NO333085B1 - Opploselig CRAM-1 polypeptid antistoff rettet mot CRAM-1 og som modulerer transendotelial migrering av leukocytter, samt anvendelse derav for fremstilling av medikamenter for inhibering av angiogenese i tumorer. - Google Patents

Abstract

Et nytt polypeptid i isolert form som tilhører en delfamilie av human immunoglobulin-superfamilien beskrives, hvilket polypeptid oppviser minst 70% sekvenshomologi med aminosyresekvensen av murint konfluensregulert adhesjonsmolekyl l eller 2 (CRAM-1 eller CRAM-2) som avbildes på henholdsvis figurens øvre og andre rad, og antistoffer mot disse samt deres anvendelse ved behandling av betennelse og svulster.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører identifikasjon av en ny delfamilie av vaskulære adhesjonsmolekyler og en modulasjon av funksjonen av disse molekyler som angitt i krav 5 for fremstilling av medikamenter til behandling av angiogenese i tumorer og av inflammasjon. Oppfinnelsen vedrører også antistoffer mot slike molekyler som angitt i krav 1.

Gjennom hele den embryoniske og tidlige postnatale utvikling prolifererer og differensierer seg endotelceller for å danne nye blodkar ved vaskulogenese og angiogenese. I voksne organismer definerer endotel blod/vev-barriæren og består av ikke-sykliserende hvilende celler. Disse polariserte celler bindes til hverandre ved hjelp av sterke tilkoblinger og klebrige berøringspunkter for å danne et kontinuerlig sjikt av celler. Funksjonene av endotelsjiktet består i å vedlikeholde vevhomeostase, fibrinolyse, koagulasjon, vasotonia og leukocytt-transmigrasjon. Alle disse egenskaper reguleres ved en finjustering av ekspresjonen og funksjonen av adhesjonsmolekyler.

Patologiske tilstander såsom betennelser, svulstvekst, sår eller angionese fører til en forbigående endring av antallet og funksjonen av adhesjonsmolekyler på vaskulær endotel, og dette fører til en endret homeostase av karet. Som et eksempel øker svulster den lokale konsentrasjon av angiogene faktorer, hvilket induserer en veksel fra ikke-sykliserende hvilende endotelceller til prolifererende endotel. Den angiogene veksling induseres av flere faktorer omfattende IL-8, epidermisk vekstfaktor (EGF), vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), løselig VCAM-1, basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og tumornekrosefaktor (TNF). Som et resultat degraderer endotelceller av eksisterende kar den ekstracellulære matriks (ECM) og trenger inn i kringliggende vev, hvilket fører til en vaskularisering av svulster.

Under den angiogene veksling modifiseres mønstret av endotelgenekspresjon. F.eks. fører en behandling av endotelceller med bFGF eller TNFa til en fire ganger høyere avP3-integrinekspresjon, et adhesjonsmolekyl som er innblandet i endotelcellemigrering. I tillegg modifiserer den angiogene veksling den inflammatoriske respons av endotel, hvilket fører til en abnormal migrering av leukocytter mot svulstene. Normalt ekstravaserer leukocytter fra blodet ved å klebe til og migrere gjennom endotel. Disse mekanismer finner sted i en flertrinns prosess som omfatter selektiner, integriner og adhesjonsmolekyler fra immunoglobulin-superfamilien.

I svulstassosiert endotel har VCAM, ICAM og selektiner vist seg å være nedregulert. Nedreguleringen av disse adhesjonsmolekyler kan representere en mekanisme ved hvilken svulster unngår en invasjon av cytotoksiske celler fra immunsystemet.

Det er et formål for foreliggende oppfinnelse å søke etter nye adhesjonsproteiner fra immunoglobulin-superfamilien (Ig-Sf) som blir transkripsjonen regulert i endotel under innvirkningen av svulster. Slike molekyler er angitt i krav 5.

Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å definere molekyler avledet fra de nye adhesjonsproteiner for bruk ved fremstilling av medikamenter til behandling av forskjellige indikasjoner, såsom f.eks. svulster og betennelse.

Under forskningen som førte til foreliggende oppfinnelse, brukte man en eksperimentell murin modell for identifikasjon av transkripsjonsprodukter som ble regulert under kokultur av en endotelcellelinje med melanomaceller. For å begrense utsilingsstrategien til adhesjonsmolekyler fra Ig-Sf, utviklet man en ny fremgangsmåte for RNA-fremvisning benevnt "Targeted Differential Display" eller målrettet differensiell fremvisning. Nyheten i den modifiserte fremvisningsteknikk ligger i bruken av kun ett sett degenererte primere. Slik det skal demonstreres i eksemplene, viste det seg på overraskende måte at dette fører til en tilstrekkelig spesifisitet.

Nærmere bestemt brukte man delvis degenererte primere (i foreliggende tilfelle er degeneransnivået mellom 2048 og 4096 forskjellige former for primere i ett sett), utviklet for innsikting mot de konserverte sekvenser som finnes i C2-domene av Ig-Sf-medlemmene, for å drive den polymerasekjedereaksjon (PCR)-baserte målrettede differensielle fremvisningsteknikk (Samaridis & Colonna (1997), Eur. J. Immunol. 27, 660-665).

På grunnlag av dette funn kan det ved undersøkelse av slike forbindelser anvendes en fremgangsmåte for en spesifikk identifikasjon av differensielt uttrykte DNA-sekvenser omfattende bruk av Diferential Display Reverse Transcription-PCR, hvor det brukes ett sett av delvis eller fullstendig degenererte primere som er spesifikke for målgenet. En hovedbegrensning av konvensjonell RNA-fremvisningsstrategi er metodens mangel på spesifisitet. Med det mål å øke denne spesifisitet, ble det brukt under søk etter andre adhesjonsmolekyler, degenererte primere som var målrettet mot sekvensene som koder for molekyler med C2-domene. Dette ble oppnådd ved linjestilling av C2-domene fra flere Ig-Sf-adhesjonsmolekyler og identifikasjon av en lineær aminosyrekonsens omkring cysteinresiduet som var del av C2-domenestrukturen: Y-(RQYS)-C-x-A-S-N-x2-G. Mer generelt kan denne fremgangsmåte også brukes i søk etter andre sekvenser hvor revers translasjon av én eller flere av de mest hyppige konsenssekvenser brukes for å utvikle de degenererte primere som brukes for en differensiell fremvisning.

Metoden gjorde det mulig å identifisere et transkripsjonsprodukt som var nedregulert i endotelceller ved konfluens i nærvær av melanoma- eller karsinomaceller. cDNA kodet for et nytt molekyl fra Ig-Sf med uvanlige strukturelle trekk og ble benevnt CRAM-1 for "Confluency Regulated Adhesion Molecule" eller konfluensregulert adhesjonsmolekyl. Den nylige beskrivelse av et strukturelt beslektet molekyl, JAM, som var implisert i leukocytt-transmigrasjon, tydet på at det eksisterte en ny familie av adhesjonsmolekyler hvor JAM og CRAM-1 var prototypene. En sekvenssammenligning med EST-databaser muliggjorde videre en kloning av CRAM-2, et tredje medlem av denne molekylfamilie. Fig. 1 viser de murine cDNA-sekvenser som koder for CRAM-1- og CRAM-2-proteiner. I foreliggende beskrivelse brukes navnene JAM og JAM-1, CRAM-1 og JAM-2 samt CRAM-2 og JAM-3 synonymt.

Den komparative vevfordeling av transkripsjonsproduktene som kodet for JAM, CRAM-1 og CRAM-2, viste en foretrukken ekspresjon av disse molekyler i endotel-og epitelområder, hvilket tydet på en rolle ved vedlikehold av celle/celle-kontakten. Disse celle/celle-vekselvirkninger av hvilende endotelceller regulerer den vaskulære permeabilitet, cellecyklusen og leukocytt-transmigrasjonen over endotelveggen.

For å ytterligere belyse funksjonen og vekselvirkningen av de tre molekyler, brukte man en molekylær fremgangsmåte. Med dette formål konstruerte man chimeriske molekyler bestående av Flag-markør- og "Enhanced Green Fluorescent Protein"

(EGFP)-sekvenser kondensert til en løselig eller membranbundet form for CRAM-1, CRAM-2 eller JAM (oppsummert på fig. 2). Når de ble transfisert inn i cellelinjer, plasserte seg EGFP-fusjonsproduktene av CRAM-1 og JAM i celle/celle-kontakter, hvilket bekreftet at disse molekyler spiller en rolle i celle/celle-kommunikasjonen. Derimot var CRAM-2 mer bredt fordelt på celleflaten. Videre blokkerte det løselige konstrukt av CRAM-1 den transendotele migrering av leukocytter in vitro, mens løselig JAM kun oppviste en svak virkning. Tilsammen tydet disse resultater på at denne nye delfamilie av adhesjonsmolekyler spiller en sentral rolle ved vedlikehold av den vaskulære integritet og funksjonen av endotelsjiktet.

Pa grunnlag av disse funn tilveiebringer foreliggende molekyler nye muligheter å motvirke medisinske indikasjoner såsom kronisk betennelse og svulstutvikling, basert på medikamenter basert på CRAM-polypeptider.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse et antistoff rettet mot et polypeptid i isolert form som tilhører en delfamilie av human immunoglobulin-superfamilie, hvilket polypeptid oppviser minst 80% sekvensidentitet med aminosyresekvensen av murint konfluensregulert adhesjonsmolekyl 1 (CRAM-1) som avbildet på fig. 3, øvre rad. Fig. 4 og 5 viser linjestillingen på aminosyrenivå av henholdsvis muse-JAM-2 (CRAM-1) og JAM-3 (CRAM-2).

CRAM-polypeptidene som finnes i menneskers eller dyrs kropper, er markører for voksende celler. CRAM-ekspresjonen oppreguleres i celler som vokser.

Beskrevet heri er to nye murine polypeptider som er medlemmer av denne nye familie. På grunnlag av sekvensinformasjonen om disse polypeptider kan andre medlemmer av familien identifiseres på velkjent måte såsom PCR, krysshybridise-ring på DNA-samlinger, kryssreaktivitet av antistoffer.

Sekvensinformasjonen kan være enten aminosyresekvensen eller nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen.

Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen dermed et tilsvarende polypeptid i mennesker, omfattende de sekvenser som er angitt i krav 5, nemlig V-domenet av CRAM-1 som tilsvarer aminosyrer 53-115 av SEQ ID NO:19 samt V- og C2-domenet av CRAM-1 som tilsvarer henholdsvis aminosyrer 53-115 samt aminosyrer 144-230 av SEQ ID NO:19 og aminosyrer 1-159 av SEQ ID NO: 19 og aminosyrer 1-238 av SEQ ID NO: 19.

I tillegg til å bruke sekvensinformasjonen av de to CRAM-proteiner som beskrives heri, for å identifisere andre medlemmer av familien i andre arter, såsom mennesker, kan de to proteiner og deres tilsvarende familiemedlemmer også brukes for fremstilling av avledede molekyler, såsom antistoffer rettet mot (poly)-peptidene ifølge oppfinnelsen, eller rekombinante ekvivalenter av proteinene, i løselig form, eller peptider som omfatter i det minste en del av aminosyresekvensen av polypeptidene.

For fremstilling av polypeptider ifølge oppfinnelsen kan det brukes poly- eller oligonukleotider som har en sekvens som koder for et fullstendig polypeptid eller en del derav, hvilket polypeptid har en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med aminosyresekvensen av CRAM-l-proteinene som beskrives heri. Nærmere bestemt slike nukleotidsekvenser som er minst 80%, mer foretrukket minst 90%, mest foretrukket i det vesentlige 100% identiske med den humane DNA-CRAM-1-sekvens som avbildes i SEQ ID NO:23.

Slike poly- eller oligonukleotider kan f.eks. være RNA eller DNA og kan være primere, prober, antisense-RNA osv.

Alle slike molekyler kan brukes for å modulere funksjonen av de opprinnelige polypeptider som finnes i menneske- eller dyrekroppen, eller for diagnose.

Angiogenese i f.eks. svulster kan inhiberes med antistoffer. De kan brukes som målrettingsmolekyler for celler som bærer CRAM-polypeptidene. Antistoffene kan virke alene, eller de kan kobles til andre molekyler, såsom toksiner, radioaktive markører, fluorescerende markører, enzymatiske markører, fotoaktiverbare markører, men også til liposomer, celler osv.

De merkede antistoffer er spesielt godt egnet for diagnostisk bruk av antistoffene, dvs. at de kan brukes til å lokalisere angiogenese i en voksende svulst. I tillegg kan antistoffer koblet til toksiner eller radioaktive molekyler brukes for å spesifikt drepe svulsten innenfra ved å sikte mot (de voksende) kar i svulsten.

Man fant at molekyler av type CRAM ikke kunne påvises i den normale vaskulatur, unntatt lymfatika og de høyt endotele venuler i lymfeorganer, såsom lymfeknuter og Peyer's flekker. Fordelen dermed er at målrettingen av f.eks. anti-CRAM-antistoffer kan være høyt spesifikke for f.eks. svulstceller, hvorved uønskede bivirkninger unngås.

Videre kan (poly)peptidene også binde molekylet på angiogene kar, og dermed stimulere eller inhibere angiogenese.

Løselig (poly)peptid som i det vesentlige har samme aminosyresekvens som CRAM-polypeptidene, kan brukes ved behandling av betennelsesreaksjoner av vaskulær endotel. Man fant at den transendotele migrering av leukocytter kan inhiberes med sCRAM-l-IG2Do eller monoklonale antistoffer mot CRAM-1. Dette kan derfor brukes til å stanse eller stimulere en immunologisk reaksjon, såsom hva som forekommer ved betennelse. Slike antistoffer ifølge oppfinnelser er angitt i krav 1.

Den spesifikke ekspresjon av molekylet på vaskulære celler av HEVer in vivo som er spesialisert på lymfocyttmigrering, viser til at CRAM har en stimulerende virkning på lymfocyttmigrering eller den vaskulære permeabilitet. Denne virkning kan skyldes modulasjonen av molekyler som normalt er innbefattet i forseglingen av det vaskulære leie (CRAM-1, CRAM-2, JAM, PECAM, VE-Cadherin). Dette funn danner grunnlaget for andre anvendelser som omfatter en regulering av interendotele berøringer ved å levere rekombinante CRAM-(poly)peptid-molekyler, eller monoklonale antistoffer mot CRAM-1.

Anti-CRAM-antistoffer kan også brukes for å blokkere celle/celle-vekselvirkningene i voksende celler. Dette fører til en disorganisasjon av de intercellulære kontakter som normalt er nødvendige for barriærefunksjonen av blodkar. Dette funn kan brukes til å øke permeabiliteten av voksende kar for å øke leveringen av legemidler til steder, såsom voksende svulster, postmenstrual uterus osv. Disorganisasjonen av intercellulære kontakter kan derfor brukes til å blokkere utviklingen av svulstceller som bærer antigenet, såsom angiomaer (svulster som stammer fra vaskulær endotel) eller visse raskt voksende karsinomaer.

For diagnose kan man bruke merkede antistoffer, men også merkede oligonukleotider som er komplementære med CRAM-DNA eller -mRNA som finnes i endotelceller som uttrykker CRAM-protein(er).

Foreliggende oppfinnelse skal illustreres nærmere i det følgende eksempel under henvisning til de vedlagte tegninger, hvor: Fig. 1 viser den murine cDNA-sekvens som koder for CRAM-1- og CRAM-2-protein. muCRAM-1 ble delklonet i pcDNA3-vektor og sekvensiert ved bruk av Sp6- og 17-primere. muCRAM-2 ble erholdt som IMAGE-klon fra EST-samlingen (Ac: AA690843 og W80145), og ble sekvensert i pT7T3-DPac-vektor ved bruk av T7- og T3-primer. Fig. 2 viser en skjematisk representasjon av de molekylære verktøy som brukes i eksemplet. Strukturen og viktige residuer i den nye familie avbildes i den øvre rute. Stjernene representerer de tenkte fosforylasjonsstillinger i det cytoplasmatiske parti av de tre molekyler. Det andre anerkjente Cys-residuum i C2-domene mangler i JAM-sekvensen. Forskjellige chimeriske molekyler representeres nedenfor med posisjonen og de kringliggende residuer av fusjonssetene. En del av molekylene som stammer fra JAM-, CRAM-1- eller CRAM-2-sekvensen, vises på hvit bakgrunn. Fig. 3 viser linjestillingen av CRAM-1- og CRAM-l-aminosyresekvensen. Hulrom vises stiplet.

Fig. 4 viser en linjestilling av murint og humant CRAM-1 (JAM-2).

Fig. 5 viser en linjestilling av murint og humant CRAM-2 (JAM-3).

Fig. 6 viser nukleinsyresekvensen av humant CRAM-1 (øvre rute), den fullstendige aminosyresekvens av humant CRAM-1 (midtre rute) og en delvis aminosyresekvens av humant CRAM-2. Fig. 7 viser en målrettet differensiell fremvisning ved bruk av degenererte primere. (A): viser nukleotidsekvensen av PCR-primere som koder for sekvensene som foreligger i C2-Ig-domene. To primere koder for den samme sekvens grunnet kodonene som koder for Ser-residuet. Nivået av degenerans er 4096 forskjellige former for primerne som koder for YRCXAS, og 2048 former for de øvrige. (B): viser fremvisningen av radioaktive PCR-produkter som oppnås med YYCXAS1-primerne. Banene tilsvarer fremvisningen av PCR-produkt foretatt på cDNA erholdt fra t-ende-endotelcellelinje (bane t-end), B16-melanomacellelinje (bane B16), eller kokultur av de to cellelinjer (midtbane). Pilen viser det aktuelle PCR-produkt erholdt fra nedregulert transkripsjonsprodukt CRAM-1 under kokulturbetingelser. Fig. 8: (A) viser nukleotidsekvensen og den avledede aminosyresekvens av konfluensregulert adhesjonsmolekyl 1 (CRAM-l)-cDNA. Det tenkte hydrofobe signalpeptid (første) og transmembrant parti (andre) er understreket. Forutsagte N-glykosylasjonsstillinger (konturskrift), cysteiner som sannsynligvis vil danne disulfidbindinger (parentes) og Ser/Thr/Tyr-residuer av mulige fosforylasjonsstillinger (fet skrift) angis. (B) viser en strukturell modell for murint CRAM-l-protein. Det ekstracellulære parti viser et VH- og et C2-lignende Ig-domene med to tenkte N-bundne glykosylasjonsstillinger. Pilen peker på partiet som tilsiktes med de delvis degenererte primere (YYCXAS1) som brukes i den målrettede differensielle fremvisning. Fig. 9 viser en linjestilling av murin JAM-, CRAM-1- og CRAM-2-proteinsekvens. De identiske residuer er tegnet i sorte bokser, og de homologe residuer er gråsjattert. Den samlede identitet er 36% mellom CRAM-2 og CRAM-1; 31% mellom JAM og CRAM-1 og 33% mellom JAM og CRAM-2; homologien er henholdsvis 52%, 52% og 49%. Hulrommene vises med streker i sekvensene. De anerkjente konserverte residuer (Cys og Trp) av V- og C2-domene er merket med en stjerne. Fig. 10 viser ekspresjonen av transkripsjonsprodukter som koder for JAM, CRAM-1 og CRAM-2, påvist ved RT-PCR i forskjellige linjer (A) eller påvist ved "northern blot" i forskjellige vev (B). (A): RT-PCR oppnås på cDNA fra endotelcellelinje behandlet ved TNF (banene 2 og 11 tilsvarer TNF-behandlet t-end) eller ikke behandlet (banene 3, 4, 6, 7, 9, 12 tilsvarer henholdsvis b-end.5, e-end.2, t-end V<++>L", t-end V<lav>L<++>, TME og t-end). Banene 5 og 10 tilsvarer svulstcellelinjene B16 (melanoma) og KLN205 (karsinoma). Bane 8 tilsvarer ikke-transformert tymisk epitelcellelinje MTE4-14. Bane 1 er positivkontrollen for JAM-, CRAM-1- og CRAM-2-amplifikasjoner på plasmidene som inneholder de klonede cDNA'er. (B): Autoradiograf av P<32->probehybridisering til muse-"northern blot". Probene som ble brukt for hver hybridisering, oppgis til venstre. Hybridiseringssignalene for JAM og CRAM-1 påvises ved en størrelse på 2 kb. Fig. 11 viser JAM-2- og JAM-l-plasseringen i etablerte celle/celle-kontakter. A: Immunocytokjemi ble utført på paraformaldehyd-fikserte TME-celler med anti-JAM-2-antistoffer (a) eller anti-JAM-1-antistoffer (b). Piler angir de spesifikke plasseringer av proteinene i celle/celle-kontakter. Bar, 10 |i.m. (B): Chimeriske JAM-2-EGFP-molekyler (a) og chimeriske JAM-l-EGFP-molekyler (c) plasserte seg spesifikt i cellekontakter mellom transfiserte celler. Anrikningen av EGFP-rekombinante proteiner ble ikke observert mellom transfiserte og ikke-transfiserte celler (pilspiss). Bar, 20 |xm. C: Immunofelning av JAM-2 etter overflatebiotinylering av TME-endotelceller. Anti-PECAM-antistoffer (bane 1) og anti-JAM-l-antistoffer (bane 2) ble brukt som henholdsvis negativ og positiv kontroll for immunofelningen med CRAM-XIXH36-antistoff (bane 3). Molekylvekten angis til høyre. D: Immunofelning av EGFP-rekombinante proteiner fra CHO-transfiserte celler. Anti-JAM-2 (banene 2, 3, 6), anti-JAM-1 (banene 1, 4, 5) ble brukt for å immunofelle de biotinylerte lysaterfra utransfiserte (banene 1 og 2), JAM-l-EGFP-transfiserte (banene 3 og 4) eller JAM-2-EGFP-transfiserte (banene 5 og 6) CHO-celler. Molekylvekten oppgis til høyre. Fig. 12 viser migreringen av splenocytter over monosjiktene av TNF-aktiverte endoteliomaer i nærvær eller fravær av kjemokinet SDF-1. Tre endoteliomaer ble brukt: villtype t.end.l eller t.end.1 som var transfisert med cDNA som kodet for CRAM-1 eller CRAM-2. To monoklonale antistoffer ble testet for sin evne til å påvirke transmigreringen, F-26 eller H-26, som begge er rotte-IgGl-monoklonale antistoffer rettet mot murint CRAM-1. Fig. 13 viser CRAM-l-reguleringen som funksjon av konfluensen. Den semi-kvantitative PCR drives ved bruk av en blanding av primere som er spesifikke for HPRT- og CRAM-l-cDNA. PCR-reaksjonene utføres på 1,2% agarosegel og flekkes med etidiumbromid. Banene 1, 2 og 3 tilsvarer henholdsvis 100, 50 og 10% konfluens. Et svakere signal for CRAM-1 observeres i 100% konfluens (bane 1). Kulturbetingelsene for endotelcellelinjene (t-end.1 og TME) alene eller blandet med svulstcellelinjen KLN205 oppgis. Fig. 14 viseren "northern blot"-analyse av JAM-2-transkripsjonsprodukter (a), JAM-l-transkripsjonsprodukter (b) eller p-aktin-transkripsjonsprodukter (c) i musevev. Resultatene på embryoniske post-koitum (pc)- og voksne mRNA-pre-parater vises. Størrelsen av hybridiseringssignalene oppgis til høyre. Fig. 15 viser en immunohistologisk analyse av JAM-2-, JAM-1-, ZO-1- og PECAM-ekspresjonen. Serielle snitt av nyren (a-d) eller snitt fra mesenterisk lymfeknute (e-l) ble flekket med anti-JAM-2-antistoff (a, e, i), anti-JAM-1-antistoff (b, f, j), anti-ZO-1-antistoff (c, g, k) eller anti-PECAM-antistoff (d, h, I). Hver serie av bilder (a-d, e-h og i-l) ble oppnådd med identiske innstillinger for CCD. Fig. 16 viser JAM-2-ekspresjonen på endotelceller. A: Cytofluorimetrisk analyse av JAM-2-, JAM-1- og PECAM-ekspresjonen på endotelcellelinjer (tEnd.l, eEnd.2 og TME) eller skjellkarsinomacellelinje (KLN205). Stiplede profiler representerer negativkontrollene erholdt med et antistoff rettet mot CD4. B: Cytofluorimetrisk analyse av JAM-2 på ferskt isolerte endotelceller. De oppgitte organer ble dissosiert ved collagenase/dispase-spaltning, flekket med DilAc-LDL, CD31 og anti-JAM-2 eller anti-JAM-1, som oppgitt. Histogramprofilene ble erholdt ved å isolere endo-telcellepopulasjoner som var positive for DilAc-LDL (FL-2) og CD31 (FL-3). Negativkontroller ble erholdt ved å utelate de primære mAb'er mot JAM-1 eller JAM-2. Fig. 17: (A): JAM-2-EGFP-plasseringen under celle/celle-kontaktdannelse. Enkelte fluorescensbilder ble tatt hvert 3. minutt i 1 time under monosjiktdannelsen av CHO-celler som var transfisert med JAM-2-EGFP. Bildene som ble erholdt under de første 18 minutter, vises. Pa tidspunkt null, identifiserer stjerner de tre celler som foreligger på feltet. På tidspunktene 6, 12 og 18 minutter viser piler til omplasseringen av JAM-2-EGFP til den nylig dannede celle/celle-kontakt. (B): JAM-2-EGFP-plassering etter såring. Piler viser den sårede side, og pilspisser viser de membranbundne prosesser som er rike på JAM-2-EGFP. Tiden som har gått, oppgis på bildene. Bar, 10 nm. Fig. 18 viser at JAM-2-ekspresjonen nedsetter den paracellulære permeabilitet. (A): Den paracellulære permeabilitet ble bedømt ved FITC-dekstran-diffusjon over ikke-transfiserte CHO-celle-monosjikt, CHO-celler transfisert med Tac (huIL2Ra) eller med det oppgitte EGFP-fusjonsprotein (JAM-1 eller JAM-2). Transfeksjon av JAM-2-EGFP eller JAM-1-EGFP i CHO-celler førte til en betydelig nedsettelse av den paracellulære permeabilitet (henholdsvis 57,8% ± 4,9 og 70,8% ± 3,6; p<0,0001), mens en transfeksjon av Tac ikke påvirket den paracellulære permeabilitet vesentlig (100,4% ± 4,4; p=0,9872). Resultatene ble normalisert for ikke-transfiserte CHO-celler. Fig. 19 viser en målretting av JAM-2-EGFP (A) og JAM-1-EGFP (B) mot allerede eksisterende sterke bindinger. Konfluente MDCK-celler, stabilt transfisert med JAM-2-EGFP (A) eller JAM-1-EGFP (B) ble flekket med anti-okkludin og anti-kanin-Texas/Red. Serier av bilder hver 0,9 |xm fra basale til apikale nivåer vises for EGFP-fluorescensen (a) eller okkludin-flekkingen (b). Det basale nivå til venstre ble vilkårlig definert, slik at de serielle bilder omfatter det sterke tilkoblingsnivå i fokus ved +3,6 og +4,5 nm (fjerde og femte bilde til høyre). Fig. 20 viser virkningen av løselige rekombinante molekyler på leukocytters transendotele migrering. (A): Transmigrasjon uttrykkes som relativ indeks og normalisert til verdiene som erholdes på den ikke-behandlede t-end-cellelinje (stiplet linje Index 1). Resultatene som vises, ble erholdt i nærvær av 1 ug sJAM-Ig2do (tomme firkanter) eller i nærvær av 1 jxg sCRAM-l-Ig2do (fylte sirkler). Indeksen beregnes som gjennomsnittet for fem uavhengige

transmigrasjonseksperimenter. (B): Fenotypen av transmigrerte celler uttrykkes som celletall beregnet fra prosentdelen erholdt ved Facs-analyse etter flekking med anti-CD3-FITC og anti-B220-PE. Stjernene viser de eksperimentelle punkter med en signifikant forskjell i forhold til kontrollen.

I eksemplene kan begrepene JAM og JAM-1, CRAM-1 og JAM-2 samt CRAM-2 og JAM-3 brukes synonymt.

EKSEMPEL

MATERIALER OG METODER

Cellelinjer

De tymiske (tEnd.l) og embryoniske (eEnd.2) endotelcellelinjer (Williams eta/., 1989, CeN 57: 1053-1063) ble levert av Dr. W. Risau og Dr. B. Engelhardt (Max Planck Institute, Bad-Nauheim, Tyskland). Den SV40-transformerte lymfeknute-endotelcellelinje TME ble levert av Dr. A. Hamann (Harder eta/., 1991, Exp. Cell Res. 197: 259-267). Skjellcellekarsinoma KLN205-, CHO-, MDCK- og myelomacelle-linjen Sp2/0 ble erholdt fra American Type Tissue Culture Collection (ATCC). Alle cellene, unntatt CHO, ble dyrket i DMEM (Gibco BRL, Paisley, Skottland) supplementert med 10% FCS (PAA Laboratories, Linz, Østerrike), 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomycin (alle fra Gibco BRL). CHO-celler ble dyrket i Nut.Mix.F-12 (HAM)-medium supplementert som angitt ovenfor. Sammenklebende celler ble løst ved å vaske med PBS/0,15 mM EDTA, fulgt av 5 minutters inkubasjon i trypsin/EDTA ved 37°C.

Fremvisning, kloning og sekvensanalvse

For kokultureksperimenter ble 5xl0<5>t.End.l-celler dyrket sammen med 2,5xl0<4>B16-F10-melanomaceller i 64 timer i 10 cm vevkulturskåler. Som kontroll ble 5xl0<5>t.End.l-celler og 2,5xl0<5>B16-F10-celler dyrket adskilt under de samme betingelser, hvilket førte til sammenløpende monosjikt etter 64 timer. Det samlede RNA ble direkte ekstrahert i petriskåler med trizol-reagensmiddel idet man fulgte produsentens anvisninger (Gibco BRL, Paisley, Skottland). cDNA ble fremstilt fra 5 ug samlet RNA idet man brukte oligo-dT (16-mer)-primer og Superscript revers transkriptase (Gibco BRL, Paisley, Skottland). Kvaliteten og kvantiteten av cDNA ble kontrollert ved å utføre 27 PCR-sykluser på 1 |xl cDNA fortynnet 1:5, ved bruk av primere som var spesifikke for husholdnings-HPRT-cDNA. Deretter ble den differensielle PCR utført med de følgende degenererte primere: 5'-TAYAGNTGYNN-NGCYTCYAA-3', 51 -T A YC RGTGYNNNG C YTC YA A - 3' og 51 -TAYTAYTGYN N NGCYTCYAA-3', som kodet for de hyppigste aminosyresekvenser som finnes i C2-domene: YRCXAS, YQCXAS og YYCXAS. PCR-betingelsene som ble brukt, var: 2 ni fortynnet cDNA; 2,5 }xl 10X Goldstar PCR-buffer; 2 ni MgCI2; 2 ni degenererte primere 0,3 mM; 0,5n' dNTP 0,1 mM; 0,1n'aP<33->dATP 10 mCi/ml (Amersham Pharmacia Biotech, Dubendorf, Sveits); 15,65 n' H20; 0,25 ni Goldstar Taq-polymerase (Eurogentech, Seraing, Belgia).

Parametrene for PCR var som følger: 45 sek ved 94°C, 90 sek ved 50°C og 45 sek vd 72°C, gjentatt 40 ganger. Formamid/EDTA-ladebuffer ble tilsatt, og prøvene ble denaturert i 2 minutter ved 94°C. PCR-produktene ble deretter adskilt på 6% polyakrylamidgel og autoradiografbehandlet ved bruk av Kodak OM-Mat. Båndintensitetene ble sammenlignet.

Differensielt uttrykte bånd ble skåret fra den tørkede polyakrylamidgel, og fragmenter ble isolert ved koking og etanolfelning som beskrevet tidligere (Liang og Pardee, 1992, Science 257: 967-970). PCR-produktene ble deretter gjenamplifisert ved bruk av økte konsentrasjoner av dNTP (0,2 mM istedenfor 2nM) uten P<33->ATP. Produktene fra gjenamplifikasjonen ble klonet inn i pGem-T-Easy-vektor (Promega Corp, Wallisellen, Sveits) som beskrevet tidligere (Sambrook, Fritsch og Maniatis; Molecular Cloning, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).

Nukleinsyresekvensene av to uavhengige kloner ble bestemt ved bruk av Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Dubendorf, Sveits) og LI-COR DNA-analysesystem (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Tyskland).

Identifikasjon av JAM- 3

Sekvensanalyse og sammenligning ble utføt ved anvendelsene som er tilgjengelige på ExPASy Molecular Biology Server, dvs. Blast, Prosite, Swiss-Prot. Tre forskjellige EST'er som var homologe med CRAM-1, ble identifisert (tilgangsnr. AA726206, AA052463 og AA175925). Ingen av dem kodet for et hellengdes transkripsjonsprodukt og omfattet den initierende ATG-sekvens. Derfor ble 5'-kodende sekvens erholdt ved bruk av 5'-RACE-PCR-system for Rapid Amplification of cDNA Ends, versjon 2,0, i henhold til produsentens anvisninger (Gibco BRL, Paisley, Skottland).

De tre primere som ble brukt, ble utviklet på grunnlag av EST-sekvensen som følger: 5'-GAGGTACTTGCATGTGCT-3' for syntese av den første kjede, 5'-CGACAGGTGTCAGATAACA-3' og 5'-CACCCTCCTCACTCGT-3' for de to nestede PCR'er. 5'-RACE-PCR-produktet ble klonet inn i pGem-T-vektor. For å erholde hellengdes kodende sekvens for CRAM-1, ble det klonede 5'-RACE-PCR-produkt og EST (tilgangsnr. AA726206) spaltet med Hpal- og Notl-restriksjonsenzymer og ligert inn i pGem-t-vektor. Kloning av hellengdes CRAM-2 baserte seg på den samme strategi med sekvenssammenligning og 5'-RACE-teknikk. Hellengdes cDNA som kodet for CRAM-2, ble endelig erholdt fra EST's tilgangsnumre: AA690843 og W80145. Disse to kloner skiller seg i lengden av 3'-utranslatert region.

Northern blot

Det samlede mRNA fra celler eller vev ble ekstrahert ved bruk av Trizol (Life Technologies AG, Basel, Sveits) i henhold til produsentens anvisninger. Poly-A<+->mRNA ble ekstrahert fra 250 |xg samlet RNA med Olitex mRNA Purification Kit (Qiagen, Zurich, Sveits). Embryonisk Poly-A-"northern blot" ble ervervet fra CLONTECH (P.H. Stehelin and Cie AG, Basel, Sveits). Riboprobene ble fremstilt fra pcDNA3-vektor (Invitrogen, Leek, Nederland) og omfattet sekvensene som koder for immunoglobulindomenene av JAM-1 og JAM-2, eller hellengdes kodende sekvens for p-aktin. Hybridiseringen ble utført ved 62°C i buffer som inneholdt 50% formamid. Blottene ble deretter vasket to ganger (0,5xSSC, 0,1% SDS, 67°C) og autoradiografbehandlet på Kodak X-Omat ved -80°C.

Konfluenseksperiment

Virkningen av endotelcellekonfluens på JAM-2-mRNA-nivået ble undersøkt. 2xl0<5>TME-endotelceller ble dyrket i kulturskåler med 6, 10 og 15 cm diameter, for å oppnå forskjellige grader av konfluens etter 64 timer som varierte fra 10 til 100%. Antallet celler etter 64 timer, bestemt ved trypan blue-eksklusjon og telling, var likt i alle tilfellene, og var ikke avhengig av petriskålens overflateareale.

En semikvantitativ PCR-reaksjon eller "northern blotting" ble brukt for å bestemme den relative mengde transkripsjonsprodukt under de forskjellige forholdene. For påvisning av JAM-2-transkripsjonsproduktet ble primerparret 5'-GACTCACAGACAAGTGAC-3<1>og 5'-CACCCTCCTCACTCGT-3' brukt, hvilket gav et 750 bp langt amplifikasjonsprodukt. Som intern kontroll ble de følgende primere som var spesifikke for Hprt-cDNA, brukt for å amplifisere et 350 bp langt fragment: 5'-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3' og 5'-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3'.

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer

Sekvensen som kodet for EGFP, ble delklonet fra pEGFP-l-vektor (CLONTECH, P.H. Stehelin and Cie AG, Basel, Sveits) inn i pcDNA3 ved bruk av Hindlll- og Notl-seter, og derfor benevnt pcDNA3/EGFP. 3'-restriksjonssetene Hpal og Seal som finnes i sekvensen som koder for den cytoplasmatiske domene av henholdsvis JAM-2 og JAM-1, ble brukt for å kombinere de to sekvensene i N-terminus av EGFP

i pcDNA3-vektor (Invitrogen, Leek, Nederland). Innføyelsene som kodet for JAM-2 eller JAM-1, ble fjernet fra pGemt eller pRc/CMV ved bruk av henholdsvis SacII/Hpal- eller Hindlll/Scal-spaltning.

De kodende sekvenser ble deretter klonet inn i pcDNA3/EGFP-vektor spaltet med Agel, buttgjort ved innfylling og videre spaltet med Hindlll- eller SacII-enzymer. Dette førte til fusjonsseter ved aminosyreposisjon DGV29ifor JAM-2 og QPS28sfor JAM-1. Transfeksjonen av CHO-celler ble utført som beskrevet tidligere (Ballestrem et al., 1998. J. Cell Sei. 111: 1649-1658).

Stabile transfektanter til bruk for permeabilitetsassayer, ble valgt ved å dyrke transfiserte CHO-celer i 2 uker i medium som inneholdt 1 mg/ml G418. Resistente kolonier ble isolert og sjekket for sin EGFP-fluorescensintensitet ved strømningscytometri (FACScalibur-apparat, Becton-Dickinson, Mountain View, CA) og fluorescenslokalisering ved mikroskopi (Axiovert, Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Tidsforkortet videomikroskopi ble utført ved bruk av et Axiovert-fluorescensmikroskop og Openlab-programvare for bildeinnhenting.

Pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Holland) ble modifisert ved å integrere Flag-markør-kodende sekvenser (G. Wiedle, Dep. of Pathology, CMU, Geneve). Flag-markør-konstrukter inneholdende de kodende sekvenser for de løselige former for JAM-, CRAM-1- og CRAM-2-proteiner ble fremstilt ved PCR. I alle tilfellene ble fremad-primerne utviklet til å passe inn i ATG-initieringsregion. Revers-primerne ble utviklet i sekvensene som kodet for hengselparti for den éne løselige form for lg eller i sekvensen som kodet for regionen mellom C2- og transmembrandomenene for to løselige Ig-domene-molekyler. Alle reverse primere hadde 3'-forlengelser som inneholdt et Xbal-restriksjonssete for en direkte kloning i ramme av den Flag-markør-modifiserte vektor. Pfu-DNA-polymerase ble brukt i PCR for å unngå hyppige mutasjoner (Stratagene, La Jolla, CA, USA). PCR-frag- mentene ble deretter spaltet med Xbal og klonet inn i pcDNA-3-Flag-markør-vektor, spaltet med EcoRI, fylt med Klenow og fulgt av et Xbal-spaltningsprodukt.

Reaqensmidler og immunofluorescensanalyse

De følgende monoklonale antistoffer ble brukt: anti-PECAM (GC51, rotte-IgG2a; EA-3, rotte-IgGi) og anti-JAM (H202.106.7.4, rotte-Igd) (Malergue et al., 1998, Mol. Immunol. 35: 1111-1119; Piali et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 2464-2471).

Panelet av CRAM-antistoffer mot JAM-2 ble generert i laboratoriet ved bruk av standardteknikker og rekombinant løselig molekyl som immunogen (Aurrand-Lions et al., 1996, Immunitv 5: 391-405). De valgte hybridomaer ble testet ved ELISA for produksjon av antistoffer som spesifikt gjenkjente det rekombinante løselige JAM-2-molekyl. Positive kloner ble ytterligere testet på CHO-celler som var transfisert med JAM-2-cDNA (ikke vist).

Alle CRAM-antistoffene er av IgGi- eller IgG2a-isotype unntatt CRAM-25F24, som er av IgG2b-underklasse. Antistoffene ble renset på Protein G-sepharose-kolonner (Pharmacia Biotech Europe, Dubendorf, Sveits) i henhold til produsentens anvisninger. CRAM-19H36-mAb ble brukt for immunofelning, mens CRAM-18F26 var reagensmidlet som ble brukt til immunohistokjemi. Lignende resultater ble oppnådd med CRAM-4H31- og CRAM-17D33-mAb'er.

Immunofluorescensanalyse ble utført ved bruk av sekundære reagensmidler koblet til FITC eller Texas Red (Jackson Immunoresearch, Milan AG, La Roche, Sveits) for henholdsvis cytofluorimetri og immunohistokjemi.

For immunohistokjemi ble prøver fiksert i 5 minutter med avkjølt (-20°C) metanol. Prøvene ble rehydrert i PBS, gelatin 0,2% og Tween 20 0,05%, inkubert over natten med de primære antistoffer før vasking og fremvist med det egnede sekundære reagensmiddel koblet til Texas Red. For analyse av ferske endotelceller ble en dissosiasjon av ferskt utskårne vev utført ved bruk av collagenase/dispase-spaltning i henhold til etablerte rutiner (Kramer et al., 1984, J. Cell. Biol. 99: 692-698). De dissosierte celler ble flekket i 2 timer ved 37°C med Dil-acetylert LDL (Molecular Probe Europe BV, Leiden, Nederland) før flekking med anti-CRAM-19 og geite-anti-rotte-FITC-probe. Etter tre vaskinger ble cellene flekket md biotinylert anti-CD31 (Pharmingen) og streptavidin Red 670 (Life Technologies AG, Basel, Sveits).

JAM-1- eller JAM-2-ekspresjonen ble analysert på celler som var positive for de to endotelcellemarkører: acetylert LDL (FL-2) og CD31 (FL-3). Negativkontroller ble erholdt ved å utelate det primære antistoff.

Immunofelninqer

Immunofelninger ble utført som beskrevet tidligere (Aurrand-Lions eta/., 1997, Cellular Immunoloqy 176: 173-179) ved bruk av 10 mM Tris-HCI-buffer pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,5% Triton X100, 0,5% NP40, proteaseinhibitorblanding (Roche Diagnostics Ltd., Rotkreuz, Sveits) for lysis. Etter immunofelning, SDS/PAGE og overføring til en nitrocellulosemembran ble de biotinylerte proteiner fremvist ved bruk av streptavidin koblet til peroksidase (Jackson Immunoresearch) og ECL (Amersham Pharmacia Biotech, UK).

Permeabilitetsassaver

Permeabiliteten ble målt ved bruk av Transwell-kammere (6,5 mm diameter, PC-filtre, 0,4 nm porestørrelse, Costar Corp). Kort sagt ble lxlO<4>transfiserte eller ikke-transfiserte CHO-celler dyrket til konfluens på filtre som tidligere var blitt bestrøket i 30 minutter med 0,2% gelatin. Etter 5 dager ble mediet erstattet med forhåndsoppvarmet Nut/F12-medium uten FCS (500 |xl i det nedre kammer og 200 ni i det øvre kammer). FITC-dekstran (molekylvekt 38.900, Sigma Chemical Co) ble tilsatt i det øvre kammer til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml.

Etter 1 time ble kammerne fjernet, og fluorescensen ble avlest direkte i det nedre kammer ved bruk av Cytofluor II. Den midlere fluorescensintensitet av fem uavhengige kammere ble beregnet og sammenlignet ved bruk av Statview-programvare og t-test uparrede sammenligninger. For å normalisere eksperimentene ble verdien for den midlere fluorescensintensitet som ble oppnådd med villtype-CHO-celler, tatt som 100%.

Transfeksjon og rensing av løselige molekyler

En forbigående transfeksjon av 293T, Bosc23 eller en stabil transfeksjon av CHO-celler med de løselige IglDo- og Ig2Do-Flagmarkør/pcDNA-3-konstrukter ble utført ved bruk av Lipofectamin-reagensmiddel i henhold til produsentens anvisninger (Gibco BRL, Paisley, Skottland). Etter transfeksjon ble supernatentene samlet annenhver dag over et ti-dagers tidsrom. M2-perler (Kodak, New Haven, USA) kovalent bundet til anti-Flag-antistoff ble vasket to ganger med PBS som inneholdt en proteaseinhibitorblanding (Boehringer Mannheim, Tyskland). Perlene ble deretter inkubert ved 4°C i 3 timer med supernatant fra de transfiserte celler. Etter 5 vaskinger med PBS som inneholdt proteaseinhibitorer, ble en kolonne fylt md perlene, og rekombinante molekyler ble eluert med 10 mM glycinbuffer pH 3,4 i henhold til produsentens anvisninger. De eluerte fraksjoner som inneholdt de rekombinante proteiner, ble deretter konsentrert på Centricon-10 (Millipore) og dialysert mot PBS.

Den endelige proteinkonsentrasjon ble bestemt ved bruk av Micro BCA-assay (Biorad). De rensede produkter ble deretter underkastet en polyakrylamid-SDS-gelelektroforese fulgt av coomassie blue-flekking for å analysere deres renhet.

Transmiqrasionsassaver

Leukocytt-transmigreringen over endotelceller ble utført som beskrevet tidligere (Wheerasinghe eta/., 1998, J. Cell. Bioloav 142: 595-607). Kort sagt ble lxlO<5>t-end-celler dyrket i to dager i transbrønnenheter (polykarbonatfiltre, 5 nm porestørrelse, Costar) i nærvær av 1 n9Ig-løselige rekombinante molekyler: sJAM 2do eller sCRAM-1 2do. Etter 2 dager ble lxlO<6>leukocytter, som var erholdt fra lymfeknuter og Peyer's flekker, tilsatt til det øvre rom, og antallet transmigrerte celler ble overvåket hver time i løpet av eksperimentet. Etter 4 timer ble transmigrerte celler fra fem uavhengige brønner samlet og underkastet en cytofluorimetrisk analyse for B- og T-cellemarkørene B220 og CD3. Resultatene ble erholdt ved bruk av en Facscalibur-maskin og Cell-Quest-analyseprogrammet (Becton-Dickinson).

For et transmigrasjonsassay med splenocytter ble 3xl0<5>endotelceller podet i transbrønnenheter (polykarbonatfiltre, 8 nm porestørrelse, Costar), og man lot cellene danne et monosjikt i løpet av 18 timer. Mediet i det øvre rom ble fjernet, og lxlO<6>leukocytter i 100 ni, ferskt fremstilt fra milt ved Ficoll-sentrifugering, ble tilsatt til det øvre rom. SDF-1 ble tilsatt til mediet (endelig konsentrasjon: 40 nM) i det nedre rom for å etablere en kjemokingradient mellom det nedre og øvre rom. For eksperimentet med antistoffer ble rensede antistoffer 18-F26 eller 19-H36 tilsatt i en konsentrasjon på 10 ng/ m\ i det øvre rom med splenocytter. Etter 4 timer ble de transmigrerte leukocytter (i det nedre rom) samlet og telt. Resultatene ble uttrykt som % av det tilførte antall.

RESULTATER

" Tarqeted Differential Display", målrettet differensiell fremvisning

Reguleringen av gener i endotelceller avhenger av deres miljø. Foreliggende oppfinnelse var rettet mot identifikasjon av gener som gjennomgår en regulering etter berøring av endotel med svulstceller. Med dette formål ble et in wtro-assay utviklet ved bruk av kokultur av melanomasvulstceller (B16) med en endotelcellelinje (t-end). Det samlede RNA som ble ekstrahert fra blandingen, ble brukt som sjablone for å fremstille cDNA som ble underkastet en differensiell PCR-test. cDNA erholdt fra endotel- eller melanomaceller dyrket hver for seg, ble brukt som kontroller. De tre forskjellige mønstre ble sammenlignet for å identifisere transkripsjonsproduktene som ble regulert av kokulturbetingelsene. For å begrense analysen til sekvensene som koder for celleflatemolekyler av Ig-superfamilien, brukte man delvis degenererte primere som siktet inn mot sekvensen kringliggende det C-terminale cystein av C2-domene i molekyler av Ig-superfamilien. Det best reproduserbare mønster av PCR-produkter ble erholdt ved bruk av primere som kodet for sekvensen YYCxASl (fig. 7A). Denne forbedrede metode for RNA-fremvisningsteknikk ble benevnt TDD for "Targeted Differential Display" eller målrettet differensiell fremvisning.

I gjentatte TDD-eksperimenter ble 16 differensielt uttrykte gener identifisert. Etter kloning, nukleotid- og aminosyresekvensanalyse var tre av de seksten PCR-produkter mulige kandidater som kodet for ukjente medlemmer av Ig-superfamilien. Én av de tre kandidater (CRAM-1) ble valgt for ytterligere undersøkelse. Når de ble dyrket adskilt, uttrykte t-end.1-endotelceller og B16-melanomaceller høye nivåer av CRAM-l-transkripsjonsproduktet. Under kokulturbetingelser var imidlertid nivået av CRAM-l-ekspresjonen nedregulert (fig. 7B). Translasjon av et 350 bp langt fragment som tilsvarte CRAM-1, oppviste aminosyresekvensen YYCxAS, hvilket tydet på endingen av en Ig-C2-domene fulgt av en åpen leseramme (ORF) som inneholdt en hydrofob strekning med 18 aminosyrer som tilsvarte en transmembran region.

CRAM- 1. et medlem av immunoqlobulin- superfamilien

Sekvenssammenligning av PCR-produktsekvensen og nukleotiddatabaser oppviste homologe og identiske sekvenser i muse-EST-datatabaser. Forekomsten av EST'er tydet på at PCR-produktet tilsvarte en sekvens som uttrykkes in vivo. Tre ESTer viste seg å inneholde en 300 bp lang sekvens i sin 5'-ende, som var identisk med 300 bp i TDD-produktet. 3'-ende av hver EST inneholdt en poly-A-hale. Tilsammen var ESTene 1270 bp lange og tilsvarte 3'-ende av CRAM-transkripsjonsproduktet. Fordi 5'-ende av transkripsjonsproduktet manglet i EST-cDNA-klonen, ble den erholdt ved 5'- RACE-PCR. Den dannede 1980 nukleotider lange hellengdes kodende sekvens av det postulerte CRAM-l-cDNA vises på fig. 8A. Det var en sterk konsensstilling (GACATGG) for translasjonsinitiering 16 bp nedstrøms for 5'-ende, fulgt av ett enkelt ORF som forutsa et protein på 310 aminosyrer. 31-aminosyre-region etter det potensielle initierende metionin var karakteristisk for et signalpeptid. Spaltningsstillingen ble forutsagt å være ved Ala31-Val32.

Den tenkte struktur av murint CRAM-l-protein vises på fig. 8B, og består av en ekstracellulær region med en variabel tung kjede og en konstant type 2-lignende immunoglobulindomene (Pfam, The Sanger Centre og Blast) med to potensielle N-koblede glykosylasjonsstillinger (aal04 og 192). Hydrofobisitetsanalysen (Tmpred, ISREC) forutsa en transmembran region mellom posisjonene 242-260. Den postulerte cytoplasmatiske domene bestod av 49 aminosyrer og inneholdt et antall høyt konserverte Ser/Thr- og Tyr-fosforylasjonsseter (fig. 8A, residuene i kursiv skrift). Søket etter kjente mønstre med Prosite-programmet identifiserte motivene SSK/SYK som protein kinase C, SKQD/TSEE som CK2 og KQDGESY/KHDGVNY som tyrosin kinase-fosforylasjonssignaturer.

JAM, CRAM- 1 og CRAM- 2 definerer en nv delfamilie

Flere proteiner oppviste en høy homologi med CRAM-1. To medlemmer av Ig-superfamilien, nemlig humant A33-antigen og en del av muse-neuralcelleadhesjonsmolekyl, N-CAM, viste seg å ha henholdsvis 41% og 46% homologi med CRAM-1. JAM, et annet medlem av Ig-Sf, hadde en lignende struktur som CRAM-1 med 34% aminosyresekvensidentitet og 54% homologi. Den betydlige identitet av JAM og CRAM-1 ble brukt for å finne en tredje nært beslektet sekvens i EST-databasen, nemlig CRAM-2. Identiteten av de tre molekyler antydet at det finnes en ny delfamilie av molekyler i Ig-superfamilien (fig. 9). Homologien vedrørte ikke bare den samlede struktur av V- og C2-domene (C54 til C118 og C147 til C235 på fig. 9), men også sekvenser innenfor cytoplastisk domene. På interessant måte fant man de mest divergente regioner av de tre molekyler i starten av V-domene (posisjon 40 til 60) og i det proksimale cytoplasmiske parti (posisjon 280 til 300). Funksjonen av disse to regioner tilsvarer sekvenser omfattet i ligandbinding og signaltransduksjon i andre medlemmer av Ig-superfamilien, hvilket tyder på at JAM, CRAM-1 og CRAM-2 spiller en rolle i celle/celle-kommunikasjonen.

Vevfordelinq av JAM-, CRAM- 1- og CRAM- 2- mRNA

Ekspresjonen av de tre transkripter i celler av forskjellig opphav ble påvist ved bruk av RT-PCR. Alle endotel- og epitelcellelinjer og de fleste svulstcellelinjer som ble testet, var positive, men i forskjellig grad for de forskjellige transkripsjonsprodukter (fig. 10A). Det høyeste ekspresjonsnivå for CRAM-1 fant man i SV40-transformert HEV-cellelinje TME (bane 9) og i embryonisk endotelcellelinje e-end.2 (bane 4). CRAM-2- og JAM-transkripsjonsprodukter oppviste en mer begrenset fordeling og ble funnet i voksne endotelcellelinjer sammen med CRAM-l-transkripsjonsproduktet (banene 3, 7, 9 og 12). Det er bemerkelsesverdig at JAM- og CRAM-2-transkripsjonsproduktene ble sterkt nedregulert ved TNF-behandling av endotelceller, mens nivået av CRAM-l-transkripsjonsprodukter holdt seg uendret (banene 2 og 11). På interessant måte uttrykte hverken en embryonisk endotelcellelinje (bane 4) eller en voksen endotelcellelinje som representerte en angiogen variant av t-end (bane 6) JAM eller CRAM-2.

Vevfordelingen av JAM-2-transkripsjonsprodukter ble undersøkt ved "northern blotting" og sammenlignet med JAM-1 (fig. 14). JAM-2-transkripsjonsproduktet var 2 kb langt og ble sterkt uttrykt i embryonisk vev og i Peyer's flekker, lymfeknuter, nyre og tester av voksne dyr. En tenkt skjøtevariant på 1,8 kb ble påvist i testene. Ekspresjonen av JAM-2-transkripsjonsproduktet var lavt i lunge, lever, milt og thymus. Det relative overflod av JAM-1 og JAM-2 ble sammenlignet under embryogenese: mRNA som kodet for JAM-2, kunne påvises såpass tidlig som på dag 7,5 etter coitum, mens JAM-l-mRNA ikke kunne påvises i det hele tatt under embryogenese.

Disse resultater antyder at CRAM-1 uttrykkes omfattende under embryogenese og oppviser en begrenset ekspresjon i epitel- eller endotelområder i voksne vev. Dette stemmer overens med idéen at det spiller en rolle ved opprettelse og vedlikehold av den polariserte organisasjon av celler.

JAM- 2, et 45 kD- protein, er avhengig av homofile vekselvirkninger for å plassere seg i celle/ celle- kontakter

Fordi den HEV-avledede cellelinje TME uttrykte det høyeste nivå av JAM-2, ble denne endotelcellelinje brukt for en nærmere undersøkelse av den subcellulære plassering av JAM-2 og å sammenligne den med plasseringen av JAM-1. Plasseringen av JAM-2-protein på flaten av endotelcellene var begrenset til celle/celle-kontaktsteder (flg. 11A, a). Flekkingen for JAM-2 var svakere enn hva som ble observert for JAM-1 og mindre utpreget i membranstrekninger mellom celler.

Deretter undersøkte man om JAM-2 som forelå i celle/celle-kontakter, vekselvirket homofilt med JAM-2, eller om det vekselvirket heterofilt med et annet molekyl på nabocellen. Med dette formål ble JAM-2-protein kondensert med grønt fluorescerende protein (JAM-2-EGFP), og konstruktet ble transfisert inn i CHO-celler. Når CHO-celler transfisert med JAM-2-EGFP-cDNA oppnådde konfluens, ble JAM-2 kun observert i celle/celle-kontakter hvor begge cellene uttrykte proteinet

(fig. 11B), mens kontakter mellom uttrykkende og ikke-uttrykkende celler manglet JAM-2 (fig. 11B, a, vist med pilspisser). Det samme resultat ble oppnådd når celler ble transfisert med det kimære molekyl JAM-1-EGFP (fig. 11B, b). Dette tydet på at både JAM-2 og JAM-1 trengte homofile vekselvirkninger for å plassere seg ved celle/celle-kontaktpunkter.

For å karakterisere JAM-2 biokjemisk, utførte man immunofelninger av JAM-2 eller EGFP-kimære proteiner, uttrykt henholdsvis i TME-cellelinje eller i transfiserte CHO-celler (fig. 11C og D). Anti-JAM-2-antistoff, CRAM-19H36, immunofelte ett enkelt bånd på 45 kD fra TME-cellelysatet (Fig. 11C, bane 3).

Den tilsynelatende molekylvekt var identisk både under reduserende og ikke-reduserende betingelser (ikke vist) og tilsvarte den forutsagte molekylvekt som ble avledet fra aminosyresekvensen av JAM-2, hvor hvert N-glykosylasjonssete utgjorde 5 kDa. Immunofelning av JAM-1 ved bruk av H202-106 anti-JAM-spesifikt antistoff førte til en enkelt kjede med lavere molekylvekt (ca. 42 kD, bane 2) som utelukket en mulig kryssreaktivitet mellom anti-JAM-2- og anti-JAM-l-antistoffer.

Immunofelninger av rekombinante JAM-l-EGFP- eller JAM-2-EGFP-proteiner etter overflatebiotinylering førte til enkle brede bånd på henholdsvis 70 og 73 kD, hvilket tydet på at molekylene ble uttrykt på overflaten av CHO-transfiserte celler (fig.

11D, banene 4 og 6). Disse molekylvektene var forventet, siden EGFP har en molekylvekt på 28 kD.

Tilpasning og leukocvttmiqrerinq

For å forstå hvordan molekyler påvirker integriteten av endotelcellemonosjiktet og hvordan de regulerer funksjonen av vaskulær endotel, ble leukocytt-trans-endotelialmigrasjonsassayer utført i nærvær av rekombinant løselig JAM eller CRAM-1. Endotelceller ble dyrket i to dager i nærvær av sJAM-Ig2Do eller sCRAM-l-Ig2Do. Monosjiktets integritet ble ikke påvirket under dette tidsrom, sannsynligvis pga den molekylære redundans av mekanismen med celle/celle-kontaktdannelse. Transmigrasjonsassayet ble utført i nærvær av 1 jxg rekombinante løselige molekyler. Slik det vises på fig. 20A, ble antallet transmigrerende celler kun svakt påvirket av nærværet av sJAM-Ig2Do (tomme firkanter) under de første tre timene. Etter fire timer økte antallet transmigrerte celler sammenlignet med kontrollen (stiplet linje). Derimot nedsatte nærværet av sCRAM-l-Ig2Do (fylte sirkler) sterkt antallet transmigrerende celler.

Fordi leukocyttpopulasjonene var heterogene, bedømte man om sCRAM-l-Ig2Do virket på en bestemt leukocytt-delpopulasjon, eller om transmigrasjonen ble blokkert uten spesifisitet. For dette formål ble de transmigrerte celler merket for lymfocyttmarkørene CD3 og B220 (fig. 20B).

Man fant overraskende at sCRAM-l-Ig2Do spesifikt blokkerte transmigrasjonen av ikke-lymfoide leukocytter, dvs. myeloide cellelinjer (midtre rute, stiplede kolonner). Derimot økte sJAM-Ig2Do kun svakt antallet transmigrerende T-celler (venstre rute, hvit kolonne) uten noen virkning på andre celle-delpopulasjoner.

Videre, når endotelceller som var transfisert med CRAM-1, ble brukt for et transmigrasjonsassay, observerte man en sterkere transmigrasjon (fig. 12), mens transfeksjonen med CRAM-2 ikke hadde noen virkning på transmigrasjonen. Når SDF-1 ble tilsatt til assayet, oppnådde leukocytters transendotele migrasjon 20%. Dette ble delvis blokkert av monoklonale antistoffer mot CRAM-1.

Disse resultater tyder på at tilkoblingen av CRAM-1 mellom endotelceller kan regulere funksjonen av endotelsjiktet. Det ville forventes at molekylene fra denne familie vil bli til en barriære når endotelceller når konfluens. Med dette formål undersøkte man reguleringen av CRAM-l-transkripsjonsprodukter i endotelceller under forskjellige kulturbetingelser.

CRAM nedreguleres ved høv konfluens

Fordi transkripsjonsproduktet som koder for CRAM-1, ikke reguleres av TNF, men nedreguleres når endotel kodyrkes med svulstceller, ble et konfluensassay brukt til å undersøke denne regulering nærmere. Under lav konfluens var cellene aktivt sykliserende, og CRAM-l-vekselvirkninger fant ikke sted, mens cellene ved høy konfluens delte seg mindre, og CRAM-1 ble tilkoblet. Nivået av CRAM-l-mRNA-ekspresjon ble bestemt under forskjellige celletettheter ved semikvantitativ RT-PCR. Slik det vises på fig. 13, ble ekspresjonsnivået av CRAM-l-transkripsjonsprodukter nedsatt når konfluens ble oppnådd (banene 1, 2, 3 på fig. 13 tilsvarer henholdsvis 100, 50 og 10% konfluens). Denne virkning var nærmest ikke påvisbar med t-end-celler, men var mer utpreget med TME-cellelinjen som uttrykte CRAM-1 sterkt. Nedreguleringen av CRAM-1 i endoteler ble også forsterket når endotelcellene ble dyrket sammen med KLN205-karsinomaceller som i og for seg ikke uttrykker CRAM-1. Dette bekreftet koblingen mellom CRAM-l-ekspresjon og cellecyklusen, fordi svulstceller ble sagt å øke veksthastigheten av endotelceller ved berøring. Det er verdt å merke seg at resultatene som ble oppnådd med KLN205-karsinomaceller, var identiske med hva som ble oppnådd i vår opprinnelige teststrategi med B16-melanomasvulsten. Dette tyder på en generell mekanisme ved hvilken svulster påvirker endotelbeteendet.

JAM- 2 blir sterkt uttrykt under embryogenese, og begrenset til HEVer og endotelcellesubpopulasioner i voksent vev

For å bedre definere vevfordelingen av JAM-2, ble en immunohistologisk analyse utført på nyre og mesenteriske lymfeknutesnitt (fig. 15), som uttrykte det høyeste nivå av JAM-2-transkripsjonsprodukt. I det kortikale område av nyren påviste man en spesifikk flekking av intertubulære strukturer med anti-PECAM (GC51)- eller anti-JAM-2 (CRAM-XVIIIF26)-mAb'er, mens anti-ZO-1 eller anti-JAM-1 flekket hovedsaklig de tubulære epitelceller (ikke vist).

Oppfinnerne konsentrerte seg derfor om vaskulære strukturer som dypper ned i medulla og tilsvarer radiale vener eller vasa recta-endotelstrukturer. Med dette formål ble serielle snitt utført, og de vaskulære strukturer ble identifisert ved hjelp av anti-PECAM-flekking (fig. 15 d). På det tilsvarende parti av nabosnitt påviste man lineære interendotele flekkinger med anti-JAM-2, anti-JAM-1 eller anti-ZO-1 (henholdsvis fig. 15 a, b og c). Pa snitt av mesenterisk lymfeknute ble en typisk flekking av høyt endotele venuler (HEVer) oppnådd med anti-JAM-2-mAb (fig. 15 e). HEVene viste seg også å uttrykke JAM-1, ZO-1 eller PECAM (fig. 15 f, g og h), med en noe forskjellig subcellulær plassering av flekkingene (fig. 15 e-h, innføyninger). I det kortikale område av de mesenteriske lymfeknuter ble en typisk flekking av de subkapsulære sinuser observert med alle antistoffene (fig. 15 i-l) som tilsvarte flekkingen av afferente lymfatiske kar. Dermed er flekkingen med CRAM-18F26 anti-JAM-2-mAb begrenset til visse endotelceller eller til strukturer som er nært forbundne med vaskulaturen.

For å klargjøre om endotelcellers flekking kunne forklare bildene som vises på fig. 15, ble en cytofluorimetrisk analyse av JAM-2-ekspresjonen utført på forskjellige cellelinjer eller ferskt isolerte endotelceller fra dissosierte vev. Endotelcellelinjer (tEnd.l, eEnd.2 og TME) uttrykte lave nivåer av JAM-2 på celleflaten og variable nivåer av JAM-1 (fig. 16A).

En cytometrisk analyse av ferskt isolerte endotelceller ble utført ved tredobbelt flekking av cellesuspensjoner erholdt etter collagenase/dispase-organdissosiasjon. Endotelceller ble identifisert ved å innfange celler som var flekket med både PECAM/CD31 og acetylert-LDL (Voyta et al., 1984.J. Cell Biol. 99: 2034). Flekking for JAM-2 eller JAM-1 på denne dobbelt positive cellepopulasjon vises på fig. 16B. I nyre og Peyer's flekker flekket alle de isolerte celler som var positive for CD31 og acetylert-LDL, også for JAM-2, hvilket betyr at i det minste i disse organer, uttrykte endotelceller JAM-2 in vivo. Når flekkingen ble utført på celler erholdt fra lymfeknute, ble en JAM-2-ekspresjon kun funnet på en delpopulasjon av celler, hvilket gjenspeiler en mulig heterogenisitet av endotelcellefenotyper i dette vev.

Tilsammen viser resultatene av den cytometriske og immunohistokjemiske analyse at JAM-2 ko-uttrykkes med JAM-1 av endotelceller i nyre, Peyer's flekker og lymfeknuter.

Dynamisk plassering av JAM- 2 i celle/ celle- kontakter

For å undersøke mekanismen ved hvilken JAM-2 spesifikt plasserte seg i celle/cellekontakter, brukte man tidsforkortet videomikroskopi. CHO-cellene, som var blitt stabilt transfisert med det fluorescerende kimære molekyl, ble trypsinbehandlet og strøket på kammerslides for avbildning. Etter cellespredningen var overflateekspresjonen av JAM-2-EGFP ikke enhetlig, men noe klynget i celle/celle-kontaktpunktene (fig. 17A, cellene vist med stjerner). Under dannelsen av nye celle/celle-kontakter, observerte man en omplassering av JAM-2-EGFP til celleberøringspunkter, og et intenst fluorescenssignal ble påvist ved det nye berøringspunkt mellom cellene som dannet den nye celle/celle-kontakt (piler). Det kimære protein var anriket i membranutstikkerne mellom celler som berørte hverandre, hvilket førte til de "glidelås-lignende" bilder som sees etter 12 eller 18 minutter. Det er interessant at plasseringen av JAM-2 i de primære celle/cellekontakter ikke gikk tapt under dannelse av den nye membrankontakt (se cellekontaktene i det øvre venstre hjørne). Dette funn tydet på at JAM-2-EGFP ble spesifikt omplassert i den nye cellekontakten, og at dets plassering var stabil etter tilkoblingen.

For å videre undersøke kravene for JAM-2-plasseringen, utførte man tidsavkortet videomikroskopi etter å ha skadet cellemonosjiktet (fig. 17B). Cellene i den skadede kant beholdt JAM-2 på sine intakte kontaktsteder (pilspisser), men mistet JAM-2-plasseringen på den skadede side (piler), hvilket tydet på at JAM-2-tilkobling av en ligand på den motstående celle var nødvendig for å holde på dets membran-plassering. Over et tidsrom på 90 minutter etter såringen, begynte celler som lå langs grensen til såret, å migrere mot det sårede område. På interessant vis beholdt disse cellene kontakten med naboceller via membranutstikkere som var sterkt fluorescerende, dvs. JAM-2-positive (pilspisser). Disse resultatene støttet hypotesen om at homofile JAM-2-vekselvirkninger kan spille en rolle ved opprettelse eller vedlikehold av celle/celle-kontakter.

JAM- 2 øker monosiiktstvrken og deltar i sterke tilkoblinqskomplekser

Fordi et antall molekyler som deltar i celle/celle-forbindelsen, har vist seg å regulere den paracellulære permeabilitet av cellemonosjikt, testet man om JAM-2 også kunne påvirke denne funksjon. En transfeksjon med JAM-2-EGFP nedsatte den paracellulære permeabilitet for FITC-dekstran og forbedret forseglingen av CHO-cellemonosjikt med 42,5%, mens en transfeksjon med det ubeslektede molekyl Tac (IL2R a) ikke vesentlig nedsatte den paracellulære permeabilitet av transfiserte CHO-celler (fig. 18). Transfeksjon med JAM-1-EGFP nedsatte også den paracellulære permeabilitet av transfiserte CHO-cellemonosjikt.

Disse resultatene førte til spørsmålet om de chimeriske molekyler kunne delta i et subcellulært spesialisert område såsom sterke tilkoblinger i polariserte epitelceller. For å svare på dette spørsmål ble de chimerisk EGFP-proteiner transfisert inn i MDCK-celler, og deres subcellulære plassering ble sammenlignet med plasseringen av markøren for sterke tilkoblinger, nemlig okkludin. Slik det fremgår fra fig. 19A, når serielle bilder hver 0,9 |xm ble analysert for EGFP-fluorescens og sammenlignet med okkludinflekkingen, var JAM-2-EGFP spesifikt anriket i celle/celle-kontakter på nivået for sterk tilkobling. På det basale nivå (venstre), observerte man intracellulære punkter med EGFP-fluorescens. En lignende analyse (fig. 19B) av MDCK-celler transfisert med JAM-1-EGFP viste en lignende ko-plassering med okkludin. Imidlertid var fordelingen av JAM-l-EGFP-fluorescensen mindre kontinuerlig enn hva som ble observert for JAM-2-EGFP på nivået for sterke tilkoblinger.

DISKUSJON

Dette eksempel beskriver anvendelse av en ny testestrategi for å identifisere regulerte transkripsjonsprodukter som koder for elementer av Ig-superfamilien av adhesjonsmolekyler. Beskrevet heri er kloningen med denne metode av det nye molekyl CRAM-1 som et regulert transkripsjonsprodukt. Reguleringen som observeres i endotelceller som ble dyrket i nærvær av svulster, bekreftes ved en semikvantitativ RT-PCR og viser seg å være avhengig av cellenes vekstfase. Grunnet en differensiell ekspresjon under forskjellige cellekonfluensbetingelser, brukte man navnet CRAM-1 for "Confluency Regulated Adhesion Molecule-1" eller konfluensregulert adhesjonsmolekyl-1.

Også beskrevet heri er en nært beslektet sekvens med CRAM-1 som benevnes CRAM-2. CRAM-1 og CRAM-2 representerer prototypene av en ny delfamilie av adhesjonsmolekyler som også omfatter det nylig beskrevne molekyl JAM (Chretien et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28, 4094-4104; Malergue et al., 1998, Mol. Immunol. 35, 1111-1119).

CRAM-1 og JAM uttrykkes foretrukket av endotel- og epitelvev ved celle/cellekontakter, og formidler spesielle egenskaper til polariserte sjikt. Virkningen av rekombinante løselige molekyler i et transendotelialt migrasjonsassay og reguleringen av JAM, CRAM-1 og CRAM-2 viser at disse tre molekyler spiller en viktig rolle ved vedlikehold av den vaskulære fysiologi.

Den nye teststrategi, benevnt "Targeted Differential Display" (TDD) eller målrettet differensiell fremvisning, har vist seg å være en virksom teknikk for å selektivt amplifisere aktuell cDNA. TDD benyttet seg med fremgang av delvis degenererte primere for å formidle en selektiv målretting mot den konserverte region, Y(Y/Q/R)CXAS, av C2-lignende Ig-domener. Gjentatte eksperimenter førte til reproduserbare fremvisningsmønstre. Av 16 differensielt uttrykte transkripsjonsprodukter, representerte 3 gener med en betydelig homologi med konserverte Ig-sekvenser. Denne økte spesifisitet kan overvinne hovedproblemene med de allerede kjente teknikker med klassisk RNA-fingeravtrykk og differensiell fremvisning. RNA-fingeravtrykk er lenge blitt brukt for identifikasjon av differensielt uttrykte gener. Grunnet de sekvensspesifikke primere som brukes, påviser denne metode imidlertid kun transkripsjonsprodukter av valgte og allerede kjente proteiner. På den andre side benytter seg RNA-fremvisning av vilkårlige primere og omfatter en ikke-spesifikk amplifikasjon av transkripsjonsprodukter. Målet i dette tilfelle er å fastslå eventuelle forskjeller i mRNA-nivåene av to biologiske systemer, som innleveres for sammenligning. TDD er en avansert testmetode som kombinerer RNA-fingeravtrykkets spesifisitet med degeneransen av differensiell RNA-fremvisning, hvilket fører til selektivitet. Grunnet innsiktingen mot beslektede transkripsjonsprodukter, nedsatte denne teknikk sterkt tiden som var nødvendig for testingen. Dermed muliggjøres en identifikasjon av nye medlemmer av bestemte proteinfamilier. Dette er en betydelig forbedring av de beskrevne ikke-spesifikke teststrategier.

Disse felles trekk ble brukt for å konstruere rekombinante proteiner for å undersøke funksjonen av JAM, CRAM-1 og CRAM-2. I foreliggende eksempel beskrives virkningen av sJAM-Ig2Do og sCRAM-l-Ig2Do i et in wfro-transmigrasjonsassay. Spesifikke blokkerende virkninger på migreringen av myeloide celler kunne observeres med sCRAM-l-Ig2Do, mens sJAM-Ig2Do kun hadde en svak virkning på lymfocytter.

JAM- og CRAM-2-transkripsjonsprodukter oppviste en lignende vevfordeling og ekspresjonsregulering under innvirkning av TNF, hvilket tydet på at de virker ved hjelp av lignende fysiologiske mekanismer. Derimot reguleres CRAM-l-transkripsjonsproduktene ikke av TNF, men istedenfor av proliferasjonsraten eller tettheten av endotelceller. Faktisk tyder overekspresjonen av CRAM-l-transkripsjonsprodukter i sykliserende celler og dets nedregulering i hvilende celler på atdette molekyl deltar i opprettelsen av et kontinuerlig monosjikt. Dets funksjon i konfluente monosjikt av celler er vedlikehold av endotelcellesjiktet og de forbundne egenskaper. Fordi forskjellige leukocyttpopulasjoner må migrere til stedet for immunresponser, tror man at ikke-lymfoide celler migrerer ved en CRAM-1- avhengig mekanisme, mens lymfoide celler migrerer ved hjelp av JAM eller CRAM-2. I dette tilfelle kan immunresponsen moduleres ved bruk av kombinasjoner av forskjellige løselige rekombinante molekyler.

Claims (6)

1. Antistoff som er rettet mot: a) et polypeptid som tilhører en subfamilie av den humane immunoglobulin superfamilien, hvor nevnte polypeptid er særpreget at det oppviser minst 80% sekvensidentitet med aminosyresekvensen av murint konfluens-regulert adhesjonsmolekyl 1 (CRAM-1) angitt i SEQ ID NO: 19, eller mot b) et polypeptid som tilhører en subfamilie av den humane immunoglobulin superfamilien, hvor nevnte polypepid omfatter en aminosyresekvens som er minst 80%, mer foretrukket minst 90%, mest foretrukket i hovedsak 100% identisk med aminosyresekvensen av humant CRAM-1 angitt i SEQ ID NO: 23, hvor nevnte antistoff erkarakterisert vedat det er i stand til å modulere den transendoteliale migrering av leukocytter.

2. Antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat de er koblet til et annet molekyl valgt fra toksiner, radioaktive markører, fluorescente markører, enzymatiske markører, fotoreaktive markører, liposomer, medikamenter og celler.

3. Anvendelse av antistoff ifølge krav 1 eller 2, for fremstilling av et medikament for inhibering av angiogenese i tumorer.

4. Anvendelse av antistoff ifølge krav 1 eller 2, for fremstilling av et medikament til behandling av inflammatoriske reaksjoner.

5. Oppløselig CRAM-1 polypeptid som er i stand til å blokkere transendotelial migrering av leukocytter, omfattende: (a) V-domenet av CRAM-1 som tilsvarer aminosyrer 53 til 115 av SEQ ID NO: 19; (b) V- og C2-domenet av CRAM-1 som tilsvarer henholdsvis aminosyrer 53 til 115 samt aminosyrer 144 til 230 av SEQ ID NO: 19; (c) aminosyrer 1 til 159 av SEQ ID NO: 19; eller (d) aminosyrer 1 til 238 av SEQ ID NO: 19.

6. Anvendelse av oppløselig polypeptid ifølge krav 5 for fremstilling av et medikament til behandling av inflammatoriske reaksjoner.