HU229376B1 - Vascular adhesion molecules and modulation of their function - Google Patents

Description

A találmány tárgyát izolált polipeptid képezi, amely az emberi Immunglobulin Szupercsaládba tartozik, és amely legalább 70% szekvencia-homológiát mutat az egér 1-es Összefolyással Szabályozott Adhéziós Molekulával („Confluency Regulated Adhesion Molecule, CRAM-1 vagy CRAM-2), a polipeptid elleni ellenanyagok, valamint azok gyulladás és tumorok kezelésében történő alkalmazásra.

Μ««

Éradhézsós mofekulák és funkciójuk modulációja

A találmány tárgya ér&dltéziós molekulák alcsaládjának azonosítása, biológiai aktivitásuk azonosítása és· ezen molekulák funkciójának modulációja különféle betegségek kezelésére.

Az embrioná-bs és: születés utáni korai fejlődésben az endotéliumsejtek proliferálódnak és differenciálódnak, új ereket kialakítva vaszkulegenezés és angiogesezls révén. A felnőtt szervezetben az endoíélitíni határozza meg a vár-szövet határt,, és nem c&íizáló, néma sejtekből áll. Ezen polarizált sejtek szoros kapcsolatokkal („tigbt junction) ős tapsáós kapcsolatokkal (..adhcreus junction”) kapcsolódnak egymáshoz folyamatos sejtréteget alakítva ki. Az endotelláíis réteg funkciói közé tartozik a szöveti homeoszíázis, fibrinolízis, koaguláció, vazotónus és leulcoeita áfvánáorlás fenntartása. Mindezen tulajdonságokat adhéziós molekulák expressziójáttsk és funkciójának finomhangolása szabályozza.

Patológiás helyzetek, mint például -gyulladás, tnmomövekedés, sérülés vagy angíogenezis az adhéziós molekulák számának és funkciójának átmeneti megváltozásához vezetnek az ér endoteliumában, és ez az ér megváltozott bomeosztázisát eredményezi. Például tumorok megnövelik az angiogén faktorok helyi koncentrációját, amelyek a nem dklizáió, séma sejtek prcdiferáíö endotélíummá való átkapcsolását váltja ki. Az angíogés átkapcsolást számos faktor váltja ki, köztük az ÍL-8, .az ep-ldermálls növekedést faktor (EGF), a vaszkuláris endotélium növekedési faktor (VEGE), az oldható VCAM-l, a bázikus tibroblaszt növekedési faktor (bFGF) és a tumor nekrózis fektor (TNF). Ennek eredményeképpen a meglévő érék endotéKumsejíjsi lebontják az extraceiluláris mátrixot (ECM), és: elözönlik a környzo szöveteket, ami & tumorok erekkel való ellátásához vezet.

Az angfegán átkapcsolás: során az eodotélkiíis génexpmssaáó mintázata megváltozik. Például az endotéliumsejtek bFGF-fel vagy TNFo-vai való kezelése, az cgjk-íntegrin — ami egy, az endotéítotnsejtek vándorlásában szerepet j átszó adhéziós .molekula - expressziójának négyszeres nö vekedését eredményezi. Ezenfelül az aagiogán átkapcsolás· módosítja az endotélium gyulladásos válaszreakcióját, és a leukociták tumorok felé történő abnormális vándorlásához vezet Normálisan a leukociták elhagyják a vért az endotéliumhcz tapadva és azon átvándorolva, Ezen mechanizmusok többlépcsős- folyamatban mennek végbe, amiben szelekéinek, integrinek és Immunglobulin Szupercsaládba tartozó adhéziós molekulák vesznék részt

A tamorra! kapcsolatos endotéllnmban a YCÁM-ről, ICAM-ról és .szelekunekről kimutatták, hogy alulszabáiyozottak. Ezen adhéziós molekulák aiutezabályozása olyan mechanizmust képviselhet, amely révén a tumorok elkerülik az immunrendszer cltotoxikas sejtjeinek az invázióját A WO 98/2489? számú nemzetközi közzétételi írat tárgyát képezik humán és egér eredető-junketós adhéziós molekulák (JAM), valamint feltár eltaianyagokaí és oldható JAM expresszióját is, A WO 00/36302 számú nemzetközi közzétételi irat feltárja a ERŐ I 8ő8 nevű fehérje polhmkieotid- és polipeptid-szekvenciáját, de nem tár fel konkrét biológiai aktivitást,

A találmány célja az Immunglobulin Szupercsaládba (lg Stj tartozó új adhéziós molekulák keresése, amelyek transzkripciósán szabályozottak tumorok befolyása alatt álló endotéliumban.

A találmány további célja az. éj adhéziós fehérjékből származó -.molekulák meghatározása ktiiSobőző indikációk, mint például tumorok és gyulladás kezelésében való alkalmazásra.

A találmányhoz vezető kutatásban kísérleti egérmodellt -alkalmaztunk a szabályozott fesnszkriptumok azonosítására endotéllális: sejtvonal és melanóma-sejtek együtt-tenyésztése során. Annak érdekében, hogy a szkrínelési stratégiát az lg ST adhéziós molekulákra korlátozzuk, az RNS-prezentőlás („RNA display”) egy új

Aktaszámunk; 95333-3ŐI5A/1T **»« megközelítési módját fejlesztettük fa. z\ módosított prezentálást módszer újdonsága abban van, hogy csak. egy készlet áegeneráit iánemditót alkalmazunk. Mint ahogy a példákban bemutatjuk, meglepő módon azt találtok, h ogy ez elegendő spéc iik is ást eredményez.

Közelebbről, az lg Sf tagok C2-deménjeibes található konzervált szekvenciák célzáséra tervezett részlegesen degeneráií iáíioindhókat (jelen esriben a degeneráltság foka 2048 és 4096 közötti különböze láuebsdltó egy készleten belül) alkalmaztunk Polimoráz Láncreakción (PCR) alapuló Célzott Differenciális Prezentációs Módszer („Xargeíed Diífererttial Display technkpue”) irányítására (Samaridís és Coionna, Enr. j. Immunok 27,660-665. old. (W7)j.

Ezen fölismerés alapján a találmány tárgya eljárás differenciálisán expres-szált DNS-szekvenciák speciftkus azonosítására Differenciális Prezentációs Reverz Transzkripciós PCR alkalmazásával, amelyben egy készlet, a célgénre specifikus, részlegesen -vagy teljesen degenerált láneindkót alkalmazunk. A hagyományos RNS-prszetüáiási stratégia egy fő korlátja az eljárás spectiltásának hiánya. Ezen specifitás növelése céljából egyéb adhéziós molekulák keresése során degeaerált láncmdítókat alkalmaztunk, amelyek Cj-dométmeí rendelkező molekulákat kódoló szekvenciákat vesznek célba. Ezt számos lg Sf adhéziós molekula. Cy-doménjéioek egymás alá rendezésével és egy lineáris amin-ösav-konszenzns azonosításával értük el, amely a Cj-doménben részi vevő ciszíein-oldalláocot vesz körül; Y-(RQYS)-C-x-A-S-N-XrG· Általánosabb-értelemben ezen megközelítési mód alkalmazható lehet más szekvenciák keresésére is, amely során a leggyakoribb konszenzus szekvenciák közül egy vagy több reverz írattszidciójáí alkalmazzuk degeneráit láncisdlíók tervezésére differenciális prezentáció céljára.

Az eljárás lehetővé tette egy íranszkriptum azonosítását, amelyet az összefolyás ahdszabályoz endetéltasejtekben, melaaóma- vagy karcinómasejtek jelenlétében, A oDNS az lg Sf egy molekuláját kódolta, amely szokatlan szerkezeti elemekkel rendelkezett, és összefolyással Szabályozott Adhéziós Molekulának („Conflnency Reguhúed Ádhesion Mofecuie'’, CRAM-3) neveztük el. A CRA.M-1 polinukleotid- és polipeptidszekvenciája azonos a WÖ ÖÖ/3Ö1Ö2 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt PRO 1 Sód szekvenciájával, de írt azonosították először a biológiai aktivitását. Egy szerkezetileg hasonló, a leukocita vándorlásban szerepet játszó íKölekuki, a IÁM felss leírása sugallta az: adhéziós molekulák egy új családjának a létezését, amelynek a IÁM és a CRAM-Ί a prototípusai. EST-adatbázisokkal való szekvetteia-összehasoniltás ezenkívül lehetővé tette ezen molekulacsalád harmadik tagjának, a CRAM-2-nek a klónozását. Az 1. ábrán a CRAM- 1 és CRAM-2 fehérjét kódoló egér cDNS-szekvenciákat mutatjuk be. A bejelentésben a IÁM és JAM-l, CRAM-I és IAM-2, valamint a CRAM-2 és IAM-3 neveket felcserélhető módon használjuk,

A IÁM, CRAM-I és CRAM-2 fehérjéket kódoló transzkriptumok összehasonlító szöveti eloszlási elemzése azt mutatta, hogy ezen molekulák elsősorban endotéliális és epiíéhális kompartmentekben expresszáiödnak, a sejt-sejt közti érintkezés föjmförtásában való szerepel sugallva ezáltal, A néma endotéliális sejtek ezen sejt-sejt közti kölcsönhatásai szabályozzák az erek áteresztőképességét, a sejtciklust és a íeukociták átvsodorlását az crfelos keresztül.

A bárom molekula funkciójának és kölcsönhatásának további megvilágítására molekuláris megközelítési módot alkalmaztunk, fentiek érdekében kiméta molekulákat hoztunk létre, amelyek Ffög-cimke és Fokozottan Zöld-fluoreszcens Fehérje („Enhanced Grecu Flaerescent Protein”, BGFP) és CRAM-1, CRAM-2. vagy IÁM oldható vagy mernbránkőtőtt formáit tadáimazíák (ezeket a 2. ábrán foglaljuk össze). Sejtvonalakba íranszfektálva a CRAM-I és JAM feGfeP-iuziős terméke a sejt-sejt kapcsolódási pontokon helyezkedett el, meg-3XX * » ♦

X ·:

erősítve ezen molekulák szerepét a sejt-sejt közötti kommunikációban. Ezzel szemben a CRAM-2 sokkal szélesebb körben oszlott el a sejt felszínén, Ezenkívül a CRAM-l oldható konstrukciói gátolták a kiskockák, endotélkunon keresztüli átvándorlását ./» yfíro, míg az oldható JAM csak csekély hatást mutatóit. Mindent őszszevetve· az eredmények: azt sugallták, hogy az adhéziós molekulák ezen öl alcsaládjának központi szerepe van a vaszknlárís integritás fenntartásában ás az endotéliálís réteg működésében.

Ezen fölismerések alapján a találmány tárgyát orvosi indikációk, mint például krónikus gyulladás vagy tumorképződés elhárítására. alkalmas eszközök képezik CRAM-peiipeptidsken alapuló reagensekkel.

Előnyösen a tal&teáay tárgyát az emberi Immunglobulin Saupercsalád egy aksaládjóba tartozó izolált polipepdd képezi gyógyszerként történő ateimszésra, amely legalább 70% szekvencia-somolőgiát mutat a 3. ábra felső sorában bemutatott egér 1 -es Összefolyással Szabályozod Adhéziós Molekulával (CRAM-l).. A 4. és S·.. ábrán sz egér JAM-2 (CRAM-l) és 7ΑΜ-3 (CRAM-2) ammosav-szekvenciájának egymás alá rendezését mutatjuk be.

Az. emberi vagy állati szervezetben található CRAM polípeptldek a növekvő sejtek markerei, A CRÁM-expresszto feiüiszabályozotí olyan sejtekben, amelyek növekednek.

Két egér poiípeptídet tárnak fel, amelyek ezen család tagjai. Ezen pohpeptidek szekvenciainformációja alapján· azonosíthatjuk: a család más tagjait jól ismert módszerekkel, mmt példáid PCR-rel, DNSkönyvtárak kereszt-blbridizácícjával, ellenanyagok kereszt-reaktivitksávah

A szekveneía-iufonnáeió lehet akár az am-isosav-szekvencla, akár sz aminossv-szekvenciát kódoló nnkleotid-szekveneía.

Előnyösen a találmány tárgya tehát egy megfelelő pclspeptíd gyógyszerként történd alkalmazásra emberben, amely lényegében a ÓB ábra középső részért látható aminosav-szekvenciát tartalmazza, vagy azzal legalább 70%-bau homológ aminosav-szekveadát tartalmaz.

A feltárt: két CRAM-fehérje szekvenda-mformáelójának a család más tagjainak más fajokban, mint például emberben való azonosítására való alkalmazása mellett a két feltétje és a megfelelő .családtagjaik síkéimoshatók számazék-rnolekttlák előállítására is, mint például a találmány szerinti (polí)peptídek ellesi ellenanyagok, vagy a fehérjék rekombittáss ekvivalenseinek előállítására, adott esetben oldott formában, vagy a polipeptid legalább részleges amfeosav-szekvetóáját tartalmazó peptídek előállítására. Az ammosavszekvencia megfelelő részel különösért az exíracellnlárls doméúek: VC& és a membránkőseil ehopíazmalikus .szekvencia: A-£Y,QH^HR,K.]-O-í€,Y]-F.

Ellenanyagok és (poli)peptíd rtpusú származékok mellett a találmány tárgyát képezik poli- és olígunukleotídok: is gyógyszerként történő alkalmazásra, amelyeknek a szekvenciája a teljes polipepíldet vagy annak egy részét kódolja, amely polipeptid amínosav-szekvenciája legalább 7ó®4-bars homológ, a CRAM-l fehérje feltárt amiimssv-szekwtciájával. Közelebbről & találmány tárgyát képezik olyan mrkleofírt-szekvesciák gyógyszerként történő alkalmazásra, melyek legalább 70%-ban, előnyösen legalább 80%-bars, előnyösebbért legalább 90%-han, legelőnyösebben lényegében 108’%-ban homológok az emberi DNS CRAM-l szekvenciájával, amit a ó. ábrán mutatunk, be, ilyen poli- és elígonukieotid például lehet RNS és DNS, és lehet lánemditó, próba, antiszensz RNS, stb.

Minden ilyen molekula alkalmazható az eredeti, emberi vagy állati szervezetben található polipeptid funkciójának a modulálására, vagy diagnózisra.

*« «χ««

Az angiogeaezist. például daganatokban, gátolhatjuk ellenanyagokkal. Azok célzó otolekulákként alkalmazhatók a CRAM-poiipeptídeí hordozó sejtek esetén. Az elienarivagok magukban hathatnak, vagy más molekulához kapcsolhatók, mint például taxisokhoz,, radioaktív jelzőkhöz, 'fíwreszcess jelzőkhöz, enzimes jelzőkhöz, fénnyel aktiválható jielzökhős, de liposzóínákhoz·, sejtekhez, stb, is.

A jelólt ellenanyagok különöse» megfelelőek az ellenanyagok diagnosztikai alkalmazására, azaz azokat angiogenezls lokalizálására használhatjuk növekvő daganatokban. Ezenfelül toxínokhoz vagy radioaktív molekulákhoz kapcsolt ellenanyagok alkalmazhatók a tömör belülről való specifikus elpusztítására a daganatban lévő (növekvő) erek célzása révén.

Úgy találtok, hogy CRAM-tfpusá molekulák nem deíektálhuíök a normál érrendszerben, kivéve a nyirokrendszert és a nyirokszerveket, mint például nyirokcsomók és Peyer-féle plakkok magas esdötéliális yenuláit,. Ennek előnye az, hogy a például az anti-CRAM ellenanyagok célzása nagyon specifikus lehet, például .daganatsejtekre, elkerülve ezáltal a nemkívánatos mellékhatásokat.

Ezenkívül a (poli)peptidek kötődhetnek a molekulához anglogestes erekben, és ezáltal serkenthetik vagy gátolhatják -az sngíogenezist.

A CR.AM-j>olipeptldekket lényegében megegyező anunosav-szekveneiájú oldható (polijpeptid alkalmazható az ér-endoíélferm gyulladásos reakcióinak a kezelésében. Azt találtuk, hogy a leukociták endoiéhum.os keresztül történő vándorlása gátolható sCRAM-l-ÍG2Do-vaI vagy CRAM-5 elleni monoklonáiis ellenanyagokkal Ez és hasonló molekulák tehát alkalmazhatók itníntmolögía reakció, mini például a gyulladásos reakció csökkentésére vagy serkentésére.

A molekula »« vjVo specifikus expresszié)» HÉV érsejt|eíK - amelyek límfocíta vándorlásra specializálódtak - a CRAM límfocks^vándortósra és ár-áteresztőképességre gyakorolt serkentő hatása mellett érvei. Ez a hatás- az. érágy elzárásba» normálisa» részi vevő molekulák (CRAM-1, CRAM-2, JAM, FECAM, VECadheria) modulálása miatt lehet. Ez a felismerés az alapja a találmány más alkalmazásainak az mtoreadotéliális kapcsolatok -szabályozására, találmány szerinti rekombisáns CRAM molekulák, ípolijpeptidek, vagy CRAM-l elleni monokiorsális ellenanyagok odajuttaíása révén.

CRAM ellesi ellenanyagokat alkalmazhatunk a növekvő sejtek .sejt-sejt közötti kölcsönhatásainak gátlására is. Ez az mtercellulárís kapcsolatok szétbomlásához vezet, amelyek normálisan a vérerek gát funkciójához szükségesek. Ezt a felismerést a növekvő erek áteresztőképességének növelésére alkahnazlsujuk, annak érdekében, hogy fokozzuk a drogok eljutását a célhelyre, mint például növekvő daganatokhoz, menstruáció utáni roéhbe, stb. Az íntercelhdáris kapcsolatok szétbomlása tehát alkalmazható az antigént hordozó daganatsejtek, mim például angíóms (ér-endotéimmbói származó daganatok) vagy némely gyorsan növekvő kareinőma fejlődésének gátlására.

A diagnosztikai alkalmazás jelölt ellenanyagokkal történhet, de jelölt -oltgenokleet-idokknl is, amelyek komplementerek a CRAM-fehérjéikéit expresszsló csdotéltális sejtekben található DNS-sel vagy mRNS-sek

A találmányi az alábbi példával kívánjuk. Illusztrálni, amelyben a mellekéit ábrákra hivatkozunk:

Az 1, ábrán a CRAM-l és CRAM-2 fehérjéket kódoló egér cCNS-szekveneiákat mutatjuk be, A maCRAM-l-et pcöNA3-vektorha szuhklónoztuk, és Spö és T7 lánmndítókkai szekvenáliuk, A muCRAM-2-t IMAGE klónkésh szereztük EST-könyvtárból (AA69Ö843 és WS2Ö145), és pT?T3-DPae-vektorban szekvenáltuk T? és T3 láríciuditők alkalmazásával.

-5Α 2. ábrán a példában alkalmazott molekuláris eszközök sematikus ábrázolását mutatjuk be. Az áj család szerkezetét és: fontos oldalláncúk a felső részen mutatjuk be. A csillagok a feltételezett foszföriláciős helyeket jelölik a három molekula eíéoplazmstikus részén. A C2-dómén második k&nohikus -cisztein oldtttlánea hiányzik a JAM-szekvencíában. Atel különböző kanéra molekulákat matatunk be a fúziós hely helyzetével: és a körülvevő oldalláneakkal A molekulák JAM. CRAM-i és CRAM-2 szekvenciákból eredő részeli fehér háttérén mutatjuk be.

A 3, ábrán a CRAM-1 és CRAM-2 anőnosav-szekvenciájának egymás slá rendezését mutatjuk. be, A mseket kötőjellel jelöljük.

A 4, ábrán egér és ember CRÁM-1 (.IAM-2) szekveasiájának egymás alá rendezését matatjuk be.

Az 5, ábrán egét és ember CRAM-2 (.SAM-3) szekvenciájának egymás alá rendezését mutattuk be.

A 6. ábrán az ember; CRAM-1 oukleotid-szekvenciáját (felső részi, az emberi CRAM-1 teljes aminosav-szekvenciáját (középső rész), és az emberi CRAM-2 részleges amtnosav-szekvenctájáí matatjuk be.

A 7. ábrán célzott differenciális prezentációt mutatunk be áegenerált láncindkókkal. Az (A) részben a €2 lg~doménben lévő szekvenciák PCR-láncínditőmak nukleotid-szekvenciáját mutatjuk be. Két lánclndltó ugyanazt a szekvenciát kódolja szerte óldalláncot kódoló kodooek miatt A degeneráitság mértéke 4Ö9Ö az YRCX.AS szekvenciát kódoló UnefedMsra, és 2048 a többire. A (B) részben az YYCXAS1 lánc indítóval kapott radioaktív FCR-terrnékek prezentációját mutatjuk be. .A sávok azon PCR-íermékek prezentációjának felelnek meg, amelyeket t-end fináotéliálls settvönalbói (..t-erd'· sáv), Βϊδ-méíaaőma sejtvonalból Í,.B ló sáv), vagy a kér sejtvonsl együtt-tenvészíésébői (középső sáv) kapott eÖNS futtatásával kaptunk. Nyíllal jelöljük az együtttenyésztéses körülmények közötti akilszabályozott CRAM-1 íranszkriptummai kapott PCR-terméket.

A 8, (A) ábrán az 1-es Összefolyással Szabáivosott Adhéziós Molekula (CRAM-1) cDNS-ének mtkleotid-szekvenciáját és kikövetkeztetett amínosav-szekvenelájáf mutatjuk be. A feltételezett hidtofób szignálpeptid szekvenciát (első) és '«aaszmemhtea szekvenciát (második) aláhúzással jelöljük. A megjósolt Nglikozilációs helyeket (áthúzással jelölve), valószínűleg dlszalftá-hidat alkotó eiszteínekst (zárójellel jelölve) és a lehetséges foszforilációs helyek Ser/Thr/Tyr Gklailáncatt (félkövérrel szedve) szintén jelezzük. A (B) ábrán az egér CRAM-1 feltétje szerkezeti: modelljét mutattuk be. Az exiraceHuiárts rész egy VH- és ssy C2-szerÖ dométst m»teí. két feltételezett N-kapcsolt gilkoziiáeiós hellyel. A nyíllal a Célzott Differenciális Prezentációban alkalmazott részlegesen degenerált láactedftókkal (YYCXASt) célzott régiót jelezzük.

A 9. ábrán a IÁM, CRAM-1 és CRÁM-2 fehérjék szekvenciájának egymás alá rendezését mutatjuk be. Az azonos oldalláncokat feketével jelöljük, a homológok olösiláneokat szürkével. Az általános azonosság 36% 8 CRÁM-2 és CRAM-1 között, 3 i % a .1AM és CRAM-1 között és 33% a JA.M és CRAM-2 között; a megfelelő homológja értékek sorrendben 52%,. 52% és 49%. A réseket kötőjellel jelezzük a szekvenciákban. A VHás €2do®é»ek kanonikus konzervált oldalláneait (Cys és Trp) -csillaggal jelöljük,

A 19. ábrán JAM-ot, CRAM-1 -et és CRAM-2-t kódoló ttanszkriptumök expresszióíst mutattuk be különböző vonalakban RT-PCR-rel detektálva (A), vagy különféle szövetekben „Northern bloC-lal detektálva (B). (A): az RT-BCR-t TNF-fel kezelt (a .2- és 11. sáv felel meg a TNF-fei kezelt t-end-nek), vagy nem kezelt (a 3,, 4., ő„ 7., 9. és 12. sáv felei meg sorrendben a b-end.S-nek, e-end.2-nek, ί-οη0ν'“Ι/'-«;ά;, t-endV^L^-nak, TME-nek és i-end-nek) enaotéliális sejtvonalbéi származó oDNS-en végeztük. Az 5. és lö. sáv felel meg sorrendben a Blő (naelanóma) és KLN2Ö5 (kareinötua) daganatos sejtvonalateak, A 8. sáv felel meg a nem transzformák MTE'4-14 csecsemőmirigy sejtvonafeak. Az 1. -sáv a JAM, CRAM-1 és CRÁM-2 amplifikácló pozitív

-όο* ( χ **

4, φ «· « ««»» ** .kotströllja a klónozott eDöiS-eket hirtalmazö 'plazmidokos. (8): P^5jí-vei jelölt próba egér „Northern- bloí”-hoz való hibridizációjának antoradiográfiája, Az egyes hibridizációkhoz alkalmazott próbákat a bal- oldalon jelezzük. A 3AM és CRAM-Í hibridizációjának jeleit 2 kb nagyságnál, detektáltok.

A ! 1. ábrán JAM-2 és IÁM-1 létező sejt-sejt közötti kapcsolatokon való- elhelyezkedését mutatják be. A: Az immtmcitokéttuát paraíormatdehiddel rögzített TME'sejteken hajtottak végre anri-IAM-2 (a) vagy aníiJAM-1 (b) ellenanyagokkal Nyilakkal jelezzük a fehérjék specifikus elhelyezkedéséi. a sejt-sejt kapcsolatokon, A tnéretjelölés jelentése 10 gm. 8: JAM-2-EGFP (a) és JAM-Í-EGFP (c) kíméra motektsiák specifikusan a transzfokíáit sejtek közti sejtkapcsolatokon helyezkednek el. Az. EGFP rekombináns feitetjék feldhsulása nem figyelhető meg trsnszfektált és nem. Sranszfektáh sejtek között (nyíl). A méretjelőlés jelentése 20 ttm, C: JAM-2 ímmtaspreclphációjá TME endotéliális sejtek felszínének bíotinilálása után. Artti-RECAM-ot (1. sáv) és sttttJAM-l-et (2, sáv) alkalmaztunk negatív és pozitív kontrollként a CRAM-XIXH3Ó ellenanyaggal (3, .sáv) való. immonpreciphác lóhoz, A molekulatötnegeket a jobb oldalon jelezzük. D; EGFF rekombináns fehérjék immtmpreeipháeiója CHO Iranszfoktált sejtekből. Astí-JAM-2-ί {2,, 3, és ó, sáv), anti-JAM-l-et (í,, 4. és 5. sáv) alkalmaztunk a nem trssszfekíáit (1, és 2. sáv), JAM-l-EGFP-vel transzfektált (3. és 4. sáv) vagy JAM-2EGFP-vel transsíektált (5. és ő. sáv) CHÖ-sejtek biothsíiáit ItzáEumainak immunpreclpitálásához, A molekulatömegeket a jobb oldaton jelezzük.

A 12. ábrán lépsejtek vándorlását jmttatjuk be TNF-fel aktíváit enöoteliőma egysejtes rétegen keresztöl, SDF-1 kemökts jelenlétében vagy anélkül. Háromféle ertdotdiómát alkalmaztunk:, vad típusú kend. 1-et vagy t.etsd.l-et CRAM-1 vagy CRAM-2 cDNS-ével transzfektálva. Két ntonokionáíís: ellenanyagot vizsgáltaik az átvándorlásra való hatás képessége szempontjából az F-26-ot és Η-26-ot, mindkettő patkány IgGl monoklonális ellenanyag egór CRAM-1 elles termelte· ve,

A .13. ábrán a CRAM-1 szabályozását mutatjuk be az összefolyás függvényében. A szemlkvaatiiatív PCR-t HPRT és CRAM-t cDNS-etee specifikus láncindítók keverékével végeztük. A FCR-reakciök&í 1,2%-os agarózgélen megfuttattuk és otídiambretniddal festettük. Az 1., 2. és 3 sáv sorrendben 100, 50 és !0%-os összefolyásnak felei meg. Gyengébb jelet -figyeltünk meg CRAM-i-re fö6%-os összefolyásnál (1. sáv). Az endalélí'áhs sejtvönalak (t-end,! és. TME) tenyésztési kőrülmónyeit (magukban vagy KLN205 daganatos ssjtvonallai keverve) j élezzük.

A 14. ábrán JAM-2 (a), JAM-i (fe) vagy tj-aktin (c) transzkripmorok'„Northern biot” elemzését matatjuk be egér szövetekben. Embrionális poszí-koitutn („pc”) és felnőtt mKNS preparátumok eredményét mutatjuk be. A hibridizációs lelek nagyságát a jobb oldalon jelezzük,

Á 15. ábrán JAM-2, IÁM-1, 2Ö-1 és FFCAM expresszió immunhíszlolőgiai elemzését matatjuk be. Vese sorozatos metszeteit (a«d>, vagy hélfedri nyirokcsomó metszeteit {«-!) festettük antí-JAM-2 (a, e, i), antiIAM-1 (b, f, j), attti-ZO-1 (c, g, k) vagy antl- PECAM (d, h, l) ellenanyagokkal. Az összes képsorozatot (a-d, eb ős i-l) .azonos beállítás mellett, vettük fel CCD-vel,

A 16. ábrán eödoíéiíálís sejtek JAM-2 expresszlóját matatjuk be. Az. A részben endetéliáiis sejtvonalak ítEnd.L eEnd.2 és TME) vagy pikkelyes kureinőtna sejtvonal (KLN2Ö5) JAM-2, JAM-1 és PECAM expressziójának cítofiiíorimetríás elemzését mutatjuk be. A szaggatott profitok CÍM elten termeltetett ellenanyaggal kapott negatív kontrollt jelzik. A B ábrán frissen izolált endöíéháíts sejtek JAM-2 eitoflnoritneíriás elemzését matatjuk be. A jelzett szerveket Roilagenáz/díszpáz emésztéssel bontottuk szét, DILAc-l..DL.-!ei, CD3l-gyel és anri-IAM-2-vel vagy anti-JAM-l-gyel festettük, amint azt jelezzük. A hisztogram profitokat

-7DHAc-LDt-re (FL-2) és CDS l-re (FL-3) pozitív endoteliáiis sejtpopulációk kapuzásával kaptok, A negatív kontroliokai a JAM-1 vagy JAM-2 ellent elsődleges snonoklonélts ellenanyagok kihagyásával kaptak.

A. 1?.. (A) ábrán, a JAM-2-EGFP elhelyezkedését mutatjuk be sejt-sejt közötti kapcsolatok kialakulása során. Egyedi fluoreszcens képeket gyűjtöttünk 3 percenként 1 órán keresztül -a JAM-2-EGFP-vel transzfekíáít CH-Ö sejtek egysejtes réteg képzése során. Az első 18 perc alatt kapott képeket mulatjuk be. A ö időpontban csiliaggai jelöljük a képmezöben jelenlévő három sejtet A 6. 12 és 18 perces Időpontban nyíllal jelöljük a JAM2-EGFP áthelyeződését az újonnan kialakult sejt-sejt kapcsolatokhoz. A. (8) ábrán JAM-2-EGFP sebzés utáni elhelyezkedését mulatjuk be. Nyilakkal jelöl jak a sebzett oldalt, és nyílhegyekkel emeljük ki a JAM-2-EG.FPben gazdag memferánayulványokat. Az eltelt időt is jelezzük a képeken. A méreíjulöiés jelentése 10 gm,

A 18. -ábrán :a. paraceihíláris áteresztőképesség csökkenését mutatjuk be JAM-2 expresszié hatására. Az (Aj részben a psraceiluláris áteresztőképességet FFFC-dextrán diffúzióval értékeljük nem transzfektált CHO sejtek, Tác-cal (huitlRa) transzfektáit CHO sejtek, vagy a jelzett EGFF fiizlós fehérjével (JAM-l vafgy Jam-2) transzferált CHO sejtek egysejíes rétegén keresztül. JAM-2-EC-FP vagy JAM-l-EGFP trenszfektalása CHO sejtekbe a paraoelkláris áteresztőképesség szignifikáns .csökkenéséhez vezetett (57,8% + 4,9%, illetve 70,8% £ 3,6%, p<0,Ü8Öl), míg Tac Erunszfektálása nem hatolt szignifskássan -a paraceilulárls áteresztőképességre (100-,4% i 4,4%, p^Ö,9572), Az eredményeket nem transz.fekíáít CHO sejtekre nonaalizáltük.

A 19, ábrán IAM-2-EGFP (A) és JAM-1-EGFF (B) célzását mutatjuk be már meglévő szoros kapcsolatokhoz. JAM-2-ECFP-vel (Aj vagy JAM-1-EGFF-vei (B) stabilan teanszíekták, összefolyt MDCK sejteket festettünk ansi-okkíadínnaí és anti-nyál-Texas/Vőrössel. Az alapitól a csécsi szintig minden 0,9 pm-en készített képek sorozatát mutatjuk he EGFP-fluoreszeeneiára (a) és okkludln festésre (b). Az alapi szintet önkényesen a bal oldalon állapítottuk meg, ily mádon a sorozatos képek a *3,6 és +4,5 pm-es szintes tartalmazzák fókuszban a szoros kapcsolatokat (4. és: S. kép a jobb oldalon).

A 20. ábrán oldható -rekömbináns ujötekulák hatását mutatjuk be leu&ociták endötélmmon keresztüli vándorlására. Az (A) részben, az átvándorlást viszony-számként fejezzük ki és a sem kezelt t-end sejtvönalm kapott értékekre normalizáljsk (szaggatott vonallal jelölve). Az 1 pg s)AM-lg2do (üres négyzettel jelölve) jelenlétében és 1 pg sCEAM-l-lg2do (teli körrel jelölve) jelenlétében kapott eredményeket mutatjuk be, A viszonyszámot 5 független átoásdorlási kísérlet átlagaként számítjuk. A (B) részben sz átvándorolt sejtek fenotípusái sejtszánsokkal fejezzük ki, amelyeket anti-CD3-FiTC-eel és anti-B22Ö-FE-vel való festést követő FACS elemzéssel kapott .százalékokból számítunk. A csillagok azokat a kísérlett pontokat, jelzik, amelyek szignifikánsan eltérnek a kontrolitól,.

A példákban a 3A.M és JAM-1, CRAM-1 és JAM-2, valamint a -CRÁM-2 és JAM-3 neveket felcserélhető módon használjuk.

Szabadalmi példa

Anyagok és eljárások

Seítyenabh

A csecsemőmirigy eredetű (íEnd. 1) és embrionális (eEnd.2) endóteliőms sejtvonalakaí [Williams és mtsai., Céh 57, 1Ö53-1Ö63. old. (1989)] Dr, W. Risau és Gr, B Engelhardt (.Max Planck inslitul-e Bad-'Nsuheim, Oermsny) biztosította. Az SVdÖ-nel banszformált TME nyirokcsomó endotéliális sejtvonalat Dr. A. Hamsnn [Harder és mtsat, Exp, Céh. Rés. 197,259-267. old. (1991)) biztosította, A KLN2Ö5 pikfeelysejíes kareinóma, a CHO, az MGCK és az Sp2/Ő mieiáma sejtvonalakat az American Type Cottnre Collectios-íöl (ATCC) szerez** tük be. Az összes sejtet,, a CHÖ kivételével, DMEM tápközegben (Ősbe© BRT, Paisley, Scoüand) tenyésztettünk, 10% FCS'-sel (PAA Laboratories, Linz, Austría), 2 i»M glutamitml, 100 U/mi perdcíllmssl és 190 tl/xní sztreptomicionel (mittáegyík ősben BRL) kiegészítve. A CHG sejteket NutMix.F-12 (HAM) tápközegben tenyésztettük, a fentiek szerért kiegészítve. A megtapadt sejteket PBS/0,15 mM EBTA mosást követő 5 perces tripszhuRDTA jnfcnbálással távolítottúk el 37'C-on.

Az együtí-teayészíési kísérletekhez 5x10'' t.End.1 sejtet tenyésztettünk együtt 2_t5xi0⁴ BíŐFÍO nielanésna sejttel 64 érán keresztül lő cm-es szövettenyésztö csészékben. Kontrollként 5x1 ö* t,Bnd..l sejtet és 2,5x10* Blé E10 melaaréna sejtet tenyésztettünk küíön-küiön azonos körülmények között, összefolyó egysejtes réteget eredményezve 64 őta elteltével. A. totál RNS«t közvetlenül a Peíri-csésxékben vontuk ki Trjzol reagenssel, .a gyártó utasításai alapján (Gíbco SSL, Paisley, Scotland). A cDNS~t 5 pg totál SNS-böl készítettük, oligod'F láncindító (16 bázis hosszúságú) és S«persen>í Revarse Troftscrtpíose (Gíbco BRL, Paisley, Seoíland) olkalmazásávíü, A eDMS minőségét és mennyiségét PCR-rel' ellenőriztük, 2? ciklust futtatva 1 pg ötszörösére hígított cBNS-seí, a háztartási HFR.T cDNS-re specifikus iáncinditók: alkalmazásával* Ezután hajtottuk végre a differenciális PCR-t az alábbi áegsnerátt láaeindítók alkalmazásával; ⁵ TÁYAGNTGYNNNGCYTCYAA’, ^s'TAYCRGTG¥NNNGCYTCYAA^rés ^rTAYTAYTGYNNNGCYTCYAA^y, amelyek s C₂-doméafeen. leggyakrabban előforduló amísosav-szekveneiákst kódolják: YRCXAS, YQCXAS és YYCXAS. A PCR körülményei alábbiakat tartalmazták; 2 pl hígított cBHSj 2,5 pl 1ÖX Go&feíar TCE puffer; 2 pl MgCl-g 2 pí 0,3 mM degenerált lártcind&ó; 0,5 pl. 0,1 mM dNTP; ő₅i pl 16 mCi/ml íxP^3ídATP (Ammham. Pharmacia Btotsch, Bübendorf, Switzerlted); 15,65 pl víz, 0,25 pl<?o&&&$r Taq Pofymerase (Eurogenteeb, Seraing, Belgium).

A PCR paraméterei az alábbiak voltak: 4.5 másodperc 94’C-on, 9fi másodperc 50‘C-on és 45 másodperc '72*C-oa, 40-szer ismételve. Formamld/BDTÁ mintaféivivö puffer adtunk a reakcióhoz és a mintákat 2 percig denaturáltuk 94 C-on. A PCR-termékeket azután 6%-os poliakrihm;íd-gélen vbálasztottuk el, és airtoradiögraíáituk Áfeitó GAf-A-fo? alkalmazásával. A csíkok intenzitását összehasonlítottuk,

A differenciálisán expresszák csíkokat kivágtak a: megszáritott gélből, és a fragmessekei forralással és etanoíos kicsapta! visszanyertük [Lkam és Paráee, Science 257, 967-970, old. (1992)]. A PCíUermékeket öjra ísmplifikáltnk megnövelt koncentrációjú dXTP (0,2 mM 2 pM helyett) alkalmazásával, «Ρ³⁴ dATP nélkül. Az újra ampiíűkált termékeket pGm-7'£ssy (Premega Corp., Wailiselleu, Switzerland) vektorba klónoztuk korábbi leírás szerint [Sambrook, Frítseh és Maaiatis, „Melecular clonmg, 2. kiadás, kiad/. Coki Spring Hsrbor Í.aboraíory Press (i969)].

Meghatároztuk két: független klón mukleodd-szekvenciáját Tíssrmo Se^aesee Fftweseent Zréőe/ed /Vmmr Cy-cfe A'h (Amersham Pharmacia Biotech, Öübendorf, Switaerland) és a L/-CÖ9? £hVd

Afiütysis Rystem (MWG-Bioteeh GmbH, Ehersberg, Germanv) alkalmazásával,

A JAM-3 azonosítása

A szekvencia-elemzés; és összehasonlítást az AxPrtSy Afo/ees/őr Bfefogy &arver-en hozzáérhető alkalmazások (Biasf, Proske, Svriss-Prot} révén hajtottak végre. Három különböző, a CRAM-i-gyel homológ EST-; azonosítottunk (Elérési szám: AA7262Ö6, AAÖ52463 és AA175925). Egyik sem kódolta a teljes: hosszúságú íranszkriptumot, és nem tartalmazta az ATG indító kodont. Ezért az 5’ kódoló szekvenciát az 5 R4C.EPC& SysSemfor ö/cONX £n«&, Emü.v? ?.£’ (Gibco 8RL, Paisley, Scotland) alkalmazásával kaptuk meg a gyártó utasításai' szerint.

-9·»·*.♦

A három alkalmazót? láncinástót az ES'F-szekvenciák alapján terveztük meg az alábbi módont 5’ÖAGGTACTTGCATGTGCT-r az első szál szinteméhez, 5’-CGACAGGTGTCAGATAÁCA-3’ és 5’« CACCCTCCTCAC'FCGTG⁵ & két egymásba illeszted PCR-hsz. Az 5* RACB-PCR terméket pöem-Tvektorba klónoztuk. A CRAM-1 teljes hosszúságú szekvenciájának kinyeréséhez a klónozott 5’ RACE-PCR terűteket és az. BS'T'-t (elérési szám:: AA726286) Hpa ϊ és Nőt 1 restrikciós enzimekkel emésztésük, és pGem-F vektorba klónoztuk. A teljes hosszúságú CRAhf-2 klónozása, ugyanilyen stratégián alapult, szekvencia-össselutsonistáson és 5’ RACE-PCR-en. A CRAM-2-t kódoló teljes hosszúságú cDNS-t végül az AÁ69Ö&43 és W80145 elérési számú EST szekvenciákkal kaptok „meg. Ez a két klón a 3' nem traaszlálúdú régió hosszában tér el.

A sejtekből és szövetekből totál ηι-RNS-t vontunk, ki Trizol (Life Technologies AG, Basel, Switzerlaná) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint, Poii-Á’ uíRblS-t voátunk ki 250 $ig totál RNS-bói í'ŰÖgOíi»· j»RACé Rmy?tfí«ío.n Á7f (Qiagen, Zürich, Switzeríand) alkalmazásával. Áz embrionális Poii-A „Northern biot” reagenskészletet a ClosTeeh-tŐl (EH Stéfeelin and Cie AG, Basel, Switzeriand) vásároltuk meg.. A rifeopsóbákat pcöNAS vektorból (tnviíroges, Leek, bietherlandsj állítotok elő, és tartalmazták a 3AM-I és JAM-2 immunglobalm doménjeit 'kódoló szék verse iákat, vagy a β-aktin teljes hosszúságú kódoló .szekvenciáját A hibridizációt ó2*C-oa hajtottak végre 50% formamidot tartalmazó pufferben, A hiot-okat azután kétszer mostok (Ő,5x SSC. Ö, 1% SDS, 67°C-on). és automdiograíáksk KödőfcX-Omsí alkalmazásával -S8*C-on.

ö^fólyúriklsérfet

Az ersdotéliális sejtek összefolyásának hatását vizsgáltuk a JÁM-2 mRNS színijére, 2xl8⁵' TME endotéliális sejtet tenyésztettünk é, 1Ö és 15 cm átmérőjű tenyésztő csészékben, külööbözó, 10%-tói 100%-íg terjedő mértékű összefolyás? eredményezve 64 óra éltekével. A sejtek száma ó4 óra után, Tripánfcék-kizátássai és számlálással ellenőrizve azonos volt az összes esetben, és nem függöd a Petri-csésze felszínétől,

A különféle körülmények közötti transzkriptumok. viszonylagos mennyiségnek meghatározásához szemikv&ntkafiv PCR-t és Northern biot eljárási alkalmaztunk. A JAM-S-transzkriptum meghatározásához, az ⁵ GACTCACAOACÁÁGTCAC-’ és ⁵ -CACCCFCCTCACTCG7'-³ láneindlto-párt alkalmaztok, and egy 750 básispár hosszúságú amplifskációs terméket eredményezek. Belső kontrollként az alábbi, fíFRT eDNS-re specifikus iáncmdftóks? alkalmaztuk, egy 350 bázispár hosszúságú ír&gmensí eredményezve·.

^$'-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-''és ^s'-GAGGGTAGGCTÖGCCTÁTAGGCT-^r,

Az EGEF-t kódoló: szekvenciát, a pBGF'P-i vektorból (ClonTech, P.H Síehelln and Cie AG, Basel, Switzeriand) szobklónoztuk peDNA3 vektorba HWIIl és Mol l restrikciós helyek alkalmazásával:, a pcDNAS/EGFP nevS piazmidot kapva, A Hpa 1 és Sca 1 3' restrikciós helyeket, amelyek sorrendben a tAM-2 és JAM-I citopkízmatlkus doménjának kódoló szekvenciájában találhatók, alkalmaztak a két szekvenciának az SGFP N-terminálisához való fúziójára a pcONAS vektorban (hrvitrogen, Leek, Netherkmds). A JAM-2-t és JAM-l-et kódoló inzerteket kivágtuk a pGem-T vagy pRe/CMV vektorból Sac lUHpA I, illetve Hisd FiLSea 1 emésztések. alkalmazásával

A kódoló szekvenciákat azután Age 1 resteikciós enzimmel emésztett, tompa végűre feltöltöd, és Hinti FU vagy Sac 11 enzimekkel tovább emésztett pcDNA3/EGFP vektorba klónoztuk. Ez a IÁM-2 esetében, a » * ** * * * * χ * * * _Λ*

X* ♦'·*'* *'* «ΐ*

DGV_J?b a JÁM-1 esetéire;! a QPSjss fúziós helyeket eredményezte. A CHO sejtek iranszfektálásáí korábban fe. írt módon végeztük (Baltestrem és mtsai., L CeB. Sd. Ili,1649-1658. old, (1998)].

Az áteresztőképesség; vizsgálatokhoz alkalmazóit stabil trattszfekiánsokat a tf-anszfektálí CHO sejtek 2 hétig történő tenyésztésével szelektáltuk 1 mgónl G4 8-at tartalmazó tápközegben. A misztens kolóniákat izoláltok, és EGFP flnoreszceneiára ellenőriztük áramlási eitometnéval (FXCSea//ó«r készülék, Becton Dickínson, Mountam View. CA) és mikroszkóppal (tówí) Zeiss, Oberkoehejt, Germany).

A gyorsított videó mikroszkópiát Ariovert tluoreszcons mikroszkóppal hajtottuk végre Qw&ró képeletnző szoftver alkalmazásával.

A peDNA3 emlős expresszié» vektort (ínvlírogen, Leek, Netherltmós) Flag-ctake kódoló szekvenciájának beépítésével módosítottuk (G. Wiedfe, Dépt. of Paihofogy, CMU, Geneva). A JÁM-I, -CRAM-l és CKAM-2 fehérjék oldható formálnak kódoló szekvenciáit tartalmazó Flag-címke konstrukciókat FCR-rel állítottuk elő. Az előre irányuló Itinc indítókat minden esetben úgy terveztük, hogy az ATG kiindulási régióra ilieszfcedjesek. A fordított iráttyá lásclsditőkaf úgy terveztük, hogy egy oldható formájú Ig-tnofekula csuklófészét kódoló szekvenciában, vagy kát oldható formájú ig-domés C2 és iranszmembrán doménje közti kódoló szekvenciában. legyen. Az összes fordított irányú láncfedítóban Xfeaí restrikciós helyet tartalmazó 3' toldalék volt a Fing-címkével módosított vektorban történd közvetlen, fázisban való klónozáshoz. A POR sorért Pfu-polimet ázt (Straíagene, La Jolla, CA, USA) alkalmaztunk a gyakori mutációk elkerülése végett. Azután a FCRfrsgmenssket Xba I restrikciós enzimmel emésztettük, és az Eeo RÍ enzimmel emésztett, Rienow-fr&gmensssl föltöltött, és Xba 1 enzimmel emésztett peDNAJ-Plag-eímke vektorba klónoztuk.

R«lSspsgk. és jttmunhupreszcenciás elemzés

Az alábbi monoklouslis ellenanyagokat alkata.sztuk; anti-FECAM (GCS1, patkány {§<%.; EÁ-3, patkány IgGt) és ató-JAM 111202,196.7.4, patkány IgO_}) (Malergae és mísai., Mól, ImanoL 35, 1111-1 i 19. old. (1998); Fialí és rotsai., Eur. J. Immunoi. 23, 2464-2471.. old. (1993)j.

A JAM-2 elleni CRAM-elle-nauyagok sorozatát a laboratóriumban állítottuk elő szokásos módszerek és rekomhináns oldható molekulák immunogénként való alkalmazásával (Anrraod-Líons és mtsaí., Immonity ó, 391-485. old- (1996)], A kiválasztott hlbddónsákat enzimes immunológiai vizsgálati eljárással (EUSA) szkríneltük a rekotnhinánx oldható JAM-2 molekulát specifikusan felismerő ellenanyagok, termelésére, A pozitív klánokat tovább vizsgáltuk JAM-2 cDNS-sel traríszfektált CHO sejtekkel (nem mutatjuk be).

Az összes CRAM-elfensnyag IgG- vagy lgö_2s ízotipusba tartozik, kivéve a CRAM-25f24~eí, ami IgGíi, alosztályé. Az ellenanyagokat Froíom G óepfeírvoe oszlopon (Phorrsaeia Biotech Europe, Dilbendorf, Swííxsrland) tisztítottak. a gyártó utasításai szerint. A CRAM-19H3S monokkmáiis elienonyagot alkalmaztuk irotsunprecipsiációra, míg CRAM-l8F36 volt az, hrnrumhisztokfemsára alkalmazott reagens. Hasonló eredményeket kaptunk CRAM-4H31 és CRAM-17D33 monoklonális eiienanyagokkttl is.

Az imm.unfbrcreszeencíás elemzéseket EfFC-cel vagy Texas Vörössel (Jaekson: Immsjnoresesreh, Milán AG, La Rocké, Swüzstland) kapcsolt másodlagos reagensekkel htetoítuk végre dtofiuerimetria, illetve immunhisziokémia esetén.

Az itnmushiszíokémiához a mintákat 5 percig rögzítettük lehűtött «mollal (~29C). A mintákat rehidráltek PBS/0,2%- zselafis/ö,05F» Twees-2Ő pnfferben, az elsődleges ellenanyaggal éjszakán át Inkubálfuk mosás előtt, és a megfelelő Texas Vörössel kapcsolt másodlagos reagenssel előhívlak. A -friss endotéliális ejtek elemzéséhez, a frissen metszett szöveteket kollagenáz/diszpáz emésztéssel szétbontottuk bevett eljárások: szerint

-Π(Kramer és mísak, 3, CeH Biot, 99,Ő92-69S. old. (1984)]. A szétbontott sejteket 2 órán át festett-ük 37''€-<m Dií~ acetdáh tl>l.~le; (Molesalsr Probe Europe BV, Leidén, Nelheriands), mielőtt aítti-€RAM-19 és kecske anti· patkány-FITC próbával festettük. Hárois mosás teán a sejteket bíoftniláit atei-CD31 (Pharmingen) ellenanyaggal és sztreptavidin-Red 678-seI (Life teclmologies Aö, .Basel, Swltzerfand) festettük.

A 3AM-Í ás JAM-2 sxpresszíót két wdotéllálls sejtmaskerre íaeetliálí LDL (F.1,-2) és CD3 1 (FL-3)] pozitív sejteken elemeztük. A negatív fconttol'lokat az elsődleges ellenanyag kihagyásával készítettük.

Az ímratatprecípttádós eljárásokat korábban leírtak szerint végeztük (Aurrand-Lions és ttttsai., Celíalar ímmunology I7S, 173-179. old. (5997)3, lö mM Tris-HCl, pH 7,4, ISO ®MNaCI, 9.,5¾Triton X-100, Ö,5% NP4Ö, proteáz-mhibitor koktél (Reche fbagnöstlcs LM Ro&rteiz. Switzeriand) összetételű paffért: alkalmazva. ifzisre. Az bnmnnprecipitáció, SBS/RAGE,. és nörocellnlöz membránra történő transzfer után a bietmlíálí fehérjéket periksrtázz&l képcsőit sztrepi&vídifmsl (Jackson linmunorssearch) és· ECL-iel (Atnerehatn Pharmacia

Sioföch, UK) hívtuk elő,

Át§ ké^Ss^irigsMbtLaliáráspk

Az áteresztőképességet rzmwMAkainra (6,5 mm átmérő, PC-szüróvel, 0,4 pm-es· póntsmérertd, Costar Corp.) alkahnazásável mértük. Rövidé!?, 1x1 Q⁴ transzfektált vagy nem transzfektáft CHO sejtet: tenyésztettünk összefolyásig előzetesen 30 percig 0>2% zselatinnal bevont szűrőkön. 5 nap elteltével a tápközeget lecseréltük: előmelegített, FCS nélküli NnbFl 2 tápközegre (SöO pl az alsó kamrában és 200 pl a felső kamrában). A felső kamrába FITC-dexíráte (molekulatömeg:'38900, Sigma Chemical Cö.) adtunk 1 mgí'ml végkcneetürációbao.

Egy óra elteltével a kamrákat eltávoltetek és a fluoreszcenciát közvetlen® meglndároztuk az alsó kamrában // aSkalmazásávah Kíszámhottíuk öt független kamra fiaoreszceociás intenzitásának az átlagát. és Shavfew szoftver és párosiíatlan {-teszt alkalmazásával összehasonlítottak. A kísérletek normalizálásához a vad típusú CHO sejtekkel kapott átlagos Saomzcencia intenzitást vettük 1-00%-nak.

A 293 T, Sose 23 vagy IglDo-és í§2Do-Flag<imke/pcDNA3 konstrukciókkal stabilan ttaoszfekiált CHO sejtek tranziens transafekcíóját /.(uo/bctoHHhe reagenssel (Gibco· 8RL, 'Paisley, Scotland) hajtottak végre a gyártó utasításai -szerint, A transzfékciót kővetően a íeiülúszót kétnaponta összegyűjtöttük 10 napon keresztül. Ánti-Flag ellenanyaggal kovalensen kapcsolt kíS-gyöngyökeí (Kodak, New Haven, USA) kétszer mostunk Prwtease Mtt&öor Aíré-et (Boefcringer Manóheim, öermany) tartalmazó PÖS-sel. Azután a gyöngyöket 3 órán át tnkubátek 4‘C-on a transzfektált sejtek lelülászójával. Proteáz Irihibitorakat tartalmazó PBS-sel való ötszöri mosási kővetően a gyöogyökcí oszlopba töltöttük, és a rekombioáss molekulákat 16 mM glícin, Ph^::-3,4 páterrel eiuáltuk a gyártó «tssításai szerint. A rekombsnáns: fehérjét t&rtaistazó ebiéit frakciókat Cenirfcntt-tö (Mitlipore) készülékkel tőruény siettük, és PBS-sel szemben dializálfök.

A fehérjekor,centtácíóí Afe-o EGA vizsgálati eljárás (öiorud) alkalmazásával határoztak meg. A tisztított termékeket azután>poliakrilamid-SDS-gélé!drtroforérissel és Cootaorrie B&e-festéssel vizsgáltak a tisztaságuk elemzésére.

Átk^áoriári.yMsájaftdj^sok

A lettkociták endotéliamsdteken keresztül történő átvándorlását korábban leírt módon iWheemmghe és tnísai, J.Cell Blology 142,595-607..old. (199S)l hajtottak végre. Röviden, lx!0^? t-end sejtet

-12tenyésztettöttk két napon át kapott Íranswed kannákban (pobkarbo.oát szőrös, 5 pm pőrusméretíd, Costasj 1 p.gAnl oldható Ig-ntoiekula -(sJAM-2óo és sCKAM-l-2-do} jelenlétében, Két nap elteltével .1x18*, nyirokcsomóból és Peysr-féie piakkból származó ieukocitát adtunk a felső kamrába, és a kísérlet során kivándorló sejtek számát rögzítettük minden órában, 4 óra elteltével az 5 független kamrából kapott átvándorolt sejteket összekötöttük, és citoííueritaeteíás- elemzésnek vetettük alá 8228 és CDS 3- és T-sejtes markerekkel. Az eredményeket FACScalÜmr készülék és- CWf-gaesf program (Becton Díckrasoa) alkalmazásával kaptuk.

Lépsejtekkel végzett átvándoriási vizsgálati eljáráshoz 3xl-0⁵ endotéliumsejtet oltottunk /ransw/í kamrába (poiikarbenát szűrös, 8 tűn pórus mérettel, Costar) egy sejtes réteg létrehozására 18 órán alatt. A tápkőzegeí eltávölitottuk a felső kamrából, és 1x10, lépbél Ficoll-centrifegál ássál frissen preparált leukoeitát adtunk a felső kamrába 188 pl-ben. Az alsó .kamrában lévő tápközeghez SDF-l-et adtunk 40 nM végkoncenttácíóban, az alsó és felső kamra közötti kemokio-gradiess létrehozása céljából. Az ellenanyagokkal végzett kísérlethez tisztított 1S-F26 vagy 19-iloö ellenanyagra: adtunk 19 pg/m! koncentrációban a {épsejteket tartalmazó felső kamrába. 4 óra elteltével az átvándorolt knkoclíákat (az. alsó kamrában.) begydljiöttük, és megszórnotok. Az. eredményeket a bevitel százalékában feiezWk ki.

Eredmények fíélzottJ10«^igis^ezgníáeló

Az endotéltonsejtokben lévő gének szabályozása a környezetüktől függ. A találmány célja azon gének azonosítása volt, amelyek szabályozása az endoíéiiurnsejtefc daganatsejtekkel való érintkezése során megváltozik. Ebből a célból fe vdro vizsgálati eljárást fejleszsetttink ki melanőma daganat sejtek (8 lő) és endotelíóma sejtvonal (t-end) egvütt-terjyásztésének alkalmazásával A keverékből kivont totál RNS-t tetttplátkéul alkalmaztuk cDNS előállítására, amit differenciális FCR sskrlnelésnek vetettünk alá. Az önmagukban tenyésztett eudotéliális vagy melanóma sejtekből kapott cDNS-t alkalmaztok kontrollként. Á három különböző mintázatot összehasonlítottuk az együtt-tenyésztés körülményeinek szabályozása alatt állő Irattszkríptumok azonosítására. Annak érdekében, hogy az elemzést az lg szopercsalád sejtfelszíni molekulákat kődölő szekvenciákra korlátozzuk, részlegesen degenerált lárcíndítókat alkalmaztunk, amelyek az lg szupercsaládba tartozó molekulák CS-clo-ménjének C-terminálisán lévő clszteínt körülvevő szekvenciái célozták, A PCR-termékek fegreprodukálbatóob -mintázatát ez YYCxASl szekvenciát kódold íáneindttók alkalmazásával kaptuk (7. A ábra). Ezt a javított. RNS-prezeotáciős eljárást TDD-aek neveztük el, „Targefed Differential Display (Célzott Differenciális Prezentáció).

A TDD ismétek kísérleteiben lő differenciálisán expresszálödó gént azonosítottunk. A klónozást, nokleotid- és ammosáv-szekvencia-elemzést követően a ló PC'R-iermék közül három volt az Ig-szsxpercsaláá lehetséges ismeretlen tagjait kódoló jelölt. A három jelölt egyikét (CRAM-1) választottuk ki további vizsgálatok céljára, Külön-külön tenyésztve a í-end,l és 816 melanóma sejtek a CRAM-T írosztóptomof magas szinten expresszálták. Azonban egyföttenyésztve a CRAM- i expresszlójának szintje aluiszabályozod volt (?. B ábra). Egy, a ORA'M-í-aek megfelelő 350 btóspár hosszöságú íragmens transzlációja az YYCxAS- szekvenciát mutatta, jelezve egy lg C2-domén C-íermináiísát, amit egy 18 aminosavból álló hidrofób szakasz; kódoló nyílt leolvasási fázis („ORF”) követett, ami transzraembfán régió? jelez.

CSAMrL.az.|mmmrglultomJ

A PCR-tormék szekvenciája és nukleotid-adatbázisok közti szekveneia-összehasonltos homológ és azonos szekvenciákat tárt fel egér EST-adatbázisokbao. Az EST-k jelenléte azt jelzi, hogy a FCR-íermékek «<*** *

X ·* ♦ *

«.« ♦*»·* in v/vo expresszálódó szekvenciáknak feleinek meg. Három EST-rői art t&iátek, hogy egy 3ÖŐ bp hosszúságú szekvenciát tartalmaznék az. 5’ végükön, .mely azonos 300' bázispárral a TDD-termékben. Mindegyik EST 3' vége pofi-A farkat tartalmazott összességében. az EST-ek 1270 bp hosszúságúak voltak, és a CRAM íranszkripíom 3* végének feleitek meg. Mive! a íranszkrípbani 5’ vége hiányzott az EST cDNS-klónban, 5’' RACEPCR-rei kaptuk azt meg, Az javasolt CRAM-1 cDNS 1980 nukieoEd hosszúságú teljes kódoló szekvenciáját a 8, A ábrán mutatjuk be. Erős transzlációs ínicíáeiós konszenzus szekvencia (GACATGG) van a leolvasással megegyező irányban lő bp-ra az 5’ végtől, amelyet egyetlen, egy 31Θ aminosav hosszúságú fehérjét jósoló ŐRT követ. A lehetséges kezdő snetsonint kővető 31 aminosav szíguálpeptidre jellemező, A hasítás megjósolt helye az Λ1&31. és Va-132 között van.

Az egór CRAM-1 febétje feltételezett szerkezetét a S. B ábrán mutatjuk be, amely egy extraceiluMrls részt tartalmaz egy változó nehéz lánccal' és egy 2-es típusú állandó immunglobulin döntésnél (Efam, The Sanger Gertire és Blast), valamint két lehetséges N-gltkoziláeiós hellyel (104.. ás 192. aminosav), A hidrofóblíási elemzés (Tmpred, ISREC) transzmemhtán .régiót jósol a 242-260. helyen. A javasolt cltoplazmatíkus dómén 49 .amhtosavból áll és számos ssgyon konzervált Set/Tfer és Tyr foszforllációs helyet tartalmaz (8. A -ábra, az. oldalláncok dőlt betűvel szedve). Az ismert mmíázatok Prostié programmal való keresése az. SSK/SYK motívumot mint protein-kináz-C, az SKQD/TSEE motívumot mint CK2 és a KQDGESY/KHDGVNY motívwoí mint tlrozm-kináz Ibszíbriláelós helyet azonosította.

Számos fehérje matatott nagyfokú homológját a CRAM-í-gyei. Az. lg. szupercsalád két tagjáról, az emberi A33 antigénről és az. egér ídegsejt adhéziós molekuláról (N-CAM) azt találtuk, hogy sorrendben 41 %~ bán, és 46%-ban homológok a CfGkM- l -gyel, A JAM. az lg Sf egy másik tagja hasonló szerkezetté mint a C.RAM-1, 34% aminosav azonossággal és 54% homológjával. A IÁM és CRAM-ϊ közti szígnifikáus azonosságot alkalmazva egy harmadik, közeli rokon szekvenciát -találtunk az EST-edatbázisokban, nevezeteset! a CRAM-2-t. A három molekula közötti azonosság egy új alcsalád létezést sugallja az lg saspercsaládhaa (9. ábra), A homológra nemcsak a V- és C2-domének (C54-Ü118, illetve C147-C235 a 9. ábrán) általános szerkezeié re vonatkozik, hanem- a citoplazmatikus domésen belüli szekvenciákra is. Érdekes módon a bárom molekula leginkább eltérő régiója a V-domén elején található (40-60., aminosav hely), és a közeli citoplazmatikus részen (28Ö-3QÖ. aminosav hely). Ezen két. régió funkciója lígandum kötésében és a jeltovábbításban résztvevő szekvenciáknak. felel meg az lg szupercsál&d más tagúiban, a JAM, CRAM-Í és CRAM-2 szerepét sugallva, a sejtsejt közti kommunikáeíöban.

A három trauszkrlpium expresszlőját különböző eredetű sejtekben detektáltuk RT-PCR alkalmazásával. Az; összes vizsgált esudötéliálts, ephéliálís és a legtöbb daganatos sejt pozhív volt a különböző írauszkriptumokra nézve, bár különböző mértékben-<10, A ábra),. A CRAM-1 legmagasabb szinti! expresszíóját a TMEjeiö, SV4S-ne! transzformált HÉV sejtvonalhan találtuk (9. sáv), és m e-end-2 embrionális endotéllális sejtvoaalhan (4. sáv). A CRAM-2 és IÁM korlátozottabb eloszlást mutatott, és együtt fordult elő a CRAM-l-gyel a felnőtt e-ndoféliálls sejtvonalakban (3., 7.,9. és 12. sáv). Figyelemre méltó -nődön a .IÁM és CRAM-2 íttmszkriptumok erőteljesen alulszabályozottak voltak TNF-kezeiés hatására, míg a CRAM-l trauszkriptam szintje változatlan maradt (2. és 11, sáv). Érdekes -módon az embrionális endotéháls sejtvonai (4. sáv) vagy a t-ead egy ungiogenikus variánsát képviselő felnőtt, endotéliáirs sejtvonai (S. sáv) nem expresszit JAM-ot vagy CRAM-2-t.

-14Λ*

A JA.M~2-íranszkripüím szövet eloszlását rnrthem biot eljárással: vizsgáltuk és a j AM-1 -éhez. hasonlítottak (14. ábra), A J'AM-2-transzkript«{» .2 kb hosszúságú, és nagymértékben expresszálődott embrionális szövetben, és felnőtt állatok Peyer-íeíe pkkkjaiban, nyífökcsotnóibar!, veséjében és heréjében. Egy* 1,8 kb hoszszúságh, feltételezett „splfce* varitot találtunk herében. A JAM-2 írsntóíripttan expreszszíója alacsony volt tüdőben, májban, (épben és csecsemőmirigyben. összehasonlítottuk a JAM-l és a JAM-2· viszonylagos bőségét az embriógersesis során: a JAM-2-t kódoló stRNS detektálható volt már 7,5 nappal a fogamzás után, míg. a JAM-1 snR'NS egyáltalán nem volt detektálható az embriógenezls során.

Ezen eredmények, azt sugallják, hogy a CRAM-l széles körben expresszálódik az embriógenezis során, és a felnőtt szövetekben az expresssáója az epitéliáíis és esdotélíálís: kompartmentetee .korlátozódik. Ez egyezést mutat azzal az elképzeléssel, hegy a sejtek polarizált szerveződésének kialakításában és fenniartásában játszik szerepet.

A JAM-2 egy 45 kD.A raoiekulafőmegü fehérje., amelynek a sejt-sejt közti kapcsolatokon való elheMivel a HEV-eredetú TMB sejtvonal expresszálta a JAM-2-ί a legmagasabb szinten, ezen enóoiéliális sejtvoíssbt alkalmaztuk a JAM-2 sejten belüli elhelyezkedésének további vizsgálatára, és annak J.AM-1-éhez való hasonlítására. A JAM-2 fehérje endotéhális sejtek felszínén való «helyezkedése a Sejt-sejt közti kapcsolatokra korlátozódik (II. A ábra, a). A JAM-2 tesíődése gyengébb volt, mint amit a J.AM-1-nál megfigyeltönk, és kevésbé kifejezett a sejtek közti roembránnyúlványekban.

Azután azt vizsgáltak, hogy a sejt-sejt közti kapcsolatokban jelenlévő JAM-2 vajon hoíuofil módon hat-e kölcsön JAM-2-vel, vagy helerofil módon hat kölcsön egy másik molekulává: a szomszédos sejten. Ebből a célból a JAM-2 fehérjét Alid flttöreszcess fehérjével fuzionáhattuk (JAM-2-EöFPj, és a konstrukciót CHO sejtekbe transzfektáitok. Amikor a JAM-2-EGFP-vel sranszfeklált CHO sejtek elérték az összefolyást állapotot, a JAM-2 csak azon sejt-sejt közötti kapcsolatokban volt megfigyelhető, ahol mindkét sejt expresszálta a fehérjét (11.13 ábra), míg az expresszié és nem expresszáló sejtek, közti kapcsolatok mentesek voltak J.AM-2~től (11.8 ábra, a, nyílhegyekkel jelölve). Ugyanilyen eredményt kaptunk, amikor sejteket a kíntéra JAM-1-EGFP molekulával transzfektálíunk i 11. 8 ábra, b). Ez azt jelezte, hogy a JAM2-2 vagy JAM-1 esetén homoíll kölcsönhatásra van szükség a sejt-sejt közli kapcsolatokon való elhelyezkedés érdekében.

A JAM-2 biokémiai jellemzése érdekében TMB sejtvonsi, illetve trsnszfektálí CHO sejtek: által expresszált JAM-2, illetve EGFP fehérjék hnmunpreeípítáeióját hajtottuk végre (II, C és 11. ö ábra). A CICÁM-Γ9Η30 aríti-JAM-2 ellenanyag egyetlen, 45 kDa-os csíkban csapódott ki a TME-sejtek íizáfamábói (11. C ábra, 3. sáv),

A látszólagos molekulatömeg azonos volt redukáló és nem redukáló körülmények között (adatokat nem közlünk) és megfelelt a JAM-2 anünosav-szekveneiája alapján kikövetkeztetett molekulatömegek, mindegyik N-gíikozilációs helyet 5 kDa-nak számítva. A JAM-1 Η-202-lC'ő anti-JAM specifikus ellenanyaggal való Immueprecipítáelőja egyetlen, kisebb molekulatömegé (köritlbelül 42 kDa, 2. sáv) csíkot eredményezett, ami kizárta az anti-JAM-2 és anti-JAM-1 ellenanyagok közti lehetséges keresztreaktivitást.

A rekomhmáns· JAM-i-EGFP vágj·· JAM-2-EGEP fehérjék imrounprecipitációja a felszín feíotibiiáíását követően sorrendben 70 és 72 ki3a nagyságú egyedüli széles csíkot eredményezett, tó: jelezve, hogy a molekulák expresszálőáíak a transzfektált CEO sejtek felszínén (11. O ábra, 4. és 6. sáv), Ezen molekulatömegek várhatóak voltak, mivel gz EGE? molekulatömegeik kDa,

-15» »φφ« ♦♦

X·». φ*»φ »φφ«

ΦΦΦ»

Annak érdekében, .hogy megértsük hogyan befolyásolják a molekulák az endotéliálís sejtréteg integritását és hogyan szabályozzák az ér esdetélíumának a működését, feukscííák ssáotéliuraon keresztüli vándorlását vizsgáló vizsgálati eljárásokat végeztünk rekomblúáas· oldható JAM vagy CRAM-Í molekulák jelenlétében. Endotéliálís sejteket két napon át tenyésztettünk slÁM-ígZDo· vagy sCRA.M-1-lg2Do jelenlétében, Az egysejtes réteg integritása nem változott ezalatt, valószínűleg a sejt-sejt közti kapcsolatok kialakulást mechanizmusának molekuláris redundanciája miatt. Az átvándorlási vizsgálati eljárást 1 pg oldható rekombináns molekula jelenléiében hajtottuk végre. Mint ahogyan a 20. A ábrán bemutatjuk, az első három órában alig hatott az sJAMIgSDo jelenléte az átvándorlö sejtek számára (üres négyzettel jelölve). Négy óra elteltével az átvándorlö sejtek száma növekedett a kontrollal összehasonlítva (szaggatott vonallal jelölve), Ezzel ellentétben az sCRAM-lIg2Do jelenléte (teli körrel jelölve) erősen csökkentette az átvándorló sejtek számát..

Mivel a lopkodta populációk heterogének voltak, azt is vizsgáltuk» hogy az sCRAM-l-ig2Do vajon egy specifikus leukociía alcsoportra feaíeít-e, vagy az kivándorlás speci&ás nélkül gátlódéit. Ebből a célból az átvándorolt sejteket CD3 és B22Ö hm&cita mtskerekre jelöltük (20. B ábra).

Rendkívüli módon az sCRAM-l-Ig2Do specifikusan gátolta a sem-limfoid leukociták, azaz mteloiáeredetü sejtek (középső rész, vonalkázott oszlopok) átvándörlásál, Ezzel ellentétben sJAM-í§2Ds> gyengén növelte az átvándorló T-sejtek számát (bal oldali rész, fehér oszlop), bármilyen más sejt-populációra való hatás nélkül.

Ezenkívül, amikor CRAM-l-gyel transzfektált endosehóma sejteket alkalmaztunk az átvándorlási vizsgálati eljáráshoz, megnövekedeti átvándorlást figyeltünk meg (12, ábra), míg CRAM-2 ottnszíekíáiása nem volt hatással az áívándorlásra, Amikor SDF-l-el adtunk a vsszgálafi eljárásb.oz, a leukociták endotélnunon keresztüli átvándorlása elérte a 20%-ot. Ezt részben gátolták a CRAM-1 ellesi monoklonális ellenanyagok.

Ezen eredmények azt mutatják, hogy a CRAM-1 jelenléte az endetéhumsejíek között az endotéliálís réteg működését szabályozhatja. Várható, hogy ezen családba tartozó molekulák akadályt képeznek, amikor az endotéiíális sejtek elérik az összefolyást. Ebből a célból megvizsgáltuk a CRAM-l-transzkriptumok szabályozását az endötéhümsejtekben különböző tenyésztés körülmények között.

Mivel a CRAM-Í-el kódoló trtmszkríptumokat a TN'F nem szabályozza, viszont alulszahslyozottak, amikor az endotélmmsejtek daganatos sejtekkel vannak együttteny észtve, egy összefolyásí vizsgálati eljárást alkalmaztunk ezen szabályozás további vizsgálatára. Alacsony fokú összefolyás mellett a sejtek aktívan cíklizáhak, és aem történt CRAM-i kölcsönhatás, míg magas fokú összefolyás mellett a sejtek kevésbé osztódtak; és a CRAM-1 hatott. Meghatároztuk a CRAM-1-mRNS szintjét különböző sejtsúrSség mellett szemikvaníitadv PCR-rcl. Mint ahogy a 13. ábrást bemutatjuk, a CRAM-1 -íranszkriptnm szintje csökkent, amikor az öszszefolyás bekövetkezett (a 13., ábra 1,» 2, és 3. sávja sorrendben 100» 50 és i 8% -os összefolyásnak felel meg). Ez a hatás alig volt detektálható a t-ená sejtekkel, de kifejezettebb volt a TME sejtvonallal, amely nagymértékben expreszszálía a CRAM-1-et A CRAM-Í alulszabályozásu szintén fokozott volt az endotőliumban, amikor az endotéliálís sejteket együít-ienyésztettük KLN2Ö5 kareínómasejtekkei, amelyek maguk nem expresszáltsk CRAM-I-et. Ez Igazolta az összefüggést a CR.AM-1 exprsssz.iója és a sejtciklus között, mivel a daganatos -sejtekről ismert volt, hogy növelik az endotéliális sejtek növekedését érintkezés esetén. Érdemes megjegyezni, hogy a KLN2Ö5 karomomasejtekkel kapott eredmény megegyezett azzal,, amit a Slő melanőma daganattal végzert eredeti szkrínelési stratégíánkbaa alkalmaztunk. Ez. egy általános- mechanizmust jeles, ami révén a dagana-16ft A* **** »♦ * ♦ * ,/ « M* * * »t * » * «« *·♦ * ^Φ tok befolyásollak az ondotélimn viselkedését.

ókra korlát jk>feótLs2ÖTetekben

Aniták érdekében, hogy jobban meghatározzuk a JAM-2 szöveti eloszlását, ímmunfeíáztológiai elemzést végeztünk vese és bélS'osfn nyirokcsomó metszetein (15. ábra), amelyek a JAM-2 transztóptetnol a legmagasabb szinten expresszáiták. A vese kérgi régiójában az intertubuláris struktúrák specifikus testödését detektáltuk antl-PECAM (GC51) vagy and-JÁM-2 (CRAM-XVIÖF2Ó) monoklonáhs ellenanyagokkal, míg az asti-ZÖ1 ^VW antWÁM.-í túlnyomóan a tsbahtsok epsteUális sejtjeit festette meg (adatokat nem közlünk).

Tehát a ligyeinsönket az árstruktúrák felé fordítottuk, amelyek mélyen lenyúlnak a vese veidbe, -és a sugárirányú vénák vagy más néven a vara méta endotéliális szerkezeteinek léiéinek meg. Ennek érdekében sorozatos metszeteket készítenünk, és antí-PECAJM ferstéssei azonosítónak az érszerkezeteket (15. d ábra). A szomszédos metszetek ekvivalens régióiban a lineáris interesdoteliáUs festödést detektáltunk ants-JÁM-2, astiJAM-1 vagy ami~ZÖ~l ellenanyagokkal (sorrendben 15. a, b és c ábra). A béifodri nyirokcsomó metszetem a magas eadotéllálís venulák („high endothelial vennie” HÉV)· tipikus íestödését anti-JAM-2-vel kaptuk (15. e ábra), A HEV-ekröl azt találtuk, hogy JÁM-l-ef, ZO-l-et vagy PECAM-ot is expresszálnak (15. í, g, h ábra), apró eltérésekkel a. festödés szubcelluláris elhelyezkedésében (IS. ábra, e-h kis kép). A béifodri nyirokcsomók kérgi régióiban a szubkapszuiárís szinuszok tipikus festödését figyeltük meg az összes ellenanyaggal (15.1-1 ábra), ami az afferens .nyirokerek fesíödósének. felel meg. Ezáltal a CRAM- 18F.2Ó anií-JÁM-2 monoklsnáiis ellenanyaggal való íestödés bizonyos sndotélsális sejtekre vagy szorosan az érrendszerrel kapcsolatos szerkezetekre korlátozódik.

Annak érdekében, hogy tisztázzuk, vajon az endotéliális sejtek festódése okozta-e a IS, ábrán bemutatott képeket, a JAM-2 expresszKpáiuüt ciíofiuorbnetrlás elemzését végeztük el számos sejtvonaion vagy' szétbontott szövetekből frissen izolált eodotélmnisejtekön. Az endöfélíális sejtvonalak (tEnd.L e'End.2 és TME) JAM-2 alacsony, és JAM-l változó szirtijét expresszáiták a sejtfeiszinen (14. A ábra),

A frissen izolált endotébamsejtek citometriás -elemzését a szervek kuílagenáz/diszpáz emésztésével kapott sejtszaszpenziók hármas festésével hajtottuk végre. Az endötéliontsej leket PECAM/CD31 -gyei és aeetíl&k LDL-lel festeti (Voyts és misek, ,1. Cefi' Bioi. 99, '2034. old, (1984)1 sejtek kapuzásával azonosítottuk. Ezen duplán pozitív sejtpopuláció JAM-2 vagy JAM-i festését a lő. B ábrán mutatjuk. be. A vesében és BeverFéle pakkokban. az Összes CDS 1-re és aceüláít ED-L-re pozitív sejt fesíődött JA.M-2-vel Is, ami azt jelenti, hogy ~ legalább ezekben & szervekben - az. endoíéliumsejtek JAM-2-1 expreszáltak te vteo, Amikor a festést nyirokcsomóból kapott sejteken hajtottuk végre, JAM-2 festödést csak. egy sejt szabpopniáeion találtunk, az endotéliális. sejtek tehetséges heterogenitását mulatva ebben a szövetben.

Mindent összevetve, s cstomefriás és immuuhisztokérttisi vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a JAM-2 együtt expresszáiódfs a JAM-l-gyel a vese, Peyer-féfc plakkok és nyirokcsomók ondotélíumsejtjeibou.

Annak érdekében, hogy kielemezzük azt a mechanizmust, amely révén a JAM-2 specifikusan a sejtse)!. közti kapcsolatekban helyezkedik el, gyorsított yideo-mskröszkópiát alkalmaztunk. A fluoreszcens kinréra molekulákkal stabilan transzfektált CHO sejteket tripszlneel kezeltük, és kamrás lemezekre helyeztük képfeldolgozásra. A sejtek elterítése után a JAM-2-EGFP felszíni espresszíója nem volt egységes, hanem inkább túr-17tős a sejt-sejt közti kapcsolatok környékén (17. A ábra. a sejteket csillaggaljelöltük). Az új sejt-sejt közti kapcsolatok. kialakulása során a JAM-2 áthelyeződését figyeltük, tneg a ^kapcsolatokhoz, és itkenztv fluoreszcens jelet detektáltak az aj kapcsolódási pont okon az űj sejt-sejt kapcsolatot kialakító sejtek között (nyilakkal jelölve), A kimére fehérje íeldósult a'kapcsolódó· sejtek közti sejtnyúlványokban, „clpzárszerő” .képekhez vezetve 12 vagy 18 pere ekekével. Érdekes módon a JAM-2 elsődleges sejt-sejt közti kapcsolatokban való elhelyezkedése nem veszett el az új mernbrankapesolatok kialakulása során (lásd a bal felső sarokban lévő sejtkapcsolatokat). Ez a felismerés azt jelezte, hogy J AM-2-EGFF specifikusán az új sejt-sejt közti kapcsolatokban helyezkedett el, é s azt, hogy összekapcsolódás után az elhelyezkedése stabil volt.

A JAM-2 elhelyezkedésének követelményeinek további vizsgálatához gyorsított video-míkroszkóplát végeztünk az egysejtes réteg megsértése márt (17. B ábra), A. megsértett él melletti sejtek megtartották ti JAM-2l a sértetlen sejt-kapcsolataiknál (nyílheggyel jelölve), de elvesztették a ΪΑΜ-2-t a sebzett oldalon (ayiHal jelölve), jelezve, hogy a JA.M-2 összekapcsolódása egy szemközti sejtheti iig&rsdmnmal szükséges volt a ntembráne (helyezkedésének fenntartásához. A sebzést követő 90 perces időtartam folyamán a sebet körülvevő sejtek elkezdtek a sebzett területre vándorolni. Érdekes módon ezen sejtek megtartották a kapcsolataikat a szomszédos sejtekkel menferámiyülványökon keresztül, amelyek élénken fluoreszkáltak, azaz JAM-S-pozitívak voltak (nyílheggyel jelölve). Ezen eredmények alátámasztották azt a hipotézist, hegy a JAM-2 homoíil kölcsönhatása szerepei játszhat a sejt-sejt közti kapcsolatok kialakításában vagy fenntartásában,

AJAM;2,megnóyelGi^trétegv^mgságát.és.résrt veszAsgoraskapcsolmokfe^lc^lben

Mível a sejt-sejt közti kapcsolatokban részt vevő molekulák számáról kimutatták, hogy az egysejtes sejtrétegek paraceiloláris áteresztőképességét szabályozzák, azt is vizsgáltuk, hogy a JAM-2 is hat-e erre a működésre, ÍAiM-2-EGFP íraaszfekciójá csökkentette a FfFC-dexírás paraeelteláris áteresztőképességét, és 42,5%kal javította a CHO sejtek egysejtes rétegének tömítését; űrig a nem rokou Tac molekula (lllftu) transzfektálása nem csökkentette szignifikánsan a trauszfektált CEO sejtek paracelluláris áteresztőképességét (18. ábra). .A JAM-l-FGFP transzfékeíűía szintén csökkentese a trauszfektált CHO sejtek egysejtes rétegének psrscelkdárís áteresztőképességét.

Ezen eredmények felvetették azt a kérdést, hogy a klrnera molekulák képesek-e részt venni egy specializált szubceilnlárís fcompartmeniben, például polarizált epltéllálls sejtek szoros kapcsolataiban.

E kérdés .megválaszolásához a lóméra EGFP-féhérjéket MDCK sejtekbe transzfektáltnk, és azok szubceliuiárls elhelyezkedését összehasonlítottuk a szoros kapcsolatok markerének, az okkludinnak az elhelyezkedésével. Mint -ahogy a 19. A ábrán hemutatjuk, amikor minden 0,9 om-en készített sorozatos képeket elemezfűnk EGFP fluoreszcenciára és összehasonlítottak az okkludinos festéssel, a JÁM-2-EGFP specifikusan feldúsult a szoros kapcsolatok szintjén lévő sejt-sejt közti kapcsolatokban, A bazális membrán szintjén (bal oldalon) az BGFP fíuoreszceneiájának húraceiluláris pontjait figyeltük üteg, A JAM-i-EGFF-vel transzferált MDCK sejtek hasonló vizsgálata (19. B ábra) hasonló együttes elhelyezkedést mutatott az okkludinnaí. Mindazonáltal a JAM-i~BGEP eloszlása kevésbé volt összefüggő, mint amit a JAM-2-KGFF esetén figyeltünk meg a szoros kapcsolatok színtj és.

diszkusszió

Ebben a példában egy új szkrlnelési stratégia alkalmazásáról számolunk be olyan szabályozott teanszkriptomok azonosítására, amelyek az Ig-s záporé saladba tartozó adhéziós molekulákat kódolnak. A CRAM-1 molekula szabályozod íranszkrlptumának klónozását tárjuk fel ezzel az eljárással. A daganatok jelenlétében tenyésztett endotéliális sejtekben történő szabályozást szemikvanihmiv RT-PCR-rei igazoltuk, és megmutattuk, hogy az a sejtek növekedési fázisától függ, A változó összefolyást körülmények közötti differenciális expresszié miatt a CRAM-Í nevet gátak az új fehérjének (Összefolyással Szabályozott Adhéziós Molekula, „Coniluency Regoíated Adhasson Molecule”).

A bejelentésben föltártatok egy, a CRAM-l-gyei közeli rokonságban álló szekvenciát, a CRÁM-2-t, A CRAM-1 és CRAM-2 az adhéziós molekulák egy új alcsaládjának a prototipusát képviselik, amely atalááha tartozik a nemrégiben leírt JAM molekula is jChrefien és tntsal,, Eur. 5. Inan-anol. 28, 4094-4194. old. (199S); Malergue ésmtsai., Mól, Intmusöl. 35, 1111-1119. old. (1998)1,

A CRAM-í és IÁM elsősorban az endotéliális és eplíéliálls szövetben exprcsszálódnak a sejt-sejt közti kapcsolatoknál, és speciális tulajdonságokat kölcsönöznek a polarizált sejtrétegnek, A rekombináns oldható molekulák hatása endetéiíomon keresztüli vándorlási vizsgálati eljárásban és a JAM, CRAM-í. és CRAM-2 szabályozása azt mutatja, hogy ez a hárem molekula fontos szerepet játszik az érrendszer fiziológiájának fönntartásában.

A Célzott Differenciális Prezentációnak („Targeted Differenciál Display”, TDD) nevezed: új sskrlnelési stratégia hatékony módszernek bizonyult az érdeklődés tárgyát képező cDNS ampiifkálására, A 'FDD sikeresen kihasználta a részlegesen ««generált iáncindiíók alkalmazását a C2-szerö lg.....domének konzervált régiójának .(Y(YZQ(R.)CXASj szelektív célzására. Megismételt kísérletek reprodukálható prezentálás! xnintázatot eredntónyezíek. tő differenciálisán expreszszált iranszkripíurn közül három felelt meg olyan géneknek, amelyek szignifikánsan homológok konzervált Ig-régiókkal, A specífitás ezen növekedése segít túllépni a már ismert, klasszikus RNS umgerprindng’’ és differencián» prezentációs módszerek íS nehézségein. Az RNS „fíngerpritttatg” már régóta alkalmazott elj:árás differenciálisán expresszált gének azonosítására. Azonban a szekvencia-specifikus láncíndkók alkalmazása miatt ezen eljárás csak a kiválasztod, ás már ismert fehérjék tratiszkriptumast detektálja. Másrészről az RNS prezentálás random lánchsditókat alkalmaz, és a transzkriptumok nem specifikus ampfifsksiását eredményezi. Ebben az esetben két biológiai rendszer ntRNSszintjeí közti különbség kimutatása a cél összehasonlítás révén. A TDD egy fejlett szkrhseiésí eljárás, amely az RNS „fingerpritifing specifiíását és a differenciális RNS prezentálás degenerállságát kombinálja, szelektivitást eredményezve, A rokon transzkrlptumok célzása miatt ezen módszer szignifikánsan csökkentette a szknneléshez szükséges idők Tehát lehetséges specifikus fehérjecsaládok 9j tagjainak azonosítása. Ez az ismertetett nem specifikus stratégiák alapvető megjavítása.

Ezen közős tulajdonságokat alkalmaztuk rekombmáns fehérjék konstruálásához annak érdekében, hogy tónulmányozzuk s JAM, CRAM-1 és CRAM-2 funkcióit. A példában az »JAM-lg2Do és sCRAM-1lg2Do hatásait tárjak fel t'« vifeo átvándorlási vizsgálati eljárásban. Mseloid sejtek vándorlásának specifikus gátlásának hatását figyelhettük meg as sCRAM- t-tg2Do molekulával, inig sz sJAM.-ig2Do csak kis hatással volt a limföckákra,

A JAM- és CRAM-2~íranszkriptumok hasonló szöveti eloszlást és expresszíós szabályozást mutattak TNF hatása alatt, jelezve, hogy hasonló fiziológiai mechanizmus révén műkődnek. Ezzel ellentétben a CEAM1 -íraoszkriptemekat nem a TNF szabályozza, hanem inkább a proliferáctó sebessége vagy az endotéliumsejtek sűrűsége. Valóban, a CRAM-1-transztóptoraok túltermelése ciklízáló sejtekben és aíulszabályozása néma sejtekben azt jelzi, hogy a molekula az össze fiiggo egy sejtes sejtréteg kialakításában vesz részt, A funkciója sejtek összefolyt egysejtes rétegében az endotéliális sejtréteg és az azzal kapcsolatos mlaldonságok fenntartása. Miivel φ φ«φφ *« φφ * *

-19a különböző leukocsía-populációknak sz immunválasz: helyére kell vándorolniuk, azt gondoljak, hogy a «eiR~ Irmfeid sejtek CRAM-l-hlggö mechanizmus révén vándorolnak, míg a lismfoid sejtek JAM- vágj' CRAM-2függő mechanizmus révén. Ebben az esetben az immunválasz modulálható a különböző oldható rekombináus molekulák komblnáelólmk alkalmazásával.

-204 *♦*; *’*» « »’* •s . » » ·*“

W Λί Α Χ X *

Claims (8)

1. »:♦ *»»*.» ** **♦«

   SZABADALMI igénypontok

   1. Poiipepíid. amely a humán .immunglobulin szupercsslád egy afesaládiába tartók, a következő csoportból választva:

   a) polipeptid, amely az egér l-es Összefolyással Szabályozott Adhéziós Molekula .(CRAM-1) 3, ábra felső sorában bemutatott amisKssav-szekveneiájával rendelkezik;

   b) az (a) pont szerinti polipeptid érett formája, ahol az érett forma a 32. aminosav-helyen kezdődik;

   c) polipeptid, amely az egér 1-os Összefolyással Szabályozott Adhéziós Molekula (CRAM-l) 3. ábra felső sorában bemutatott amíKosav-s.zekvettsiá|ávaí legalább 70%-os szekveocta-homoiógiát matat, amely polipeptid llmfocka vándorlást stimulál vagy egyrétegű sejtek paraeeifolaris permeabslitását csökkenti;

   d) polipeptid, amely tartalmazza a humán CRAM-l-nek a 6. ábra középső részén bemutatott amiaosav-szekvenciáját;

   e) a (d) pont szerinti polipeptid érett formája, ahol az érett forma a 32. aminosav-helyeit kezdődik: és t) polipeptid; amelynek ammsav-szekvenesája legalább 70%-fean homológ a (d) pont szerinti polipeptíddel, amely polipeptid limfoeita vándorlást stimulál vagy egy rétegben elhelyezkedő sejtek paraeelhjlám pemeabilBsát csökkenti gyógyszerként történő alkalmazásra.
2. 2, Oldható CRAM-l -poiipepíid, amely a CRAM-l-nek a 2-2, ábrán bemutatott V-dománj-ét tartalmazza, amely képes blokkolni a leukociták endoteHarson keresztüli átvátfoorlását,
3. 3, A 2. igénypont szerinti oldható polipeptid, amely tartalmaz:

   a) egér CRAM- 1-ttek a 2-2, vagy a S. ábrán bemutatott V-homénjét;

   b) egér CRAM-1 -nek a 2-2. vagy a 8. ábrán bemutatott V és C2 áoménjét;

   c) egér CRAM-l-nek a 8. ábrán bemutatott, 1-159 közötti amisosavait vagy

   d) egér CRAM-l-nek a 8. ábrán bemutatott, 1 -238 közötti amfeösavaik
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti oldható polipeptid, gyógyszerként történő alkalmazásra.
5. 5. A 4. igénypont. szerinti oldható polipeptid, gyulladásos reakció kezelésében történő alkalmazásra.
6. 6, Poimakleotid a kővetkező csoportból választva:

   a) polínukieotld, amelynek rnikleotid-szekvenciája azonos az egér CRAM-l-nek az 1. vagy a g, ábrán bemutatott nukleotid-szekvenciájávai;

   b) polinukieotid, amelynek nnkleotid-szekvencíája egy teljes pobpeptideí vagy annak egy részét kódolja, .amely polipeptid minosav-szekve»eiája a CRAM-t-»efc a 3. ábra felső sorában bemutatott mfcosav-szekvenciájával legalább 70%-bas homológ, és amely ptrlipeptíd limfocita vándorlást stimulál, vagy egy rétegben elhelyezkedő sejtek paracelhdtó permeabilsiását csökkenti;

   c) polipeptid, amelynek reukfeotíd-szekvenolája -azonos a humán CRAM-1 -nek a 6, ábrán bemutatott Hukleoiíd-szekvenclájával és

   d) polinukieotid, amelynek nnkleond-szekvenciája egy teljes polipeptidet vagy annak egy részét kódolja, amely polipeptid arninosav-szekvendája -a humán CRAM-1 -nek a ő. ábrán bemutatott amiao•25*j «* ’« ♦ ·*; z z «ϊ» *»«* «»»« ♦* «* · ♦ sav-szekvenciájává; legalább 70%-fean homológ, és amely poiipepíld lirafoclta vándorlást stiirtnlái, vagy egy rétegben elhelyezkedő sejtek paraoelluláns psrmsabihíásáí csökkenti gyógyszerként történő alkalmazásra.
7. 7. Ellenanyag az í. igénypont szerinti pelipeptiti ellen, ahol az ellenanyag képes gátolni a leakóciták endotéliumon keresztdh átvándetiását.

   S. A 7. Igénypont szerinti ellenanyag, ahol az ellenanyag soxirhoz, radioaktív -jelölőhöz vagy droghoz kapcsolt
8. 9, A 7. vagy h, igénypont szerinti ellenanyag, gyósyszerkéGt történő alkalmazásra.

   cZ> ο ο o C.> c