PL207994B1 - Polipeptyd, skierowane przeciw niemu przeciwciało i ich zastosowanie w medycynie oraz kodujące go poli- lub oligonukleotydy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydu w postaci wyizolowanej należącego do podrodziny ludzkiej nadrodziny immunoglobulin, poli- lub oligonukleotydów o sekwencji nukleotydowej, która koduje kompletny polipeptyd albo jego część, polipeptydu w postaci rozpuszczalnej zawierającego domeny zewnątrzkomórkowe VH i C2 oraz skierowanych przeciw polipeptydowi przeciwciał o zastosowaniu w medycynie, w szczególności w leczeniu rozmaitych chorób.

Na przestrzeni rozwoju zarodkowego i wczesnego postnatalnego, komórki śródbłonkowe namnażają się i różnicują tworząc nowe naczynia krwionośne poprzez ich rozwój de novo. W organizmach dorosłych, śródbłonek stanowi barierę krew-tkanka i składa się z nieprzechodzących cyklu komórek spoczynkowych. Te spolaryzowane komórki są połączone ze sobą wzajemnie po przez ścisłe połączenia i przyleganie z wytworzeniem ciągłej warstwy komórkowej. Funkcje warstwy śródbłonkowej obejmują utrzymanie homeostazy tkankowej, fibrynolizę, koagulację, zapewnienie napięcia naczyń i transmigrację leukocytów. Wszystkie te właściwości są kontrolowane przez precyzyjne dostrojenie ekspresji i funkcji cząsteczek adhezyjnych.

Sytuacje patologiczne, takie jak stan zapalny, wzrost nowotworu, zranienie lub naczyniotworzenie prowadzą do przejściowej zmiany liczby i funkcji cząsteczek adhezyjnych na śródbłonku naczyniowym a to z kolei prowadzi do zmienionej homeostazy naczyń. Przykładowo, nowotwory zwiększają lokalne stężenie czynników powodujących naczyniotworzenie, które indukują zmianę od nieprzechodzących cyklu komórkowego spoczynkowych komórek śródbłonkowych do namnażającego się śródbłonka. Do czynników indukujących zmiany naczyniotwórcze należą miedzy innymi IL-8, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), rozpuszczalny VCAM-1, czynnik wzrostu podstawowych fibroblastów (bFGF) oraz czynnik martwicy nowotworów (TNF). W rezultacie, komórki ś ródbł onkowe istnieją cych naczyń rozkł adają substancję zewną trzkomórkową (ECM) i dokonują inwazji otaczających tkanek, co prowadzi do unaczynienia nowotworów.

W czasie zmiany naczyniotwórczej modyfikowany jest wzór ekspresji genu ś ródbłonkowego.

Przykładowo, leczenie komórek śródbłonkowych przy użyciu bFGF albo TNFa prowadzi do czterokrotnego wzrostu ekspresji integryny a_ve₃, cząsteczki adhezyjnej, dla której postuluje się udział w migracji komórek śródbłonkowych. Ponadto, zmiana związana z rozwojem naczyń modyfikuje odpowiedź zapalną śródbłonka, prowadząc do nieprawidłowej migracji leukocytów w kierunku nowotworu. Normalnie, wynaczynienie leukocytów z krwi następuje poprzez przyleganie i migrację przez śródbłonek. Mechanizmy te mają miejsce w wieloetapowym procesie, w którym uczestniczą selektyny, integryny i immunoglobulinowa nadrodzina cząsteczek adhezyjnych.

Wykazano, że w śródbłonku związanym z nowotworem poziom VCAM, ICAM i selektyny ulega obniżeniu. Obniżenie poziomu tych cząsteczek adhezyjnych może obrazować mechanizm, za pośrednictwem którego te nowotwory unikają inwazji komórek cytotoksycznych układu immunologicznego.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych białek adhezyjnych z nadrodziny immunoglobulin (Ig Sf), które są regulowane transkrypcyjnie w śródbłonku pod wpływem nowotworu.

Ponadto, celem wynalazku jest oznaczenie cząsteczek pochodzących z nowych białek adhezyjnych użytecznych do stosowania w leczeniu rozmaitych wskazań, takich jak na przykład nowotwory albo zapalenie.

W badaniach, które doprowadziły twórców niniejszego wynalazku do uzyskania pożądanych rozwiązań zastosowano doświadczalny model mysi do identyfikacji transkryptów regulowanych w czasie jednoczesnej hodowli linii komórek śródbłonkowych z komórkami czerniaka. Dla ograniczenia strategii poszukiwań do cząsteczek adhezyjnych z IG Sf, opracowano nowe podejście obrazowania RNA nazywane ukierunkowanym obrazowaniem różnicowym, ang. „Targeted Differential Display. Nowość zmodyfikowanej techniki obrazowania polega na zastosowaniu tylko jednego zastawu zdegenerowanych starterów. Jak będzie pokazane w przykładach niespodziewanie stwierdzono, że prowadzi to do uzyskania wystarczającej specyficzności.

Bardziej konkretnie, do przeprowadzenia ukierunkowanego różnicowego obrazowania w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR)(Samaridis and Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27, 660-665) wykorzystano częściowo zdegenerowane startery (w tym przypadku poziom zdegenerowania wynosi pomiędzy 2048 i 4096 różnych postaci starterów w obrębie zestawu), zaprojek towane do nakierowywania do konserwowanych sekwencji znajdujących się w domenach C2 przedstawicieli Ig Sf.

PL 207 994 B1

W oparciu o przeprowadzone badania, niniejszy wynalazek ujawnia sposób specyficznej identyfikacji różnicowo wyrażanych sekwencji DNA, obejmujący zastosowanie różnicowego obrazowania poprzez PCR z odwrotną transkrypcją (ang. Differential Display Reverse Transcription PCR), w której stosuje się jeden zestaw częściowo albo całkowicie zdegenerowanych starterów specyficznych wobec genu docelowego. Jednym z głównych ograniczeń konwencjonalnej strategii obrazowania RNA jest brak dostatecznej specyficzności metody. Dla zwiększenia tej specyficzności, wynalazcy w swoich poszukiwaniach innych cząsteczek adhezyjnych użyli zdegenerowanych starterów, których celem są sekwencje kodujące cząsteczki z domenami C2. Uzyskano to poprzez dopasowanie domen C2 kilku cząsteczek adhezyjnych Ig Sf, identyfikację liniowej sekwencji aminokwasowej najwyższej zgodności, otaczającej resztę cysteinową uczestniczącą w strukturze domeny C2: Y-(RQYS)-C-x-A-S-N-x2-G. Bardziej ogólnie, podejście to można również zastosować w poszukiwaniach innych sekwencji, w których odwrotną translację jednej albo większej liczby najczęściej występujących sekwencji najwyższej zgodności wykorzystuje się do zaprojektowania zdegenerowanych starterów używanych w metodzie róż nicowego obrazowania.

Sposób ten umożliwił identyfikację transkryptu, którego poziom obniża się w komórkach śródbłonkowych w wyniku konfluencji w obecności komórek czerniaka albo komórek rakowych. cDNA kodował nową cząsteczkę należąca do Ig SF z niezwykłymi właściwościami strukturalnymi, nazwaną CRAM-1 czyli „cząsteczka adhezyjna regulowana przez konfluencję (ang. „Confluency Regulated Adhesion Molecule). Niedawno zaprezentowany opis cząsteczki strukturalnie spokrewnionej, JAM-1, dla której postuluje się udział w transmigracji leukocytów, sugerował istnienie nowej rodziny cząsteczek adhezyjnych, w której JAM-1 i CRAM-1 stanowiły prototypy. Porównanie sekwencji z bazami danych EST umożliwiło ponadto sklonowanie CRAM-2, trzeciego przedstawiciela tej rodziny molekularnej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest polipeptyd w postaci wyizolowanej należący do podrodziny ludzkiej nadrodziny immunoglobulin, wybrany spośród:

a. polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową mysich cząsteczek adhezyjnych regulowanych przez konfluencję 1 (CRAM-1) jak przedstawiono na Fig. 3 (pogrubiona czcionka)

b. polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową ludzkiej CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6B.

Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku są poli- lub oligonukleotydy o sekwencji nukleotydowej, która koduje kompletny polipeptyd albo jego część, który to polipeptyd jest wybrany spośród:

a. polipeptydu zawierającego sekwencje aminokwasową mysich cząsteczek adhezyjnych regulowanych przez konfluencję 1 (CRAM-1) jak przedstawiono pogrubioną czcionką na Fig. 3.

b. polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową ludzkiej CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6B, korzystnie o sekwencji nukleotydowej identycznej z sekwencją nukleotydową ludzkiego CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6A, korzystniej będący RNA albo DNA a najkorzystniej będący starterem, sondą albo antysensownym RNA.

Niniejszy wynalazek dotyczy również polipeptydu w postaci rozpuszczalnej zawierający domeny zewnątrzkomórkowe VH i C2 polipeptydu według wynalazku jak przedstawiono na Fig. 8B do zastosowania jako lek użyteczny do leczenia reakcji zapalnych.

Kolejno, wynalazek dostarcza również polipeptydu według wynalazku w postaci rozpuszczalnej do zastosowania jako lek użyteczny do modulowania przepuszczalności naczyń w guzach.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało skierowane przeciw polipeptydowi według wynalazku. Przeciwciało to jest użyteczne do zastosowania jako lek użyteczny do kierowania cząsteczek do komórek zawierających polipeptydy według wynalazku, do zastosowania jako lek użyteczny do hamowania naczyniotworzenia w guzach, do zastosowania jako lek użyteczny do leczenia reakcji zapalnych oraz do zastosowania jako lek użyteczny do zwiększania przepuszczalności naczyń w guzach dla dostarczania leków.

Na Fig. 1 przedstawiono mysie sekwencje cDNA kodujące białka CRAM-1 i CRAM-2. Powszechnie, nazwy JAM i JAM-1, CRAM-1 i JAM-2, jak również CRAM-2 i JAM-3 są stosowane zamienne.

Porównawcza dystrybucja transkryptów kodujących JAM-1, CRAM-1 i CRAM-2 w tkankach wykazała preferencyjną ekspresję tych cząsteczek w przedziałach śródbłonkowych i nabłonkowych, sugerując rolę w utrzymaniu kontaktu komórka-komórka. Te oddziaływania komórka-komórka spoczyn4

PL 207 994 B1 kowych komórek śródbłonkowych regulują przepuszczalność naczyń, cykl komórkowy i transmigrację leukocytów przez ścianę śródbłonka.

Dla pełniejszego wyjaśnienia funkcji i wzajemnych oddziaływań miedzy tymi trzema cząsteczkami, zastosowano podejście molekularne. Mając powyższe na uwadze, skonstruowano chimerowe cząsteczki składające się ze znacznika Flag i sekwencji białka o wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) dołączonych do rozpuszczalnej albo związanej z błoną postaci CRAM-1, CRAM-2 albo JAM (zebrane na Fig. 2). Po transfekcji do linii komórkowych, produkty fuzji CRAM-1 i JAM z EGFP lokalizowały się na styku komórka-komórka, potwierdzając rolę tych cząsteczek w komunikacji komórka-komórka. W przeciwieństwie do tego, CRAM-2 był szerzej rozprzestrzeniony na powierzchni komórki. Ponadto, rozpuszczalny konstrukt CRAM-1 blokował transśródbłonkową migrację leukocytów in vitro, podczas gdy rozpuszczalny JAM wykazywał jedynie efekt marginesowy. Łącznie uzyskane wyniki sugerują centralną rolę tej nowej podrodziny cząsteczek adhezyjnych w utrzymaniu integralności naczyń i funkcji warstwy śródbłonkowej.

W oparciu o te ujawnienia, niniejszy wynalazek ujawnia również nowe sposoby przeciwdział ania wskazaniom medycznym, takim jak przewlekłe zapalenie i rozwój nowotworu przy zastosowaniu odczynników opartych o polipeptydy CRAM.

Figury 4 i 5 pokazują dopasowanie na poziomie aminokwasowym pomiędzy mysią CRAM-1 (JAM-2) i CRAM-2 (JAM-3), odpowiednio.

Polipeptydy CRAM znajdujące się w ciele ludzkim albo zwierzęcym są markerami dla rosnących komórek. Poziom ekspresji CRAM podnosi się w komórkach, które rosną.

Ujawniono tutaj dwa nowe mysie polipeptydy, które są przedstawicielami tej rodziny. W oparciu o informację o sekwencji dla tych polipeptydów moż na zidentyfikować innych przedstawicieli dobrze znanymi sposobami, takimi jak PCR, hybrydyzacja krzyżowa z bibliotekami DNA, reakcja krzyżowa z przeciwciał ami.

Informacja o sekwencji może być bądź sekwencją aminokwasową, bądź sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową.

Poza zastosowaniem informacji o sekwencji dla ujawnionych tu dwóch białek CRAM do identyfikacji innych przedstawicieli rodziny w innych gatunkach, takich jak człowiek, dwa wskazane powyżej białka i odpowiadających im przedstawicieli rodziny można również zastosować do wytworzenia pochodnych cząsteczek, takich jak przeciwciała skierowane przeciw poli (peptydom) według wynalazku albo zrekombinowanych ekwiwalentów tych białek, ewentualnie w postaci rozpuszczalnej albo peptydów zawierających co najmniej część sekwencji aminokwasowej polipeptydów. Odpowiednimi częściami sekwencji amino-kwasowej są w szczególności domeny zewnątrzkomórkowe VC2 i sekwencja obecna w cytoplazmie proksymalnej do błony: A-[Y,Q]-[R,S]-[R,K]-G-[C,Y)-F.

Poza przeciwciałami i pochodnymi (poli)peptydowymi, wynalazek dotyczy również poli- lub oligonukleotydów mających sekwencję, która koduje kompletny polipeptyd według wynalazku albo jego części. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sekwencji nukleotydowej, która jest w co najmniej 70%, korzystniej w co najmniej 80%, jeszcze korzystniej w co najmniej 90%, najkorzystniej zasadniczo w 100% homologiczna z ludzką sekwencją DNA GRAM-1 przedstawion ą na Fig. 6.

Takie poli- lub oligonukleotydy mogą stanowić, na przykład, RNA lub DNA, startery, sondy, antysensowne RNA.

Wszystkie takie cząsteczki można zastosować do modulowania funkcji wyjściowych polipeptydów znajdujących się w ciele ludzkim albo zwierzęcym albo dla celów diagnozy.

Naczyniotworzenie na przykład w nowotworach może być hamowane przez przeciwciała. Można je zastosować jako cząsteczki kierujące w stronę komórek niosących polipeptydy CRAM. Przeciwciała mogą działać same albo mogą być łączone z innymi cząsteczkami, takimi jak toksyny, znaczniki radioaktywne, fluorescencyjne, enzymatyczne, znaczniki podlegające aktywacji fotonami, ale również liposomy, komórki, itd.

Wyznakowane przeciwciała są szczególnie przydatne do zastosowania diagnostycznego przeciwciał, tj. mogą być stosowane do lokalizowania rozwoju naczyń w rosnących nowotworach. Ponadto, przeciwciała połączone z toksynami albo cząsteczkami radioaktywnymi można stosować do specyficznego zabijania komórek nowotworu poprzez kierowanie ich do (rosnących) naczyń w nowotworze.

Stwierdzono, że cząsteczka typu CRAM nie była wykrywana w normalnym układzie naczyniowym z wyjątkiem naczyń limfatycznych i górnych śródbłonkowych żyłek w organach limfoidalnych, jakich jak węzły limfatyczne i kępki Peyera. Ich zaletą jest to, że kierowanie do celu przykładowo przePL 207 994 B1 ciwciał anty-CRAM może być wysoce specyficzne na przykład wobec komórek nowotworowych, unika się zatem niepożądanych skutków ubocznych.

Ponadto, (poli)peptydy mogą również wiązać się z cząsteczką na rozwijających się naczyniach i przez to stymulować albo hamować naczyniotworzenie.

Rozpuszczalne poli(peptydy) mające zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową jak polipeptydy CRAM można zastosować do leczenia reakcji zapalnych śródbłonka naczyń. Stwierdzono zgodnie z wynalazkiem, że przezsródbłonkowa migracja leukocytów może być hamowana przez sCRAM-1-Ig2Do albo przeciwciała monoklonalne przeciw CRAM-1. Te i podobne cząsteczki można zatem zastosować do wygaszania albo stymulowania reakcji immunologicznej, takiej jak mająca miejsce w przypadku zapalenia.

Specyficzna ekspresja cząsteczki na komórkach naczyniowych HEV in vivo, które są wyspecjalizowane w migracji limfocytów dowodzi, że CRAM ma wpływ stymulacyjny na migrację limfocytów albo przepuszczalność naczyń. Ten efekt może być zatem wynikiem modulacji cząsteczek normalnie biorących udział w zasklepianiu się łożyska naczyniowego (CRAM-1, CRAM-2, JAM, PECAM, VE-Cadherin). Odkrycie to jest podstawą innych zastosowań wynalazku obejmujących regulację wewnątrzśródbłonkowych połączeń poprzez dostarczenie zrekombinowanych cząsteczek (poli)peptydowych CRAM według wynalazku albo przeciwciał monoklonalnych wobec CRAM-1.

Przeciwciała anty-CRAM można również stosować do blokowania oddziaływań komórka-komórka w rosnących komórkach. To prowadzi do dezorganizacji międzykomórkowych kontaktów, które są normalnie wymagane dla pełnienia funkcji bariery w naczyniach krwionośnych. Ujawnienie to można zastosować do zwiększania przepuszczalności rosnących naczyń w celu zwiększania dostarczania leków w odpowiednie miejsca, takie jak rosnące nowotwory, post-menstrualna macica, itd. Dezorganizację międzykomórkowych kontaktów można zatem zastosować do blokowania rozwoju komórek nowotworowych niosących antygen, takich jak naczyniaki (nowotwory pochodzące ze śródbłonka naczyniowego) albo niektóre szybko rosnące nowotwory.

W zastosowaniach diagnostycznych moż na wykorzystać wyznakowane przeciwciał a, ale również wyznakowane oligonukleotydy, które są komplementarne do DNA albo mRNA CRAM znajdującego się w komórkach śródbłonkowych wyrażających białko(-a) CRAM.

Niniejszy wynalazek będzie poniżej zilustrowany przez następujące przykłady, w których znajdują się liczne odniesienia do załączonych rysunków, które przedstawiają:

Fig. 1: Mysią sekwencję cDNA kodującą białka CRAM-1 i CRAM-2. MuCRAM-1 subklonowano w wektorze pcDNA3 i zsekwencjonowano przy zastosowaniu starterów Sp6 i Tl. MuCRAM-2 otrzymano jako klon IMAGE z biblioteki EST (Ac:AA690843 i W80145) i zsekwencjonowano w wektorze pT7T3-DPac przy użyciu starterów T7 i T3.

Fig. 2: Schematyczne przedstawienie narzędzi molekularnych użytych w przykładzie. Struktura i waż ne reszty w nowej rodzinie są przedstawione w górnej części. Gwiazdki reprezentują przypuszczalne miejsca fosforylacji w cytoplazmatycznej części trzech białek. W sekwencji JAM brakuje drugiej kanonicznej reszty Cys domeny C2. Różne chimerowe cząsteczki białka są przedstawione poniżej z zaznaczeniem pozycji i otaczających reszt w miejscach fuzji. Część cząsteczek pochodzących z sekwencji JAM, CRAM-1 lub CRAM-2 jest pokazana na jasnym tle.

Fig. 3. Dopasowanie sekwencji aminokwasowych CRAM-1 i CRAM-2. Przerwy są zaznaczone kreskami.

Fig. 4. Dopasowanie mysiej i ludzkiej CRAM-1.

Fig. 5. Dopasowanie mysiej i ludzkiej CRAM-2.

Fig. 6. Sekwencja nukleotydowa ludzkiej CRAM-1 (górna część), pełna sekwencja aminokwasowa ludzkiej GRAM-1 (środkowa część) i częściowa sekwencja aminokwasowa ludzkiej CRAM-2.

Fig. 7. Ukierunkowane różnicowe zobrazowanie przy zastosowaniu zdegenerowanych starterów. (A): Pokazane są sekwencje nukleotydowe starterów PCR kodujących sekwencje obecne w domenach C2 Ig. Dwa startery kodują tą samą sekwencję ze względu na kodony kodujące resztę Ser. Poziom degeneracji to 4096 odmiennych postaci starterów kodujących YRCXAS i 2084 postaci dla innych. (B): Pokazany jest obraz radioaktywnych produktów PCR otrzymanych ze starterami YYCXAS1. Ścieżki odpowiadają obrazowi produktów reakcji PCR przeprowadzonej na cDNA otrzymanych ze śródbłonkowej linii komórkowej t-end (ścieżka t-end), linii B16 czerniaka (linia B16) albo wspólnej hodowli dwóch linii (ścieżka środkowa). Strzałki wskazują na produkt PCR będący przedmiotem zainteresowania otrzymany z transkryptu CRAM1, którego poziom obniża się w warunkach wspólnej hodowli.

PL 207 994 B1

Fig. 8: (A) Sekwencja nukleotydowa cDNA i wydedukowana sekwencja aminokwasowa dla cząsteczki adhezyjnej regulowanej przez konfluencję (CRAM-1). Przypuszczalny hydrofobowy peptyd sygnałowy (pierwszy) i region transmembranowy (drugi) są podkreślone. Wskazane są przewidywane miejsca N-glikozylacji (wyróżnione), cysteiny, które prawdopodobnie tworzą wiązania dwusiarczkowe (nawiasy) i reszty Ser/Thr/Tyr możliwych miejsc fosforylacji (wytłuszczone). (B) Model strukturalny dla mysiego białka CRAM-1. Zewnątrzkomórkowa część z domenami VH i podobną do C2 Ig z dwoma przypuszczalnymi miejscami N-glikozylacji. Strzałka wskazuje region będący celem dla częściowo zdegenerowanych starterów (YYCKAS1) zastosowanych w ukierunkowanym różnicowym obrazowaniu.

Fig. 9: Dopasowanie sekwencji mysich białek JAM, CRAM-1 i CRAM-2. Identyczne reszty są ujęte w czarne ramki, a reszty homologiczne są zacieniowane na szaro. Całkowita identyczność pomiędzy CRAM-2 i CRAM-1 wynosi 36%, pomiędzy JAM i CRAM-1 31% a pomiędzy JAM i CRAM-2 33%, odpowiednie homologie wynoszą 52%, 52% i 49%. Przerwy są pokazane jako kreski w sekwencji. Kanoniczne konserwowane sekwencje (Cys i Trp) domen V i C2 są zaznaczone gwiazdką.

Fig. 10: Ekspresja transkryptów kodujących JAM, CRAM-1 i CRAM-2 wykrawana poprzez RT-PCR w różnych ścieżkach (A) albo wykrywana poprzez filtry Northern w rozmaitych tkankach (B). (A): RT-PCR przeprowadza się na cDNA pochodzącym z linii komórek śródbłonkowych traktowanych TNF (ścieżki 2 i 11 odpowiadają linii t-end traktowanej TNF) i nie traktowanych (ścieżki 3, 4, 6, 7, 9, 12 odpowiadają liniom b-end.5, e-end.2, t-end V⁺⁺L^-, t-end V^lowL⁺⁺, TME i t-end, odpowiednio). Ścieżki 5 i 10 odpowiadają nowotworowym liniom komórkowym B16 (czerniak) i KLN205 (rak). Linia 8 odpowiada nietransformowanej grasiczej śródbłonkowej linii komórkowej MTE4-14. Ścieżka 1 jest kontrolą pozytywną dla amplifikacji JAM, CRAM-1 i CRAM-2 na plazmidach zawierających sklonowany cDNA. (B) Autoradiogramy hybrydyzacji sondy P³² z mysimi filtrami Northern. Sondy zastosowane do każdej hybrydyzacji są pokazane po lewej stronie. Sygnały hybrydyzacyjne dla JAM i CRAM-1 są wykrywane na wysokości 2 kb.

Fig. 11: Lokalizacja CRAM-1 i CRAM-2 na ustabilizowanych złączach komórka-komórka. A: Immunocytochemię przeprowadzono na utrwalonych paraformaldehydem komórkach TME przy użyciu przeciwciał anty-CRAM-1 (a) albo anty-JAM (b). Strzałki wskazują specyficzną lokalizację białek na styku komórka-komórka. Kreska skali, 10 μm. B: Chimerowe cząsteczki CRAM-1-EGFP (a) i CRAM-1-EGFP (b) zlokalizowano specyficznie na stykach pomiędzy transferowanymi komórkami. Wzbogacenie w zrekombinowane białka EGFP nie było obserwowane w komórkach transfekowanych w porównaniu z nie transfekowanymi (strzałka). Kreska skali, 20 nm. C: Immunoprecypitcja CRAM-1 po biotenylacji powierzchni komórek śródbłonkowych TME. Przeciwciała anty-PECAM (ścieżka 1) i anty-JAM (ścieżka 2) zastosowano jako kontrolę negatywną i pozytywną, odpowiednio przy immunoprecypitacji z przeciwciałem CRAM-XIXH36 (ścieżka 3). Masy cząsteczkowe są pokazane po prawej stronie. D: Immunoprecypitacja zrekombinowanych białek EGFP z transfekowanych komórek CHO. Przeciwciała anty-CRAM-1 (ścieżki 2, 3, 6) albo anty-JAM (ścieżki 1, 4, 5) zastosowano do immunoprecypitacji biotynylowanych lizatów z niestransfekowanych (ścieżki 1 i 2) albo stransfekowanych JAM-1-EGFP (ścieżki 3 i 4) lub CRAM-1-EGFP (ścieżki 5 i 6) komórek CHO. Masy cząsteczkowe są pokazane po prawej stronie.

Fig. 12: Migracja splenocytów przez pojedynczą warstwę w aktywowanych TNF śródbłoniakach w obecności albo nieobecności chemokiny SDF-1. Użyto trzy śródbłoniaki: t.end.1 typu dzikiego albo t.end.1 transfekowany cDNA kodującym CRAM-1 albo CRAM-2. Dwa monoklonalne przeciwciała, F-26 lub H-26, obydwa będące szczurzymi przeciwciałami monoklonalnymi IgG1 skierowanymi przeciw mysiej CRAM-1, testowano pod kątem ich zdolności do wpływania na transmigrację.

Fig. 13: Regulacja funkcji konfluencji CRAM-1. Półilościowy PCR przeprowadzono przy użyciu mieszaniny starterów specyficznych dla DNA HPRT i CRAM-1. Reakcje PCR przeprowadzono w 1,2% żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny. Ścieżki 1, 2 i 3, odpowiadają 100, 50 i 10% konfluencji, odpowiednio. Słabszy sygnał obserwowano dla CRAM-1 przy 100% konfluencji (ścieżka 1). Wskazane są warunki hodowli linii śródbłonkowych (t.end.1 i TME) samych albo zmieszanych z rakową linią komórkową KLN205.

Fig. 14: Analiza transkryptów w tkankach mysich dla CRAM-1 (a), JAM-1(b) lub β-aktyny (c) na filtrach Northern. Pokazane są wyniki dla preparatów mRNA embrionalnego po zapłodnieniu (pc) i dorosłego. Wielkości sygnałów hybrydyzacyjnych są pokazane po prawej stronie.

Fig. 15: Analiza immunohistologiczna ekspresji CRAM-1, JAM-1, ZO-1 i PECAM. Seryjne skrawki nerki (a-d) i skrawki krezkowych węzłów limfatycznych (e-1) barwiono przeciwciałami antyPL 207 994 B1

CRAM-1 (a, e, i), anty-JAM-1 (b, f, j), anty ZO-1 (c,g, k) oraz anty-PECAM (d, h, l). Przy każdej z serii zdjęć (a-d, e-h i i-l) stosowano identyczne ustawienia dla CCD.

Fig. 16: Ekspresja CRAM-1 w komórkach śródbłonkowych.

A. Analiza fluorocytometryczna ekspresji CRAM-1, JAM-1 i PECAM w liniach komórek śródbłonkowych (tEnd.1, eEnd.2 i TME) albo linii komórkowej raka łuskowatego (KLN 205). Słupki zakreskowane przedstawiają kontrole negatywne otrzymane z przeciwciałami skierowanymi przeciw CD4. B: Analiza cytofluorometryczna CRAM-1 na świeżo wyizolowanych komórkach śródbłonkowych. Wskazane narządy poddano dysocjacji poprzez trawienie kolagenazą/dispazą, barwiono przeciwciałami DilAc-LDL, CD31 i anty-CRAM-1 albo anty-JAM-1, jak zaznaczono. Wykresy histogramów otrzymano poprzez zatrzymywanie populacji komórek śródbłonkowych pozytywnych dla DilAc-LDL (FL-2) i CD31(FL-3). Kontrole negatywne otrzymano pomijają c pierwszorzę dowe mAb wobec JAM-1 lub CRAM-1.

Fig. 17. (A): Lokalizacja CRAM-1-EGFP w czasie tworzenia się styku komórka-komórka. Zdjęcia dla pojedynczej fluorescencji zbierano co 3 min. przez 1 godzinę w czasie tworzenia się pojedynczej warstwy komórek CHO transfekowanych CRAM-1-EGFP. Pokazane są zdjęcia otrzymane w czasie pierwszych 18 min. W czasie 0, gwiazdki wskazują na 3 komórki obecne w polu widzenia. W czasie 6, 12 i 18 min. strzałki wskazują na przemieszczanie się CRAM-1-EGFP do nowo powstałego styku komórka-komórka. (B): Lokalizacja CRAM-1-EGFP po zranieniu. Strzałki wskazują miejsce zranienia, a ostrze strzałki pokazuje procesy błonowe, których wiele zachodzi w CRAM-1-EGFP. Czas migawki jest wskazany na rysunkach. Kreska skali, 10 μm.

Fig. 18: Ekspresja CRAM-1 zmniejsza przepuszczalność parakomórkową. (A) Przepuszczalność parakomórkową oceniano poprzez dyfuzję Dekstranu-FITC przez niestransfekowane pojedyncze warstwy komórek CHO, komórek CHO transfekowanych Tac (hu-IL2Ra) albo wskazanym białkiem fuzjnym z EGFP (JAM-1 albo CRAM-1). Transfekcja JAM-1-EGFP lub CRAM-1-EGFP komórek CHO prowadzi do znaczącego zmniejszenia się przepuszczalności parakomórkowej (58,8%⁺/-4,9 i 70,8%⁺/-3,6, odpowiednio, p<0,0001), podczas gdy transfekcja Tac nie wpływa znacząco na przepuszczalność parakomórkową (100,4%/-4,4, p=0,9872). Wyniki są znormalizowane do nietransfekowanych komórek CHO.

Fig. 19: Kierowanie CRAM-1-EGFP (A) i JAM-1-EGFP (B) do istniejących uprzednio ścisłych połączeń. Konfluentne komórki MDCK, stabilnie transfekowane CRAM-1-EGFP (A) albo JAM-1-EGFP (B) barwiono przeciwciałami anty-okludyna i anty-królicze-Czerwień Teksas. Seria zdjęć co 0,9 μm z poziomów podatawowych do górnych jest pokazana dla fluorescencji EGFP (a) albo barwienia okludyną (b). Poziomy podstawowe po lewej stronie są określone arbitralnie, tak aby seria zdjęć objęła ścisłe połączenie przy ogniskowaniu +3,6 i 4,5 um (czwarte i piąte zdjęcie do prawej).

Fig. 20. Wpływ rozpuszczalnych zrekombinowanych cząsteczek na przezsródbłonkową migrację leukocytów (A): Transmigracja jest wyrażana jako względny współczynnik i znormalizowana dla wartości otrzymanych dla nie traktowanych linii komórkowych t-end (przerywana linia, Wskaźnik 1). Pokazane są wyniki otrzymane w obecności 1 ug sJAM-Ig2do (otwarte kwadraty) albo w obecności 1 ug sCRAM-1-Ig2do (wypełnione kółka). Współczynnik jest policzony jako średnia z pięciu niezależnych doświadczeń transmigracji. (B): Fenotyp transmigrujących komórek jest wyrażany jako liczba komórek wyliczona z wartości procentowych otrzymanych w analizie Facs, po której następuje barwienie przy użyciu anty-CD3-FITC i anty-B220-PE. Gwiazdki wskazują punkty eksperymentalne znacznie odbiegające od kontroli.

W poniższych przykładach określenia JAM i JAM-1, CRAM-1 i JAM-2, jak również CRAM-2 i JAM-3 mogą być ewentualnie stosowane wymiennie.

P r z y k ł a d y

Materiały i metody

Linie komórkowe

Grasicza (tEnd.1) i embrionalna (eEnd.2) linia komórkowa śródbłoniaka (Williams i wsp., 1989, Cell 57:1053-1063) była dostarczona przez dr W. Risau i dr B. Engelhardt (Max Planck Institute, Bad-Nauheim, Niemcy). Transformowana SV40 linia komórek śródbłonka węzła limfatycznego TME była dostarczona przez dr A. Hamann (Harder i wsp., 1991, Exp Cell Res. 197:259-267). Łuskowate komórki nowotworowe KLN 205, linie komórkowe GHO, MDCK oraz linię komórkową chłoniaka Sp2/0 otrzymano z American Type Tissue Culture Collection (ATCC). Wszystkie komórki, z wyjątkiem CHO, hodowano w pożywce DMEM (Gibco BRL, Paisley, Scotland), uzupełnionej 10% FCS (PAA Laboratories, Linz, Austria), 2 mM glutaminą, 100 jedn./ml penicyliny i 100 jedn./ml streptomycyny (wszystkie

PL 207 994 B1 z Gibco BRL). Komórki CHO hodowano w po ż ywce Nut.Mix.F-12 (HAM) uzupełnionej jak wyż ej. Przywarte komórki oddzielano od podłoża poprzez przemywanie PBS/ 0,15 mM EDTA, a następnie przez 5 min. inkubacj ę w trypsynie/EDTA w 37°C.

Zobrazowanie, klonowanie i analiza sekwencji

W celu przeprowadzenia doś wiadczeń z jednoczesną hodowlą , 5x10⁵ komórek t.End.1 hodowano razem z 2,5x10⁴ komórek czerniaka B16 F10 przez 64 godziny w 10 cm płytkach do hodowli komórkowej. Jako kontrolę, 5x10⁵ komórek t.End.1 i 2,5x10⁴ komórek B16 F10 hodowano oddzielnie w tych samych warunkach w wyniku czego po 64 godzinach powstała konfluentna pojedyncza warstwa. Całkowity RNA ekstrahowano bezpośrednio w płytkach Petriego odczynnikiem Trizol zgodnie z instrukcjami producenta (Gibco BRL, Paisley, Scotland). cDNA otrzymano z 5 μg całkowitego RNA, stosując starter oligo-dT (16-mer) i Superscript Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Paisley, Scotland). Jakość i ilość cDNA sprawdzano poprzez przeprowadzenie 27 cykli PCR na 1 μl cDNA rozcieńczonego 1:5, przy użyciu starterów specyficznych dla cDNA genu metabolizmu podstawowego HPRT. Następnie przeprowadzono różnicowy PCR z następującymi zdegenerowanymi starterami ^5'TAYAGNTGYNNNGCYTCYAA^3', ^5'TAYCRGTGYNNNGCYTCYAA^3' i ^5'TAYTAYTGYNNNGCYTCYAA^3' kodującymi najczęściej występujące sekwencje aminokwasowe występujące w domenie C2: YRCXAS, YQCXAS oraz YYCXAS. Warunki PCR polegały na użyciu 2 μl cDNA rozcieńczonego DNA; 2,5 μ! buforu 10 x Goldstar PCR; 2 μ MgCl2; 2 μ! zdegenerowanych starterów 0,3 mM; 0,5 μl of dNTP 0,1 mM; 0,1 μl aP³³ dATP 10 mCi/ml (Amersham Pharmacia Biotech, Dubendorf, Szwajcaria); 15,65 μl H2O; 0,25 μl polimerazy Taq Goldstar (Eurogentech, Seraing, Belgia).

Parametry dla reakcji PCR były następujące: 45 sek. w 94°C, 90 sek. w 50°C i 45 sek. w 72°C powtórzone 40 razy. Bufor do nakładania próbek formamid/EDTA denaturowano przez 2 min. w 94°C. Produkty PCR rozdzielano następnie w 6% żelu poliakryloamidowym i poddawano autoradiografii przy użyciu Kodak OM-Mat. Porównywano intensywność prążków.

Różnicowo wyrażane prążki wycinano z wysuszonego żelu poliakryloamidowego i fragmenty odzyskiwano poprzez gotowanie i wytrącanie etanolem jak opisano uprzednio (Liang i Pardee, 1992, Science, 257:967-970). Następnie produkty PCR ponownie powielano stosując zwiększone stężenie dNTP (0,2 mM zamiast 2 μΜ) bez P³³-ATP. Produkty reamplifikacji sklonowane w wektorze pGem-T Easy Vector (Promega Corp, Wallisellen, Szwajcaria) jak opisano uprzednio (Sambrook, Fritsch, i Maniatis; Molecular cloning; 2 wyd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).

Określono sekwencję nukleotydową dwóch niezależnych klonów przy użyciu zastawu Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Seguencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Dubendorf, Szwajcaria) oraz systemu do analizy DNA LI-COR DNA Analysis System (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Niemcy).

Identyfikacja CRAM-2

Analizę i porównanie sekwencji przeprowadzono przy użyciu programów dostępnych na serwerze ExPASy Molecular Biology Server, tj. Blast, Prosite, Swiss-Prot. Zidentyfikowano trzy różne EST homologiczne do CRAM-1 (nr dostępu AA726206, AA052463 i AA175925). Żaden z nich nie kodował transkryptu pełnej długości i zawierającego inicjacyjną sekwencję ATG. Dlatego sekwencję kodującą koniec 5' otrzymano przy zastosowaniu systemu do szybkiej amplifikacji końców DNA: 5'RACE-PCR System for Rapid Amplification of cDNA Ends, wersja 2.0 zgodnie z instrukcjami producenta (Gibco BRL, Paisley, Scotland).

Trzy zastosowane startery zaprojektowano w oparciu o sekwencję EST jak następuje: 5'-GAGGTACTTGCATGTGCT-3' dla syntezy pierwszej nici, 5'-CGACAGGTGTCAGATAACA-3' i 5'-GACCCTCCTCACTCGT-3' dla dwóch zagnieżdżonych PCR. Produkt 5'RACE-PCR sklonowano w wektorze pGem-T. W celu otrzymania sekwencji kodującej dla CRAM-1 pełnej długości sklonowane produkty 5'RACE-PCR i EST (nr dostępu AA726206) strawiono enzymami restrykcyjnymi Hpal i Notl i poddano ligacji z wektorem pGem-t. Klonowanie CRAM-2 pełnej długości opierało się na takiej samej strategii porównania sekwencji i technice 5'RACE. DNA pełnej długości kodujący CRAM-2 otrzymano ostatecznie z EST nr dostępu: AA690843 i W180145. Te dwa klony różnią się długością nie ulegającego translacji regionu 3'.

Analiza Northern

Całkowity mRNA z komórek i tkanek ekstrahowano przy zastosowaniu Trizolu (Life technologies AG, Basel, Szwajcaria) zgodnie z instrukcjami producenta. mRNA poli A+ ekstrahowano z 250 μg całkowitego RNA przy użyciu zestawu Oligotex mRNA Purification Kit (Qiagen, Zurich, Szwajcaria). Filtry Northern z embrionalnym poli A zakupiono w CLONTECH (P.H Stehelin and Cie AG, Basel, SzwajcaPL 207 994 B1 ria). Sondy RNA przygotowano z wektora pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Holandia) i zawierały one sekwencje kodujące domeny immunoglobulinowe JAM-1 i CRAM-1, albo sekwencję pełnej długości kodującą β-aktynę. Hybrydyzację przeprowadzano w 62°C w buforze zawierającym 50% formamid. Filtry przemywano następnie dwukrotnie (0,5xSSC, 0,1%SDS, 67°C) i poddawano autoradiografii na błonie Kodak X-Omat w -80°C.

Doświadczenie z konfluencją

Badano wpływ konfluencji komórek śródbłonkowych na poziom mRNA CRAM-1. 2 x 10⁵ komórek śródbłonkowych TME hodowano w płytkach hodowlanych o średnicy 6, 10 i 15 cm aby osiągnąć różne poziomy konfluencji po 64 godzinach w zakresie od 10 do 100%. Liczba komórek 64 godzinach, sprawdzana poprzez usuwanie błękitu trypanowego i zliczanie była taka sama we wszystkich przypadkach i nie była powiązana z powierzchnią płytki Petriego.

Półilościową reakcję PCR i analizę Northern zastosowano do określenia względnej ilości transkryptu w różnych warunkach. W celu oznaczenia transkryptu CRAM-1 użyto pary starterów 5'-GACTCACAGACAAGTGAC-3' i 5'-CACCCTCCTCACTCGT-3' dających produkt amplifikacji o długości 750 bp. Jako wewnętrzną kontrolę zastosowano następujące startery specyficzne dla cDNA Hprt w celu powielenia fragmentu o długości 350 bp: 5'-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3' i 5'-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3'.

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych

Sekwencję kodującą EGFP subklonowano z wektora pEGFP-1 (CLONTECH, P.H Stehelin and Cie AG, Basel, Szwajcaria) do pcDNA3 przy użyciu miejsc Hindlll i Notl i nazwano następnie pcDNA3/EGFP. Miejsca restrykcyjne 3' Hpal i Scal, znajdujące się w sekwencji kodującej domeny cytoplazmatycznej odpowiednio, CRAM-1 i JAM-1, zastosowano do połączenia dwóch sekwencji na końcu N EGFP w wektorze pcDNA3 (lnvitrogen, Leek, Holandia). Wstawki kodujące CRAM-1 lub JAM-1 wycinano z pGemt lub pRc/CMV poprzez strawienie SacII/Hpal lub Hindlll/Scal, odpowiednio.

Sekwencje kodujące klonowano następnie w wektorze pcDNA3/EGFP strawionym Agel, końce wytępiono poprzez wypełnienie i trawiono dalej enzymami Hindlll lub SacII. Wynikiem tego były miejsca fuzji w pozycjach aminokwasowych DGV291 dla JAM-2 i QPS285 dla JAM-1. Transfekcję komórek CHO przeprowadzono jak opisano uprzednio (Ballestrem i wsp., 1998, J Cell. Sci. 111:1649-1658).

Stabilne transfektanty użyte w testach przepuszczalności selekcjonowano poprzez hodowanie transfekowanych komórek CHO przez twa tygodnie w pożywce zawierającej 1 mg/ml G418. Izolowano kolonie oporne i sprawdzano pod kątem intensywności fluorescencji EGFP poprzez cytometrię przepływową (urządzenie FAGScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) oraz lokalizację fluorescencji przy zastosowaniu mikroskopii (Axiovert, Zeiss, Oberkochen, Niemcy).

Video-mikroskopię w odstępach czasowych przeprowadzono przy zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego Axiovert i oprogramowania Openlab do uzyskania obrazu.

Ssaczy wektor ekspresyjny pcDNA 3 (Invitrogen, Leek, Holandia) zmodyfikowano poprzez wstawienie sekwencji kodującej znacznik Flag-Tag (G. Wiedle, Dep. of Pathology, CMU, Genewa) Konstrukty Flag-Tag zawierające sekwencje kodujące rozpuszczalnych postaci białek JAM, CRAM-1 i CRAM-2 otrzymano po przez PCR. We wszystkich przypadkach zaprojektowano startery lewe pasujące do regionu inicjacyjnego ATG. Starter prawy zaprojektowano w obrębie sekwencji kodującej z regionu zawiasowego dla jednej rozpuszczalnej postaci Ig albo w obrębie sekwencji kodującej region pomiędzy C2 i domenami transbłonowymi dwóch domen Id rozpuszczalnej cząsteczki. Wszystkie startery lewe miały dodatkową sekwencję po stronie 5' zawierającą miejsce restrykcyjne Xbal dla ukierunkowanego klonowania w ramce wektora zmodyfikowanego przez Flag-tag. Polimerazę DNA Pfu zastosowano w reakcji PCR w celu uniknięcia częstych mutacji (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Fragmenty PCR strawiono następnie Xbal i sklonowane w wektorze pcDNA-3 Flag-Tag strawionym EcoRl, końce wypełniono przy użyciu polimerazy Klenowa, a następnie trawiono Xbal.

Odczynniki i analiza immunofluorescencyjna

Użyto następujące monoklonalne przeciwciała: anty-PECAM (GC51, szczurze IgG2a EA-3, szczurza IgG1) oraz anty-JAM (H202.106.7.4, szczurze IgG1) (Malergue i wsp., 1998, Mol Immunol. 35:1111-1119; Piali i wsp., 1993, Eur J Immunol. 23:2464-2471).

W laboratorium wytworzono zestaw przeciwciał CRAM przeciw CRAM-1 stosując standardowe techniki i zrekombinowane rozpuszczalne białko jako immunogen (Aurrand-Lions i wsp., 1996, Immunity. 5: 391-405). Wybrane hybrydomy badano w teście ELISA pod kątem wytwarzania przeciwciał rozpoznających specyficznie zrekombinowaną rozpuszczalną cząsteczkę CRAM-1. Klony pozytywne testowano dalej na komórkach CHO transfekowanych cDNA CRAM-1 (niepokazane).

PL 207 994 B1

Wszystkie przeciwciała CRAM były izotypu IgG1 lub IgG2a z wyjątkiem CRAM-25F24, które należały do podklasy IgG2b. Przeciwciała oczyszczano na kolumnach z sefarozą z białkiem G (Pharmacia Biotech Europe, Dubendorf, Szwajcaria) zgodnie z instrukcjami producentów. mAbGRAM-19H36 zastosowano do immunoprecypitacji, podczas gdy GRAM-18F26 stanowiły odczynnik do immunohistochemii. Podobne wyniki otrzymano z mAbs CRAM-4H31 i CRAM-17D33.

Analizę immunofluorescencji przeprowadzono przy użyciu drugo rzędowych odczynników połączonych z FITC lub czerwienią Texas Red (Jackson Immunoresearch, Milan AG, La Roche, Szwajcaria) dla cytofluorymetrii i immunohistochemii, odpowiednio.

W przypadku immunohistochemii, próbki utrwalano przez 5 min. zimnym (-20°C) metanolem, uwadniano w PBS, żelatynie 0,2%, Tween 20 0,05%, inkubowano przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami przedpłukaniem i uwidaczniano odpowiednim drugorzędowym odczynnikiem połączonym z czerwienią Texas. W celu analizy świeżych komórek śródbłonkowych, dysocjację świeżo pobieranych tkanek przeprowadzano stosując trawienie kolagenazą/dispazą według ustalonych procedur (Kramer i wsp., 1984, J Cell Biol. 99:692-698). Rozpuszczone komórki barwiono przez 2 godziny w 37°C Dil-acetylowanym LDL (Molecular Probe Europe BV, Leiden, Holandia) przed barwieniem anty-CRAM-19 i sondą: kozie anty szczurze przeciwciało-FITG. Po trzech przemywaniach komórki barwiono biotynylowanym anty-CD31 (Pharmingen) i streptawidyna-czerwień 670 (Life technologies AG, Basel, Szwajcaria).

Ekspresję JAM-1 lub CRAM-1 analizowano na komórkach pozytywnych dla dwóch markerów śródbłonkowych: acetylowanego-LDL (FL-2) i CD31 (FL-3). Kontrole negatywne otrzymywano poprzez pominięcie pierwszorzędowych przeciwciał.

Immunoprecypitacje

Immunoprecypitacje przeprowadzono jak opisano uprzednio (Aurrand-Lions i wsp., 1997, Cellular Immunology. 176:173-179) stosując do lizy 10 mM bufor Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X100, 0,5% NP40, mieszaninę inhibitorów proteaz (Roche Diagnostics Ltd, Rotkreuz, Szwajcaria). Po immunoprecypitacji, SDS/PAGE i przeniesieniu na filtry nitrocelulozowe biotynylowane białka uwidaczniano przy użyciu streptawidyny połączonej z peroksydazą (Jackson Immunoresearch) i ECL (Amersham Pharmacia Biotech, UK).

Testy przepuszczalności

Przepuszczalność mierzono przy użyciu komór Transwell (6,5 średnicy, filtry PC, rozmiar por

0,4 μm, Costar Corp). Pokrótce, 1x10⁴ transfekowanych lub nietransfekowanych komórek CHO hodowano do konfluencji na filtrach uprzednio powlekanych przez 30 min. 0,2% żelatyną. Po 5 dniach, pożywkę zmieniono na podgrzaną uprzednio pożywkę Nut/F12 bez FCS (500 μl w dolnej komorze i 200 μl w górnej komorze). Dekstran-FITC (MW 38,900, Sigma Chemical Co) dodawano do górnej komory w stężeniu końcowym 1 mg/ml.

Po 1 godzinie brano komory i sczytywano fluorescencję bezpośrednio w niższej komorze przy użyciu Cytofluoru II. Mierzono i porównywano średnią intensywność fluorescencji w pięciu niezależnych komorach przy zastosowaniu oprogramowania Statview oraz niesparowanych porównań w teście-t. Dla znormalizowania doświadczeń wartości średniej intensywności fluorescencji otrzymanej dla komórek CHO typu dzikiego traktowano jako 100%.

Transfekcja i oczyszczanie rozpuszczalnych białek

Przejściowe transfekcje 293 T, Bose 23 albo stabilne transfekcje komórek CHO rozpuszczalnymi konstruktami Ig1Do i Ig2Do Flagtag/pcDNA-3 przeprowadzano przy użyciu odczynnika Lipofectamine Reagent zgodnie z instrukcjami producentów (Gibco BRL, Paisley, Scotland). Po transfekcji supernatanty zbierano co dwa dni na przestrzeni 10 dni. Kulki M2 (Kodak, New Haven, USA) kowalencyjnie połączone z przeciwciałem anty-Flag przemywano dwukrotnie PBS zawierającym mieszaninę inhibitorów protez Protease Inhibitor Mix (Boehringer Mannheim, Niemcy). Kulki inkubowano następnie w 4°C przez 3 godziny z supernatantem z transfekowanych komórek. Po pięciu płukaniach PBS zawierającym inhibitory protez, kolumnę pakowano kulkami, zrekombinowane białka wymywano 10 mM buforem glicynowym pH 3,4 według producenta. Wymywane frakcje zawierające zrekombinowane białka zatężano na Centricon-10 (Millipore) i dializowano wobec PBS.

Końcowe stężenie białka oznaczano przy zastosowaniu testu Micro BCA (Biorad). Oczyszczone produkty poddawano następnie elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS, po czym barwiono Coomassie w celu przeanalizowania ich czystości.

PL 207 994 B1

Testy transmigracji

Transmigrację leukocytów przez komórki śródbłonkowe przeprowadzano jak wcześniej opisano (Wheerasinghe i wsp., 1998, J. Cell Biology, 142: 595-607). Pokrótce, 1 x 10⁵ komórek t-end hodowano przez dwa dni w jednostkach transstudzienkowych (filtry poliwęglanowe, wielkość porów 5 μm, Costar) w obecności 1 pg rozpuszczalnych zrekombinowanych cząsteczek Ig sJAM 2do lub sCRAM-1 2do. Po dwóch dniach 1x10⁶ leukocytów otrzymanych z węzłów limfatycznych i kłębków Peyera dodawano do górnego przedziału i liczbę transmigrujących komórek monitorowano w czasie doświadczenia co godzinę. Po czterech godzinach transmigrujące komórki otrzymane z pięciu niezależnych ścieżek zbierano razem i poddawano analizie fluorocytometrycznej pod kątem markerów B220 i CD3 dla komórek B i T. Wyniki otrzymano przy użyciu urządzenia Facscalibur i programu do analizy Cell-Quest (Becton-Dickinson).

W celu przeprowadzenie testu transmigracji splenocytów, 3x10⁵ komórek śródbłonkowych wysiewano w jednostkach transstudzienkowych (filtry poliwęglanowe, wielkość porów 8 μm, Costar) umożliwiając komórkom utworzenie pojedynczej warstwy przez 18 godzin. Z górnego przedziału usuwano pożywkę i do górnego przedziału dodawano 1x10⁶ leukocytów świeżo otrzymanych z wątroby poprzez wirowanie w Ficollu w objętości 100 gl. Do pożywki w dolnym przedziale dodawano SDF-1 (końcowe stężenie 40 nM) w celu ustalenia gradientu cytokiny pomiędzy dolnym i górnym przedziałem. W przypadku doświadczeń z przeciwciałami, oczyszczone przeciwciała 18-F26 lub 19-H36 dodawano w stężeniu 10 gg/ml do górnego przedziału ze splenocytami. Po 4 godzinach, transmigrujące leukocyty (w dolnym przedziale) zbierano i zliczano. Wyniki wyrażano jako % liczby wyjściowej.

Ukierunkowane różnicowe zobrazowanie

Regulacja genów w komórkach śródbłonkowych zależy od ich otoczenia. Zamierzeniem niniejszego wynalazku była identyfikacja genów, które podlegają regulacji po zajściu kontaktu śródbłonka z komórkami nowotworowymi. W tym celu opracowano test in vitro stosując wspólną hodowlę komórek nowotworowych czerniaka (B16) z linią komórkową śródbłoniaka (t-end). Całkowity RNA ekstrahowany z mieszaniny zastosowano jako matrycę do otrzymania DNA poddanego przeszukaniu poprzez różnicowy PCR. DNA otrzymany z komórek śródbłonkowych albo czerniaka hodowanych osobno zastosowano jako kontrole. Porównywano trzy różne wzory w celu zidentyfikowania transkryptów regulowanych w warunkach jednoczesnej hodowli. W celu ograniczenia analizy do sekwencji kodujących cząsteczki na powierzchni komórek z nadrodziny IG, zastosowano częściowo zdegenerowane startery, które kierują do sekwencji otaczającej C-końcową cysteinę w domenie C2 w cząsteczkach nadrodziny Ig. Najbardziej powtarzalny wzór produktów PCR otrzymano przy użyciu starterów, które kodują sekwencję YYCxAS1 (Fig. 7A). Ta ulepszona metoda techniki obrazowania RNA została nazwana TDD czyli ukierunkowane różnicowe zobrazowanie (od ang. „Targeted Differential Display).

W powtarzanych doświadczeniach TDD, zidentyfikowano szesnaście różnicowo wyrażanych genów. Po sklonowaniu, analizie sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej, trzy z szesnastu produktów PCR pozostało jako kandydaci kodujący nieznanych przedstawicieli nadrodziny Ig. Jeden z tych trzech kandydatów (CRAM-1) został wybrany do dalszych badań. Hodowane osobno komórki śródbłonkowe t-end.1 i komórki czerniaka B16 wyrażały wysokie poziomy transkryptu CRAM-1. Jednakże, w warunkach jednoczesnej hodowli, poziom ekspresji CRAM obniżał się (Fig. 7B). Translacja fragmentu DNA o długości 350 par zasad odpowiadającego CRAM-1 ukazała sekwencję aminokwasową YYCxAS wskazującą na koniec domeny IgC2, po której następuje otwarta ramka odczytu (ORF) zawierająca hydrofobowy ciąg 168 aminokwasów, które są charakterystyczne dla regionu transbłonowego.

CRAM-1, przedstawiciel nadrodziny immunoglobulin

Porównanie sekwencji pomiędzy sekwencją produktu PCR i nukleotydowymi bazami danych wykazało obecność homologicznych i identycznych sekwencji w mysich bazach EST. Obecność EST wskazywała, że produkt PCR odpowiadał sekwencji wyrażanej in vivo. Okazało się że trzy EST zawierają na końcu 5' sekwencję o długości 300 bp, która była identyczna z 300 bp w produkcie TDD. Końce 3' każdej sekwencji EST zawierały ogon poli A. Sekwencje EST miały całkowitą długość 1270 bp i odpowiadały końcowi 3' transkryptu CRAM. Ponieważ brakowało końca 5' transkryptu w klonie DNA EST, otrzymano go poprzez 5'RACE PCR. Otrzymana w rezultacie pełna sekwencja kodująca o długości 1980 bp postulowanego DNA dla CRAM-1 jest pokazana na Fig. 8A. Jest tam silne miejsce najwyższej zgodności (GACATGG) dla inicjacji translacji 16 bp poniżej końca 5', po którym następuje pojedyncza ORF dla przewidywanego białka złożonego z 310 aminokwasów. 31-aminokwasowy re12

PL 207 994 B1 gion za potencjalnym kodonem metioninowym, był charakterystyczny dla peptydu sygnałowego. Przewidywanym miejscem cięcia była Ala-31-Val 32.

Przypuszczalna struktura mysiego białka CRAM-1 jest pokazana na Fig. 8B i składa się z regionu zewnątrzkomórkowego ze zmiennym łańcuchem ciężkim i immunoglobulinową domeną stałą typu 2 (Pfam, The Sanger Centre and Blast) z dwoma potencjalnymi miejscami glikozylacji (pozycje aminokwasowe 104 i 192). Analiza hydrofobowości (Tmpred, ISREC) przewidywała region transbłonowy pomiędzy pozycjami 242-260. Postulowana domena cytoplazmatyczna składała się z 49 aminokwasów i zawierała wiele silnie konserwowanych miejsc fosforylacji Ser/Thr i Tyr (Fig 8A, reszty zapisane kursywą). Analiza znanych wzorów przy zastosowaniu programu Prosit zidentyfikowała sygnatury dla fosforylacji: motyw SSK/SYK dla kinazy białkowej C, SKQD/TSEE dla CK2, a KQDGESY/KHDGVNY dla kinazy tyrozynowej.

JAM, CRAM-1 i CRAM-2 stanowią nową podrodzinę

Kilka białek wykazywało wysoki poziom homologii z CRAM-1. Dwóch przedstawicieli nadrodziny Ig: ludzki antygen A33 i część mysiej cząsteczki adhezyjnej z komórek nerwowych. N-CAM, odpowiednio. JAM, inny przedstawiciel Ig Sf ma podobną strukturę co CRAM-1 z 34% identycznością sekwencji i 54% homologii. Znaczący stopień identyczności między JAM i CRAM-1 wykorzystano do znalezienia trzeciej ściśle spokrewnionej sekwencji w bazie danych EST, a mianowicie CRAM-2. Identyczność pomiędzy tymi trzema cząsteczkami sugerowała istnienie nowej podrodziny cząsteczek w nadrodzinie Ig (Fig. 9). Homologia dotyczył a nie tylko cał ej struktury domen V i C2 (C54 do C118 i C147 do C235 na Fig. 9), ale również sekwencji wewną trz domen cytoplazmatycznych. Co interesujące, największe zróżnicowanie między regionami tych trzech cząsteczek znaleziono na początku domeny V (pozycja 40 do 60) i w części początkowej (pozycja 280 do 300). Funkcje tych trzech regionów odpowiadają sekwencjom biorącym udział w wiązaniu ligandu i przekazywaniu sygnału u innych przedstawicieli nadrodziny Ig sugerując rolę JAM, CRAM-1 i CRAM-2 w komunikacji komórkakomórka.

Dystrybucja tkankowa mRNA JAM, CRAM-1 i CRAM-2

Ekspresję trzech transkryptów w komórkach różnego pochodzenia wykryto przy zastosowaniu RT-PCR. Wszystkie testowane linie komórkowe, śródbłonkowa, nabłonkowa i większość testowanych linii komórek nowotworowych było pozytywnych, jakkolwiek z w różnym stopniu dla różnych transkryptów (Fig. 10A). Najwyższy poziom ekspresji dla CRAM-1 znaleziono w TME, linii komórkowej HEV transformowanej SV40 (ścieżka 9) i w zarodkowej śródbłonkowej linii e-end 2 (ścieżka 4). Transkrypty CRAM-2 i JAM wykazywały bardziej ograniczoną dystrybucję i znajdywano je w liniach komórek śródbłonkowych dorosłych łącznie z transkryptem CRAM-1 (ścieżki 3, 7, 9 i 12). Należy zaznaczyć, że poziom transkryptów JAM i CRAM-2 bardzo obniżał się po potraktowaniu komórek śródbłonkowych TNF, podczas gdy poziom transkryptu CRAM-1 pozostawał niezmieniony (ścieżki 2 i 11). Co interesujące, w zarodkowej śródbłonkowej linii komórkowej (ścieżka 4) albo linii komórek śródbłonkowych dorosłego reprezentującej wariant t-end związany z rozwojem naczyń (ścieżka 6) nie następowała ekspresja JAM ani CRAM-2.

Dystrybucję tkankową transkryptu CRAM-1 badano poprzez filtry Northern i porównywano z JAM-1 (Fig. 14). Transkrypt CRAM-1 miał dł ugość 2 kb, wykazywał wysoki poziom ekspresji w tkance zarodkowej i kępkach Peyera, węzłach limfatycznych, nerce i jądrach dorosłego zwierzęcia. Przypuszczalny wariant składania mRNA o wielkości 1,8 kb był wykrywalny w jądrach. Ekspresja transkryptu CRAM-1 była niska w płucach, wątrobie, śledzionie i grasicy. Względną ilość JAM-1 i CRAM-1 porównywano w czasie embriogenezy: mRNA kodujący CRAM-1 był wykrywalny już w 7,5 dniu po zapłodnieniu, podczas gdy mRNA JAM-1 nie był wykrywany wcale w czasie embriogenezy.

Wyniki te sugerują, że CRAM-1 jest szeroko wyrażany w czasie embriogenezy i wykazuje ekspresję ograniczoną do przedziałów nabłonkowych i śródbłonkowych w tkankach dorosłych. To pozostaje w zgodzie z hipotezą, że odgrywa on rolę w ustaleniu się i utrzymaniu spolaryzowanej organizacji komórek.

CRAM-1, białko o wielkości 45 kD, którego lokalizacja na styku komórka-komórka zależy od oddziaływań homofilowych

Ponieważ linia komórkowa TME pochodząca od HEV wyrażała wysoki poziom CRAM-1, tą śródbłonkową linię komórkową użyto do dalszego badania subkomórkowej lokalizacji CRAM-1 i porównania jej z JAM-1. Lokalizacja białka CRAM-1 na powierzchni komórek śródbłonkowych była ograniczona do styków komórka-komórka (Fig. 11A, a). Barwienie pod kątem CRAM-1 było słabsze niż obserwowane dla JAM-1 i słabsze w wyrostkach błonowych pomiędzy komórkami.

PL 207 994 B1

Następnie badano, czy CRAM-1 obecne na stykach komórka-komórka oddziaływało homofilowo z CRAM-1 czy też oddziaływało heterofilowo z inną cząsteczką na sąsiedniej komórce. W tym celu białko JAM połączono z białkiem o zielonej fluorescencji (CRAM-1-EGFP) i konstrukt transfekowano do komórek CHO. Kiedy komórki CHO transfekowane cDNA CRAM-1-EGFP osiągały stan konfluencji, CRAM-1 obserwowano jedynie na stykach komórka-komórka, kiedy obydwie komórki wyrażały białko (Fig. 11B), podczas gdy na stykach pomiędzy wyrażającymi i nie wyrażającymi komórkami brak było CRAM-1 (Fig. 11B, a, wskazane przez ostrze strzałki). Ten sam wynik otrzymano, kiedy komórki były transfekowane chimerową cząsteczką JAM-1-EGFP (Fig. 11B, b). To wskazuje, że zarówno CRAM-1, jak i JAM-1 wymaga aby oddziaływania homofilowe były zlokalizowane na stykach komórka-komórka.

W celu scharakteryzowania CRAM-1 biochemicznie, przeprowadzono immunoprecypitację chimerowych białek CRAM-1 albo EGFP, wyrażanych przez linię komórkową TME albo transfekowane komórki GHO, odpowiednio (Fig. 11G i D). W przypadku przeciwciała anty-CRAM-1, CRAM-19H36 następowała immunoprecypitacja pojedynczego prążka o wielkości 45 kD z lizatów komórkowych TME (Fig. 11C, ścieżka 3).

Ciężar cząsteczkowy był identyczny w warunkach redukujących i nieredukujących (niepokazane) i odpowiadał przewidywanej masie cząsteczkowej wydedukowanej z sekwencji aminokwasowej CRAM-1, przy czym każda N-glikozylacja dodawała 5 kDa. Wynikiem immunoprecypitacji JAM-1 przy zastosowaniu przeciw ciał H202-106 specyficznych wobec JAM-1 był pojedynczy prążek o niższej masie cząsteczkowej (~ 42 kD, ścieżka 2), który wykluczał możliwą reakcję krzyżową między przeciwciałami anty-CRAM-1 i anty-JAM-1.

Immunoprecypitacja zrekombinowanych białek JAM-1-EGFP lub GRAM-1-EGFP po biotynylacji powierzchni prowadziła do powstania pojedynczych szerokich prążków o wielkości 70 i 73 kD, odpowiednio, wskazując, że cząsteczki były wyrażane na powierzchni transfekowanych komórek GHO (Fig. 11D, ścieżki 4 i 6). Te masy cząsteczkowe były spodziewane, ponieważ EGFP ma masę cząsteczkową 28 kD.

Szczelność i migracja leukocytów

W celu zrozumienia, jak cząsteczki wpływają na integralność pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych i w jaki sposób regulują funkcje śródbłonka naczyniowego, przeprowadzono testy przezśródbłonkowej migracji w obecności zrekombinowanego rozpuszczalnego JAM lub CRAM. Komórki śródbłonkowe hodowano przez dwa dni w obecności sJAM-Ig2Do albo sCRAM-1-Ig2Do. Integralność pojedynczej warstwy nie była naruszona w tym czasie, prawdopodobnie na skutek molekularnej nadmiarowości mechanizmu tworzenia się kontaktu komórka-komórka. Test transmigracji przeprowadzono w obecności 1 μq zrekombinowanych rozpuszczalnych białek. Jak pokazano na Fig. 20 A, liczba transmigrujących komórek była prawie niezmieniona przez obecność sJAM-Ig2Do (kwadraty) w czasie pierwszych trzech godzin. Po czterech godzinach, liczba transmigrujących komórek wzrastała w porównaniu z kontrolą (linia przerywana). W przeciwieństwie do tego, obecność cCRAM-1-Ig2Do (wypełnione kółka) bardzo zmniejszała liczbę transmigrujących komórek.

Ponieważ populacja leukocytów była heterogenna, oceniono, czy sGRAM-1-Ig2Do wpływał na specyficzną subpopulację leukocytów i czy transmigracja była blokowana bez specyficzności. W tym celu, transmigrujące komórki znakowano pod kątem markerów leukocytowych CD3 i B220 ( Fig. 20B).

Co warte odnotowania, sCRAM-1-Ig2Do specyficznie blokowało transmigrację leukocytów nielimfoidalnych, tj. linię komórek mielioidalnych (część centralna, zakreskowane kolumny). W przeciwieństwie do tego, sJAM-Ig2Do w niewielkim stopniu zwiększał liczbę transmigrujących komórek T (część lewa, biała kolumna) bez żadnego wpływu na inne subpopulację komórek.

Ponadto, kiedy komórki śródbłoniaka transfekowane CRAM-1 użyto w teście transmigracji, obserwowano wzrost transmigracji (Fig. 12), podczas gdy transfekcja CRAM-2 nie miała wpływu na transmigrację. Kiedy do testu dodawano SDF-1, przezsródbłonkowa migracja leukocytów osiągała 20%. Była ona częściowo blokowana przez przeciwciała monoklonalne przeciw CRAM-1.

Wyniki te wskazują, że obecność CRAM-1 pomiędzy komórkami śródbłonkowymi może regulować funkcje warstwy środbłonkowej. Można oczekiwać, że cząsteczki z tej rodziny będą stanowić barierę, kiedy komórki śródbłonkowe osiągną konfluencję. Aby to ustalić, badano regulację transkryptów CRAM-1 w komórkach śródbłonkowych w różnych warunkach hodowli.

Poziom CRAM jest obniżany przez wysoki stopień konfluencji

Ponieważ transkrypt, który koduje CRAM-1 nie jest regulowany przez TNF, ale jego poziom obniża się, kiedy śródbłonek jest hodowany jednocześnie z komórkami nowotworowymi, przeprowadzono test konfluencji aby dalej zbadać tą regulację. W warunkach niskiego stopnia konfluencji, komórki

PL 207 994 B1 przechodziły aktywnie cykle komórkowe i oddziaływania CRAM-1 nie następowały, natomiast przy wysokim stopniu konfluencji, komórki dzieliły się mniej i miało miejsce działanie CRAM-1. Poziom ekspresji mRNA CRAM-1 określono przy różnej gęstości komórek poprzez półilościowy RT-PCR. Jak pokazano na Fig. 13, poziom ekspresji transkryptów CRAM-1 zmniejszał się, kiedy osiągnięty został stan konfluencji (ścieżki 1, 2, 3 na Fig. 13 odpowiadają 100, 50 i 10% konfluencji, odpowiednio). Efekt ten był ledwo wykrywalny dla komórek t-end, ale bardziej widoczny dla linii komórkowej TME z wysokim poziomem ekspresji CRAM-1. Obniżanie poziomu CRAM w śródbłonku zwiększało się również, kiedy komórki śródbłonkowe hodowano jednocześnie z komórkami nowotworowymi KLN205, które same nie wykazują ekspresji CRAM-1. To potwierdziło związek pomiędzy ekspresją CRAM-1 i cyklem komórkowym, ponieważ są doniesienia, że komórki nowotworowe zwiększają szybkość wzrostu komórek śródbłonkowych po zajściu kontaktu. Należy zaznaczyć, że wyniki otrzymane dla komórek nowotworowych KLN205 były identyczne ze stosowanymi w naszej wyjściowej strategii przeszukiwania z czerniakiem B16. To wskazuje na ogólny mechanizm, za pośrednictwem którego nowotwory wpływają na zachowanie śródbłonka.

CRAM-1 wykazuje wysoki poziom ekspresji w czasie embriogenezy i jest ona ograniczona do HEV i podpopulacji komórek śródbłonkowych w tkankach dorosłych.

Aby lepiej określić dystrybucję tkankową CRAM-1, przeprowadzono analizę histochemiczną na skrawkach nerki i węzła limfatycznego (Fig. 15), które wykazują najwyższe poziomy ekspresji transkryptu CRAM-1. W regionie korowym nerki wykrywano specyficzne barwienie struktur wewnątrzkanałowych mAB anty-PRCAM(GC51) lub anty-JAM-2 (CRAM-XVIIIF26), podczas gdy anty-AO-1 lub antyJAM-1 barwiły głównie kanalikowe komórki śródbłonkowe (niepokazane).

Wynalazcy skupili zatem swoją uwagę na strukturach naczyniowych, które są zagłębione w rdzeniu i odpowiadają strukturom śródłonkowym żył promieniowych lub kanałów odprowadzających. W tym celu, dokonano seryjnych przekrojów i zidentyfikowano struktury naczyniowe przy zastosowaniu barwienia anty-PECAM (Fig. 15d). W odpowiednim regionie w sąsiednich skrawkach wykrywano liniowe barwienie śródbłonkowe przy użyciu przeciwciał anty-CRAM-1, anty-JAM-1 albo anty-ZO-1 (Fig. a, b i c, odpowiednio). Na skrawkach krezkowego węzła limfatycznego, typowe barwienie górnych śródbłonkowych żył (HREV) otrzymano z mAb anty-CRAM-1 (Fig. 15e). Stwierdzono również, że HEV wyraża JAM-1, ZO-1 lub PECAM ( Fig. 15 f, g i h) z subtelnymi różnicami w lokalizacji subkomórkowej barwienia (Fig. 15 e-h, wkładka). W obszarze korowym krezkowych węzłów limfatycznych, obserwowano typowe barwienie zatok podtorebkowych ze wszystkimi przeciwciałami (Fig. 15 i-l), odpowiadające barwieniu doprowadzających naczyń limfatycznych. A zatem barwienie przy użyciu mAb CRAM-18F26 anty-CRAM-1 jest ograniczone do niektórych komórek śródbłonkowych albo do struktur ściśle związanych z układem naczyniowym.

W celu wyjaśnienia, czy barwienie komórek śródbłonkowych odpowiada za obraz pokazany na Fig. 15, przeprowadzono analizę cytofluorometryczną ekspresji CRAM-1 na różnych liniach komórkowych albo świeżo wyizolowanych komórkach śródbłonkowych z rozpuszczonych narządów. Śródbłonkowe linie komórkowe (tEnd.1, eEnd.2 i TME) wyrażały niskie poziomy CRAM-1 na powierzchni komórek i zmienne poziomy JAM-1 (Fig 16A).

Analiza cytometryczna na świeżo wyizolowanych komórkach śródbłonkowych poprzez potrójne barwienie zawiesiny komórek otrzymanej po rozpuszczaniu narządu przy zastosowaniu kolagenazy/dispazy. Komórki śródbłonkowe identyfikowano poprzez zatrzymywanie komórek wybarwionych zarówno PECAM/CD31, jak i Acetylowanym LDL (Voyta i wsp., 1984, J. Cell. Biol. 99:2034). Barwienie dla CRAM-1 lub JAM-1 na tych podwójnie pozytywnych populacji komórek jest pokazane na Fig. 16B, w nerce i kłębkach Peyera. Wszystkie izolowane komórki pozytywne dla CD31 i acetylowanego LDL barwiły się również dla CRAM-1, co oznaczało, że co najmniej w tych narządach, komórki nabłonkowe wyrażały CRAM-1 in vivo. Kiedy przeprowadzono barwienie na komórkach otrzymanych z węzła limfatycznego, ekspresję CRAM-1 znajdywano jedynie w subpopulacji komórek, odzwierciedlając możliwą heterogenność fenotypów komórek śródbłonkowych w tej samej tkance.

Łącznie, wyniki analizy cytometryczneji immunohistochemicznej pokazały, że ma miejsce jednoczesna ekspresja CRAM-1 i JAM-1 przez komórki śródbłonkowe nerki, kłębki Peyera i węzły limfatyczne.

Dynamiczna lokalizacja CRAM-1 do styków komórka-komórka

W celu wyjaśnienia mechanizmu, dzięki któremu CRAM-1 lokalizował się specyficznie na stykach komórka-komórka zastosowano video-mikroskopię z gradientem czasowym. Komórki CHO, stabilnie transfekowane fluorescencyjną chimerową cząsteczką trypsynizowano i wysiewano do komory

PL 207 994 B1 na szkiełku w celu uzyskania obrazu. Po rozprowadzeniu komórek, powierzchniowa ekspresja JAM-EGFP nie była jednorodna, ale raczej grupowała się na stykach komórka-komórka (Fig. 17A, komórki zaznaczone gwiazdką). W czasie tworzenia się nowych styków komórka-komórka, obserwowano przemieszczenie CRAM-1-EGFP do połączenia między komórkami i intensywny sygnał fluorescencji wykrywano w nowych miejscach styku między komórkami powstającymi w nowych miejscach kontaktu komórka-komórka (strzałki). Chimerowego białka było więcej w wypustkach błonowych pomiędzy stykającymi się komórkami, prowadząc do obrazu „suwaka widocznego po 12 i 18 min. Co interesujące, lokalizacja CRAM-1 na pierwszorzędowych stykach komórka-komórka nie była tracona w czasie tworzenia się nowego styku błon (patrz styk komórek w lewym górnym rogu). Te obserwacje wskazują, że CRAM-1-EGFP przemieszczał się do owego styku komórek i po zaangażowaniu się tam, jego lokalizacja była stabilna.

W celu dalszego zbadania wymagań odnośnie lokalizacji CRAM-1 przeprowadzono video-mikroskopię w zmiennym czasie po zranieniu pojedynczej warstwy komórek (Fig. 17B). Komórki na brzegach zranienia zatrzymywały CRAM-1 w miejscach styku (ostrze strzałki), ale traciły lokalizację CRAM-1 w miejscach zranienia (strzałki), wskazując, że angażowanie CRAM-1 przez ligand przeciwnej komórki jest niezbędny do utrzymania jego błonowej lokalizacji. W czasie 90 minuty po zranieniu, komórki otaczające zranienie zaczynają migrację do obszaru zranienia. Co interesujące, te komórki utrzymują kontakt z komórkami sąsiadującymi poprzez wypustki błonowe, które dawały jasną fluorescencję tj. były dodatnie pod względem CRAM-1 (ostrze strzałki). Wyniki te potwierdzają hipotezę, że homofilowe oddziaływania CRAM-1 mogą odgrywać rolę w ustaleniu się i utrzymywaniu kontaktów komórka-komórka.

CRAM-1 zwiększa ścisłość pojedynczej warstwy i uczestniczy w ścisłych kompleksach łączących.

Ponieważ pokazano, że liczba cząsteczek uczestniczących w połączeniach komórka-komórka reguluje przepuszczalność parakomórkową pojedynczej warstwy komórkowej, testowano czy CRAM-1 mógłby również wpływać na tą funkcję. Transfekcja CRAM-1-EGFP zmniejsza przepuszczalność parakomórkową dla FITC dekstranu i ulepsza zasklepianie się pojedynczej warstwy komórek CHO o 42,5%, podczas gdy transfekcja niespokrewnioną cząsteczką Tac(IL2R α) nie zmniejszała znacząco przepuszczalności parakomórkowej transfekowanych komórek CHO (Fig. 18). Transfekcja JAM-1-EGFP zmniejszała również przepuszczalność parakomórkową pojedynczej warstwy transfekowanych komórek CHO.

Wyniki te stawiają pytanie, czy chimerowe cząsteczki były zdolne do uczestniczenia w subkomórkowym wyspecjalizowanym przedziale, takim jak ścisłe połączenie w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych.

W celu uzyskania odpowiedzi na to pytanie, chimerowe białko z EGFP transfekowano do komórek MDCK i ich lokalizację subkomórkową porównywano z markerem ścisłych połączeń okludyną. Jak pokazano na Fig. 19A, kiedy analizowano serię zdjęć co 0,9 nm pod kątem fluorescencji EGFP i porównywano z barwieniem na okludynę, wzbogacenie w CRAM-1-EGFP występowało na stylu komórka-komórka na poziomie ścisłych połączeń. Na poziomie podstawowym (na lewo) obserwowano wewnątrzkomórkowe plamy fluorescencji EGFP. Podobna analiza (Fig. 19B) komórek MDKC transfekowanych JAM-1-EGFP pokazała podobną kolokalizację z okludyną. Pomimo tego, dystrybucja fluorescencji JAM-1-EGFP była mniej ciągła, niż obserwowana dla CRAM-1-EGFP na poziomie ścisłych połączeń.

Dyskusja

Przykład ten przedstawia zastosowanie nowej strategii poszukiwań w celu zidentyfikowania regulowanych transkryptów kodujących przedstawicieli cząsteczek adhezyjnych z nadrodziny Ig. Opisane jest tutaj klonowanie według tego sposobu nowej cząsteczki GRAM-1 jako regulowanego transkryptu. Regulację obserwowaną w komórkach śródbłonkowych rosnących w obecności nowotworów potwierdzono poprzez półilościowy RT-PCR i wykazano jego zależność od fazy wzrostu komórki. Ze względu na różnicową ekspresję w warunkach zależnych od konkonfluencji komórek, zastosowano nazwę CRAM od ang. „Confluency Regulated Adhesion Molecule czyli „cząsteczka adhezyjna regulowana przez konfluencję.

Opisana jest tu również blisko spokrewniona z CRAM-1 sekwencja, nazwana CRAM-2. CRAM-1 i CRAM-2 reprezentują prototyp nowej rodziny cząsteczek adhezyjnych, która obejmuje również opisaną ostatnio cząsteczkę JAM (Chretien i wsp. 1998, Eur. J. Immunol. 28, 4094-4104; Malergue i wsp., 1998, Mol. Immunol. 35, 111-1119).

PL 207 994 B1

Ekspresja CRAM-1 i CRAM-2 następuje preferencyjnie w tkance śródbłonkowej i nabłonkowej na stykach komórka-komórka i nadaje specyficzne właściwości warstwom spolaryzowanym. Wpływ zrekombinowanej rozpuszczalnej cząsteczki w teście przezśrodbłonkowej migracji oraz regulacja JAM, CRAM-1 i CRAM-2 pokazują, że te trzy cząsteczki odgrywają ważną rolę w utrzymaniu fizjologii naczyniowej.

Udowodniono, że nowa strategia poszukiwań, nazwana TDD czyli ukierunkowane różnicowe zobrazowanie (od ang. „Targeted Differential Display), jest wydajną techniką do wybiórczej amplifikacji cDNA będącego przedmiotem zainteresowania. TDD z sukcesem wykorzystuje zastosowanie częściowo zdegenerowanych starterów do uzyskania selektywnego kierowania do konserwowanych regionów, Y(Y/Q/R)CXAS domen Ig typu C2. Powtarzane doświadczenia doprowadziły do powtarzalnych wzorów w uzyskiwanym obrazie. Z 16 różnicowo wyrażanych transkryptów, trzy odpowiadają genom ze znaczącą homologią do konserwowanych sekwencji Ig. Ten wzrost specyficzności pozwala przezwyciężyć główne trudności w znanych już technikach klasycznego odcisku palca RNA i różnicowego obrazowania. Analiza odcisku palca RNA jest od dawna stosowana do identyfikacji różnicowo wyrażanych genów. Jednakże na skutek stosowanych starterów specyficznych do sekwencji, sposób ten wykrywa jedynie transkrypty wybranych i znanych już białek. Z drugiej strony, zobrazowanie RNA wykorzystuje startery losowe i zakłada niespecyficzną amplifikację transkryptów. Celem w tym przypadku jest uchwycenie jakichkolwiek różnic w poziomie mRNA pomiędzy dwoma systemami biologicznymi, które poddaje się porównywaniu. TDD jest zaawansowanym sposobem poszukiwań, który łączy specyficzność analizy odcisku palca RNA z degeneracją różnicowego obrazowania RNA czego wynikiem jest selektywność. Na skutek kierowania do celu spokrewnionych transkryptów, technika ta znacząco skraca czas wymagany do poszukiwań. Identyfikacja nowych przedstawicieli specyficznej rodziny białkowej staje się zatem możliwa. Jest to istotne ulepszenie opisanych nie specyficznych przeszukiwań.

Te wspólne właściwości zostały zastosowane do skonstruowania zrekombinowanych białek w celu badania funkcji JAM, CRAM-1 i CRAM-2. W niniejszym przykładzie, opisany jest wpływ sJAM-Ig2Do i sCRAM-1-Ig2Do w teście transmigracji in vitro. Specyficzny wpływ blokujący na migrację komórek mieloidalnych można było zaobserwować w przypadku sCRAM-1-Ig2Do, podczas gdy sJAM-Ig2Do wykazywał jedynie niewielki wpływ na limfocyty.

Transkrypty JAM i CRAM-2 wykazują podobną dystrybucję tkankową i regulację ekspresji pod wpływem TNF, co wskazuje, że działają one poprzez podobne mechanizmy fizjologiczne. W przeciwieństwie do tego, transkrypty CRAM-1 nie są regulowane przez TNF, ale raczej poprzez szybkość proliferacji lub gęstość komórek śródbłonkowych. Rzeczywiście, nadekspresja transkryptów CRAM-1 w przechodzących cykl komórkach i obniżenie ich poziomu w komórkach spoczynkowych wskazują, że cząsteczki te uczestniczą w ustalaniu się ciągłej pojedynczej warstwy komórkowej. Jego funkcją w konfluentnej pojedynczej warstwie komórek jest utrzymanie warstwy komórek śródbłonkowych i związanych z tym właściwości. Ponieważ różne populacje leukocytów muszą migrować do miejsca odpowiedzi immunologicznej, sądzi się, że komórki nielimfoidalne migrują poprzez mechanizm zależny od CRAM-1, podczas gdy komórki limfoidalne migrują z udziałem JAM i CRAM-2. W tym przypadku, odpowiedź immunologiczną można modulować poprzez zastosowanie kombinacji różnych rozpuszczalnych zrekombinowanych cząsteczek.

Claims (12)

1. Polipeptyd w postaci wyizolowanej należący do podrodziny ludzkiej nadrodziny immunoglobulin, wybrany spośród:

a. polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową mysich cząsteczek adhezyjnych regulowanych przez konfluencję 1 (CRAM-1) jak przedstawiono na Fig. 3 (pogrubiona czcionka)

b. polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową ludzkiej CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6 B.

2. Poli- lub oligonukleotydy o sekwencji nukleotydowej, która koduje kompletny polipeptyd albo jego część, który to polipeptyd jest wybrany spośród:

a) polipeptydu zawierającego sekwencje aminokwasową mysich cząsteczek adhezyjnych regulowanych przez konfluencję 1 (CRAM-1) jak przedstawiono pogrubioną czcionką na Fig. 3.

PL 207 994 B1

b) polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową ludzkiej CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6 B.

3. Poli- lub oligonukleotyd według zastrz. 2 o sekwencji nukleotydowej identycznej z sekwencją nukleotydową ludzkiego CRAM-1 jak przedstawiono na Fig. 6A.

4. Poli- lub oligonukleotyd według dowolnego z zastrz. od 2 do 3, który jest RNA albo DNA.

5. Poli- lub oligonukleotyd według dowolnego z zastrz. od 2 do 4, który jest starterem, sondą albo antysensownym RNA.

6. Polipeptyd w postaci rozpuszczalnej zawierający domeny zewnątrzkomórkowe VH i C2 polipeptydu określonego w zastrz. 1 jak przedstawiono na Fig. 8B do zastosowania jako lek użyteczny do leczenia reakcji zapalnych.

7. Polipeptyd jak określony w zastrz. 1, w postaci rozpuszczalnej do zastosowania jako lek użyteczny do modulowania przepuszczalności naczyń w guzach.

8. Przeciwciało skierowane przeciw polipeptydowi określonemu w zastrz. 1.

9. Przeciwciało jak określone w zastrz. 8 do zastosowania jako lek użyteczny do kierowania cząsteczek do komórek zawierających polipeptydy określone w zastrz. 1.

10. Przeciwciało jak określone w zastrz. 8 do zastosowania jako lek użyteczny do hamowania naczyniotworzenia w guzach.

11. Przeciwciało jak określone w zastrz. 8 do zastosowania jako lek użyteczny do leczenia reakcji zapalnych.

12. Przeciwciało jak określone w zastrz. 8 do zastosowania jako lek użyteczny do zwiększania przepuszczalności naczyń w guzach dla dostarczania leków.