CZ20013267A3 - Polypeptidy - Google Patents
Polypeptidy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013267A3 CZ20013267A3 CZ20013267A CZ20013267A CZ20013267A3 CZ 20013267 A3 CZ20013267 A3 CZ 20013267A3 CZ 20013267 A CZ20013267 A CZ 20013267A CZ 20013267 A CZ20013267 A CZ 20013267A CZ 20013267 A3 CZ20013267 A3 CZ 20013267A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cram
- jam
- cells
- amino acid
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 108
- 102100023429 Junctional adhesion molecule C Human genes 0.000 description 67
- 108010040135 Junctional Adhesion Molecule C Proteins 0.000 description 66
- 108010040149 Junctional Adhesion Molecule B Proteins 0.000 description 61
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 102100022304 Junctional adhesion molecule A Human genes 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 108010040082 Junctional Adhesion Molecule A Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 18
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 17
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 16
- 102100024441 Dihydropyrimidinase-related protein 5 Human genes 0.000 description 15
- 101001053479 Homo sapiens Dihydropyrimidinase-related protein 5 Proteins 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 12
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 10
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 10
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 10
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 10
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 5
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 4
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 3
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010022164 acetyl-LDL Proteins 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000010865 video microscopy Methods 0.000 description 3
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 241001301450 Crocidium multicaule Species 0.000 description 2
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BRABKKMYSDDDCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-ethoxy-4-methoxy-5-methylsulfanylphenyl)ethanamine Chemical compound CCOC1=CC(CCN)=CC(SC)=C1OC BRABKKMYSDDDCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000996823 Homo sapiens Cell surface A33 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001046633 Homo sapiens Junctional adhesion molecule A Proteins 0.000 description 1
- 101001050320 Homo sapiens Junctional adhesion molecule B Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100023430 Junctional adhesion molecule B Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001050319 Mus musculus Junctional adhesion molecule B Proteins 0.000 description 1
- 101001050316 Mus musculus Junctional adhesion molecule C Proteins 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011830 Neural cell adhesion Human genes 0.000 description 1
- 108050002172 Neural cell adhesion Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101150082530 TJP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034686 Tight junction protein ZO-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000212 effect on lymphocytes Effects 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000004407 endothelial cell of postcapillary venule of lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000054366 human GPA33 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000000231 kidney cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000007542 postnatal development Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- DQJCHOQLCLEDLL-UHFFFAOYSA-N tricyclazole Chemical compound CC1=CC=CC2=C1N1C=NN=C1S2 DQJCHOQLCLEDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000005233 tubule cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 201000011531 vascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003845 vascular endothelial function Effects 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000037197 vascular physiology Effects 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká identifikace nové podskupiny cévních adhezních molekul a modulace funkce těchto molekul pro 5 léčení různých onemocnění.
Dosavadní stav techniky
V průběhu embryonálního a časně postnatálního vývoje endotheliální buňky proliferují a diferencují za vytvoření nových cév 10 prostřednictvím vaskulogeneze a angiogeneze. U dospělého organismu určuje endothelium bariéru mezi tkání a krví a skládá se z klidových buněk, u kterých neprobíhá buněčný cyklus. Tyto polarizované buňky jsou vzájemně navázány těsnými spojeními a adherenovými spoji za vytvoření souvislé vrstvy buněk. Funkce 15 endotheliální vrstvy spočívá v udržování rovnováhy tkání, fibrinolýzy, koagulace, cévního tlaku a transmigrace leukocytů. Všechny tyto vlastnosti jsou řízeny jemným sladěním exprese a funkce adhezních molekul.
Patologické situace jako je zánět, růst tumoru, poranění nebo 2o angiogeneze vedou k dočasné změně počtu a funkce adhezních molekul na cévním endotheliu, což vede ke změně rovnováhy cév. Například tumory zvyšují místní koncentraci angiogenních faktorů, což indukuje přepnutí z klidových endotheliálních buněk, u kterých neprobíhá buněčný cyklus, na proliferující endothelium. Angiogenní 25 přepnutí je indukováno několika faktory včetně IL-8, epidermálního růstového faktoru (EGF), vaskulárního endotheliálního růstového faktoru (VEGF), rozpustného VCAM-1, základního růstového faktoru fibroblastů (bFGF) a tumorového nekrózního faktoru (TNF). Výsledkem • · e » * «
je, že endotheliální buňky existujících cév degradují extracelulární matrici (ECM) a pronikají do okolní tkáně, což vede k vaskularizaci tumorů.
V průběhu angiogenního přepnutí je modifikován obraz exprese 5 endotheliálních genů. Například působení bFGF nebo TNFa na endotheliální buňky vede ke čtyřnásobnému zvýšení exprese integrinu ανβ3, tedy adhezní molekuly, která se účastní migrace endotheliálních buněk. Navíc modifikuje angiogenní přepnutí zánětlivou odpověď endothelia, což vede k abnormální migraci leukocytů do tumorů.
Normálně leukocyty vystupují z krve adhezí k endotheliu a migrací přes ně. Tyto mechanismy probíhají vícestupňovým postupem, který zahrnuje selektiny, integriny a adhezní molekuly širší skupiny imunoglobulinů (Immunoglobulin Superfamily, Ig Sf).
V endotheliu asociovaném s tumorem bylo ukázáno, že dochází k regulaci vedoucí k poklesu VCAM, ICAM a selektinů. Regulace vedoucí k poklesu těchto adhezních molekul může představovat mechanismus, kterým tumory zabrání invazi cytotoxických buněk imunitního systému.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je najít nové adhezní proteiny širší skupiny imunoglobulinů Ig Sf, které jsou pod vlivem tumorů regulovány v endotheliu na úrovni transkripce.
Dalším předmětem vynálezu je definovat molekuly odvozené od 25 nových adhezních proteinů pro použití při léčení různých stavů, jako jsou například tumory a záněty.
Při výzkumu, který vedl k předkládanému vynálezu, byl používán experimentální myší model pro identifikaci transkriptů regulovaných v průběhu společné kultivace endotheliální buněčné linie • · · ·
s melanomovými buňkami. Pro omezení strategie screeningu na adhezní molekuly skupiny Ig Sf byl vyvinut nový přístup k zpřístupňování RNA (RNA display) označovaný „cílené diferenciální zpřístupňování“ (Targeted Differential Display). Novost tohoto 5 modifikovaného způsobu zobrazení spočívá v použití pouze jediné sady degenerovaných primerů. Jak bude ukázáno v příkladech, bylo překvapivě zjištěno, že to vede k dostatečné specificitě.
Pro techniku cíleného diferenciálního zpřístupňování založenou na polymerázové řetězové reakci (PCR) (Samaridis & Colonna (1997), 10 Eur. J. Immunol. 27, 660 - 665) byly konkrétně použity částečně degenerované primery (v tomto případě je úroveň degenerace mezi 2048 a 4096 různými formami primerů v jedné sadě) navržené tak, aby jejich cílem byly konzervované sekvence nalézané v doménách C2 členů Ig Sf.
Na základě tohoto zjištění poskytuje předkládaný vynález způsob specifické identifikace diferenciálně (rozdílně) exprimovaných sekvencí DNA zahrnující použití PCR s reverzní transkripcí s diferenciálním zpřístupněním (Differential Display Reverse Transcription PCR), při které se používá sady částečně nebo úplně degenerovaných primerů specifických pro cílový gen.
Hlavní omezení běžné strategie zpřístupnění RNA je nedostatek specificitý metody. Ve snaze zvýšit tuto specificitu používali autoři vynálezu při svém hledání jiných adhezních molekul degenerované primery, jejichž cílem byly sekvence kódující molekuly s doménami C2.
Toho bylo dosaženo uspořádáním domén C2 několika adhezních molekul Ig Sf a identifikací lineární shody aminokyselin obklopujících cysteinový zbytek účastníci se struktury domény C2:
Y-(RQYS)-C-x-A-S-N-x2-G.
V obecnějším smyslu může být tento přístup použit také při 3o hledání dalších sekvencí, ve kterých se používá reverzní překlad jedné • · · ·
• ·
- 4 · · ♦ ” *+ ···· ·· nebo více nejčastějších konvenčních (consensus) sekvencí pro návrh degenerovaných primerů použitých pro diferenciální zpřístupnění.
Tato metoda umožnila identifikaci transkriptu, který byl regulován v endotheliálních buňkách konfluencí v přítomnosti 5 melanomových nebo karcinomových buněk ve smyslu snížení exprese. cDNA kódovala novou molekulu Ig Sf s neobvyklými strukturními vlastnostmi a byla označena CRAM-1 ve významu adhezní molekula řízená konfluencí, „Confluency Regulated Adhesion Molecule“. Nejnovější popis strukturně příbuzné molekuly, JAM, která se podle 10 předpokladů účastní transmigrace leukocytů, ukázal možnost existence nové skupiny adhezních molekul, ve kterých jsou prototypy JAM a CRAM-1. Srovnání sekvence s databázemi EST dále umožnilo klonování CRAM-2, třetího člena této skupiny molekul. Obr. 1 ukazuje sekvence myší cDNA kódující proteiny CRAM-1 a CRAM-2. V této 15 přihlášce se používají názvy JAM a JAM-1, CRAM-1 a JAM-2 stejně jako CRAM-2 a JAM-3 zaměnitelně.
Komparativní distribuce transkriptů kódujících JAM, CRAM-1 a CRAM-2 v tkáních ukázala přednostní expresi těchto molekul v endotheliálních a epitheliálních kompartmentech, což ukazuje na 20 úlohu při udržování styků buňka-buňka. Tyto interakce buňka-buňka v klidových endotheliálních buňkách řídí cévní permeabilitu, buněčný cyklus a transmigraci leukocytů přes endotheliální stěnu.
Aby bylo dále možno objasnit funkci a vzájemnou souhru těchto tří molekul, bylo použito molekulárního přístupu. K tomuto účelu byly 25 zkonstruovány chimérní molekuly obsahující sekvence Flag-tag a Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) fúzované k rozpustné nebo na membránu vázané formě CRAM-1, CRAM-2 nebo JAM (shrnuto v obr. 2). Při transfekci do buněčných linií se fúzní produkty EGFP s CRAM-1 a JAM lokalizovaly do míst styku buňka-buňka, což 30 potvrzuje úlohu těchto molekul při komunikaci buňka-buňka. Naopak CRAM-2 byl siřeji distribuován na povrchu buněk. Navíc blokoval • · • · · · rozpustný konstrukt CRAM-1 transendotheliální migraci leukocytů in vitro, zatímco rozpustný JAM ukázal tento efekt pouze okrajově. Navíc tyto výsledky ukazují na klíčovou úlohu této nové podskupiny adhezních molekul při udržování cévní integrity a funkce endotheliální 5 vrstvy.
Na základě těchto zjištění poskytuje předkládaný vynález nové prostředky působící proti onemocněním jako je chronický zánět a rozvoj nádoru činidly založenými na polypeptidech CRAM.
Předkládaný vynález se zvláště týká polypeptidu v izolované 10 formě náležející do podskupiny širší skupiny imunoglobulinů (Immunoglobulin Superfamily), kde tento polypeptid vykazuje alespoň 70% sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí myších adhezních molekul řízených konfluencí (Confluency Regulated Adhesion Molecules), 1 nebo 2, (CRAM 1 nebo CRAM-2), jak je 15 znázorněno na obr. 3 v horní, popřípadě dolní řádce. Obr. 4 a 5 ukazují uspořádání aminokyselin v myším JAM-2 (CRAM-1), popřípadě JAM-3 (CRAM-2).
Polypeptidy CRAM nalezené v lidském nebo zvířecím těle jsou markéry pro rostoucí buňky. Exprese CRAM je regulována v rostoucích 20 buňkách ve směru zvýšení exprese.
Popisují se dva nové myší polypeptidy, které patří do této skupiny. Na základě sekvenční informace těchto polypeptidů je možno identifikovat další členy této skupiny dobře známými prostředky, jako je PCR, křížová hybridizace na knihovnách DNA, a zkřížená reaktivita 25 protilátek.
Informace o sekvenci se může týkat buď sekvence aminokyselin nebo nukleotidové sekvence kódující sekvenci aminokyselin.
Předkládaný vynález se tedy zvláště týká odpovídajícího polypeptidu u lidí obsahujícího v podstatě aminokyselinovou sekvenci ···· ··
- 6 znázorněnou v obr. 6B, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je s touto sekvencí alespoň ze 70 % homologická.
Navíc k použití informace o sekvenci těchto dvou proteinů CRAM popisované v předkládaném vynálezu pro identifikaci dalších 5 členů této skupiny u jiných druhů jako je člověk, mohou být také použity tyto dva proteiny a jim odpovídající členové této skupiny, použity pro přípravu odvozených molekul, jako jsou protilátky zaměřené proti (poly)peptidům podle vynálezu, nebo rekombinantní ekvivalenty proteinů, popřípadě v rozpustné formě, nebo peptidy io obsahující alespoň část aminokyselinové sekvence těchto polypeptidů. vhodné části aminokyselinové sekvence jsou zvláště v extracelulárních doménách: VC2, a membránová proximální cytoplasmatická sekvence: A-[Y,Q]-[R,S]-[R,K]-G-[C,Y]-F.
Navíc k derivátům typu protilátek a (poly)peptidů se vynález také 15 týká póly- nebo oligonukleotidů se sekvencí, která kóduje úplný polypeptid nebo jeho část, kde takový polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň 70 % homologní s aminokyselinovou sekvencí proteinů CRAM-1 nebo CRAM-2, jak jsou zde popisovány. Vynález se zvláště týká nukleotidových sekvencí, které jsou alespoň 20 ze 70 %, s výhodou alespoň z 80 %, výhodněji alespoň z 90 %, nejvýhodněji v podstatě 100% homologní se sekvencí CRAM-1 lidské DNA, ukázanou na obr. 6.
Tyto póly- nebo oligonukleotidy mohou být například RNA nebo DNA a může jít o primery, sondy, protismyslné RNA atd.
Všechny tyto molekuly mohou být použity pro modulaci funkce původních polypeptidů nalézaných v lidském nebo zvířecím těle nebo pro diagnózu.
Angiogeneze například v nádorech může být inhibována protilátkami. Mohou být použity jako molekuly hledající cíl na buňkách 30 nesoucích polypeptidy CRAM. Protilátky mohou působit samostatně nebo mohou být navázány na další molekuly, jako jsou toxiny, • · · · · · radioaktivní značky, fluorescenční značky, enzymatické značky, světlem aktivovatelné značky, ale také na liposomy, buňky atd.
Značené protilátky jsou zvláště vhodné pro diagnostické použití protilátek, tj. mohou být použity pro lokalizaci angiogeneze v rostoucím tumoru. Navíc mohou být protilátky navázané na toxiny nebo radioaktivní molekuly použity pro specifické zabíjení tumoru zevnitř tím, že jako cíl jsou určeny (rostoucí) cévy v tumoru.
Bylo zjištěno, že molekuly typu CRAM nebyly detekovány v normální cévní soustavě, s výjimkou lymfatických a endotheliálních žilek v lymfoidních orgánech, jako jsou lymfatické uzliny a Peyerovy pláty. Jejich výhoda je v tom, že směrování například protilátek antiCRAM může být vysoce specifické například pro tumorové buňky, čímž se zabrání nežádoucím vedlejším účinkům. Navíc se (poly)peptidy mohou také vázat na molekulu angiogenních cév a tím stimulovat nebo inhibovat angiogenezi.
Rozpustný (poly)peptid, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako polypeptidy CRAM, může být použit při léčení zánětlivých reakcí cévního endothelia. Podle vynálezu bylo zjištěno, že transendotheliální migrace leukocytů může být inhibována sCRAM-1-IG2Do nebo monoklonálními protilátkami proti CRAM-1. Tato a podobné molekuly mohou být proto použity pro ukončování nebo stimulaci imunologické reakce vyskytující se například u zánětu.
Specifická exprese molekuly na cévních buňkách HEV in vivo, které se specializují na migraci lymfocytů, mluví proti stimulačnímu efektu CRAM na migraci lymfocytů nebo cévní permeabilitu. Tento efekt proto může být způsoben modulací molekul, které se normálně účastní utěsňování cévního lože (CRAM-1, CRAM-2, JAM, PECAM, VE-Cadherin). Tento objev je základem jiných přihlášek vynálezu, které se týkají regulace interendotheliálních spojení dodáváním rekombinantních molekul (poly)peptidů CRAM podle vynálezu, nebo monoklonálních protilátek proti CRAM-1.
Protilátky anti-CRAM mohou být také použity pro blokování mezibuněčných interakcí u rostoucích buněk. To vede k disorganizaci mezibuněčných kontaktů, které jsou normálně požadovány pro bariérovou funkci krevních cév. Toto zjištění může být využito pro zvýšení permeability rostoucích cév pro zvýšení dovávání léčiv do takových míst jako jsou rostoucí tumory, děloha po menstruaci atd. Disorganizace intracelulárních kontaktů může být proto použita pro blokování rozvoje tumorových buněk nesoucích antigen, jako jsou angiomy (tumory pocházející z cévního endothelia) nebo některé rychle rostoucí karcinomy.
Pro diagnostické použití lze využít značených protilátek, ale také značených oligonukleotidů, které jsou komplementární s CRAM DNA nebo mRNA nalézaných v endotheliálních buňkách exprimujících protein nebo proteiny CRAM.
Předkládaný vynález bude dále ilustrován v následujícím příkladu, ve kterém se odkazuje na přiložené výkresy:
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Sekvence myší cDNA kódující proteiny CRAM-1 a CRAM-2. muCRAM-1 byla subklonována do vektoru pcDNA3 a sekvenována použitím primerů Sp6 a T7. muCRAM-2 byla získána jako klon IMAGE z knihovny EST (Ac: AA690843 a W80145) a byla sekvenována ve vektoru pT7T3-DPac s použitím primerů T7 a T3.
Obr. 2: Schematické znázornění molekulárních nástrojů použitých v příkladu. Struktura a důležité zbytky nové skupiny jsou znázorněny v horní části vrchního pruhu. Hvězdičky znázorňují domnělá fosforylační místa v cytoplasmatické částí tří molekul. Druhý konvenční zbytek Cys domény C2 v sekvenci JAM chybí. Dole jsou znázorněny různé chimérní molekuly s polohou a okolními zbytky míst • · ··♦·
fúze. Část molekul pocházejících ze sekvencí JAM, CRAM-1 nebo CRAM-2 je ukázána na bílém pozadí.
Obr. 3: Srovnání aminokyselinových sekvencí CRAM-1 a CRAM-
1. Mezery jsou ukázány jako pomlčky.
Obr. 4: Srovnání CRAM-1 (JAM-2) myši a člověka.
Obr. 5: Srovnání CRAM-2 (JAM-3) myši a člověka.
Obr. 6: Sekvence nukleových kyselin lidského CRAM-1 (horní část), úplná aminokyselinová sekvence lidského CRAM-1 (střední část) a částečná aminokyselinová sekvence lidského CRAM-2.
Obr. 7: Cílené diferenciální zpřístupnění použitím degenerovaných primerů. (A): Nukleotidové sekvence primerů PCR kódující sekvence přítomné v doménách C2 Ig. Dva primery kódují stejnou sekvenci v důsledku kodonů kódujících zbytek Ser. Úroveň degenerace je 4096 různých forem primerů kódujících YRCXAS a 2048 forem jiných. (B): Zpřístupnění radioaktivních produktů PCR získaných primery YYCXAS1. Dráhy odpovídající zpřístupnění produktů PCR běží na cDNA získané z endotheliální buněčné linie Tend (dráha T-end), melanomové buněčné linie B16 (dráha B16), nebo společné kultury mezi dvěma buněčnými liniemi (střední dráha). Šipka ukazuje sledovaný produkt PCR získaný z transkriptu CRAM-1 regulovaného směrem ke snížení exprese za podmínek společné kultury.
Obr. 8: (A) Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence konfluencí řízené adhezní molekuly 1 (CRAM-1) cDNA. Podtrženy jsou domnělý hydrofobní signální peptid (první podtržení) a transmembránová oblast (druhé podtržení). Jsou ukázána předpovězená místa N-glykosylace (přeškrtnutí), cysteiny s pravděpodobným vytvořením disulfidických vazeb (závorky) a zbytky Ser/Thr/Tyr možných míst fosforylace (tučně). (B) Strukturní model myšího proteinu CRAM-1. Extracelulární část s doménou VH a C2 • · ···· podobnou Ig s dvěma domnělými glykosylačními místy propojenými přes N. Šipka ukazuje oblast, která je cílem pro částečně degenerované primery (YYCXAS1), používané v technologii cíleného diferenciálního zpřístupnění (Targeted Differential Display).
Obr. 9: Uspořádání sekvence myších proteinů JAM, CRAM-1 a CRAM-2. Identické zbytky jsou v černých obdélnících a homologní zbytky jsou vystínovány šedě. Celková identita je 36 % mezi CRAM-2 a CRAM-1, 31 % mezi JAM A CRAM-1 a 33 % mezi JAM a CRAM-2; odpovídající homologie jsou 52 %, 52 % a 49 %. Mezery jsou znázorněny pomlčkami v sekvencích. Konvenční konzervované zbytky (Cys a Trp) domén V a C2 jsou znázorněny hvězdičkami.
Obr. 10: Exprese transkriptů kódujících JAM, CRAM-1 A CRAM2 detekovaná RT-PCR v různých drahách (A) nebo detekovaná northernovým přenosem v různých tkáních (B). (A): RT-PCR se provádí na cDNA pocházející z endotheliální buněčné linie zpracované působením TNF (dráhy 2 a 11 odpovídají buněčné linii t-end po působení TNF), nebo bez toho to působení (dráhy 3, 4, 6, 7, 9, 12 odpovídají buněčným liniím b-end.5, e-end.2, t-end V++L‘, t-end VlowL++, TME a t-end). Dráhy 5 a 10 odpovídají buněčným liniím tumoru B16 (melanom) a KLN205 (karcinom). Dráha 8 odpovídá netransformované thymové epitheliální buněčné linii MTE4-14. Dráha je pozitivní kontrola pro amplifikace JAM, CRAM-1 a CRAM-2 na plasmidech obsahujících klonované cDNA. (B): Autoradiografie hybridizace sondy P32 k northernovému přenosu myšího materiálu. Sondy používané pro každou hybridizaci jsou uvedeny vlevo. Hybridizační signály pro JAM a CRAM-1 jsou detekovány v oblasti velikosti 2 kb.
Obr. 11: Lokalizace JAM-2 a JAM-1 do vyvinutých kontaktů buňka-buňka. A: Imunocytochemické reakce byly prováděny na buňkách TME fixovaných paraformaldehydem s protilátkami anti-JAM- (a) nebo anti-JAM-1 (b). Šipky ukazují specifickou lokalizaci proteinů
- 11 do styků mezi buňkami. Proužek znázorňuje 10 pm. B: Chimérní molekuly JAM-2-EGFP (a) a JAM-1-EGFP (c) byly specificky lokalizovány do styků buněk mezi transfekovanými buňkami. Obohacení rekombinantními proteiny EGFP nebylo pozorováno mezi 5 transfekovanými a netransfekovanými buňkami (špičky šipek). Proužek odpovídá 20 pm. C: Imunoprecipitace JAM-2 po biotinylaci povrchu endotheliálních buněk TME. Jako negativní a pozitivní kontroly byly použity protilátky anti-PECAM (dráha 1) a anti-JAM-1 (dráha 2) pro imunoprecipitaci protilátkou CRAM-XIXH36 (dráha 3). Molekulové io hmotnosti jsou vyznačeny vpravo. D: Imunoprecipitace rekombinantních proteinů EGFP z buněk transfekovaných CHO. Pro imunoprecipitaci biotinylovaných lyzátů z netransfekovaných (dráhy 1 a 2), JAM-1-EGFP (dráhy 3 a 4) nebo JAM-2-EGFP (dráhy 5 a 6) buněk CHO byly použity anti-JAM-2 (dráhy 2, 3, 6), anti-JAM-1 (dráhy 15 1,4, 5). Molekulové hmotnosti jsou vyznačeny vpravo.
Obr. 12: Migrace splenocytů přes monovrstvy endotheliomů aktivovaných TNF v přítomnosti nebo nepřítomnosti chemokinu SDF-1. Byly použity tři endotheliomy: standardní typ t.end.1 nebo t.end.1 transfekovaný cDNA kódující CRAM-1 nebo CRAM-2. Dvě 20 monoklonální protilátky byly testovány na schopnost ovlivňovat transmigraci, a to F-26 nebo H-26, obě krysí lgG1 monoklonální protilátky proti myšímu CRAM-1.
Obr. 13: Regulace CRAM-1 jako funkce konfluence. Provádí se semikvantitativní PCR použitím směsi primerů specifických pro cDNA 25 HPRT a CRAM-1. Reakce PCR se analyzují na 1,2% agarózovém gelu a barví ethidiumbromidem. Dráhy 1, 2 a 3 odpovídají konfluenci 100, 50, popřípadě 10 %. Je pozorován slabší signál pro CRAM-1 při konfluenci 100 % (dráha 1). Uvedeny jsou kultivační podmínky endotheliálních buněčných linií (t-end.1 a TME) samostatně nebo ve 30 směsi s tumorovou buněčnou linií KLN 205.
·· 4444
Obr. 14: Analýza transkriptů JAM-2 (a), JAM-1 (b) nebo β-aktinu (c) v myších tkáních northernovým přenosem. Jsou ukázány výsledky post coitum (pc) embryonálních a dospělých preparátů mRNA. Velikosti hybridizačních signálů jsou označeny napravo.
Obr. 15: Imunohistologická analýza exprese JAM-2, JAM-1, ZO1 a PECAM. Postupné řezy ledviny (a-d) nebo řezy mezenterické lymfatické uzliny (e-l) byly barveny protilátkami anti-JAM-2 (a, e, i), anti-JAM-1 (b, f, j), anti-ZO-1 (c, g, k) nebo anti-PECAM (d, h, I). Každá řada obrázků (a-d, e-h, a i-l) byla získána s identickými nastaveními CCD.
Obr. 16: Exprese JAM-2 na endotheliálních buňkách. A: Cytofluorimetrická analýza exprese JAM-2, JAM-1 a PECAM na endotheliálních buněčných liniích (t.end.1, e.end.2 a TME) na buněčné linii skvamózního karcinomu (KLN 205). Tečkované profily představují negativní kontroly získané protilátkou proti CD4. B: Cytofluorimetrická analýza JAM-2 na čerstvě izolovaných endotheliálních buňkách. Uvedené orgány byly rozděleny štěpením směsí kolagenáza/dispáza, barveny DilAc-LDL, CD31 a anti-JAM-2 nebo anti-JAM-1, jak je uvedeno. Profily histogramů byly získány tak, že se bral v úvahu signál populace endotheliálních buněk pozitivní na DilAc-LDL (FL-2) a CD31 (FL-3). Negativní kontroly byly získány vynecháním primárních protilátek proti JAM-1 nebo JAM-2.
Obr. 17: (A): Lokalizace JAM-2-EGFP při tvorbě styku mezi buňkami. Jednotlivé fluorescenční obrazy byly zachycovány každé 3 min po dobu 1 hod v průběhu tvorby monovrstvy buněk CHO transfekovaných JAM-2-EGFP. Jsou ukázány obrázky získané během prvních 18 min. V čase 0 identifikují hvězdičky tři buňky přítomné vzorném poli. V čase 6, 12 a 18 min zdůrazňují šipky relokalizaci buněk JAM-2-EGFP k nově vytvořenému kontaktu mezi buňkami. (B): Lokalizace JAM-2-EGFP po poranění. Šipka indikuje místo poranění a ♦ · · · * ·
9 9 · · · · ·
- 13 - ...... ··· ··· ·* ··· hlavy šipek znázorňují membránový proces bohatý na JAM-2-EGFP. Na obrázcích je uveden uplynulý čas. Proužek znázorňuje 10 pm.
Obr. 18: Exprese JAM-2 snižuje paracelulární permeabilitu. (A): Paracelulární permeabilita byla vyhodnocována difúzí FITC-dextranu přes monovrstvy netransfekovaných buněk CHO, buněk CHO transfekovaných Tac (hulL2Ra) nebo s uvedeným fúzním proteinem EGFP (JAM-1 nebo JAM-2). Transfekce JAM-2-EGFP nebo JAM-1EGFP v buňkách CHO vedla k podstatnému snížení paracelulární permeability (57,8 % ± 4,9 a 70,8 % ± 3,6, p<0,0001), zatímco transfekce Tac paracelulární permeabilitu významně neovlivnila (100,4 ± 4,4, p = 0,9872). Výsledky byly normalizovány na netransfekované buňky CHO.
Obr. 19: Směrování JAM-2-EGFP (A) a JAM-1-EGFP (B) na existující těsné spoje. Konfluentní buňky MDCK, stabilně transfekované JAM-2-EGFP (A) nebo JAM-1-EGFP (B), byly barveny anti-okludinem a konjugátem protikráličí protilátky s barvivém Texas red. Řady obrázků po 0,9 pm od bazálních k apikálním úrovním jsou ukázány pro fluorescenci EGFP (a) a okludinové barvení (b). Bazální úroveň nalevo byla arbitrárně definována jako sériové obrázky obsahující úroveň těsných spojů v rovině zaostření +3,6 a +4,5 pm (čtvrtý a pátý obrázek doprava).
Obr. 20: Vliv rozpustných rekombinantních molekul na transendotheliální migraci leukocytů. (A): Transmigrace je vyjádřena jako relativní index a normalizována na hodnoty získané na neošetřené buněčné linii t-end (čárkovaně je ukázán index 1). Jsou ukázány výsledky získané v přítomnosti 1 pg sJAM-lg2do (prázdné čtverečky) nebo v přítomnosti 1 pg sCRAM-1-lg2do (plné kroužky). Index se počítá jako střední hodnota z pěti nezávislých transmigračních experimentů. (B): Fenotyp transmigrovaných buněk je vyjádřen jako počty buněk vypočtené z procent získaných analýzou ♦ · · »♦ ·
- 14 Facs po barvení anti-CD3-FITC a anti B220-PE. Hvězdičky ukazují experimentální body s podstatným rozdílem proti kontrole.
V příkladech mohou být termíny JAM a JAM-1, CRAM-1 a JAM2, a CRAM-2 a JAM-3 používány zaměnitelně.
Příklady provedení vynálezu
Příklad
Materiály a metody
Buněčné linie io Thymová (tEnd.1) a embryonální (eEnd.2) endotheliomové buněčné linie (Williams a další, 1989, Cell 57: 1053 - 1063) byly poskytnuty Dr. W. Risauem a Dr. B. Engelhardtem (Max Plaňek
Institute, Bad-Nauheim, Německo). Endotheliální buněčná linie TME lymfatické uzliny transformovaná SV40 byla poskytnuta Dr. A.
Hamannem (Harder a další, 1991, Exp. Cell Res. 197: 259 - 267).
Buněčné linie karcinomu skvamózních buněk KLN 205, CHO, MDCK a myelomová buněčná linie Sp2/0, byly získány ve sbírce Američan Type Tissue Culture Collection (ATCC). Všechny buňky kromě CHO byly pěstovány v DMEM (Gibco BRL, Paisley, Skotsko), doplněném 10%
FCS (PAA Laboratories, Linz, Rakousko), 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 U/ml streptomycinu (vše Gibco BRL). Buňky CHO byly . pěstovány v médiu Nut.Mix.F-12 (HAM) doplněném jak bylo uvedeno výše. Adherentní buňky byly uvolňovány promytím PBS/0,15 mM * EDTA s následnou 5 min inkubací v roztoku trypsin/EDTA při 37 °C.
Zpřístupnění, klonování a analýza sekvence
Pro experimenty se společnou kultivací bylo pěstováno 5 x 105 buněk t.End.1 spolu s 2,5 x 104 melanomových buněk B16 F10 64 hod v miskách pro tkáňové kultury o průměru 10 cm. Jako kontrola bylo • · · * · · • · · ·· .. «...
• · · » · < .
• ·· · · · · · ·
- 15 - ·:·· ···· .:. .:. ·..· .:.
pěstováno odděleně 5 x 105 buněk t.End.1 a 2,5 x 105 buněk B16 F10 za stejných podmínek a za získání konfluentních monovrstev po 64 hod. Celková RNA byla extrahována přímo na Petriho miskách Trizolovým činidlem podle doporučení výrobce (Gibco BRL, Paisley, Skotsko). cDNA byla připravena z 5 pg celkové RNA, s použitím primeru oligo-dT (16-mer) a reverzní transkriptázy Superscript Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Paisley, Skotsko). Kvalita a kvantita cDNA byly kontrolovány provedením 27 cyklů PCR na 1 pl cDNA ve zředění : 5 s použitím primerů specifických pro HPRT cDNA. Potom byla provedena diferenciální PCR s použitím následujících degenerovaných primerů: 5TAYAGNTGYNNNGCYTCYAA3’, 5TAYCRGTGYNNN-GCYTCYAA3 a 5TAYTAYTGYNNNGCYTCYAA3’, kódujících nejčasnější aminokyselinové sekvence obsažené v doménách C2: YRCXAS, YQCXAS a YYCXAS. Byly použity následující podmínky PCR: 2 μΙ zředěné cDNA; 2,5 μΙ PCR pufru 10x Goldstar PCR; 2 μΙ MgCI; 2 μΙ degenerovaných primerů 0,3 mM; 0,5 μΙ dNTP 0,1 mM; 0,1 μΙ αΡ33 dATP 10 mCi/ml (0,37 GBq/ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Diibendorf, Švýcarsko); 15,65 μΙ H2O; 0,25 μΙ Goldstar Taq polymerázy (Eurogentech, Seraing, Belgie).
Parametry PCR byly následující: 45 s při 94 °C, 90 s při 50 °C a 45 s při 72 °C, čtyřicetinásobné opakování. Byl použit nanášecí pufr formamid/EDTA a vzorky byly denaturovány 2 min při 94 °C. PCR produkty byly potom odděleny na 6% polyakrylamidovém gelu a byla provedena autoradiografie na materiálu Kodak OM-Mat. Byly porovnávány intenzity pruhů.
Odlišně exprimované pruhy byly vyříznuty ze suchého polyakrylamidového gelu a fragmenty byly izolovány povařením a srážením ethanolem jak bylo popsáno výše (Liang a Pardee, 1992, Science, 257: 967 - 970). Produkty PCR byly potom znovu amplifikovány se zvýšenými koncentracemi dNTP (0,2 mM namísto μΜ) bez P33-ATP. Produkty opakované amplifikace byly klonovány do vektoru pGem-T Easy Vector (Promega Corp., Wallisellen, •» ····
Švýcarsko), jak bylo popsáno výše Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Sekvence nukleových kyselin dvou nezávislých klonů byly 5 zjišťovány pomocí kitu Termo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Důbendorf, Švýcarsko) a analytického systému LI-COR DNA Analysis Systém (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Německo).
Identifikace JAM-3
Analýza sekvence a porovnání byly prováděny pomocí aplikací dostupných na serveru ExPASy Molecular Biology Server, tj. Blast, Prosíte, Swiss-Prot. Byly identifikovány tři různé EST homologní s CRAM-1 (depozitní číslo AA726206, AA052463 a AA175925). Žádná 15 z nich nekódovala transkript s úplnou délkou a neobsahovala iniciační sekvenci ATG. Proto byla získána 5’ kódující sekvence použitím amplifikačního systému 5’RACE-PCR Systém for Rapid Amplification of cDNA Ends, version 2.0, postup podle doporučení výrobce (Gibco BRL, Paisley, Skotsko).
Tři použité primery byly navrženy na základě sekvencí EST následovně: 5’-GAGGTACTTGCATGTGCT-3’ pro syntézu prvního řetězce, 5’-CGACAGGTGTCAGATAACA-3’ a 5’-CACCCTCCT-CACTCGT-3’ pro dvě „nested“ PCR. Produkt 5’RACE-PCR byl klonován do vektoru pGem-T. Pro získání úplné kódující sekvence pro
CRAM-1 byly klonovaný produkt 5’RACE-PCR a EST (depozitní číslo AA726206) štěpeny restrikčními enzymy Hpal a Notl a ligovány do vektoru pGem-t. Klonování CRAM-2 s úplnou délkou bylo založeno na stejné strategii jako porovnávání sekvence a technika 5’RACE. cDNA s úplnou délkou kódující CRAM-2 byla nakonec získána z EST 30 s depozitními čísly AA690843 a W80145. Tyto dva klony se odlišují délkou 3’-nepřekládané oblasti.
····
- 17 Northernův přenos
Celková mRNA z buněk nebo tkání byla extrahována použitím činidla Trizol (Life Technologies AG, Basel, Švýcarsko) podle 5 doporučení výrobce. Poly-A+ mRNA byla extrahována z 250 pg celkové RNA pomocí kitu Oligotex mRNA Purification Kit (Qiagen, Zurich, Švýcarsko). Souprava Embryonic Poly-A northern blot byla zakoupena od firmy CLONTECH (P.H Stehelin and Cie AG, Basel, Švýcarsko). Ribonukleotidové sondy byly připraveny z vektoru pcDNA3 io (Invitrogen, Leek, Holandsko) a obsahovaly sekvence kódující domény imunoglobulinu JAM-1 A JAM-2, nebo úplnou kódující sekvenci βaktinu. Hybridizace byla prováděna při 62 °C v pufru obsahujícím 50% formamid. Přenosy byly potom dvakrát promyty (0,5 x SSC, 0,1% SDS, 67 °C), a byla provedena autoradiografie na filmu Kodak X-Omat při 15 -80 °C.
Experimenty tykající se konfluence
Byl testován vliv konfluence endotheliálních buněk na hladiny mRNA JAM-2. 2 x 105 endotheliálních buněk TME bylo kultivováno 2o v kultivačních miskách o průměru 6, 10 a 15 cm pro dosažení různých úrovní konfluence po 64 hod v rozmezí od 10 do 100 %. Počet buněk po 64 hod zkontrolovaný vyloučením trypanové modři a počítáním byl ve všech případech stejný, a nesouvisel s velikostí povrchu Petriho misky.
Pro zjištění relativního množství transkriptu za různých podmínek byla provedena semikvantitativní reakce PCR nebo northernův přenos. Pro detekci transkriptu JAM-2 bylo použito páru primerů 5’-GACTCACAGACAAGTGAC-3’ a 5’-CACCCTCCT-CACTCGT-3’ za získání amplifikačního produktu o délce 750 bp. Jako
3o vnitřní kontrola byly použity následující primery specifické pro Hprt ··· · · · Σ 2 ···· ·· ew eJe o délce 350 bp: 5’a 5'-GAGGGTAGGCTGG- 18 cDNA pro amplifikaci fragmentu GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’ -CCTATAGGCT-3’.
Konstrukce expresních vektorů
Sekvence kódující EGFP byla subklonována z vektoru pEGFP-1 (CLONTECH, P.H Stehelin and Cie AG, Basel, Švýcarsko) do pcDNA3 s použitím restrikčních míst Hindlll a Notl, a tedy nazvaného pcDNA3/EGFP. 3’-restrikční místa Hpal a Scal, která se nacházejí 10 v sekvenci kódující cytoplasmatickou doménu JAM-2, popřípadě JAM1, byla použita pro fúzi těchto dvou sekvencí na N-konec EGFP ve vektoru pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Holandsko). Inzerty kódující JAM-2 nebo JAM-1 byly vyříznuty z pGemt nebo pRc/CMV s použitím štěpení Sacll/Hpal nebo Hindlll/Scal.
Kódující sekvence byly potom klonovány do vektoru pcDNA3/EGFP štěpeného Agel, přičemž konce byly zarovnány doplněním a bylo provedeno další štěpení enzymy Hindlll nebo Sacll. To vedlo k fúzním místům v polohách aminokyselin DGV291 pro JAM-2 a QPS285 pro JAM-1. Transfekce buněk CHO byla prováděna jak bylo 20 popsáno dříve (Ballestrem a další, 1998, J. Cell Sci. 111: 1649 1658). Stabilní transfektanty použité pro testy permeability byly selektovány pěstováním transfekovaných buněk CHO dva týdny v médiu obsahujícím 1 mg/ml G418. Rezistentní kolonie byly izolovány a kontrolovány na intenzitu fluorescence EGFP metodou průtokové 25 cytometrie (zařízení FACScalibur apparatus, Becton Dickinson, Mountain View, CA) a lokalizace fluorescence pod mikroskopem (Axiovert, Zeiss, Oberkochen, Německo). Videomikroskopie v čase byla prováděna použitím fluorescenčního mikroskopu Axiovert a softwaru Openlab pro zachycování obrazu.
Savčí expresní vektor pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Holandsko) byl modifikován integrací kódujících sekvencí Flag-Tagu (G. Wiedle, Dep.
·· ····
| • | 99 | ||
| ·· • | • 9 9 9 | 99 | |
| 9 | 9 9 9 | ||
| 9 | 9 9 | ||
| ·· | 999 | 1t9 | 99 |
* · · • · • ♦ ·
-19of Pathology, CMU, Ženeva). Pomocí PCR byly připraveny konstrukty Flag-Tag obsahují kódující sekvence pro rozpustné formy proteinů JAM, CRAM-1 a CRAM-2. Ve všech případech byly navrženy dopředně primery tak, aby zapadly do iniciační oblasti ATG. Reverzní primery 5 byly navrženy v sekvencích kódujících oblast raménka pro jednu rozpustnou formu v Ig nebo v sekvenci kódující oblast mezi C2 a transmembránovou doménou pro dvě rozpustné molekuly v doménách Ig. Všechny reverzní primery měly 3’-prodloužení obsahující restrikční místo Xbal pro přímé klonování modifikovaného vektoru Flag-tag ve 10 správném čtecím rámci. Při PCR byla použita Pfu DNA polymeráza, aby se zabránilo častým mutacím (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Fragmenty PCR byly potom štěpeny Xbal a klonovány do pcDNA-3 Flag-Tag vektoru štěpeného EcoRI, vyplněného Klenowovým fragmentem a potom štěpeného Xbal.
Reakční činidla a imunofluorescenční analýza
Byly použity následující monoklonální protilátky: anti-PECAM (GC51, krysí lgG28l EA-3, krysí IgGi) a anti-JAM (H202.106.7,4, krysí IgG-i) (Malergue a další, 1998, Mol. Immunol, 35: 1111 - 1119; Piali a 20 další, 1993, Eur. J. Immunol, 23: 2464 - 2471). V laboratoři byl vytvořen soubor protilátek CRAM proti JAM-2 s použitím standardních technik a rekombinantní rozpustné molekuly jako imunogenu (AurrandLions a další, 1996, Immunity, 5: 391 - 405). Vybrané hybridomy byly systematicky prozkoumány metodou ELISA z hlediska produkce 25 protilátek specificky rozpoznávajících rekombinantní rozpustnou molekulu JAM-2. Pozitivní klony byly následně testovány na buňkách CHO transfekovaných JAM-2 cDNA (není ukázáno).
Všechny protilátky CRAM jsou isotypu IgGi nebo lgG2a kromě CRAM-25F24, která je podtřídy lgG2b- Protilátky byly čištěny na 3o kolonách Protein G Sepharose (Pharmacia Biotech Europe,
Dubendorf, Switzerland), podle doporučení výrobce. Pro
imunoprecipitaci byla použita mAb CRAM-19H36, zatímco pro imunohistochemická stanovení byla použita CRAM-18F26. Podobné výsledky byly získány s monoklonálními protilátkami CRAM-4H31 a CRAM-17D33.
Imunofluorescenční analýza byla prováděna pomocí sekundárních činidel navázaných na FITC nebo barvivo Texas Red (Jackson Immunoresearch, Milan AG, La Roche, Švýcarsko) pro cytofluorimetrii, popřípadě imunohistochemii.
Pro imunohistochemické účely byly vzorky fixovány 5 min 10 chladným (-20 °C) methanolem. Vzorky byly rehydratovány v pufru PBS, želatina 0,2%, Tween 20 0,05%, inkubovány přes noc s primárními protilátkami před promytím a vyvolávány vhodným sekundárním činidlem navázaným na barvivo Texas Red. Pro analýzu čerstvých endotheliálních buněk byla provedena disociace čerstvě 15 vyříznutých tkání použitím štěpení kolagenáza/dispáza zavedeným postupem (Kramer a další, 1984, J, Cell Biol. 99: 692 - 698). Disociované buňky byly barveny 2 hod při 37 °C materiálem Dilacetylated LDL (Molecular Probe Europe BV, Leiden, Holandsko), před barvením anti-CRAM-19 a sondou kozí protilátkou proti krysímu FITC. 20 Po třech promytích byly buňky barveny biotinylovaným anti-CD31 (Pharmingen) a barvivém Streptavidin Red 670 (Life technologies AG, Basel, Švýcarsko).
Exprese JAM-1 nebo JAM-2 byla analyzována na buňkách pozitivních na dva endotheliální buněčné markéry: acetylovaný LDL 25 (FL-2) a CD31 (FL-3). Negativní kontroly byly získány vynecháním primární protilátky.
Imunoprecipitace
Imunoprecipitace byly prováděny jak bylo popsáno výše 30 (Aurrand-Lions a další, 1997, Cellular Imunoloqy, 176: 173 - 179) s použitím pufru 10 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,5% Triton X 100, 0,5% NP40, koktejl inhibitorů proteáz (Roche Diagnostice Ltd., Rotkreuz, Švýcarsko) pro lyži. Po imunoprecipitaci, SDS/PAGE a přenosu na nitrocelulózovou membránu byly biotinylované proteiny 5 vyvolávány použitím streptavidinu navázaného na peroxydázu (Jackson Immunoresearch) a ECL (Amersham Pharmacia Biotech, UK).
Testy permeability <
io Permeabilita byla měřena v komůrkách Transwell (průměr
6,5 mm, PC filtry, velikost pórů 0,4 pm, Costar Corp.). Ve stručnosti, 1 x 104 transfekovaných nebo netransfekovaných buněk CHO bylo kultivováno do konfluence na filtrech, které byly předtím potahovány 30 min 0,2% želatinou. Po pěti dnech bylo médium změněno za předehřáté médium Nut/F12 bez FCS (500 pl v dolní komůrce a 200 μΙ v horní komůrce). Do horní komůrky byl přidán FITC-dextran (Mh 38 900, Sigma Chemical Co.) v konečné koncentraci 1 mg/ml.
Po 1 hod byly komůrky odstraněny a fluorescence byla přímo odečítána v dolní komůrce použitím přístroje Cytofluor II. Střední 20 intenzita fluorescence v pěti nezávislých komůrkách byla vypočítána a porovnávána použitím softwaru Statview a nepárových srovnání ttestem. Pro normalizační experimenty byly hodnoty střední intenzity fluorescence získány na buňkách CHO standardního typu a tyto hodnoty byly uvažovány jako 100%.
* 25
Transfekce a purifikace rozpustných molekul
Předchodná transvekce 293 T, Bose 23 nebo stabilní transfekce buněk CHO rozpustnými konstrukty IgIDo a lg2Do Flagtag/pcDNA-3 byly prováděny pomocí činidla Lipofectamine Reagent podle instrukcí 30 výrobce (Gibco BRL, Paisley, Skotsko). Po transfekci byly
- 22 supernatanty oddělovány každé dva dny v průběhu desetidenního období. Kuličky M2 Beads (Kodak, New Haven, USA), kovalentně navázané na protilátku anti-Flag, byly dvakrát promyty PBS s obsahem směsi inhibitorů proteáz Protease Inhibitor Mix (Boehringer Mannheim, 5 Německo). Kuličky byly potom inkubovány při 4 °C 3 hod se supernatantem z transfekovaných buněk. Po pěti promytích PBS s obsahem inhibitorů proteáz byla těmito kuličkami naplněna kolona a rekombinantní molekuly byly eluovány 10 mM glycinovým pufrem pH
3,4 podle doporučení výrobce, eluované frakce obsahující io rekombinantní proteiny byly potom zakoncentrovány na koncentrátoru Centricon-10 (millipore) a dialyzovány proti PBS.
Konečné zakoncentrování proteinů bylo zjištěno testem Micro BCA assay (Biorad). Purifikované produkty byly potom testovány elektroforézou na gelu polyakrylamidu/SDS s následným barvením 15 modří Coomassie blue pro získání analýzy čistoty.
Transmiqrační testy
Transmigrace leukocytů přes endotheliální buňky byla prováděna jak bylo popsáno výše (Wheerasinghe a další, 1998, J. Cell 20 Biology, 142: 595 - 607). Ve stručnosti, 1 x 105 buněk t-end bylo kultivováno dva dny v jednotkách transwel (polykarbonátové filtry, velikost pórů 5 pm, Costar) v přítomnosti 1 pg rekombinantních molekul sJAM 2do nebo sCRAM-1 2do rozpustných v Ig. Po dvou dnech bylo přidáno 1 x 106 leukocytů získaných z lymfatických uzlin 25 a Peyerových plátů do horního oddílu a počet transmigrovaných buněk byl monitorován v průběhu experimentu každou hodinu. Po čtyřech hodinách byly transmigrované buňky získané z pěti nezávislých jamek spojeny a podrobeny cytofluorimetrické analýze na markéry B- a Tbuněk B220 a CD3. Výsledky byly získány na přístroji Facscalibur a s 30 použitím analytického programu Cell-Quest (Becton-Dickinson).
-23- ····*··
Pro transmigrační test se splenocyty bylo zaočkováno 3 x 105 endotheliálních buněk do jednotek transwell (polykarbonátové fitry, velikost pórů 8 pm, Costar), přičemž buňky byly ponechány více než 18 hod pro vytvoření monovrstvy. Médium v horním oddílu bylo 5 odstraněno a do horního oddílu bylo potom přidáno 1 x 106 leukocytů ve 100 pl, čerstvě připravených ze sleziny centrifugací v materiálu Ficoll. Do média byl přidán SDF-1 (konečná koncentrace 40 nM) do nižšího oddílu pro získání gradientu chemokinů mezi dolním a horním oddílem. Pro experiment s protilátkami byly přidány vyčištěné io protilátky 18-F26 nebo 19-H36 v koncentraci 10 pg/ml do horního oddílu se splenocyty. Po 4 hod byly transmigrované leukocyty (v dolním oddílu) sklizeny a počítány. Výsledky byly vyjádřeny jako procenta vstupu.
Výsledky
Cílené diferenciální zpřístupnění
Regulace genů v endotheliálních buňkách závisí na okolním prostředí. Předkládaný vynález byl zaměřen na identifikaci genů, které jsou regulovány po styku endothelia s tumorovými buňkami. Pro tento 20 účel byl vyvinut test in vitro s použitím společné kultivace melanomových tumorových buněk (B16) s endotheliomovou buněčnou linií (t-end). Jako templát pro přípravu cDNA, u které byl prováděn diferenciální screening metodou PCR, byla použita celková RNA extrahovaná ze směsi. cDNA získaná z endotheliálních nebo 25 melanomových buněk kultivovaných samostatně byla použita jako kontrola. Tyto tři různé skupiny údajů byly srovnávány pro identifikaci transkriptů regulovaných za podmínek společné kultivace. Pro omezení analýzy na sekvence kódující molekuly buněčného povrchu širší skupiny Ig byly použity částečně degenerované primery, které se 30 zaměřují na sekvence obklopující C-koncový cystein v doménách C2 v molekulách širší skupiny Ig. Většina reprodukovatelných souborů • · · ·
produktů PCR byla získána pomocí primerů, které kódují sekvenci YYCxASI (obr. 7A). Tato zlepšená metoda zpřístupnění RNA (RNA display) byla nazvána TDD, což je zkratka označení „Targeted Differential Display“.
Při opakovaných experimentech s TDD bylo identifikováno šestnáct odlišně exprimovaných genů. Po klonování a analýze nukleotidové a aminokyselinové sekvence byly tři ze šestnácti produktů PCR možnými kandidáty kódujícími neznámé členy širší skupiny Ig. Jeden z těchto tří kandidátů (CRAM-1) byl zvolen pro další 10 testování. Při odděleném pěstování exprimovaly endotheliální buňky tend.1 a melanomové buňky B16 vysoké hladiny transkriptu CRAM-1. Za podmínek společné kultivace však byla exprese CRAM-1 regulována směrem k potlačení exprese (obr. 7B). Translace fragmentu o délce 350 bp odpovídajícího CRAM-1 ukázala 15 aminokyselinovou sekvenci YYCxAS, což ukazuje na zakončení domény C2 Ig následovaná otevřeným čtecím rámcem (ORF) obsahujícím hydrofobní sled 18 aminokyselin označených jako transmembránová oblast.
CRAM-1, člen širší skupiny imunoqlobulinů
Srovnání sekvence mezi sekvencí produktu PCR a databázemi nukleotidů odhalilo homologní a identické sekvence v databázích myších EST. Přítomnost EST ukázala, že produkt PCR odpovídal sekvenci exprimované in vivo. Bylo zjištěno, že tři sekvence EST 25 obsahují sekvenci o délce 300 bp na svých 5’-koncích, která byla identická se sekvencí 300 bp v produktu TDD. 3’-konce každé sekvence EST obsahovaly zakončení poly-A. Celkově měly sekvence EST délku 1270 bp a odpovídaly 3’-konci transkriptu CRAM. Protože 5’-konec transkriptu chyběl v klonu cDNA EST, byl získán metodou 30 5’RACE-PCR. Výsledná kódující sekvence o délce 1980 nukleotidů cDNA postulované CRAM-1 je ukázána na obr. 8A. Bylo nalezeno • · • · · ·
místo vysokého souhlasu (GACATGG) pro zahájení translace v místě 16 bp ve směsu translace od 5’-konce, následované jediným ORF s předpokládanou délkou proteinu 310 aminokyselin. Oblast 31 aminokyseliny následující za potenciálním iniciačním methioninem 5 byla charakteristická pro signální peptid. Bylo předpovězeno, že místo štěpení bude ležet na Ala 31-Val 32.
Domnělá struktura myšího proteinu CRAM-1 je ukázána na obr. 8B a sestává z extracelulární oblasti s variabilním těžkým řetězcem a konstantní imunoglobulinové domény podobné doméně typu 2 io (Pfam, The Sanger Centre and Blast) s dvěma potenciálními glykosylačními místy spojenými přes atom dusíku (AA 104 a 192). Analýza hydrofobnosti (Tmpred, ISREC) předpověděla transmembránovou oblast mezi polohami 242 - 260. Postulovaná cytoplasmatická doména se skládala ze 49 aminokyselin a obsahovala 15 řadu vysoce konzervovaných fosforylačních míst Ser/Thr a Tyr (obr.
8A, zbytky uvedeny kurzívou). Prohledávání známých rozvržení programem Prosíte identifikovalo motivy SSK/SYK jako fosforylační oblasti proteinkinázy C, SKQD/TSEE jako fosforylační oblasti CK2 a KQDGESY/KHDGVNY jako fosforylační oblasti tyrozinkinázy.
JAM, CRAM-1 a CRAM-2 definují novou podskupinu.
Několik proteinů ukázalo vysokou homologii s CRAM-1. Bylo zjištěno, že dva členové širší skupiny Ig: lidský antigen A33 a část myší nervové abuněčné adhezní molekuly, N-CAM, mají 41%, 25 popřípadě 46% homologii s CRAM-1. JAM, další člen širší skupiny Ig, má podobnou strukturu jako CRAM-1 s 34% identitou aminokyselin a 54% homologii. Významná identita mezi JAM a CRAM-1 byla použita pro nalezení třetí úzce příbuzné sekvence v databázích EST, totiž CRAM-2. Identita mezi těmito třemi molekulami ukázala existenci nové 30 podskupiny molekul ve širší skupině Ig (obr. 9). Homologie se netýkala pouze celkové struktury domén V a C2 (C54 až C118 a C147 až C235 • · · ·
v obr. 9), ale také sekvencí uvnitř těchto cytoplasmatických domén. Je zajímavé, že většina odlišných oblastí mezi těmito třemi molekulami byla zjištěna na začátku domény V (poloha 40 až 60) a v blízké cytoplasmatické části (poloha 280 až 300). Funkce těchto dvou oblastí 5 odpovídají sekvencím, které se účastní při vazbě ligandu a přenosu signálu do jiných členů širší skupiny Ig, což ukazuje na úlohu JAM, CRAM-1 a CRAM-2 při komunikaci mezi jednotlivými buňkami.
Distribuce JAM, CRAM-1 a CRAM-2 mRNA v tkáních io Exprese těchto tří transkriptů v buňkách různého původu byla detekována pomocí RT-PCR. Všechny endotheliální, epitheliální a většina testovaných tumorových buněčných linií byly pozitivní, i když s různými stupni pro různé transkripty (obr. 10A). Nejvyšší hladina exprese pro CRAM-1 byla nalezena v buněčné linii TME odvozené od
HEV transformované SV40 (dráha 9) a v embryonální epitheliální buněčné linii e-end.2 (dráha 4). Transkripty CRAM-2 a JAM ukázaly omezenější distribuci a byly zjištěny v dospělých endotheliálních buněřných liniích spolu s transkriptem CRAM-1 (dráhy 3, 7, 9 a 12). Je zřejmé, že transkripty JAM a CRAM-2 byly silně regulovány ve smyslu snížení exprese působením TNF na endotheliální buňky, zatímco hladina transkriptů CRAM-1 zůstala nezměněná (dráhy 2 a 11). Je zajímavé, že embryonální endotheliální buněčná linie (dráha 4) nebo dospělá endotheliální buněčná linie reprezentující angiogenní variantu t-end (dráha 6) neexprimovala JAM nebo CRAM-2.
Distribuce transkriptů JAM-2 ve tkáni byla zjišťována northernovým přenosem a porovnávána s JAM-1 (obr. 14). Transkript JAM-2 měl délku 2 kb a byl vysoce exprimován v embryonální tkáni a v Peyerových plátech, lymfatických uzlinách, ledvině a varleti dospělých zvířat. Ve varleti byla detekována domnělá rozštěpená varianta o délce 1,8 kb. Exprese transkriptů JAM-2 byla nízká v plicích, játrech, slezině a thymu. Relativní nadbytek JAM-1 a JAM-2 byl porovnáván v průběhu embryogeneze. mRNA kódující JAM-2 byla detekovatelná již v den 7,5 post coitum, zatímco mRNA JAM-1 nebyla detekována v průběhu embryogeneze vůbec.
Tyto výsledky ukazují, že CRAM-1 je široce exprimován v průběhu embryogeneze, a vyznačuje se omezenou expresí do epitheliálních nebo endotheliálních oddílů v dospělých tkáních. To je v souladu s domněnkou, že hraje úlohu při vytváření a udržování polarizované organizace buněk.
JAM-2, protein o velikosti 45 kD, závisí při své lokalizaci do míst styku mezi buňkami na homofilních interakcích
Protože buněčná linie TME odvozená od HEV exprimovala nejvyšší hladinu JAM-2, tato endotheliální buněčná linie byla použita pro další studium subcelulární lokalizace JAM-2, a pro porovnání této 15 lokalizace s JAM-1. Lokalizace proteinu JAM-2 na povrchu endotheliálních buněk byla omezena na místa styku buňka-buňka (obr. 11A, a). Zbarvení JAM-2 bylo slabší než zbarvení pozorované pro JAM-1 a méně převažovalo v prodloužení membrán mezi buňkami.
Potom bylo zkoumáno, zda JAM-2 přítomný na místech styků 20 buňka-buňka interagoval homofilně s JAM-2, nebo zda interagoval heterofilně s jinou molekulou na sousední buňce. Tomuto účelu byl protein JAM-2 fúzován k k zeleně fluoreskujícímu proteinu (JAM-2EGFP), a konstrukt byl transfekován do buněk CHO. Když buňky CHO transfekované cDNA JAM-2-EGFP dosáhly konfluence, JAM-2 byl 25 pozorován pouze na místech styku mezi buňkami, kde obě buňky exprimovaly protein (obr. 11B), zatímco místa styku mezi exprimujícími a neexprimujícími buňkami JAM-2 neobsahovaly (obr. 11B, a, ukázáno špičkami šipek). Stejný výsledek byl pozorován, jestliže buňky byly transfekovány chimérní molekulou JAM-1-EGFP (obr. 11B, b). To 30 ukázalo, že buď JAM-2, nebo JAM-1, vyžadovaly pro lokalizaci v místech styku buňka-buňka homofilní interakce.
• · · · · ·
Pro biochemickou charakterizaci JAM-2 byly provedeny imunoprecipitace chimérních proteinů JAM-2 nebo EGFP exprimovaných buněčnou linií TME nebo transfekovanými buňkami CHO (obr. 11C a D). Protilátka anti-JAM-2, CRAM-19H36, imunoprecipitovala jediný pruh o velikosti 45 kD z lyzátu buněk TME (obr. 11C, dráha 3).
Zdánlivá molekulová hmotnost byla identická za redukujících nebo neredukujících podmínek (není ukázáno) a odpovídala předpovězené molekulové hmotnosti odvozené z aminokyselinové sekvence JAM-2, kde každé místo N-glykosylace se počítá jako 5 kD. Imunoprecipitace JAM-1 s použitím H202-106 specifické protilátky anti-JAM vedla k jedinému pruhu s nižší molekulovou hmotností (~42 kD, dráha 2), který vylučoval možnou zkříženou reaktivitu mezi protilátkami anti-JAM-2 a anti-JAM-1.
Imunoprecipitace rekombinantních proteinů JAM-1-EGFP nebo JAM-2-EGFP po biotinylaci povrchu vedly k jednotlivým širokým pruhům s molekulovou hmotností 70, popřípadě 73 kD, což ukazuje, že tyto molekuly byly exprimovány na povrchu transfekovaných buněk CHO (obr. 11D, dráhy 4 a 6). Tyto molekulové hmotnosti byly očekávány, protože EGFP má molekulovou hmotnost 28 kD.
Těsnost a migrace leukocytů
Pro porozumění, jak molekuly ovlivňují integritu monovrstvy endotheliálních buněk, a jak regulují funkci cévního endothelu, byly prováděny testy transendotheliální migrace leukocytů v přítomnosti rekombinantního rozpustného JAM nebo CRAM-1. Endotheliální buňky byly dva dny kultivovány v přítomnosti sJAM-lg2Do nebo sCRAM-1IG2Do. Integrita monovrstvy nebyla v průběhu tohoto období ovlivňována, pravděpodobně v důsledku molekulární redundance mechanismu tvorby styku buňka-buňka. Transmigrační test byl prováděn v přítomnosti 1 pg rekombinantních rozpustných molekul.
Jak je ukázáno v obr. 20a, počet transmigrujících buněk byl nepatrně ovlivňován přítomností sJAM-lg2Do (prázdné čtverečky) v průběhu prvních tří hodin. Po čtyřech hodinách došlo ke zvýšení počtu transmigrovaných buněk v porovnání s kontrolou (vyznačena 5 čárkovaně). Naopak přítomnost sCRAM-1-lg2Do (plné kroužky) silně omezila počet transmigrujících buněk.
Protože populace leukocytů byly heterogenní, bylo testováno, zda sCRAM-1-lg2Do působil na specifickou subpopulaci leukocytů, nebo zda byla transmigrace blokována nespecificky. K tomuto účelu io byly transmigrované buňky značeny lymfocytovými markéry CD3 a B220 (obr. 20B).
Je pozoruhodné, že sCRAM-1-lg1 Do specificky blokoval transmigraci nelymfoidních leukocytů, tj. buněk myeloidní výstelky (prostřední obrázek, čárkované sloupce). Naopak sJAM-lg2Do 15 nepatrně zvyšoval počet transmigrujících T-buněk (levý obrázek, prázdný sloupec) bez jakéhokoli efektu na další subpopulace buněk.
Navíc, jestliže byly při transmigračním testu použity endotheliomové buňky transfekované CRAM-1, byla pozorována zvýšená transmigrace (obr. 12), zatímco transfekce CRAM-2 neměla 20 na transmigraci vliv. Jestliže byl k testu přidán SDF-1, dosáhla transendotheliální migrace leukocytů 20 %. Tento jev byl částečně blokován monoklonálními protilátkami proti CRAM-1.
Tyto výsledky ukazují, že zapojení CRAM-1 mezi endotheliálními buňkami může regulovat funkci endotheliální vrstvy. Dalo by se 25 očekávat, že molekuly této skupiny vytvoří bariéru, jestliže endotheliální buňky dosáhnou konfluence. Z tohoto hlediska byla regulace transkriptů CRAM-1 vyšetřována v endotheliálních buňkách za různých podmínek kultivace.
»· ·«··
CRAM je vysokou konfluenci regulován ve smyslu snížení exprese
Protože transkript kódující CRAM-1 není regulován TNF, ale je regulován ve smyslu snížení exprese, jestliže bylo endothelium společně kultivováno s tumorovými buňkami, bylo pro další objasnění této regulace použito testu konfluence. Za podmínek nízké konfluence procházely buňky aktivními buněčnými cykly a nedocházelo k interakcím CRAM-1, zatímco za vysoké konfluence se buňky méně dělily a byla pozorována účast CRAM-1. Míra exprese mRNA CRAM-1 byla zjišťována za různých hustot buněk semikvantitativní RT-PCR. Jak je ukázáno na obr. 13, míra exprese transkriptů CRAM-1 se snižovala při dosažení konfluence (dráhy 1, 2, 3 na obr. 13 odpovídají 100, 50, popřípadě 10% konfluenci). Tento jev byl obtížně detekovatelný v případě buněk t-end, ale byl vyjádřenější u buněčné linie TME, která se vyznačovala vysokou expresí CRAM-1. Regulace CRAM-1 ve smyslu snížení exprese v endotheliu byla také zvýšena, jestliže byly endotheliální buňky kultivovány spolu s karcinomovými buňkami KLN 205, které samy CRAM-1 neexprimují. To potvrdilo souvislost mezi expresí CRAM-1 a buněčným cyklem, protože bylo popsáno, že tumorové buňky zvyšují po kontaktu míru růstu endotheliálních buněk. To je významné, protože výsledky získané s karcinomovými buňkami KLN 205 byly identické s výsledky získanými použitím původní strategie screeningu autorů vynálezu s buňkami melanomového tumoru B16. To ukazuje na obecný mechanismus, kterým tumory ovlivňují chování endothelia.
JAM-2 je ve vysoké míře exprimován v průběhu embryoqeneze a je omezen na HEV a subpopulace endotheliálních buněk v dospělých tkáních
Pro lepší definici distribuce JAM-2 v tkáních byla provedena imunohistologická analýza na ledvině a řezech mesenterické lymfatické uzliny (obr. 15), která exprimovala nejvyšší hladiny ·* 9999
Q4 999 · · Ζ Z !
- ···· ·· *·* ,,, *,,* transkriptu JAM-2. V oblasti kůry ledviny bylo detekováno specifické zbarvení intertubulárních struktur monoklonálními protilátkami antiPECAM (GC51) nebo anti-JAM-2 (CRAM-XVIIIF26), zatímco ZO-1 nebo anti-JAM-1 barvily převážně epitheliální buňky tubulů (není 5 ukázáno).
Autoři vynálezu proto soustředili pozornost na cévní struktury, které se zanořují do dřeně a odpovídají radiálním cévám nebo endotheliálním strukturám rektálních cév. Pro tento účel byla provedena sériová ředění a cévní struktury byly identifikovány io barvením anti-PECAM (obr. 15d). Na ekvivalentní oblasti sousedních řezů byla detekována lineární interendotheliální zbarvení anti-JAM-2, anti-JAM-1 nebo anti-ZO-1 (obr. 15 a, b a c). Na řezech mesenterické lymfatické uzliny byla získána typická zbarvení endotheliálních žilek (HEV) protilátkou anti-JAM-2 (obr. 15e). Bylo také zjištěno, že HEV 15 exprimují JAM-1, ZO-1 nebo PECAM (obr. 15 f, g a h), s malými rozdíly v subcelulární lokalizaci zbarvení (obr. 15 e až h, výřezy). V korové oblasti mesenterických lymfatických uzlin byla pozorována typická zbarvení subkapsulárních dutin všemi protilátkami (obr. 15 i až I), což odpovídalo barvení aferentních lymfatických cév. Barvení 20 monoklonální protilátkou CRAM-18F26 anti-JAM-2 je omezeno na určité endotheliální buňky nebo na struktury, které jsou těsně asociovány s cévami.
Pro vyjasnění, zda barvení endotheliálních buněk odpovídalo za obrázky ukázané na obr. 15, byla provedena cytofluorimetrická 25 analýza exprese JAM-2 na různých buněčných liniích nebo čerstvě izolovaných endotheliálních buňkách z disociovaných tkání. Endotheliální buněčné linie (tEnd.1, eEnd.2 a TME) exprimovaly nízké hladiny JAM-2 na buněčném povrchu a proměnlivé hladiny JAM-1 (obr. 16A).
Cytometrická analýza čerstvě izolovaných endotheliálních buněk byla prováděna trojím barvením buněčných suspenzí získaných po ·· ····
disociaci orgánu směsí kolagenáza/dispáza. Endotheliální buňky byly identifikovány tak, že byly brány v úvahu signály buněk barvených jak PECAM/CD31, tak acetylovaným LDL (Voyta a další, 1984, J, Cell Biol. 99: 2034). Barvení JAM-2 nebo JAM-1 na této dvojnásobně pozitivní buněčné populaci je ukázáno na obr. 16B. V ledvině a Peyerových plátech byly všechny izolované buňky pozitivní na CD31 a acetylovaný LDL rovněž barveny na JAM-2, což znamená, že alespoň v těchto orgánech exprimovaly endotheliální buňky JAM-2 in vivo. Jestliže bylo barvení prováděno na buňkách získaných z lymfatické uzliny, exprese JAM-2 byla nalezena pouze na buněčné subpopulaci, což odráží možnou heterogenitu fenotypů endotheliálních buněk v rámci této tkáně.
Souhrnně lze uvést, že výsledky cytometrické a imunohistochemické analýzy ukazují, že JAM-2 je koexprimován s JAM-1 endotheliálními buňkami ledvin, Peyerových plátů a lymfatických uzlin.
Dynamická lokalizace JAM-2 do míst kontaktu buňka-buňka
Aby byl objasněn mechanismus, kterým se JAM-2 specificky lokalizuje do míst styku buňka-buňka, bylo použito videomikroskopie v čase. Buňky CHO, stabilně transfekované fluorescenční chimérní molekulou, byly trypsinizovány a vysety do podložek s komůrkou pro zobrazování. Po rozšíření buněk nebyla povrchová exprese JAM-2EGFP stejnoměrná, ale byla spíše ve shlucích v místech styku buňkabuňka (obr. 17A, buňky znázorněny hvězdičkami). V průběhu tvorby nových kontaktů mezi buňkami byla pozorována relokalizace JAM-2EGFP do míst spojů buněk a intenzívní fluorescenční signál byl detekován v místě nového styku mezi buňkami vytvářejícími nový kontakt buňka-buňka (označeno šipkami). Chimérní protein byl obohacen ve výčnělcích membrán mezi buňkami, které byly ve styku, což vedlo k obrázkům podobným „zipu“, které byly vidět po 12 nebo 18 • · · · . ·
minutách. Je zajímavé, že lokalizace JAM-2 v místě primárních kontaktů mezi buňkami nebyla v průběhu vytváření nového membránového kontaktu (viz buněčné kontakty v horním levém rohu obrázku) ztracena. Toto zjištění ukázalo, že JAM-2-EGFP byl specificky relokalizován do nlového místa styku mezi buňkami, a po navázání již byla jeho lokalizace stabilní.
Pro získání dalších poznatků týkajících se požadavků na lokalizaci JAM-2 byla prováděna videomikroskopie v čase po poranění monovrstvy buněk (obr. 17B). Buňky na poraněném konci uchovávaly JAM-2 na svých intaktních místech styku (špičky šipek), ale docházelo k úbytku lokalizace JAM-2 v poraněném místě (šipky), což ukazuje, že navázání JAM-2 s ligandem na protilehlé buňce bylo nezbytné pro udržení jeho lokalizace na membráně. Po dobu 90 min po poranění začaly buňky hraničící s poraněním migrovat do poraněné oblasti. Je zajímavé, že tyto buňky si zachovávají kontakty se sousedními buňkami přes výčnělky membrány, které byly jasně fluorescenční, tj. pozitivní na JAM-2 (špička šipky). Tyto výsledky podpořily hypotézu, že homofilní interakce JAM-2 mohou hrát úlohu při vytváření nebo udržování kontaktů mezi buňkami.
JAM-2 zvyšuje těsnost monovrstvy a účastní se těsných spojovacích komplexů
Protože bylo ukázáno, že celá řada molekul účastnících se spojení mezi buňkami řídí paracelulární permeabilitu buněčných monovrstev, bylo testováno, zda by mohl JAM-2 také ovlivňovat tuto funkci. Transfekce JAM-2-EGFP snížila paracelulární permeabilitu pro FITC dextran a zvýšila těsnost monovrstev buněk CHO o 42,5 %, zatímco transfekce nepříbuzné molekuly Tac (IL2R a) neovlivňovala významně tuto paracelulární permeabilitu buněk transfekovaných CHO (obr. 18). Transfekce JAM-2-EGFP také snížila paracelulární permeabilitu monovrstev buněk transfekovaných CHO.
• · · · · ·
Tyto výsledky vyvolaly otázku, zda byly chimérní molekuly schopny účastnit se na subcelulárním specializovaném kompartmentu, jako jsou těsná spojení v polarizovaných epiteliálních buňkách.
Pro získání odpovědi na tuto otázku byly chimérní proteiny EGFP transfekovány do buněk MDCK a jejich subcelulární lokalizace byla porovnávána s lokalizací markéru těsného spojení - okludinu. Jak je ukázáno na obr. 19A, kde sériové obrázky každých 0,9 pm byly analyzovány na fluorescenci EGFP a porovnávány s barvením na okludin, JAM-2-EGFP byl specificky obohacen v místech styku buňkabuňka na úrovni těsného spojení. Na bazální úrovni (vlevo) byly pozorovány intracelulární tečky fluorescence EGFP. Podobná analýza (obr. 19B) buněk MDCK transfekovaných JAM-2-EGFP ukázala podobnou společnou lokalizaci s okludinem. Nicméně distribuce fluorescence JAM-2-EGFP byla méně souvislá, než fluorescence pozorovaná pro JAM-2-EGFP na úrovni těsných spojení.
Diskuse
Tento příklad ukazuje použití nové strategie screeningu pro identifikaci regulovaných transkriptů kódujících členy širší skupiny Ig adhezních molekul. Je popsáno klonování touto metodou nové molekuly CRAM-1 jako regulovaného transkriptů. Regulace pozorovaná v endotheliálních buňkách pěstovaných v přítomnosti tumorů je potvrzena semikvantitativní RT-PCR a ukazuje se, že je závislá na fázi růstu buněk. V důsledku odlišné exprese za podmínek změny konfluence buněk byl přijat název CRAM-1 adhezní molekula 1 regulovaná konfluencí („Confluency Regulated Adhesion Molecule1“).
Je zde také popsána úzce příbuzná sekvence se sekvencí CRAM-1, nazvaná CRAM-2. Sekvence CRAM-1 a CRAM-2 reprezentují prototypy nové podskupiny adhezních molekul, které také zahrnují nedávno popsanou molekulu JAM (Chretien a další, 1998, ·· »»»·
Eur. J. Immunol. 28, 4094 - 4104; Malergue a další, 1998, Mol. Immunol. 35, 1111 - 1119).
CRAM-1 a JAM preferenčně exprimovány endotheliální a epitheliální tkání v místě styků mezi buňkami a polarizovaným vrstvám propůjčují zvláštní vlastnosti. Účinek rekombinantních rozpustných molekul při testu transendotheliální migrace a při regulaci JAM, CRAM-1 a CRAM-2 ukazuje, že tyto tři molekuly mají důležitou úlohu při udržování fyziologie cév.
Nová strategie screeningu nazvaná Targeted Differential Display (TDD) se ukázala jako účinná při selektivní amplifikaci sledované cDNA. TDD úspěšně využívala částečně degenerovaných primerů pro dosažení selektivního směrování na konzervovanou oblast, Y(Y/Q/R)CXAS, domén Ig podobných C2. Opakované experimenty vedly k reprodukovatelným výsledkům. Z šestnácti odlišně exprimovaných transkriptů odpovídají tři genům s významnou homologií s konzervovanými sekvencemi Ig. Toto zvýšení specificity umožní předejít hlavním obtížím při již známých technikách klasického otisku RNA (RNA finger printing) a diferenciálního zpřístupnění. Metoda otisku RNA byla dlouho používána pro identifikaci odlišně exprimovaných genů. V důsledku použitých primerů specifických pro sekvenci detekuje tato metoda pouze transkripty zvolených a již známých proteinů. Na druhé straně zpřístupnění RNA používá náhodných primerů a zahrnuje nespecifickou amplifikaci transkriptů.
V tomto případě je cílem vyzdvihnout jakékoli rozdíly v hladinách mRNA mezi dvěma biologickými systémy, které se porovnávají. TDD je pokročilá metoda screeningu, která kombinuje specificitu otisku RNA s degenerací diferenciálního zpřístupnění RNA poskytující selektivitu.
V důsledku směrování na příbuzné transkripty tato technika významně snižuje dobu potřebnou pro screening. Tak se stává možná identifikace nových členů specifických skupin proteinů. To je podstatné zlepšení uváděných strategií nespecifického screeningu.
Tyto společné vlastnosti byly použity pro konstrukci rekombinantních proteinů s cílem studovat funkce JAM, CRAM-1 a
CRAM-2. V tomto příkladu se popisují účinky sJAM-lg2Do a sCRAM-1lg2Do při testu transmigrace in vitro. Je možno pozorovat specifické blokování migrace myeloidních buněk s vlivem sCRAM-1-lg2Do, zatímco sJAM-lg2Do měla na lymfocyty pouze malý vliv.
Transkripty JAM a CRAM-2 ukázaly podobnou distribuci v tkáni a regulaci exprese vlivem TNF, což ukazuje, že působí podobnými fyziologickými mechanismy. Naopak transkripty CRAM-1 nejsou regulovány TNF, ale spíše rychlostí proliferace nebo hustotou endotheliálních buněk. Ve skutečnosti nadměrná exprese transkriptů CRAM-2 v cyklujících buňkách a jeho regulace ve smyslu snížení exprese v klidových buňkách ukazují, že tato molekula se účastní vytváření spojité monovrstvy. Její funkce v konfluentních monovrstvách buněk je udržování endotheliální buněčné vrstvy a příbuzných vlastností. Protože do místa imunitní odpovědi musí migrovat odlišné populace leukocytů, předpokládá se, že nelymfoidní buňky migrují CRAM-1-dependentním mechanismem, zatímco lymfoidní buňky migrují prostřednictvím JAM nebo CRAM-2. V tomto případě může být imunitní odpověď modulována použitím kombinací různých rozpustných rekombinantních molekul.
Claims (19)
1. Polypeptid v izolované formě náležející do podskupiny širší
5 skupiny lidských imunoglobulinů, kde tento polypeptid má po celé délce sekvence alespoň 70% homologii s aminokyselinovou sekvencí myších adhezních molekul regulovaných konfluencí 1 nebo 2, neboli CRAM-1 nebo CRAM-2, jak je ukázáno na obr. 3 v horní, popřípadě dolní řádce.
2. Polypeptid podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň 70%, s výhodou alespoň 80%, výhodněji alespoň 90%, nejvýhodněji v podstatě 100% homologní s aminokyselinovou sekvencí lidského CRAM-1, jak
15 je ukázáno na obr. 6.
3. Protilátky zaměřené proti polypeptidu podle některého z nároků 1 a 2.
20
4. Protilátky podle nároku 3, pro použití jako molekula, jejímž cílem jsou buňky nesoucí polypeptidy podle některého z nároků 1 a 2.
5. Protilátky podle nároku 3 nebo 4, pro použití při inhibici
25 angiogeneze u tumorů.
6. Protilátky podle nároku 3 nebo 4, pro použití při léčení zánětlivých reakcí.
7. Protilátky podle nároku 3 nebo 4, pro použití při modulaci, zvláště zvyšování cévní permeability.
8. Protilátky podle nároku 7, kde zvýšení cévní permeability je prováděno v tumorech pro dodávání léčiv.
9. Protilátky podle některého z nároků 3 až 8, navázané na jinou molekulu zvolenou ze skupiny toxiny, radioaktivní značky, fluorescenční značky, enzymatické značky, fotoaktivovatelné značky, liposomy, léčiva a buňky.
10. Rozpustný polypeptid, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako polypeptid podle některého z nároků 1 a 2, pro použití při léčení zánětlivých reakcí.
11. Peptid, který má alespoň část aminokyselinové sekvence polypeptidu podle některého z nároků 1 a 2, pro použití při léčení zánětlivých reakcí.
12. Peptid podle nároku 11, kde alespoň část aminokyselinové sekvence obsahuje extracelulární domény VC2, a/nebo membránovou proximální cytoplasmatickou sekvenci
A-[Y,Q]-[R,S]-[R,K]-G-[C,Y]-F.
13. (Poly)peptidy podle některého z nároků 1, 2, 11 a 12 v rozpustné formě, pro použití při modulaci cévní permeability.
• · • · · ·
14. Póly- nebo oligonukleotidy, které mají nukleotidovou sekvenci kódující úplný polypeptid nebo jeho část, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň 70 % homologní 5 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v obr. 3, horní a dolní řádek.
15. Póly- nebo oligonukleotid podle nároku 14, který má nukleotidovou sekvenci kódující úplný polypeptid nebo jeho io část, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň 70%, s výhodou alespoň 80%, výhodněji alespoň 90%, nejvýhodněji v podstatě 100% homologní s aminokyselinovou sekvencí lidského CRAM-1, znázorněnou na obr. 6.
16. Póly- nebo oligonukleotid podle nároku 15, který má nukleotidovou sekvenci v podstatě identickou s nukleotidovou sekvencí lidského CRAM-1, znázorněnou na obr. 6.
2o
17. Póly- nebo oligonukleotid podle některého z nároků 14 až 16, kde tímto póly- nebo oligonukleotidem je RNA nebo DNA.
18. Póly- nebo oligonukleotid podle některého z nároků 14 až 17 kde tímto póly- nebo oligonukleotidem je primer, sonda protismyslná RNA atd.
- 40**··
19. Způsob specifické identifikace odlišně exprimovaných sekvencí DNA, vyznačující se tím, že se použije PCR s reverzní transkripcí s diferenciálním zpřístupněním, přičemž se použije sada částečně nebo úplně degenerovaných primerů 5 specifických pro cílový gen.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99200746 | 1999-03-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20013267A3 true CZ20013267A3 (cs) | 2002-02-13 |
| CZ303128B6 CZ303128B6 (cs) | 2012-04-18 |
Family
ID=8239973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20013267A CZ303128B6 (cs) | 1999-03-11 | 2000-03-13 | Adhezní molekula 1 regulovaná konfluencí CRAM-1, její kódující nukleová kyselina, protilátky a použití |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7393651B2 (cs) |
| EP (2) | EP2292761A1 (cs) |
| JP (2) | JP4836329B2 (cs) |
| CN (2) | CN100469878C (cs) |
| AT (1) | ATE500328T1 (cs) |
| AU (1) | AU782139B2 (cs) |
| BR (1) | BR0008915A (cs) |
| CA (1) | CA2362896C (cs) |
| CZ (1) | CZ303128B6 (cs) |
| DE (1) | DE60045681D1 (cs) |
| EE (1) | EE05497B1 (cs) |
| ES (1) | ES2361905T3 (cs) |
| HK (1) | HK1044169A1 (cs) |
| HU (1) | HU229376B1 (cs) |
| IL (1) | IL145310A0 (cs) |
| IS (1) | IS2819B (cs) |
| MX (1) | MXPA01009110A (cs) |
| NO (1) | NO333085B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ514091A (cs) |
| PL (1) | PL207994B1 (cs) |
| RU (1) | RU2244748C2 (cs) |
| WO (1) | WO2000053749A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200107283B (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8088386B2 (en) | 1998-03-20 | 2012-01-03 | Genentech, Inc. | Treatment of complement-associated disorders |
| US8007798B2 (en) | 1997-11-21 | 2011-08-30 | Genentech, Inc. | Treatment of complement-associated disorders |
| NZ514091A (en) * | 1999-03-11 | 2004-01-30 | Rmf Dictagene S | Vascular adhesion molecules and modulation of their function |
| GB0100750D0 (en) * | 2001-01-11 | 2001-02-21 | Inpharmatica Ltd | Novel proteins |
| WO2003006673A2 (en) * | 2001-07-11 | 2003-01-23 | Texas Biotechnology Corporation | A nucleic acid encoding a human junctional adhesion protein (jam3) |
| EP1533617A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-05-25 | RMF Dictagene S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment and diagnosis of cancer |
| US7642341B2 (en) | 2003-12-18 | 2010-01-05 | Merck Serono S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer |
| CA2624393C (en) | 2005-11-04 | 2016-01-05 | Genentech, Inc. | Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases |
| RU2464030C2 (ru) * | 2006-05-26 | 2012-10-20 | Регадо Байосайенсиз, Инк. | Введение противосвертывающей системы reg1 |
| US8007797B2 (en) | 2006-09-28 | 2011-08-30 | Merck Serono S.A. | Junctional adhesion molecule-C (JAM-C) binding compounds and methods of their use |
| PL2907827T3 (pl) | 2006-11-02 | 2019-03-29 | Genentech, Inc. | Humanizowane przeciwciała przeciw czynnikowi D i ich zastosowanie |
| FR2909092B1 (fr) * | 2006-11-24 | 2012-10-19 | Pf Medicament | Nouveaux anticorps anti-proliferation |
| AR066660A1 (es) | 2007-05-23 | 2009-09-02 | Genentech Inc | Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento |
| PT2190991T (pt) * | 2007-08-06 | 2019-12-16 | Noxxon Pharma Ag | Ácidos nucleicos que se ligam a sdf 1 e a sua utilização |
| CR20170001A (es) | 2008-04-28 | 2017-08-10 | Genentech Inc | Anticuerpos anti factor d humanizados |
| US10093978B2 (en) | 2013-08-12 | 2018-10-09 | Genentech, Inc. | Compositions for detecting complement factor H (CFH) and complement factor I (CFI) polymorphisms |
| CR20160561A (es) | 2014-05-01 | 2017-05-03 | Genentech Inc | Variantes del anticuerpo anti-factor d y sus usos |
| US10654932B2 (en) | 2015-10-30 | 2020-05-19 | Genentech, Inc. | Anti-factor D antibody variant conjugates and uses thereof |
| US10407510B2 (en) | 2015-10-30 | 2019-09-10 | Genentech, Inc. | Anti-factor D antibodies and conjugates |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000053753A2 (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Genentech, Inc. | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization |
| US20030170864A1 (en) * | 2000-05-30 | 2003-09-11 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| SE9604470D0 (sv) * | 1996-12-04 | 1996-12-04 | Tamas Bartfai Konsulting Ab | Transmembrane component of tight junction |
| EP0973892A2 (en) * | 1997-03-14 | 2000-01-26 | Human Genome Sciences, Inc. | 28 human secreted proteins |
| AU6578398A (en) * | 1997-03-21 | 1998-10-20 | Genetics Institute Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
| ATE361933T1 (de) | 1997-08-01 | 2007-06-15 | Serono Genetics Inst Sa | 5' ests für sekretierte proteine aus gehirngeweben |
| US20030049676A1 (en) * | 1997-09-17 | 2003-03-13 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| EP1002864A1 (en) * | 1998-11-10 | 2000-05-24 | Universita' degli studi di Bologna | HIgR and related V domain for the manufacture of a medicament for preventing or treating HSV-1, HSV-2 and BHV infections |
| IL142794A0 (en) * | 1998-12-16 | 2002-03-10 | Genentech Inc | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| NZ514091A (en) * | 1999-03-11 | 2004-01-30 | Rmf Dictagene S | Vascular adhesion molecules and modulation of their function |
| EP1533617A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-05-25 | RMF Dictagene S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment and diagnosis of cancer |
| US7642341B2 (en) * | 2003-12-18 | 2010-01-05 | Merck Serono S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer |
-
2000
- 2000-03-13 NZ NZ514091A patent/NZ514091A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 DE DE60045681T patent/DE60045681D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 IL IL14531000A patent/IL145310A0/xx unknown
- 2000-03-13 CN CNB008063206A patent/CN100469878C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 BR BR0008915-0A patent/BR0008915A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-03-13 PL PL350417A patent/PL207994B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 CZ CZ20013267A patent/CZ303128B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 EE EEP200100472A patent/EE05497B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 CN CNA2004100952754A patent/CN1637019A/zh active Pending
- 2000-03-13 WO PCT/EP2000/002219 patent/WO2000053749A2/en active Application Filing
- 2000-03-13 ES ES00920497T patent/ES2361905T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 AT AT00920497T patent/ATE500328T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 CA CA2362896A patent/CA2362896C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 HU HU0200606A patent/HU229376B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 RU RU2001127668/13A patent/RU2244748C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-03-13 JP JP2000603370A patent/JP4836329B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 EP EP10181055A patent/EP2292761A1/en not_active Withdrawn
- 2000-03-13 AU AU41051/00A patent/AU782139B2/en not_active Expired
- 2000-03-13 EP EP00920497A patent/EP1163337B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-13 MX MXPA01009110A patent/MXPA01009110A/es active IP Right Grant
-
2001
- 2001-09-03 ZA ZA200107283A patent/ZA200107283B/xx unknown
- 2001-09-10 IS IS6072A patent/IS2819B/is unknown
- 2001-09-11 NO NO20014417A patent/NO333085B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-06-19 HK HK02104558.4A patent/HK1044169A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-30 US US11/025,834 patent/US7393651B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-06-12 US US12/137,898 patent/US7670826B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-02-10 US US12/703,439 patent/US8143056B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-06 JP JP2010106164A patent/JP2010233572A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7670826B2 (en) | Confluence regulated adhesion molecules useful in modulating vascular permeability | |
| Warmerdam et al. | Interaction of a human FcγRIIb1 (CD32) isoform with murine and human IgG subclasses | |
| US6379925B1 (en) | Angiogenic modulation by notch signal transduction | |
| US7517966B2 (en) | Triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells and antibodies that identify the same | |
| JP2004254702A (ja) | カドヘリン物質および方法 | |
| EP1240326B1 (en) | Triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells and antibodies that identify this receptor | |
| US7138243B2 (en) | NTB-A, a surface molecule involved in natural killer cells activity | |
| US20100234294A1 (en) | Identification of new isoforms of the mhc-class i specific receptor cd160 and uses thereof | |
| EP0830373A1 (en) | Cd6 ligand | |
| CN114437218B (zh) | 靶向cd276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞 | |
| AU2005202246B8 (en) | Vascular adhesion molecules and modulation of their function | |
| AU2008201101B2 (en) | Vascular adhesion molecules and modulation of their function | |
| Kuwabara et al. | Transition from TCR-beta dimer to TCR-alpha beta-expressing cells by introduction of an alpha-chain in an immature thymocyte cell line. | |
| CA2288307C (en) | Novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells and antibodies that identify the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180313 |