PL212735B1

PL212735B1 - Sposób wytwarzania fosfonowych analogów pseudopeptydów i ich zastosowanie jako preparatów o aktywności przeciwbakteryjnej

Info

Publication number: PL212735B1
Application number: PL379083A
Authority: PL
Inventors: Józef Oleksyszyn; Marcin Sieńczyk; Maciej Kliszczak; Irena Maliszewska; Ewa Zboińska
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2012-11-30
Also published as: PL379083A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fosfonowych analogów pseudopeptydów w reakcjach wielokomponentowych oraz ich zastosowanie, jako preparatów o aktywności przeciwbakteryjnej. Fosfonowe analogi pseudopeptydów stanowią nową grupę związków, wykazujących wysoką aktywność inhibitorową wobec enzymów proteolitycznych typu chymotrypsynowego i trypsynowego.

Ponadto część związków należących do tej grupy wykazuje właściwości przeciwbakteryjne.

Wiele z otrzymanych dotychczas pochodnych estrów difenylowych kwasów α-aminoalkanofosfonowych wykazuje silne zdolności do hamowania aktywności proteolitycznej enzymów. W literaturze naukowej, np. w Biochemistry, 1996, 35, 3147; J. Med Chem., 1998, 41, 2289; J. Med. Chem., 2004, 47, 2411 opisane są inhibitory kompetycyjne, które praktycznie nieodwracalnie wiążą się z centrum aktywnym enzymu. Znacznie silniejsze właściwości biologiczne wykazują jednak ich peptydowe pochodne. Przykładowo aktywność tripeptydu Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)2 wobec chymotrypsyny jest około 20 razy większa w porównaniu z estrem difenylowym kwasu 1-aminoalkanofosfonowego - CbzPhe^P(OPh)2 opisana w Biochemistry, 1991, 30, 485. Podobnie aktywność inhibitorowa fosfonowego aromatycznego analogu argininy - Cbz-(4-AmPhg)^P(OPh)2 - wobec ludzkiej trombiny wzrasta 140-krotnie w przypadku jego peptydowej pochodnej Boc-Phe-Pro-(4-AmPhg)^P(OPh)2, co zostało opisane w J. Med. Chem., 1994, 37, 226).

Do otrzymywania peptydowych pochodnych estrów difenylowych kwasów α-aminoalkanofosfonowych stosuje się klasyczne metody używane w syntezie peptydów takie jak: metoda mieszanych bezwodników, chlorków kwasowych czy przy użyciu dostępnych handlowo odczynników sprzęgających. Selektywne wprowadzenie podstawnika na amidowy atom azotu jest bardzo trudne i zazwyczaj prowadzi do otrzymania mieszaniny produktów. Opisano w literaturze naukowej w Synthesis, 1984, 3, 219; Chimia, 1983, 8, 299, dwie reakcje wykorzystania izocyjanków będących pochodnymi kwasów α-aminoalkanofosfonowych do otrzymywania ich peptydowych pochodnych. W reakcjach tych wykorzystano jako substrat ester dietylowy kwasu izocyjanometylofosfonowego. Autorzy nie podają jednak metody otrzymywania użytego izocyjanku, co więcej nie przedstawiają żadnych biologicznych właściwości uzyskanych związków. Ponadto estry dietylowe kwasów 1-amino-alkilofosfonowych nie są inhibitorami proteaz serynowych.

Opisana w Angew. Chem. Int. Ed., Engl., 1962, 1, 8; Angew. Chem. Int. Ed., Engl., 2000, 39, 3168 reakcja kondensacji aminy, aldehydu, kwasu karboksylowego i izocyjanku, zwana także reakcją Ugi, pozwala na otrzymywanie w jednym etapie praktycznie nieograniczonej liczby peptydomimetyków. Dysponując 40 różnymi aminami, aldehydami, kwasami karboksylowymi i izocyjankami otrzymać można 40⁴ = 2 560 000 różnych produktów. Z tego względu reakcja ta znalazła ogromne zastosowanie w syntezie nowych pochodnych peptoidowych. Drugą ważną reakcją kondensacji wielokomponentowej wykorzystującej jako jeden z substratów izocyjanek jest reakcja Passerini'ego, w której substratami, oprócz izocyjanku są aldehyd lub keton oraz kwas karboksylowy znana z Gazz. Chim. Ital 1921, 126, 181. Jednakże pomimo ogromnego potencjału reakcji Ugi'ego i Passerini'ego, poza dwoma przedstawionymi powyżej przykładami literaturowymi, nie wykorzystano ich w otrzymywaniu fosfonowych analogów pseudopeptydów zawierających na C końcu fosfonowy analog aminokwasu. Powodem tego może być trudność w otrzymywaniu izocyjanków pochodnych estrów kwasów α-aminoalkanofosfonowych.

Ogromną zaletą peptoidów, w porównaniu z klasycznymi peptydami, jest ich odporność na hydrolizę przez enzymy proteolityczne organizmu. Dzięki temu zwiększa się możliwość zastosowania ich jako potencjalnych leków, które nie ulegają szybkiej inaktywacji przez biochemiczne mechanizmy komórek. Brak jest zarówno w literaturze naukowej i patentowej doniesień dotyczących otrzymywania tego typu związków metodami kondensacji wielokomponentowej typu Ugi.

Sposób wytwarzania fosfonowych analogów pseudopeptydów polega na tym, że ester difenylowy pochodnej kwasu 1-izocyjanometanofosfonowego poddaje się reakcji kondensacji z aminą, aldehydem i kwasem karboksylowym w efekcie otrzymuje się fosfonowy analog pseudopeptydu. Korzystnie stosuje się w reakcji komponent aminowy, karboksylowy albo aldehydowy kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem, wybranym z grupy obejmującej nośniki: Merrifield'a, Wang'a, hydroksymetylowy, aminometylowy, aminopolistyrenowy, benzhydryloaminowy czy 4-metylobenzhydryloaminowy. Zastosowanie komponentów kowalencyjnie związanych ze stałym nośnikiem znacznie usprawnia prowadzenie reakcji i ułatwia izolację produktów końcowych.

Zgodnie z wynalazkiem, jako komponent karboksylowy stosuje się biotyny i/lub jej peptydowe pochodne.

PL 212 735 B1

Sposobem według wynalazku wytwarza się związki przedstawione wzorem ogólnym 1, w którym R1, R2, R3, R4, R5 i R6 oznaczają wodór albo podstawnik analogiczny do naturalnych aminokwasów, grupę karbobenzoksylową, tertbutyloksylową, acylową, benzhydrylową, trytylową, benzylową, rodnik alkilowy o C1 do C20 podstawiony przez jeden lub więcej hydroksyl, tiol, acyl, karboksyl, karboksyloester, amino, guanidyno, alkoksy, tioalkoksy, karbamoilo, tiokarbamoilo, aminokarbonyl, reszty cukrowe, polihydroksyalkil, aminodialkil, halogen, aromatyczny pierścień, podstawiony mono, di i tri aromatyczny pierś cień , heterocykliczny pierś cień , róż nie podstawiony pier ś cień heterocykliczny.

Zgodnie z wynalazkiem rodnik alkilowy oznacza podstawnik mający od 1 do 20 atomów węgla o ł a ń cuchu prostym lub rozgałęzionym, szczególnie metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, t-butyl, secbutyl, heksyl, 2-etyloheksyl, oktyl, dodecyl, haksdecyl i oktedecyl. Podstawnik acylowy określa podstawnik mający od 1 do 20 atomów węgla o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, kończącym się grupą CO. Grupa alkoksy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 20 atomów węgla o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym. Reszty cukrowe odnoszą się do podstawnika, który jest pochodną glukozy, galaktozy albo mannozy albo kwasu glikuronowego. Podstawnik hydroksylowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla, szczególnie grup hydroksymetylowej, 2-hydroksyetylowej, 2-hydroksypropylowej, 3-hydroksypropylowej, 4-hydroksybutylowej, 5-hydroksypentylowej albo 6-hydroksyheksylowej.

Alkil z więcej niż jedną grupą hydroksylową oznacza podstawnik mający od 3 do 6 atomów węgla i od 2 do 5 grup hydroksylowych, szczególnie grupę 2,3-dihydroksypropylową, 2,3,4-trihydroksypropylową, 2,3,4,5-tetrahydroksypentylową albo pentaetrolową. Podstawnik aminowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla, szczególnie grup aminometylowej, 2-aminoetylowej, 3-aminopropylowej, 4-aminobutylowej, 5-aminopentylowej albo 6-aminoheksylowej. Podstawnik guanidynowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla a w szczególności do guanidynometylowej, 2-guanidynoetylowej, 3-guanidynopropylowej, 4-guamdynobutylowej, 5-guanidynopentyIowej, 6-guanidynoheksylowej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania do wytwarzania leków hamujących aktywność enzymów proteolitycznych, związków przedstawionych wzorem ogólnym 1, w którym R1, R2, R3, R4, R5 i R6 mają wyżej podane znaczenie, do wytwarzania leków przeciwbakteryjnych, jako czynników hamujących aktywność enzymów proteolitycznych, takich jak proteazy serynowe typu trypsynowego i chymotrypsynowego.

Nowe fosfonowe analogi peptydów ze względu na wysoką aktywność przeciwbakteryjną, mają zastosowanie jako czynniki przeciwbakteryjne, nadające się do aplikowania samodzielnie i z innymi składnikami w lekach przeciwbakteryjnych.

W literaturze naukowej np. w J. Mol. Recogn., 2005, 18, 295 opisane jest zastosowanie łańcuchów polipeptydowych, w których strukturę wbudowano ester difenylowy kwasu 1-amino-[(4-amidyno)fenylo]metanofosfonowego. Zaletą tego typu związków jest zapobieganie interakcji białko-białko, co ma fundamentalne znaczenie np. podczas infekcji wirusem HIV. Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie ogromnej liczby tego typu pochodnych, które mogą zostać użyte do zablokowania istotnych w rozwoju wielu chorób oddziaływań międzybiałkowych.

Zaletą wynalazku jest możliwość łatwego otrzymania praktycznie nieograniczonej liczby nowych, biologicznie aktywnych pochodnych w celu stworzenia bibliotek związków o określonej specyficzności inhibitorowej oraz preparatów przeciwbakteryjnych.

Zasadnicze korzyści wynikające z wynalazku polegają na wytwarzaniu z wysoką, w porównaniu z innymi metodami, wydajnością nowych związków o silnej aktywności biologicznej, a także aktywności przeciwbakteryjnej. Ze względu na nieograniczone możliwości sposobu, według wynalazku, a także różnice w specyficzności działania różnych proteaz, możliwe jest otrzymanie selektywnych i silnych inhibitorów, które mogą znaleźć zastosowanie jako potencjalne terapeutyki czy też chemoterapeutyki przeciwbakteryjne. Zastosowanie jako komponentu karboksylowego biotyny i/lub jej peptydowych pochodnych pozwala uzyskać szereg nowych pochodnych o właściwościach inhibitorowych, które służyć mogą do badania lokalizacji komórkowej i funkcji wielu enzymów proteolitycznych, co jest szczególnie przydatne w przypadku określania właściwości nowych enzymów.

Sposób według wynalazku przedstawiony jest na schemacie 1 oraz w przykładzie otrzymywania Cbz-Ala-(N-n-butyl)-Val-Leu^P(OPh)2 o wzorze 2, w przykładzie wytwarzania Cbz-Ala-(N-n-butyl)-ValPhe^P(OPh)2 o wzorze 3 oraz w przykładzie wytwarzania Cbz-Gly-(N-n-propyl)-Val-(4-N-Phth) Lys^P(OPh)2 o wzorze 4, które w żadnej mierze nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d I

Sposób otrzymywania estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonyloalanylo-(N-n-butylo)Do kolby okrągłodennej odważa się 1,79 g (0,008 mola) N-Cbz-alaniny i zalewa 50 cm³ dichlorometanu. Następnie dodaje się 0,59 g (0,008 mola) n-butyloaminy oraz 0,55 g (0,008 mola) aldehydu izomasłowego.

PL 212 735 B1

Po rozpuszczeniu wszystkich reagentów całość miesza się i dodaje 2,64 g (0,008 mola) estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(2-metylo) propylo]metanofosfonowego rozpuszczonego w 10 cm³ dichlorometanu. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej do zaniku substratu estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(2-metylo) propylo]metanofosfonowego, a jej przebieg monitoruje się przy zastosowaniu chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej a pozostały olej rozpuszcza się w 100 cm³ octanu etylu, przenosi do rozdzielacza i przemywa kolejno: 50 cm³ 5% wodnym roztworem NaHCO3, 50 cm³ 5% wodnym roztworem kwasu cytrynowego oraz 50 cm³ solanki. Warstwę organiczną suszy się bezwodnym siarczanem sodu.

Po odsączeniu środka suszącego rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem a nastę pnie przeprowadza chromatografię kolumnową w celu oczyszczenia produktu stosują c jako wypełnienie kolumny SilicaGel 60, a jako eluentu mieszaninę chloroformu i octanu etylu w stosunku objętościowym 4 do 1. Po usunięciu rozpuszczalników z frakcji zawierających oczekiwany produkt otrzymuje się 2,10 g (48%-wagowo) N-Cbz-Ala-(N-n-butyl)-Val-Leu^P(OPh)2 w postaci klarownego, bezbarwnego oleju. Rf=0,32 (chloroform-octan etylu w stosunku objętościowym 4-1). Wzór sumaryczny C37H50N3O7P. Masa cząsteczkowa 679,79 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 19,69 (26%), 19,79 (20%), 20,07 (26%), 20,45 (28%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm], J [Hz]): 0,71-0,87 (m, 15H), 1,05-1,15 (m, 2H), 1,17-1,27 (m, 4H), 1,49-1,62 (3H), 1,68-1,81 (m, 2H), 2,43 (s, 1H), 3,12-3,27 (m, 2H), 4,14-4,30 (m, 1H), 4,46-4,61 (m, 1H), 4,77-4,97 (m, 1H), 5,00-5,15 (m, 2H), 5,77 (s, 1H), 6,95-7,23 (m, 15H, aromat.). Widmo MS (ESI): 702,5 (M+Na⁺), 719,4 (M+K⁺).

P r z y k ł a d Il

Sposób otrzymywania estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonyloalanylo-(N-n-butylo)walilo-amino[(fenylo)metylo]metanofosfonowego o wzorze 3 (Cbz-Ala-(N-n-butyl)-Val-Phe^P(OPh)2).

Do kolby okrągłodennej odważa się 1,79 g (0,008 mola) N-Cbz-alaniny i zalewa 50 cm³ dichlorometanu. Następnie dodaje się 0,59 g (0,008 mola) n-butyloaminy oraz 0,55 g (0,008 mola) aldehydu izomasłowego. Po rozpuszczeniu wszystkich reagentów całość miesza się i dodaje 2,91 g (0,008 mola) estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(fenylo)metylo]metanofosfonowego rozpuszczonego w 10 cm³ dichlorometanu. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej do zaniku substratu w postaci estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(fenylo)metylo]metanofosfonowego, a jej przebieg monitoruje się przy zastosowaniu chromatografu cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej a pozostały olej rozpuszcza się w 100 cm³ octanu etylu, przenosi do rozdzielacza i przemywa kolejno: 50 cm³ 5% wodnym roztworem NaHCO3, 50 cm³ 5% wodnym roztworem kwasu cytrynowego oraz 50 cm³ solanki. Warstwę organiczną suszy się bezwodnym siarczanem sodu. Po odsączeniu środka suszącego rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem a następnie przeprowadza chromatografię kolumnową w celu oczyszczenia produktu stosując jako wypełnienie kolumny SilicaGel 60, a jako eluentu mieszaninę chloroformu i octanu etylu w stosunkach objętościowych w zakresie od 9:1 do 1:1. Po usunięciu rozpuszczalników z frakcji zawierających oczekiwany produkt otrzymuje się 3,65 g (64%-wagowo) N-Cbz-Ala-(N-n-butyl)-Val-Phe^P(OPh)2 w postaci klarownego, lekko żółtego oleju. Rf=0,67 (chloroform: octan etylu w stosunku objętościowym 4:1). Wzór sumaryczny C40H48N3O7P. Masa cząsteczkowa 713,81 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,50 i 18,54 (12 x s, 45%, dwa nakładające się sygnały), 18,75 (25%), 18,88 (30%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm], J [Hz]): 0,76-0,84 (m, 9H), 1,02-1,22 (m, 4H), 1,26-1,38 (m, 3H), 1,71-1,82 (m, 1H), 2,06 (s, 1H), 2,95-3,20 (m, 2H), 3,43-3,53 (m, 2H), 4,53-4,57 (m, 1H), 4,86- 5,23 (2 x m, 3H, dwa nakładające się sygnały), 5,57-5,72 (m, 1H), 7,097,33 (m, 20H, aromat.). Widmo MS (ESI): 712,9 (M⁺), 751,0 (M+K⁺).

P r z y k ł a d III

Sposób otrzymywania estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonyloglicylo-(N-n-propylo)-waliloamino[(4-N-ftalilo)butylo]metanofosfonowego o wzorze 4 (Cbz-Gly-(N-n-propyl)-Val-(4-N-Phth)Lys^P(OPh)2).

Do kolby okrągłodennej odważa się 1,05 g (0,005 mola) N-Cbz-glicyny i zalewa 40 cm³ dichlorometanu. Następnie dodaje się 0,30 g (0,005 mola) n-propyloaminy oraz 0,37 g (0,005 mola) aldehydu izomasłowego. Po rozpuszczeniu wszystkich reagentów całość miesza się i dodaje 2,37 g (0,005 mola) estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(4-N-ftalilo)butylo]metanofosfonowego rozpuszczonego w 10 cm³ dichlorometanu. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej do zaniku substratu w postaci estru difenylowego kwasu 1-izocyjano-[(fenylo)metylo]metanofosfonowego, a jej przebieg monitoruje się przy zastosowaniu chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej a pozostały olej rozpuszcza się w 80 cm³octanu etylu, przenosi do rozdzielacza i przemywa kolejno: 30 cm³ 5% wodnym roztworem NaHCO3, 30 cm³ 5% wodnym roztworem kwasu cytrynowego oraz 30 cm³ solanki. Warstwę organiczną suszy

PL 212 735 B1 się bezwodnym siarczanem sodu. Po odsączeniu środka suszącego rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem a następnie przeprowadza chromatografię kolumnową w celu oczyszczenia produktu stosując jako wypełnienie kolumny SilicaGel 60, a jako eluentu mieszaninę chloroformu i octanu etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po usunięciu rozpuszczalników z frakcji zawierających oczekiwany produkt otrzymuje się 2,12 g (49%-wagowo) N-Cbz-Gly-(N-n-propyl)-Val-(4-N-Phth)Lys^P(OPh)2 w postaci klarownego, bezbarwnego oleju. Rf=0,34 (chloroform: octan etylu w stosunku objętościowym 4:1). Wzór sumaryczny C43H49N4O9P. Masa cząsteczkowa 796,85 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3. δ [ppm]): 19,02 (53%), 19,11 (47%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm], J [Hz]): 0,63-0,84 (m, 9H), 1,32-1,65 (m, 6H), 1,78-2,02 (m, 2H), 2,39-2,51 (m, 1H), 3,04-3,20 (m, 2H), 3,56-3,61 (m, 2H), 3,76-4,03 (2 x m, 3H, dwa nakładające się sygnały), 4,60-4,72 (m, 1H), 5,02 (m, 2H), 5,76 (s, 1H), 5,84 (s. 1H), 6,95-7,25 (m, 15H, aromat.), 7,56-7,60 (m, 2H, aromat.), 7,69-7,73 (m, 2H, aromat.). Widmo MS (ESI): 797,8 (M⁺), 821,1 (M+Na⁺), 836,8 (M+K⁺).

Zdolność związków według wynalazku do hamowania aktywności katalitycznej proteaz serynowych przebadano używając dostępnych handlowo enzymów: trypsyna z trzustki wołowej (SigmaAldrich) i α-chymotrypsyna z wołowej trzustki (Sigma-Aldrich) przy użyciu chromogenicznych substratów: W-a-benzoilo-L-Arg-4-nitroanilid*HCl (trypsyna), W-bursztynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-4-nitroanilid (α-chymotrypsyna). Do pomiarów hamowania aktywności enzymatycznej wykorzystano spektrofotometr Biochorom 4060. Wartości uzyskanych stałych inhibicji przedstawiono w tabelach 1 i 2. W celu obliczenia wartości inhibicji zastosowano przybliżenie reakcji pierwszego rzędu dla reakcji inaktywacji enzymu. Wyniki przedstawiają wartości IC50, tj. takie stężenie dodanego inhibitora, przy którym następuje zahamowanie połowy aktywności enzymu.

Pomiar stałych inhibicji wobec α-chymotrypsyny. Do kwarcowej kuwety pomiarowej odmierzono 2 cm³ buforu (0,1 M HEPES, 0,5 M NaCl, 9% DMSO, pH 7,5). Następnie dodano 50 μl roztworu enzymu o stężeniu wyjściowym 0,3225 μΜ oraz 50 μl badanego związku w zakresie stężeń wyjściowych od 1 mM do 0,001 μΜ. Całość inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C. Następnie do tak przygotowanych roztworów dodawano po 50 μl chromogenicznego substratu (o stężeniu wyjściowym 2 mM). Pomiar prowadzono przez 10 minut.

₃

Pomiar stałych inhibicji wobec trypsyny. Do kwarcowej kuwety pomiarowej odmierzono 2 cm³buforu (0,1 M HEPES, 0,01 M CaCl₂, pH 7,5). Następnie dodano 50 μl roztworu enzymu o stężeniu wyjściowym 6,45 μΜ oraz 50 μl badanego związku w zakresie stężeń wyjściowych od 1 mM do 0,001 μΜ. Całość inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C. Następnie do tak przygotowanych roztworów dodawano po 50 μl chromogenicznego substratu (o stężeniu wyjściowym 4,3 mM). Pomiar prowadzono przez 10 minut.

T a b e l a 1.

Aktywność inhibitorowa otrzymanych związków wobec α-chymotrypsyny.

Wzór badanego związku	IC₅0 [μΜ]
α-chymotrypsyna
Cbz-Ala-(W-t-butyl)-Val-Phe^P (OPh)2	0,281
Cbz-Ala-(W-n-butyl)-Val-Phe^P (OPh)2	66
Cbz-Ala-(W-n-propyl)-Val-Leu^P (OPh)2	23
Cbz-Ala-(W-n-butyl)-Val-Leu^P (OPh)2	>1000
Cbz-Ala-(W-n-benzyl)-Val-Leu^P (OPh)2	brak inhibicji
Cbz-Gly-(W-n-butyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)2	26,6
Cbz-Gly-(W-n-propyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)₂	brak inhibicji
Cbz-Phe-(W-n-propyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)₂	>1000
Cbz-Phe-(W-t-butyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)2	brak inhibicji
Cbz-Phe-(W-(2-fenylo)etyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)2	>1000
Cbz-Phe-(W-n-propyl)-(4-fenylo)Phg-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)2	18,6

PL 212 735 B1

T a b e l a 2

Aktywność inhibitorowa otrzymanych związków wobec trypsyny.

Wzór badanego związku	IC₅o [μΜ]
trypsyna
Cbz-Phe-(W-n-propyl)-Val-Lys^P (OPh)₂	>1000
Cbz-Gly-(W-t-propyl)-Val-Lys^p(OPh)2*HCl	brak inhibicji
Cbz-Gly-(W-t-butyl)-Val-Lys^P (OPh)2	>1000
Cbz-Phe-(W-(2-fenylo)etyl)-Val-(4-W-ftalimid)Lys^P (OPh)2	30

Zdolność związków według wynalazku do zahamowania wzrostu bakterii określono metodą szeregu rozcieńczeń na podłożu stałym (Trypcase soy agar, bioMerieux, Francja). W tym celu przygotowano szereg etanolowych rozcieńczeń badanych związków i dodawano je do sterylnego, ciepłego podłoża w taki sposób, aby ich końcowe stężenie wynosiło od 320 μg/ml do 0,5 μg/ml. Następnie podłoże wylewano na szalki Petriego i po zastygnięciu posiewano na nim po 10 μΙ płynnych, całonocnych hodowli testowanych mikroorganizmów (10⁸ cfu). Do badań wybrano bakterie gram dodatnie reprezentowane przez Staphylococcus aureus PCM 1944, Micrococcus luteus (izolowany ze środowiska naturalnego), Bacillus subtilis PCM 1949 oraz gram ujemne pałeczki Escherichia coli PCM 2057 i Serratia marcescens PCM 549, Płytki inkubowano przez 24-48 godzin w temperaturze 28°C lub 37°C.

Wpływ badanych związków na rozwój testowanych bakterii określono za pomocą wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration μg/ml]), czyli wartości najniższego stężenia badanego związku, w obecności którego wzrost bakterii na podłożu stałym został zahamowany. Wartości MIC dla poszczególnych związków zostały zebrane w Tabeli 3.

T a b e l a 3

Wartości MIC dla poszczególnych związków

Wzór badanego związku	MIC [pg/ml]
E.coli	S. marcescens	S. aureus	M. luteus	B. subtilis
W-formyl-(4-Phth)Lys^P(OPh)2	160	160	160	160	>320
W-formyl-Phe^P(OPh)2	160	160	160	160	>320
C=W-Phe^P(OPh)2	160	160	80	160	>320
C=W-Ala^POPh)2	320	320	5	2,5	320
Cbz-Ala-W-n-butyl)-Val-Leu^P(OPh)2	>320*	>320	>320	>320	>320
Cbz-Ala-(W-n-propyl)-Val-Leu^P(OPh)2	>320	>320	>320	>320	>320
Cbz-Ala-(W-t-butyl)-Val-Phe^P(OPh)2	80	320	>320	>320	>320
Cbz-Ala-(W-n-butyI)-Val-Phe^P(OPh)2	>320	>320	80	160	>320
Cbz-Phe-(W-n-propyl)-(4-fenylo)Phg- -(4-W-ftalimid)Lys^P(OPh)2	100	100	>320	>320	>320

>320 - nie zaobserwowano hamowania wzrostu bakterii do stężenia związku 320 pg/ml

Claims

1. Sposób wytwarzania fosfonowych analogów pseudopeptydów, znamienny tym, że ester difenylowy pochodnej kwasu 1-izocyjanometanofosfonowego poddaje się reakcji kondensacji z aminą, aldehydem i kwasem karboksylowym, w efekcie otrzymuje się fosfonowe analogi pseudopeptydów przedstawione wzorem ogólnym 1, w którym R1, R2, R3, R4, R5 i R6 oznaczają wodór albo podstawnik analogiczny do naturalnych aminokwasów, grupę karbobenzoksylową, tertbutyloksylową, acylową, benzhydrylową, trytylową, benzylową, rodnik alkilowy o C1 do C20 podstawiony przez jeden lub więcej hydroksyl, tiol, acyl, karboksyl, karboksyloester, amino, guanidyno, alkoksy, tioalkoksy, karbamoilo, tiokarbamoilo, aminokarbonyl, reszty cukrowe, polihydroksyalkil, aminodialkil, halogen, aromatyczny

PL 212 735 B1 pierścień, podstawiony mono, di i tri aromatyczny pierścień, heterocykliczny pierścień, różnie podstawiony pierścień heterocykliczny.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w reakcji kondensacji stosuje się komponent aminowy, karboksylowy albo aldehydowy kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem, wybranym z grupy obejmują cej noś niki. Merrifield'a, Wang'a, hydroksymetylowy, aminometylowy, aminopolistyrenowy, benzhydryloaminowy czy 4-metylobenzhydryloaminowy.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w reakcji kondensacji jako komponent karboksylowy stosuje się biotyny i/lub jej peptydowe pochodne.

4. Zastosowanie związków przedstawionych wzorem ogólnym 1, w którym R1, R2, R3, R4, R5 i R6 oznaczają wodór albo podstawnik analogiczny do naturalnych aminokwasów, grupę karbobenzoksylową, tertbutyloksylową, acylową, benzhydrylową, trytylową, benzylową, rodnik alkilowy o C1 do C20 podstawiony przez jeden lub więcej hydroksyl, tiol, acyl, karboksyl, karboksyloester, amino, guanidyno, alkoksy, tioalkoksy, karbamoilo, tiokarbamoilo, aminokarbonyl, reszty cukrowe, polihydroksyalkil, aminodialkil, halogen, aromatyczny pierścień, podstawiony mono, di i tri aromatyczny pierścień, heterocykliczny pierścień, różnie podstawiony pierścień heterocykliczny, przy czym rodnik alkilowy oznacza podstawnik mający od 1 do 20 atomów węgla o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, szczególnie metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, t-butyl, sec-butyl, heksyl, 2-etyloheksyl, oktyl, dodecyl, haksdecyl i oktadecyl, a podstawnik acylowy określa podstawnik mający od 1 do 20 atomów węgla o prostym lub rozgałęzionym ł a ńcuchu, koń czą cym się grupą CO, zaś grupa alkoksy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 20 atomów węgla o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, reszty cukrowe odnoszą się do podstawnika, który jest pochodną glukozy, galaktozy albo mannozy albo kwasu glikuronowego, podstawnik hydroksylowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla, szczególnie grup hydroksymetylowej, 2-hydroksyetylowej, 2-hydroksypropylowej, 3-hydroksypropylowej, 4-hydroksybutylowej, 5-hydroksypentylowej albo 6-hydroksyheksylowej, ponadto alkil z więcej niż jedną grupą hydroksylową oznacza podstawnik mający od 3 do 6 atomów węgla i od 2 do 5 grup hydroksylowych, szczególnie grupę 2,3-dihydroksypropylow ą , 2,3,4-trihydroksypropylową , 2,3,4,5-tetrahydroksypentylową albo pentaetrolową, a podstawnik aminowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla, szczególnie grup aminometylowej, 2-aminoetylowej, 3-aminopropylowej, 4-aminobutylowej, 5-aminopentylowej albo 6-aminoheksylowej, podstawnik guanidynowy odnosi się do podstawnika mającego od 1 do 6 atomów węgla a w szczególności do guanidynometylowej, 2-guanidynoetylowej, 3-guanidynopropylowej, 4-guanidynobutylowej, 5-guanidynopentylowej, 6-guanidynoheksylowej, do wytwarzania leków przeciwbakteryjnych.