydosalicylowego, homobifunkcyjne imidoestry, obejmujące estry disukcynoimidylowe takie jak 3,3'ditiobis(sukcynoimidylopropionian), oraz bifunkcyjne maleimidy takie jak bis-N-male-imido-1,8-oktan. Czynniki przeprowadzające w pochodne, takie jak metylo-3-[(p-azydofanylo)-ditio]propioimidynian mogą dawać półprodukty, które można aktywować światłem, zdolne do sieciowania w obecności światła. Alternatywnie, reaktywne nierozpuszczalne w wodzie macierze, takie jak węglowodany aktywowane bromkiem cyjanu i reaktywne substraty opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537; i 4 330 440 można wykorzystywać do immobilizacji białek.

Peptyd można również modyfikować przez hydroksylację reszt proliny i lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszt seryny lub treoniny, metylację grup α-aminowych łańcuchów bocznych lizyny, argininy i histydyny (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman i in.,

San Francisco, str. 79-86 (1983)), acetylację N-końcowej grupy aminowej i, w niektórych przypadkach, amidację C-końcowych grup karboksylowych.

PL 213 315 B1

Przeprowadzenie peptydu w pochodną może poprawić jego rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny okres półtrwania, i podobne. Przeprowadzanie w pochodne może również eliminować lub osłabiać wszelkie niepożądane skutki uboczne peptydu i podobne, jak ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980), które tym samym włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Modyfikacja chemiczna peptydu może zapewniać w pewnych okolicznościach dodatkowe korzyści, takie jak podwyższenie stabilności i czasu krążenia oraz podwyższenie immunogenności. Dla uzyskania większej ilości informacji na temat chemicznego przeprowadzania w pochodne peptydów, patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 350 730 (Friedman), który w całości włączono do niniejszego opisu.

Immunogenność peptydu można wzmacniać przez włączanie peptydu do dłuższego peptydu lub polipeptydu, bądź przez koniugację peptydu z nośnikami immunologicznymi, takimi jak KLH, albumina surowicy, toksoid tężcowy, i tym podobne, stosując standardowe techniki łączenia. Szereg takich metod jest znanych w nauce, np. stosowanie czynników kondensujących, takich jak dicykloheksylokarbodiimid lub stosowanie łączników, takich jak te komercjalnie dostępne w Pierce Chemical Co., Rockford, III.

Peptydowi można również nadawać postać do podawania dostawowego, dootrzewnowego, domięśniowego, podskórnego, dożylnego, doustnego, donosowego, doodbytniczego, dopoliczkowego, dozbiornikowego, dooponowego, podjęzykowego, dopłucnego, miejscowego, przezskórnego, bądź do innych dróg podawania.

Peptyd można również stosować do aktywacji komórek T z TCR, które specyficznie wiążą się z peptydami lub polipeptydami zawierającymi sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Komórki T można otrzymać od pacjenta z chorobą autoimmunologiczną stosując jedną z wielu metod znanych w nauce. Komórki T można również wzbogacać pod względem szczególnej subpopulacji, takiej jak autoreaktywne komórki T. Wyizolowane komórki T można następnie stymulować peptydem in vitro, który może aktywować i/lub zwiększać liczbę komórek T z TCR, które specyficznie wiążą się z peptydami lub polipeptydami zawierającymi sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Zaktywowane i/lub w zwiększonej ilości komórki T można następnie podawać pacjentowi od którego komórki T pochodziły, dzięki czemu mogą one wiązać autoreaktywne komórki T z TCR zawierającymi sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, usuwając w ten sposób autoreaktywne komórki T.

W rozwiązaniu opisano też przeciwciało, które specyficznie wiąże się z epitopem zawierającym sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Przeciwciało może należeć do klas IgG, IgM, IgA, IgD i IgE oraz ich fragmentów i pochodnych, obejmujących Fab, F(ab')2, Fd i przeciwciała jednołańcuchowe (scFv). Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem poliklonalnym, przeciwciałem oczyszczonym przez powinowactwo lub ich mieszaniną, które wykazuje odpowiednią specyficzność wiązania z epitopem zawierającym sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Przeciwciało można przeprowadzać w pochodną przez przyłączenie jednej lub więcej reszt chemicznych, peptydowych lub polipeptydowych znanych w nauce, jak opisano powyżej.

Przeciwciało można identyfikować i izolować stosując techniki znane w nauce, takie jak prezentację fagową, jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 565 332 (Hoogenboom i in.), 5 858 657 (Winter i in.), 5 871 907 (Winter i in.), 5 969 108 (McCafferty i in.) oraz 6 172 197 (McCafferty i in.), które w całości włączono do niniejszego opisu. Przeciwciało można również izolować z ssaka, włącznie, ale bez ograniczeń, z myszą, szczurem, kozą, królikiem, owcą, świnią lub bydłem, immunizowanego antygenem zdolnym do wywoływania odpowiedzi immunologiczne] wobec sekwencji, sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Przeciwciało może być również przeciwciałem ludzkim lub humanizowanym, jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 565 332 (Hoogenboom i in.), 5 858 657 (Winter i in.), 5 871 907 (Winter i in.), 5 969 108 (McCafferty i in.) oraz 6 172 197 (McCafferty i in.), które w całości włączono do niniejszego opisu.

Jak pełniej opisano poniżej, przeciwciało można stosować jako podstawę do leczenia lub oznaczeń diagnostycznych. Przeciwciało można również stosować do wzbogacania lub oczyszczania autoreaktywnych komórek T, które mają TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Wzbogacone lub oczyszczone autoreaktywne komórki T, które posiadają TCR zawierające sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź

PL 213 315 B1 sekwencje od nich pochodzące, można stosować w szczepionce komórek T dla pacjenta chorobą autoimmunologiczną według będącego przedmiotem jednoczesnego zgłoszenia patentowego Stanów

Zjednoczonych Ameryki numer 09/952 532 (Zhang), które w całości włączono do niniejszego opisu.

Przedstawiony jest też oligonukleotyd, który koduje peptyd lub polipeptyd zawierający peptyd według pierwszego przykładu wynalazku, bądź jego fragment. Oligonukleotyd może mieć długość około 15 do 30 nukleotydów, zawierając co najmniej 10 kolejnych nukleotydów kodujących fragment sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, sekwencji nukleotydowych komplementarnych do nich lub sekwencji od nich pochodzących. Oligonukleotyd może mieć również długość około 15 do 30 nukleotydów, zawierając albo (i) 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 kolejnych nukleotydów kodujących fragment sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4 lub 6, sekwencji nukleotydowych komplementarnych do nich lub sekwencji od nich pochodzących, (ii) 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 lub 26 kolejnych nukleotydów kodujących fragment sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5, sekwencji nukleotydowe j komplementarnej do niej lub sekwencji od niej pochodzącej. Oligonukleotyd może mieć również długość około 15 do 30 nukleotydów, zawierając sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, sekwencje nukleotydowe do nich komplementarne lub sekwencje od nich pochodzące.

Ze względu na degenerację kodu genetycznego, wiele sekwencji nukleotydowych może kodować peptyd opisany powyżej. Na przykład, oligonukleotyd może mieć długość około 15 do 30 nukleotydów, zwierając co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 1, 2 lub 3, sekwencji do nich komplementarnych lub sekwencji od nich pochodzących. Oligonukleotyd może mieć również długość około 15 do 30 nukleotydów, zawierając albo (i) 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 kolejnych nukleotydów sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 1 lub 3, sekwencji do nich komplementarnych, bądź sekwencji od nich pochodzących, (ii) 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 lub 26 kolejnych nukleotydów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, sekwencji do niej komplementarnych, bądź sekwencji od nich pochodzących. Oligonukleotyd może mieć również długość około 15 do 30 nukleotydów, zawierając sekwencję nukleotydową sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 1, 2 lub 3, sekwencji do niej komplementarnych, bądź sekwencji od nich pochodzących.

Jak pełniej opisano poniżej, oligonukleotyd można stosować jako starter do PCR. Oligonukleotyd można również stosować jako sondę do wiązania z, i również wykrywania, genu TCR, jego fragmentu, który zawiera komplementarną sekwencję nukleotydową lub sekwencję nukleotydową od niej pochodzącą. Oligonukleotyd można znakować wykrywalną resztą. W nauce znanych jest wiele 32 35 przykładów wykrywalnych reszt obejmujących, ale bez ograniczeń, ³²P, ³⁵S, biotynę lub digoksygeninę.

Opisano też parę starterów, obejmującej pierwszy starter, który jest oligonukleotydem opisanym powyżej i drugi starter, który jest oligonukleotydem o długości około 15 i 30 nukleotydów nie zawierającym sekwencji pierwszego startera i jest fragmentem regionu od νβ do C3 genu TCR w komórkach T, lub sekwencją od niego pochodzącą, przy czym pierwszy i drugi starter specyficznie wiążą się z różnymi niciami genu TCR. Drugi starter może być komplementarny do sekwencji regionu Cβ tak, że w przybliżeniu 400 bp, obejmujących region νβ^β-ϋβ genu TCR, oddziela pierwszy starter od drugiego startera.

Jak dokładniej opisano poniżej, parę starterów można stosować do amplifikacji sekwencji nukleotydowej kodującej TCR z ludzkiej komórki T, zawierającej sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących.

TCR zawierający sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, można wykrywać w próbce przeprowadzając oznaczenie immunologiczne wykorzystujące przeciwciało opisane powyżej. Termin „oznaczenie immunologiczne obejmuje jednoczesne kanapkowe, wczesne kanapkowe i odwrócone kanapkowe oznaczenia immunologiczne, które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Próbkę, która ma być testowana pod względem obecności TCR, zawierającego sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, można izolować, bezpośrednio lub pośrednio, z tkanek zwierzęcych lub ludzkich, w których zachodzi ekspresja genów łańcucha β receptora komórki T, takich jak monojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC).

Gen TCR zawierający sekwencję nukleotydową sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących (sekwencję docelową), można wykrywać w próbce

PL 213 315 B1 przez amplifikację fragmentu genu TCR zawierającego sekwencję docelową, przy czym wspomnianą amplifikację przeprowadza się stosując parę starterów.

Fragment genu TCR zawierający sekwencję docelową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, można amplifikować przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) stosując dowolną odpowiednią technikę PCR lub wyposażenie znane w nauce. Na przykład, amplifikację PCR można przeprowadzać zgodnie z procedurą, w której przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera następujące składniki: 5 μl 10x buforu II PCR (100 mM Tris-HC1, pH 8,3, 500 mM KCl), 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 0,3 μl polimerazy Taq (5U^l) (AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn. ), 30 pmoli pierwszego startera, 30 pmoli drugiego startera, oraz 1 μl próbki DNA. Polimeraza może być stabilna w temperaturach co najmniej 95°C, wykazywać zdolność przetwórczą 50-60 i szybkość wydłużania większą niż 50 nukleotydów na minutę.

Reakcję PCR można przeprowadzać stosując następujący profil amplifikacji: 1 minuta w temperaturze 95°C (denaturacja), 20 sekund w temperaturze 56°C (hybrydyzacja), i 40 sekund w temperaturze 72°C (wydłużanie) w ciągu w całości 40 cykli. Przed rozpoczęciem pierwszego cyklu, mieszaninę reakcyjną można poddawać początkowej denaturacji przez okres około 5 minut do 15 minut. Podobnie, po zakończeniu ostatniego cyklu, mieszaninę reakcyjną można poddawać końcowemu wydłużania przez okres około 5 minut do 10 minut. Niektóre reakcje PCR trwają tak krótko jak 15 do 20 cykli, a inne aż 50 cykli. W zależności od specyficznej reakcji PCR, można stosować dłuższe lub krótsze czasy inkubacji oraz wyższe i niższe temperatury na każdym etapie profilu amplifikacji.

Próbką do testowania pod kątem obecności genu TCR, zawierającego sekwencję docelową, może być kwas nukleinowy, taki jak genomowy DNA, cDNA, DNA uprzednio zamplifikowany przez PCR, lub dowolna inna postać DNA. Próbkę można izolować, bezpośrednio lub pośrednio, z tkanek zwierzęcych lub ludzkich, w których zachodzi ekspresja genów łańcucha β receptora komórki T, takich jak monojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC). Genomowy DNA można izolować bezpośrednio z tkanki, w której zachodzi ekspresja genów łańcucha β receptora komórki T. cDNA można izolować pośrednio przez odwrotną transkrypcję mRNA bezpośrednio wyizolowanego bezpośredni z tkanki, w której zachodzi ekspresja genów łańcucha β receptora komórki T.

Zdolność do wykrywania obecności genu receptora komórki T, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, można wzmacniać przez izolację próbki DNA pośrednio przez amplifikację genomowego DNA, cDNA, lub innej dowolnej postaci DNA, z zastosowaniem dwuetapowej reakcji PCR. Na przykład, pierwszą reakcję amplifikacji PCR można przeprowadzać dla zamplifikowania wstępnego fragmentu, który jest dłuższy niż, i który zawiera fragment do którego pierwszy i drugi starter mogą się selektywnie przyłączać na przeciwnych niciach. Następnie można przeprowadzać drugą reakcję amplifikacji PCR, stosując wstępny fragment jako matrycę oraz pierwszy i drugi starter, w celu amplifikacji fragmentu zawierającego sekwencję docelową. Jeśli w pierwszej reakcji PCR do amplifikacji wstępnego fragmentu stosuje się pierwszy albo drugi starter, to druga reakcja PCR jest pół-gniazdowa. Jeśli w pierwszej reakcji PCR do amplifikacji wstępnego fragmentu nie stosuje się ani pierwszego, ani drugiego startera, to druga reakcja jest gniazdowa.

W przykładowej dwuetapowej reakcji PCR, fragment genu TCR, zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, można amplifikować przeprowadzając pierwszą reakcję PCR z zastosowaniem pierwszego wstępnego startera, który hybrydyzuje z regionem νβ genu TCR i drugiego wstępnego startera, który hybrydyzuje z regionem Cβ genu TCR, w wyniku czego następuje amplifikacja fragmentu wstępnego, który rozciąga się od Vβ przez połączenie Vβ-Dβ-Jβ do Οβ, po czym przeprowadza się drugą reakcję PCR, która może być gniazdowa lub pół-gniazdowa. W świetle niniejszego wynalazku, specjaliści w tej dziedzinie będą w stanie wybrać odpowiednie startery i warunki dla amplifikacji PCR fragmentu genu TCR z komórek T, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące.

Po amplifikacji fragmentu genu TCR zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, produkt amplifikacji można wykrywać stosując liczne procedury. Na przykład, próbkę produktu amplifikacji można nakładać za żel do elektroforezy, do którego przykłada się pole elektryczne w celu rozdzielenia cząsteczek DNA pod względem wielkości. W innej metodzie, próbkę produktu amplifikacji można nakładać na żel barwiony zielenią SYBR, bromkiem etydyny lub inną cząsteczką, która będzie wiązać DNA i emitować

PL 213 315 B1 wykrywalny sygnał. Wysuszony żel może zawierać wyznakowane oligonukleotydy opisane powyżej, z którego można wykonać autoradiograf przez ekspozycję żelu na błonę fotograficzną.

Przedstawiono też zestaw testowy zawierający przeciwciało opisane w rozwiązaniu. Zestaw testowy można stosować do oznaczania próbki pod kątem obecności TCR, lub jego pochodnej, zawierającego sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących.

Zestaw testowy może również zawierać jedno lub więcej dodatkowych przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem TCR na autoreaktywnych komórkach T. TCR, z którym wiąże się specyficznie jedno lub więcej dodatkowych przeciwciał, może albo zawierać albo nie zawierać sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Ponieważ sekwencja sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, występuje tylko w niektórych TCR, może okazać się korzystne stosowanie przeciwciał, które wiążą się z innymi sekwencjami TCR, a korzystniej innymi sekwencjami CDR.

Zestaw testowy może również zawierać jeden lub więcej odczynników, które można stosować w wykrywaniu TCR, lub ich pochodnych, zawierających sekwencje sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Odczynnikiem może być bufor, kontrola pozytywna, kontrola negatywna lub ich kombinacje. Kontrolą pozytywną może być sekwencja peptydowa lub polipeptydowa zawierająca sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Kontrolą negatywną może być sekwencja peptydowa lub polipeptydowa nie zawierająca sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących.

Zestaw testowy może zawierać pierwszy starter, który jest oligonukleotydem opisanym powyżej. Zestaw testowy może również zawierać pierwszy i drugi starter, które są parą starterów opisanych powyżej.

Zestaw testowy może również zawierać jeden lub więcej odczynników, które można stosować w amplifikacji fragmentu genu TCR, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Odczynnik może być buforem, tri-fosforanami deoksynukleotydowymi, polimerazą DNA stabilną w wysokich temperaturach, kontrolą pozytywną, kontrola negatywną lub ich kombinacjami. Polimerazą DNA stabilną w wysokich temperaturach może być polimeraza Taq. Kontrolą pozytywna może być sekwencja nukleotydową zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące. Kontrolą negatywną może być sekwencja nukleotydową, które nie zawiera sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Zestaw testowy może również zawierać wyznakowany oligonukleotyd jak opisano powyżej. Inne odczynniki, które mogą być zawarte w zestawie testowym są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Pacjenta z chorobą autoimmunologiczną można diagnozować otrzymując próbkę od pacjenta i oznaczając wspomnianą próbkę pod kątem obecności autoreaktywnych komórek T, zawierających TCR obejmujące sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących. Próbka może być wzbogacona pod względem komórek T, autoreaktywnych komórek T lub autoreaktywnych komórek T MBP83-99. Chorobą autoimmunologiczną może być dowolna choroba autoimmunologiczna, w której TCR zawierające sekwencję peptydową sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, znajduje się w komórkach T.

Chorobę autoimmunologiczną można diagnozować przez porównanie poziomu komórek T posiadających TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, z poziomem wspomnianych komórek T w kontrolach. Poziom komórek T można określać przez wykrywanie obecności TCR, zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, w oznaczeniu immunologicznym według powyższego opisu. Poziom komórek T można również określać przez wykrywanie obecności kwasu nukleinowego, kodującego sekwencję zawierającą sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencje od nich pochodzące, z zastosowaniem PCR w sposób opisany w wynalazku.

Chorobę autoimmunologiczną można leczyć u niektórych pacjentów, stosując autoreaktywne komórki T posiadające TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub

6, bądź sekwencji od nich pochodzących, przez podawanie szczepionki zawierającej immunogennie skuteczną ilość peptydu określonego powyżej. Podawanie szczepionki może prowadzić do odpowiedzi immunologicznej, w której u pacjenta mogą powstawać przeciwciała i, która może również indukować

PL 213 315 B1 odpowiedź komórek T, które rozpoznają i wiążą się z TCR zawierającymi sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, co może prowadzić do usunięcia wspomnianych autoreaktywnych komórek T.

Szczepionka może zawierać peptyd sam, lub w kombinacji z immunogennie efektywnymi ilościami innych sekwencji peptydowych TCR, zwłaszcza innych sekwencji CDR. Badania kliniczne wskazują, że pacjenci z chorobą autoimmunologiczną otrzymujący autologiczną szczepionkę komórek mogą wykazywać stopniowe obniżanie odporności wobec reaktywnych wobec MBP komórek T. W niektórych przypadkach, ponownie pojawiające się komórki T mogą pochodzić z innych populacji klonalnych, co sugeruje, że reaktywne wobec MBP komórki T mogą przechodzić przesunięcie klonalne lub rozprzestrzenianie epitopu związane z zachodzącym procesem chorobowym. Przesunięcie klonalne lub rozprzestrzenianie epitopu może stanowić problem w chorobach autoimmunologicznych, w których pośredniczą autoreaktywne komórki T. Szczepionka zawierająca wieloantygenowe peptydy zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec TCR różnych populacji autoreaktywnych komórek T może pozwolić uniknąć problemu związanego z przesunięciem klonalnym lub rozprzestrzenianiem epitopu.

Ponieważ TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, jak również inne sekwencje TCR, szczególnie sekwencje CDR, mogą występować zarówno u pacjentów cierpiących z powodu choroby autoimmunologicznej, jak i normalnych osobników, którzy nie cierpią na tę chorobę, szczepionkę zawierającą peptyd lub kombinację peptydów zdolnych do wywoływania odpowiedzi immunologicznej wobec epitopów TCR, szczególnie CDR, a zwłaszcza CDR3, można podawać zarówno pacjentom z chorobą autoimmunologiczną, jak i normalnym osobnikom. Inne sekwencje peptydowe mogą obejmować motyw LGRAGLTY (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7) oraz sekwencje CDR ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 614 192 (Vandenbark).

Szczepionka może zawierać ponadto peptyd markerowy aktywacji komórek T. Peptydem markerowym aktywacji komórek T może być peptyd markerowy jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 303 314 (Zhang), który włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Szczepionka może również zawierać jeden lub więcej odczynników, które można stosować do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej na immunogen. Odczynnik może być buforem, adiuwantem lub ich kombinacją. Adiuwant może być adiuwantem na bazie chitosanu zgodnie z opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 980 912 (Podolski), którą w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Chorobę autoimmunologiczną można leczyć u niektórych pacjentów, stosując TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, przez podawanie kompozycji zawierające] przeciwciało opisane w wynalazku. Podawanie kompozycji może prowadzić do usunięcia TCR, które zawierają sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących.

Kompozycja może zawierać przeciwciało samo, lub w kombinacji z innymi przeciwciałami, które specyficznie wiążą się z innymi sekwencjami TCR, zwłaszcza innymi sekwencjami CDR. Jak omówiono powyżej, rozwój choroby autoimmunologicznej może obejmować przesunięcie klonalne lub rozprzestrzenianie epitopu autoreaktywnych komórek T. Kompozycja zawierająca wiele przeciwciał, w której każde przeciwciało specyficznie wiąże się z innym epitopem TCR, zwłaszcza CDR, wielu populacji autoreaktywnych komórek T może pozwolić uniknąć problemów związanych z przesunięciem klonalnym lub rozprzestrzenianiem.

Ponieważ TCR zawierające sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, jak również inne sekwencje TCR, szczególnie sekwencje CDR, mogą występować zarówno u pacjentów cierpiących z powodu choroby autoimmunologicznej, jak i normalnych osobników, którzy nie cierpią na tę chorobę, kompozycję zawierającą przeciwciało lub kombinację przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopami na TCR, szczególnie CDR, a zwłaszcza CDR3, można podawać zarówno pacjentom z chorobą autoimmunologiczną, jak i normalnym osobnikom.

Chorobę autoimmunologiczną można monitorować przez wykrywanie obecności genu TCR, zawierającego sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 1, 2 lub 3, bądź sekwencji od nich pochodzących, w próbce pochodzącej od pacjenta z chorobą autoimmunologiczną zgodnie z powyższym opisem, i określanie ilości genu TCR, zawierającego sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 1, 2 lub 3, bądź sekwencji od nich pochodzących.

PL 213 315 B1

Ciężkość objawów choroby autoimmunologicznej może korelować z ilością wykrytego DNA w próbce, co przenosi się na liczbę autoreaktywnych komórek T. Ponadto, wzrost ilości wykrytego DNA w próbce można wykorzystywać jako wskazanie do zastosowania leczenia mającego na celu zminimalizowanie ciężkości objawów i/lub leczenie choroby przed pojawieniem się jej objawów.

Chorobę autoimmunologiczną można monitorować też przez wykrywanie obecności TCR, zawierających sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących, w próbce pochodzącej od pacjenta z chorobą autoimmunologiczną zgodnie z powyższym opisem, i określanie ilości TCR zawierających sekwencję sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 4, 5 lub 6, bądź sekwencji od nich pochodzących.

Ciężkość objawów choroby autoimmunologicznej może korelować z ilością wykrytego peptydu lub polipeptydu w próbce, co przenosi się na liczbę autoreaktywnych komórek T. Ponadto, wzrost ilości wykrytego peptydu lub polipeptydu w próbce można wykorzystywać jako wskazanie do zastosowania leczenia mającego na celu zminimalizowanie ciężkości objawów i/lub leczenie choroby przed pojawieniem się jej objawów.

Kompozycję farmaceutyczną, taką jak szczepionka według niniejszego wynalazku i przeciwciało opisane powyżej można wytwarzać stosując metody dobrze znane w nauce.

Kompozycje farmaceutyczne stosowane jako przedkliniczne i kliniczne środki lecznicze w leczeniu choroby lub zaburzeń mogą być wytwarzane przez specjalistów, stosujących przyjęte zasady diagnozowania i leczenia. Takie zasady są znane w nauce i przedstawiono je, na przykład, w Braunwald i in., red., Harrison's Principles of Internal Medicine, wyd. 11, McGraw-Hill, wydawca, New York,

N. Y. (1987), które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Kompozycję farmaceutyczną można podawać każdemu zwierzęciu, które może doświadczyć korzystnych efektów kompozycji. Zwierzętami otrzymującymi kompozycję farmaceutyczną mogą być ludzie i inne ssaki.

Kompozycję farmaceutyczną można podawać dowolnymi sposobami, które pozwolą na osiągnięcie zamierzonego celu. Na przykład, podawanie może być pozajelitowe, podskórne, dożylne, śródskórne, domięśniowe, dootrzewnowe, przezskórne lub dopoliczkowe. Alternatywnie, lub równolegle podawanie może odbywać się drogą doustną. Kompozycje farmaceutyczne można podawać pozajelitowo przez iniekcję bolusa lub stopniową perfuzję w czasie.

Podawana dawka może zależeć od wieku, płci, zdrowia i wagi biorcy, rodzaju współistniejącego leczenia, jeśli dotyczy, częstości leczenia i charakteru pożądanego efektu. Zakresy dawek dla podawania kompozycji farmaceutycznych mogą być wystarczająco duże do uzyskania pożądanego efektu, dzięki któremu, na przykład, osiąga się odpowiedź immunologiczną wobec peptydu, co się mierzy przez DH lub wytwarzanie przeciwciał, i znacząco zapobiega się, hamuje bądź leczy chorobę autoimmunologiczną. Dawki nie będą tak duże, aby powodować szkodliwe skutki uboczne, takie jak nieoczekiwane reakcje krzyżowe, uogólniona immunosupresja, reakcje anafilaktyczne i podobne. Dawki dla ludzi mogą pozostawać w zakresie pomiędzy około 0,001 - 25 mg/kg wagi ciała.

Kompozycje farmaceutyczne mogą dalej zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, obejmujące zaróbki i substancje pomocnicze, które mogą ułatwiać obróbkę związków aktywnych przy przygotowywaniu preparatów, które można stosować farmaceutycznie. Dodatki do kompozycji farmaceutycznych mogą obejmować inkluzje adiuwanta, takiego jak ałun, chitosan lub inne adiuwanty znane w nauce. (Patrz, na przykład, Warren i in., Ann. Rev. Immunol. 4: 369-388(1986); Chedid, L., Feder. Proc. 45: 2531-2560 (1986), które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy). Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać liposomy dla wzmacniania dostarczania lub aktywności biologicznej, z wykorzystaniem sposobów i związków znanych w nauce.

Kompozycje farmaceutyczne można również podawać doustnie w postaci tabletek i kapsułek. Kompozycje farmaceutyczne mogą być również podawane doodbytniczo w postaci czopków, oraz w postaci roztworów do iniekcji lub wprowadzania doustnego.

Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać od około 0,001 do około 99 procent, lub od około

O, 01 do około 95 procent związku(ków) aktywnego(nych), razem z zarobkami. Odpowiednimi zaróbkami mogą być wypełniacze takie jak sacharydy, na przykład, laktoza lub sacharoza, mannitol lub sorbitol, preparaty celulozy i/lub fosforany wapnia, na przykład fosforan triwapniowy lub wodorofosforan wapnia, jak również czynniki wiążące, takie jak pasta skrobiowa, wykorzystująca, na przykład, skrobię kukurydzianą, skrobię pszeniczną, skrobię ryżową, skrobię ziemniaczaną, żelatyna, tragakant, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetyloceluloza sodowa i/lub poliwinylopirolidon.

PL 213 315 B1

Inne preparaty farmaceutyczne, które można stosować doustnie obejmują kapsułki pasowane wykonane z żelatyny, jak również miękkie, zatapiane kapsułki z żelatyny i plastyfikatora takiego jak glicerol czy sorbitol. Kapsułki pasowane mogą zawierać związki aktywne w postaci granulek, które mogą być zmieszane z wypełniaczami, takimi jak laktoza, czynniki wiążące, takie jak skrobie i/lub środki poślizgowe, takie jak talk lub stearynian magnezu oraz, ewentualnie, stabilizatory. W miękkich kapsułkach, związki aktywne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich płynach, takich jak oleje lub płynna parafina. Ponadto, mogą być dodane stabilizatory.

Preparaty farmaceutyczne, które można stosować doodbytniczo obejmują, na przykład, czopki, które składają się z kombinacji jednego lub więcej związków aktywnych z podłożem do czopków. Odpowiednimi podłożami do czopków mogą być, na przykład, naturalne lub syntetyczne triglicerydy lub węglowodory parafiny. Ponadto, można stosować doodbytnicze kapsułki żelatynowe, które składają się z kombinacji związków aktywnych z podłożem. Możliwe materiały podłóż obejmują, na przykład, płynne triglicerydy, glikole polietylenowe lub węglowodory parafiny.

Postacie odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne roztwory peptydu lub przeciwciała w rozpuszczalne w wodzie postaci, na przykład, soli rozpuszczalnych w wodzie. Ponadto, można podawać zawiesiny peptydu lub przeciwciała jako odpowiednie olejowe zawiesiny do iniekcji. Odpowiednie rozpuszczalniki lub podłoża lipofilowe obejmują oleje, na przykład, olej sezamowy, syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, na przykład, oleinian etylu lub triglicerydy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które podwyższają lepkość zawiesiny, obejmujące, na przykład, karboksymetylocelulozę sodową, sorbitol i/lub dekstran. Zawiesina może również zawierać stabilizatory.

Peptydowi i przeciwciału można nadawać postać stosując konwencjonalne farmaceutycznie dopuszczalne podłoża pozajelitowe do podawania przez iniekcję. Podłoża te mogą być nietoksyczne i lecznicze, liczne preparaty przedstawiono w Remington's Pharmaceutical Sciences, (supra). Nie ograniczającymi przykładami zarobek są woda, sól fizjologiczna, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i zrównoważony roztwór soli Hanka. Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać niewielkie ilości dodatków, takich jak substancje utrzymujące izotoniczność, fizjologiczne pH oraz stabilność.

Peptydowi i przeciwciału można nadawać postać w zasadniczo czystej formie wolnej od agregatów i innych materiałów, w stężeniach obejmujących około 1,0 ng/ml do 100 mg/ml.

Skuteczne dawki peptydu i przeciwciała do stosowania w zapobieganiu, hamowaniu lub leczeniu choroby autoimmunologicznej mogą pozostawać w zakresie około 1 ng do 100 mg/kg wagi ciała. Zakres dawek może również pozostawać między około 10 ng a 10 mg/kg. Zakres dawek może być również w zakresie pomiędzy około 100 ng a 1 mg/kg.

Poniższe przykłady włączono w celu przedstawienia korzystnych rozwiązań wynalazku. Dla specjalistów w tej dziedzinie powinno być zrozumiałe, że techniki ujawnione w przykładach, które reprezentują techniki odkryte przez wynalazców dla dobrego działania w praktyce wynalazku, można uważać za stanowiące korzystne sposoby jego stosowania w praktyce. Jednakże, dla specjalistów w tej dziedzinie, w świetle niniejszego wynalazku, powinno być zrozumiałe, że w szczegółowych, ujawnionych rozwiązaniach można dokonywać wielu zmian i nadal uzyskiwać zbliżone lub podobne wyniki, bez odchodzenia od zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Sekwencja DNA Vβ-Dβ-Jβ receptora komórki T zidentyfikowana u pacjentów z MS

Z Genbanku wyselekcjonowano 20 sekwencji CDR3 reaktywnych wobec MBP komórek T rozpoznających immunodominujący epitop MBP, 83-99. W celu określenia czy którakolwiek z 20 sekwencji ulega powszechnie ekspresji, próbki limfocytów krwi obwodowej od 40 pacjentów z MS i 15 osobników kontrolnych przeszukiwano za pomocą dwuetapowej RT-PCR i starterów opartych na detekcji za pomocą RT-PCR opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 303 314 (Zhang), który w całości włączono do niniejszego opisu.

W skrócie, całkowity RNA wyekstrahowano z komórek T pacjentów z MS i kontrolnych, stosując mini zestaw RNeasy (Qia-gen, Santa Clarita, CA). Pierwszą nić cDNA otrzymaną w wyniku odwrotnej transkrypcji z całkowitego RNA poddawano pierwszej rundzie amplifikacji PCR z wykorzystaniem startera specyficznego dla rodziny Vβ oraz startera Οβ, a następnie drugiej rundzie gniazdowego lub półgniazdowego POR z zastosowaniem startera νβ-ϋβ-ϋβ oraz startera Οβ. Produkty amplifikacji POR rozdzielano elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym i przenoszono na dodatnio naładowaną membranę nylonową (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) stosując blotting próżniowy (Bio-Rad, Hercules, OA) przy 5 mHg w ciągu 90 minut. DNA przytwierdzano do membrany przez 3-minutową ekspozycję na sieciowanie pod wpływem UV i poddawano wstępnej hybrydyzacji w temperaturze 68°C

PL 213 315 B1 w ciągu co najmniej 1 godziny. Dodawano 0,1 mg/ml poli(A) do roztworu do wstępnej hybrydyzacji (5xSSC, 1% roztwór blokujący, 0,1% N-laurylosarkozyna, 0,02% SDS) w ceIu zredukowania niespecyficznego wiązania sondy z DNA innym niż docelowy. Temperaturę hybrydyzacji i warunki przemywania optymalizowano w zależności od różnych specyficznych dla CDR3 sond dla zapewnienia surowych warunków hybrydyzacji. Hybrydyzację przeprowadzano w buforze zawierającym 5xSSC, 1% roztwór blokujący, 0,1% N-lauroilosarkozynę, 0,02% SDS oraz 0,3 pmola/ml wyznakowanej digoksygeniną sondy specyficznej dla sekwencji nukleotydowej kodującej region CDR3.

Wykrywanie produktów hybrydowych DNA przeprowadzano stosując zestaw Digoxigenin Luminescent Detection Kit® zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Membranę eksponowano następnie dla błonę rentgenograficzną w ciągu 15-30 minut w temperaturze pokojowej.

Z 20 testowanych sekwencji, wykryto wysoki procent trzech sekwencji kodujących CDR3 w próbkach pochodzących od pacjentów z MS w przeciwieństwie do próbek kontrolnych. Tablica 1 podaje numer dostępu w Genbank dla genów TCR zawierających każdą z trzech wykrytych sekwencji kodujących CDR3, jak również sekwencję nukleotydową i aminokwasową regionu CDR3 dla każdej sekwencji. Tablica 2 podaje całkowity procent pozytywnych detekcji sekwencji kodujących CDR3 w próbkach pochodzących od pacjentów z MS i kontrolnych próbkach PBL.

T a b l i c a 1

Sekwencje CDR3 specyficzne dla MBP83-99

Numer dostępu w Genbank	Gen V	Sekwencja CDR3
MS2002-DH		BV17	gcc	agt	agt	act	gac	tgg	agc	(SEQ ID NO: 1)
(SEQ ID NO:	7>		A	S	S	T	D	W	s	(SEQ ID NO: 4)
MS2002-18		BV5,2	agc	agc	ttg	agg	ggg	gcg	eta	aac att (SEQ ID NO: 2)
(SEQ ID NO:	8)		s	s	L	R	G	A	L	N I (SEQ ID NO: 5)
MSFRANSI E3		BV9	agc	agc	caa	gat	cgt	ttt	tgg	(SEQ ID NO: 3)
(SEQ ID NO:	9)		A	s	Q	D	R	F	W	SSEQ ID NO: 6)

T a b l i c a 2

Procent pozytywnych detekcji DNA CDR3

Numer dostępu w Genbank	% u pacjentów z MS	% w kontrolach
MS2002-DH	57,5%	33%
MS2002-18	50%	6,7%
MSFRANSI E3	80%	20%

Wyniki w Tablicy 2 są zaskakujące, ponieważ liczne badania nie potwierdzają preferencyjnego wykorzystywania produktów genu Vβ-Dβ-Jβ. Na przykład, motyw LGRAGLTY opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6 303 314 (Zhang) stwierdzano jedynie u pewnych osobników. Raczej, autoreaktywne wobec MBP klony komórek T wykazują zazwyczaj heterogenny wzór wykorzystywania genu Vβ-Dβ-Jβ, który jest stosunkowo ograniczony u poszczególnych osobników. W nauce, generalnie uważa się, że heterogenność wykorzystywania genu Vβ-Dβ-Jβ mogłaby znacząco osłabiać możliwości stosowania szczepionki peptydowej mającej na celu terapeutyczną eliminację patogennych autoreaktywnych komórek T. Opisane w niniejszym opisie wyniki po raz pierwszy wskazują, że szczepionka oparta na jednym lub większej ilości peptydów mogłaby okazać się korzystna w eliminowaniu patogennych autoreaktywnych komórek T.

PL 213 315 B1

P r z y k ł a d 2

Przygotowywanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw receptorowi komórek T reaktywnych wobec MBP

Procedura przygotowywania hybrydowej linii komórkowej, która wytwarza przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw receptorowi komórek T reaktywnych wobec MBP obejmuje fuzję komórek szpiczaka myszy BALB/c z komórkami śledziony myszy BALB/c pobudzonych motywami peptydowymi pochodzącymi z białka receptora specyficznych reaktywnych wobec MBP komórek T.

1. Przygotowywanie komórek śledziony do fuzji

Motywy peptydowe receptorów specyficznych reaktywnych wobec MBP komórek T można izolować z oczyszczonych rekombinowanych receptorów komórek T lub przez syntezę peptydu. Motyw peptydowy oczyszcza się w stopniu wyższym niż 95% czystość i stosuje do immunizacji dorosłych samców myszy BALB/c lub C57B46 przez podskórne podawanie około 30 μg w postaci zemulgowanej w kompletnym adiuwancie Freunda. Myszy immunizowano 2 tygodnie później przez kolejną inokulację motywem peptydowym w niekompletnym adiuwancie Freuda podawanym podskórnie. Po kolejnych 2-6 tygodniach, 20-40 μg motywu peptydowego podawano dożylnie, a 2-4 dni później myszy zabijano i przygotowywano zawiesinę komórek śledziony w sposób podany przez Gefter i in., Somatic Cell Genetics 3: 231, 1977. Krwinki czerwone Iizowano do inkubacji w ciągu 15 minut w temperaturze 40°C w NH4Cl (0,83%). Otrzymaną zawiesinę komórek przemywano przez wirowanie (800xg) z maktywowaną wysoką temperaturą surowicą cielęcą, a następnie w podłożu wolnym od białka (RRMI 1640, zbuforowane 7,5 mM HEPES, pH 7,2).

2. Przygotowywanie komórek szpiczaka do fuzji

Komórki szpiczaka pochodzące z linii P3U1 i pozbawione HPRT (E.C 2.4.2.8) jak opisali Yelton i in., Curr. Top. Microbiol. Immunal. 81: 1-7 (1978), utrzymywano w minimalnym podłożu podstawowym Eagle'a (MEM) zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą i 15% płodową surowicę końska. Wzrost komórek szpiczaka hamowano przez selektywne podłoże hipoksantyna-aminopteryna-tymidyna (HAT).

3. Wytwarzanie hybryd

Wytwarzanie hybryd przeprowadza się przez mieszanie 10⁷ komórek szpiczaka BALB/c z 10⁸komórek śledziony otrzymanych z myszy BALB/c lub C57B1/6 immunizowanych motywem peptydowym. Mieszaninę komórek wiruje się przy 800xg i komórki ponownie się zawiesza do fuzji w 50% roztworze (w/v) glikolu polietylenowego (PEG 1000) rozcieńczonym minimalnym podłożem podstawowym (MEM) bez surowicy, zgodnie z procedurą opisaną przez Gefter i in. (1977). Otrzymane komórki hybrydom klonowano w podłożu hipoksantyna-aminopteryna-tymidyna (HAT) przez rozcieńczenia graniczne jak opisali Galfre i Milstein Meth. Enzymol. 73: 3, 1975. Wyselekcjonowano linie komórek hybrydom, które wytwarzały przeciwciało rozpoznające motyw peptydowy.

4. Testowanie klonów pod względem wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciw receptorowi reaktywnych wobec MBP komórek T

96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania Linbro (Flow Lab) powleczono 50-100 μg motywu peptydowego lub białka receptora komórek T i inkubowano w temperaturze 20°C przez noc. Po trzykrotnym przemywaniu studzienek 0,1 M Tris (pH 7,5)--1% nonidet P-40, zawierającym 5% Carnation Instant Milk oraz 0,085 azydek sodowy, dodawano 0,05 ml supernatantów hodowli i inkubowano w temperaturze 40°C przez noc. Supernatant usuwano po trzykrotnym przemywaniu buforem RIA i przeciwciała wykrywano stosując Hybridoma Screening Kit (Bethesda Research Labs). Włączono kontrole niespecyficznego wiązania przez pominięcie albo drugiego przeciwciała, albo supernatantu hodowlanego.

Wynalazek został teraz w pełni opisany; dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że można dokonać w nim wiele zmian i modyfikacji bez odchodzenia zakresu wynalazku jak przedstawiono poniżej.

Wszystkie kompozycje i/lub sposoby ujawnione w niniejszym opisie można, w świetle niniejszego wynalazku, wykonać i przeprowadzić bez zbędnych doświadczeń. Chociaż opisano korzystne rozwiązania kompozycji i sposobów, dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że można zastosować zmiany dotyczące kompozycji i/lub sposobów oraz etapów bądź sekwencji etapów sposobu opisanego w niniejszym opisie bez odchodzenia od koncepcji i zakresu wynalazku. Bardziej szczegółowo będzie oczywiste, że pewne czynniki, zarówno chemiczne jak i związane z fizjologią można podstawić w miejsce czynników tu opisanych, o ile osiągnie się takie same lub podobne wyniki. Wszystkie takie podobne podstawienia i modyfikacje oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie uważa się

PL 213 315 B1 za pozostające w zakresie i zgodne z koncepcją rozwiązania jak zdefiniowano w dołączonych zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d 3

Identyfikacja efektywnej opartej na peptydzie szczepionki do leczenia pacjentów z MS

Kryteria włączenia do tej próby są następujące: pacjenci z klinicznie stwierdzonym MS od co najmniej dwóch lat, punktacja w podstawowej skali rozwoju inwalidztwa (EDSS) 1,5 do 6,5 dla RR-MS i 4,0 do 8,0 dla pacjentów z wtórnym postępującym MS (SP-MS), oraz co najmniej jedno pogorszenie w ubiegłych dwóch latach przed wejściem do badania dla kohorty łagodniejącego-osłabiającego się MS (RR-MS). Pacjenci nie mogą przyjmować żadnych leków immunosupresyjnych, włącznie ze steroidami, co najmniej trzy miesiące przed wejściem do badania. Steroidy są dozwolone podczas badania, jeśli nastąpi pogorszenie. Objawowe leczenie zmęczenia, spastyczności i dolegliwości ze strony pęcherza nie jest zakazane. Pacjentów testuje się pod względem autoreaktywnych komórek T z TCR, zawierającymi sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5, 6, 10 lub sekwencje CDR ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 614 192 (Vandenbark).

Przygotowuje się szczepionki zawierające immunogennie skuteczną ilość antygenów opartych na peptydach o sekwencji zawierającej sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 4, 5, 6 lub 10, bądź sekwencje od nich pochodzące. W całości przetestowano 15 następujących szczepionek; (i) jeden z czterech antygenów (w całości 4), (ii) kombinacja dwóch z czterech antygenów (w całości 6), (iii) kombinacja trzech z czterech antygenów (w całości 4), oraz (iv) kombinacja czterech antygenów (w całości 1). Każdy pacjent otrzymuje trzy podskórne iniekcje jednej z testowanych szczepionek w odstępach dwumiesięcznych.

Następnie pacjentów obserwowano pod względem czasu rozpoczęcia potwierdzonego rozwoju inwalidztwa, EDSS, szybkości nawrotu i uszkodzeń MRI. Wyniki porównywano z wynikami pacjentów, którzy przeszli leczenie wstępne, oraz pacjentów z RR-MS i SP-MS dwóch ostatnich prób klinicznych przyjmujących placebo, którzy służyli do oceny naturalnego przebiegu MS (Jacobs i in., 1996), European Study Group, 1998). Czas do rozwoju określa się przez wzrost o co najmniej 1,0 w EDSS (Poser i in., 1983) trwający co najmniej 2 miesiące. Pogorszenia w trakcie badania definiuje się przez pojawienie się nowych objawów neurologicznych lub pogorszenie wcześniej występujących objawów neurologicznych przez co najmniej 48 godzin, któremu towarzyszy obiektywna zmiana w badaniu neurologicznym (pogorszenie o co najmniej 0,5 punktu w EDSS). Pacjentów poinstruowano co do donoszeniu o wydarzeniach występującymi pomiędzy regularnymi wizytami, i byli oni badani przez neurologa jeśli objawy sugerowały pogorszenie. Ocena bezpieczeństwa obejmowała szkodliwe skutki uboczne, objawy życiowe i badanie fizykalne przy regularnych wizytach. Różnice pod względem zmiennych klinicznych u badanych pacjentów przed i po szczepieniu opartym na peptydzie analizo-wano stosując test szeregu sum Wilcoxona.

P r z y k ł a d 4

Leczenie pacjentów z MS z zastosowaniem szczepionki opartej na peptydzie

Szczepionki określone w Przykładzie 3, które skutecznie spowalniały rozwój objawów klinicznych MS podawano pacjentom z MS. Pacjenci otrzymujący leczenie szczepionką byli pacjentami cierpiącymi na MS od pewnego czasu i diagnozowanymi na podstawie znanych kryteriów.

Claims

1. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera peptyd mający sekwencję SEQ ID NO: 4 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

2. Zastosowanie peptydu mającego sekwencje SEQ ID NO:4, do wytwarzania szczepionki do leczenia stwardnienia rozsianego.