PL199081B1 - Sposób ekstrakcji protein z tkanki ssaka morskiego, kompozycja suplementu diety i zastosowanie protein z ssaka morskiego - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania oleju ze ssaków morskich bogatego w kwasy t lusz- czowe omega-3 oraz kompozycji zawieraj acych takie oleje. Wynalazek dotyczy tak ze sposobu otrzy- mywania takich olejów z foki oraz innych ssaków morskich. Bardziej szczegó lowo, wynalazek dotyczy sposobu przekszta lcania podskórnych oraz miesniowych tkanek foki oraz innych ssaków marskich. Jeszcze dok ladniej, wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania lipidowych i proteinowych ekstraktów z tusz foki oraz innych ssaków morskich, oraz takich ekstraktów. Ponadto, wynalazek dotyczy frakcji uzyskanych sposobem wed lug wynalazku oraz zawieraj acych je dodatków spo zywczych. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposób ekstrakcji protein z tkanki ssaka morskiego, kompozycji suplementu diety i zastosowania protein z ssaka morskiego.

Od setek lat polowano na foki dla ich futra i mięsa. Ostatnio poluje się na te zwierzęta głównie z powodu ich futra i tranu, przy czym pozostałą tuszę często z powrotem wyrzuca się do morza. Często jest to znacząca strata tkanek foki.

Cała branża związana z połowami fok spodziewa się znaleźć rozwijający się rynek zbytu na mięso foki, produkty z tłuszczu foki, a w przypadku rynku azjatyckiego, afrodyzjaki na bazie genitaliów foki. Ostatnio ponownie zainteresowano się olejem z foki z powodu własności oleju z foki wyekstrahowanego z tłuszczu, który jest bogaty w kwasy tłuszczowe omega-3. Olej z foki jest typowym olejem morskim, ponieważ jest on bogaty w kwasy tłuszczowe omega-3. Dokładniej zawiera on kwas dokozanoheksanowy (DHA) i kwas eikozanopentanowy (EPA), których korzystne własności znane są specjalistom w technice. Ponadto oleje te zawierają znaczne ilości skwalenu i witaminy E. Związki te są niezbędne dla zapewnienia i utrzymania dobrego zdrowia. Faktycznie w ciągu minionych dwudziestu lat eksperci zajmujący się zdrowiem zalecali diety o mniejszej zawartości tłuszczów nasyconych i większej zawartoś ci tł uszczy wielonienasyconych. Chociaż radę tą stosowało wielu konsumentów zapadalność na chorobę serca, raka, cukrzycę i na wiele innych wyniszczających chorób stale ciągle wzrastała. Naukowcy zgadzają się, że rodzaj i źródło wielonienasyconych kwasów tłuszczowych ma tak samo decydujące znaczenie jak całkowita ilość tłuszczy. Najpowszechniejsze wielonienasycone tłuszcze pochodzą z substancji roślinnej i nie mają kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach (np. omega-3). Ponadto uwodornienie wielonienasyconych tłuszczy w celu utworzenia tłuszczy syntetycznych przyczynia się do wzrostu pewnych zaburzeń zdrowotnych i zaostrza niedobór niektórych podstawowych kwasów tłuszczowych. Faktycznie stwierdzono, że suplementcja kwasami omega-3 przynosi korzyści w przypadku wielu schorzeń. Schorzenia te obejmują trądzik, alergię, chorobę Alzheimera, artretyzm, stwardnienie tętnic, torbiele piersi, raka, zwłóknienie torbielowate, cukrzycę, egzemę, nadciśnienie, nadczynność, zaburzenia jelitowe, dysfunkcję nerek, białaczkę i stwardnienie rozsiane. Godne uwagi jest to, że Światowa Organizacja Zdrowia zaleciła wzbogacenie mieszanek dla niemowląt kwasami tłuszczowymi omega-3.

Powszechnie stosowanymi związkami wielonienasyconymi są związki pochodzące z olei roślinnych, które zawierają znaczne ilości omega-6 i tylko małe ilości omega-3 lub nie zawierają ich wcale. Chociaż kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6 są oba niezbędne dla dobrego zdrowia, muszą być spożywane w stosunku około 4-1. Dzisiejsza zachodnia dieta stworzyła poważną dysproporcję przy obecnym spożyciu średnio dwadzieścia razy większym omega-6 niż omega-3. W celu przywrócenia równowagi zaniepokojeni konsumenci zaczęli poszukiwać zdrowotnych dodatków spożywczych. Podstawowymi źródłami omega-3 są olej z siemienia lnianego, oleje rybne i olej z foki. W minionej dekadzie nastąpił szybki wzrost produkcji oleju z siemienia lnianego i olejów rybnych. Oba typy olejów uważa się za dobre źródła dietetyczne wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, lecz w dostarczaniu kwasów tłuszczowych omega-3 są one mniej skuteczne niż olej z foki. Olej z siemienia lnianego nie zawiera EPA, DHA ani DPA, lecz raczej zawiera kwas linolenowy - blok budulcowy umożliwiający organizmowi wytworzenie EPA. Jednakże jest dowód na to, że szybkość przemiany metabolicznej może być wolna i nieustabilizowana, szczególnie u tych których zdrowie jest pogorszone. Oleje rybne różnią się znacznie pod względem typu i ilości składu kwasów tłuszczowych, zależnie od konkretnych gatunków i ich pożywienia. Na przykład, ryby hodowane w kulturze wodnej wykazują skłonność do mniejszego poziomu kwasów tłuszczowych omega-3 niż ryby żyjące w stanie naturalnym. Badania wykazały, że olej z foki jest korzystniejszy niż olej rybny dla osób zagrożonych chorobą serca i cukrzycą. Naukowcy założyli, że wynika to ze względnego braku DPA w oleju rybnym i mniejszej szybkości, z jaką organizm zdolny jest wyekstrahować i wykorzystać zawartość EPA i DHA oleju rybnego.

Bogatsze, najbardziej bezpośrednie i kompletne źródło olei omega-3 znajduje się w tłuszczu niektórych ssaków morskich, a zwłaszcza w foce harfowej. Ponadto, wchłanianie przez organizm omega-3 z tłuszczu foki jest szybsze i skuteczniejsze niż z olei z siemienia lnianego i rybnego. Spowodowane jest to częściowo przez konfiguracje cząsteczkową EPA i DHA w oleju z foki, która nieznacznie różni się od konfiguracji w olejach rybnych.

Tradycyjnie olej z foki ekstrahowano stosując sposoby wymagające wysokich temperatur, które sprzyjały utlenianiu wielonienasyconych tłuszczy.

PL 199 081 B1

Olej ze ssaków morskich, takich jak foka, zapewnia więc znaczne korzyści. Niestety nie ma prostych i opłacalnych sposobów oczyszczania oleju z takich ssaków morskich. Ponadto, musi się jeszcze zapewnić sposoby umożliwiające oczyszczanie oleju zawierającego znaczną ilość kwasów tłuszczowych omega-3 z tkanek tłuszczowych, aktywnych frakcji proteinowych i lipidów z tkanek mięśniowych i trzewiowych. Poza tym z uwagi na znaczny spadek ceny skór surowych z foki (około 50% w cią gu ostatniego roku) i bardzo niską cenę tusz ssaków morskich (dane z Nowofunlandzkiego i Labradorskiego Przemysłu Morskich Produktów Żywnościowych 1977, Nowofunlandzki Departament Rybołówstwa i Kultury Wodnej) istnieje potrzeba zwiększenia wartości ssaków morskich (w szczególności fok), części ciała, a szczególniej ich tusz.

Pozostaje również potrzeba znalezienia zastosowania protein tusz ssaków morskich, takich jak tusza foki, i/lub korzyści z tym związanych.

Z uwagi na korzyści zdrowotne związane z kwasami tłuszczowymi zawierającymi omega-3, o których doniesiono, istnieje potrzeba zapewnienia ekstraktów zawierają cych ich znaczne iloś ci, środków do ich wytwarzania za pomocą prostego i opłacalnego sposobu oraz zapewnienia dodatku spożywczego zawierającego te ekstrakty.

Niniejszy wynalazek usiłuje zaspokoić te i inne potrzeby.

Niniejszy opis odnosi się do wielu dokumentów, zawartość których włączona jest w całości przez odniesienie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji protein z tkanki ssaka morskiego, charakteryzujący się tym, że

a) proteiny strąca się z zastosowaniem przynajmniej jednego rozpuszczalnika organicznego;

b) odzyskuje się lipidy w fazie ciekłej z etapu a) przez odparowanie przynajmniej jednego rozpuszczalnika organicznego, oraz

c) odzyskuje się zasadniczo czyste i pozbawione znaczących ilości metali ciężkich lub pestycydów proteiny z osadu otrzymanego w etapie a).

Korzystnie przynajmniej jeden rozpuszczalnik organiczny wybiera się z grupy obejmującej aceton, alkohol, etanol i octan etylu lub stosuje się kombinację przynajmniej dwóch wymienionych rozpuszczalników organicznych.

Korzystnie alkohol wybiera się z grupy obejmującej etanol, izopropanol i propanol.

Korzystnie jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się etanol.

Korzystnie jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się aceton.

Korzystnie jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się kombinację acetonu i etanolu.

Korzystnie jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się kombinację acetonu i octanu etylu.

Korzystnie otrzymuje się proteiny, które zachowują pewną aktywność enzymatyczną.

Korzystnie jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik organiczny stosuje się rozpuszczalnik organiczny nietoksyczny dla zwierząt.

Korzystnie ssak morski jest wybrany z grupy obejmującej walenie, foki i morsy.

Korzystnie ssakiem morskim jest foka.

Korzystnie jako tkankę ssaka morskiego stosuje się tkankę nietłuszczową.

Korzystnie tkankę ssaka morskiego stanowi trzustka.

Korzystnie tkankę ssaka morskiego stanowi wątroba.

Korzystnie tkankę ssaka morskiego stanowi tkanka mięśniowa.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja suplementu diety zawierająca odpowiedni nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera proteiny ze ssaka morskiego uzyskane sposobem określonym w zastrz. 1.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie protein ze ssaka morskiego uzyskanych sposobem określonym w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji suplementu diety.

Przedstawiono również sposób ekstrakcji kwasów tłuszczowych zawierających omega-3 ze ssaka morskiego, który umożliwia uzyskanie tranu w warunkach, w których zachowuje się jego jakość. Konkretniej sposób ekstrakcji kwasów tłuszczowych omega-3 zmniejsza utlenianie wielonienasyconych tłuszczy. Sposób umożliwia dodatkowo uzyskanie lipidów z innych tkanek, jak również izolatu proteinowego z tuszy. Przez użycie tuszy jako substratu do ekstrakcji i oczyszczania niniejszy sposób, poza umożliwieniem pozbycia się tusz i niepożądanych tkanek ze ssaków morskich w sposób bardziej przyjazny dla środowiska, zapewnia znaczny wzrost jego wartości. Rzeczywiście niniejszy wynalazek umożliwia przetwarzanie tkanek ssaków morskich, które często wyrzuca się.

PL 199 081 B1

Konkretniej, w korzystnym przykładzie wykonania przedstawiono sposób przekształcania foki i pokrewnych gatunków, zgodnie z którym ich podskórne tkanki tłuszczowe ekstrahuje się za pomocą ciśnienia na zimno przy braku rozpuszczalnika.

W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku, sposób który umoż liwia uzyskanie protein z mięśni i innych tkanek foki za pomocą ekstrakcji rozpuszczalnikowej prowadzi się jako drugi etap obróbki. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania rozpuszczalnik wybiera się z acetonu, alkoholu, etanolu, octanu etylu lub kombinacji przynajmniej dwóch takich rozpuszczalników organicznych. Lipidy ekstrahowane za pomocą ekstrakcji z zastosowaniem rozpuszczalnika lub rozpuszczalników w tym drugim etapie uzyskuje się przez odparowanie rozpuszczalnika lub rozpuszczalników. Sposób obejmujący drugi etap umożliwia uzyskanie znacząco czystej frakcji proteinowej, pozbawionej znaczących ilości metali ciężkich lub pestycydów (które nie wytrącają się razem z proteinami).

Nieograniczające przykłady rozpuszczalników organicznych, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem, są dobrze znane w technice i obejmują alkohol (np. izopropanol, propanol i tym podobne). Oczywiście korzystne jest stosowanie rozpuszczalników, które nie są toksyczne dla zwierząt.

Termin zwierzę odnosi się ogólnie do królestwa zwierząt, a wiec do ssaków, ryb, ptaków i tym podobnych.

Przedstawione sposoby umożliwiają wytwarzanie oleju bogatego w omega-3 z tkanki tłuszczowej, a następnie otrzymanie zasadniczo czystych frakcji proteinowych, które zachowują działanie enzymatyczne i lipidów z mięśni i tkanek trzewiowych (tkanki, które zwykle wyrzuca się).

W wielu korzystnych przykładach wykonania niniejszy wynalazek dotyczy foki jako ssaka morskiego, z którego wytwarza się ekstrakty lub frakcje.

W przykładzie wykonania niniejszego wynalazku po zabiciu ssaka morskiego mają cego kwasy tłuszczowe bogate w omega-3 spuszcza się z niego natychmiast krew, a jego skórę usuwa się. Podskórny tłuszcz i inne tkanki tłuszczowe wycina się i trzyma w bardzo niskich temperaturach. Olej ekstrahuje się przez wywieranie ciśnienia fizycznego na tłuszcz. Szczególnie olej ekstrahuje się przez mielenie i zastosowanie na tkanki wysokiego ciśnienia (ekstrakcja na zimno). Temperatura zawarta jest miedzy około 0°C i około 10°C, a korzystniej między około 0°C i około 4°C. W tym sposobie tłuszcz roztapia się do oleju, który odzyskuje się następnie przez filtrowanie lub odwirowanie.

Olej oczyszcza się za pomocą konwencjonalnych środków takich jak na przykład, filtrowanie i/lub odwirowanie. Ponadto wodę w oleju można zbierać razem z jakimkolwiek lotnym związkiem w niej zawartym przez ogrzewanie, jak jest to powszechnie znane.

W korzystnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku inne tkanki z tuszy, włączając trzewia, miele się i ekstrahuje za pomocą zimnego acetonu i/lub etanolu. Po przemyciu nierozpuszczalnej substancji rozpuszczalnik usuwa się z ekstraktów pod niskim ciśnieniem pozostawiając koncentrat proteinowy zachowujący pewne aktywne działania enzymatyczne i nie mający znacznego poziomu zanieczyszczenia bakteriami. Materiał rozpuszczalny w rozpuszczalniku (faza lipidowa) uzyskuje się po odparowaniu i oddzieleniu od wody tkankowej.

Przedstawiono zatem sposób ekstrakcji oleju bogatego w kwasy tłuszczowe omega-3 ze ssaka morskiego obejmujący etap ekstrakcji lipidów, który obejmuje poddanie tkanki ze ssaka morskiego obróbce tkanki z zastosowaniem ciśnienia na zimno, a obróbka z zastosowaniem „ciśnienia na zimno umożliwia otrzymanie oleju bogatego w kwasy tłuszczowe omega-3 i który zmniejsza utlenianie tłuszczy wielonienasyconych i w którym etap ekstrakcji lipidów prowadzi się przy braku rozpuszczalnika organicznego.

Zgodnie z innym przykładem przedstawia się również olej ze ssaka morskiego bogaty w kwasy tłuszczowe omega-3.

Olej ze ssaka morskiego jest bogaty w kwasy tłuszczowe omega-3 i jest pozbawiony śladów rozpuszczalnika organicznego.

Określenie użyte w niniejszym tekście tran lub tłuszcz, znane osobie o zwykłym doświadczeniu, oznacza podskórną tkankę tłuszczową.

Termin ciśnienie na zimno jest dobrze znany w terminologii w technice i odnosi się do wywierania na tłuszcz ciśnienia fizycznego w niskiej temperaturze (patrz powyżej).

PL 199 081 B1

Termin użyty w niniejszym tekście znacząco czysta frakcja proteinowa lub tym podobne ma odnosić się do frakcji proteinowej lub preparatu proteinowego, który zawiera przynajmniej około 90% protein, korzystnie przynajmniej około 95% protein. Podobnie termin zasadniczo czysta frakcja proteinowa lub tym podobne oznacza frakcje proteinową będącą przynajmniej w 90% czystą, korzystnie przynajmniej w 95% czystą, a szczególnie korzystnie przynajmniej w 99% czystą.

Termin pozbawiony znacznych ilości metali ciężkich lub pestycydów ma oznaczać ilości pestycydów lub metali ciężkich mniejsze niż normy zatwierdzone przez instytucje ustalające normy (np. Health Canada [np. Ustawa i Przepisy o Lekach i Żywności], Zarząd ds. Leków i Żywności [USA] i tym podobne).

Chociaż sposób i ekstrakty przedstawia się w odniesieniu do tkanek foki, generalnie ssaki morskie mające kwasy tłuszczowe bogate w omega-3 można by stosować w sposobach według niniejszego wynalazku. Takie ssaki morskie znane są w technice. Ich nieograniczające przykłady obejmują walenia (np. wieloryby), fokę słoniową, foki, morsa i tym podobne. A zatem należy rozumieć, że osoba o zwykłym doświadczeniu będzie mogła przystosować treść niniejszego wynalazku do wytwarzania olei, protein i lipidów z tych ssaków morskich.

W korzystnym przykł adzie wykonania niniejszego wynalazku ssakiem morskim mają cym kwasy tłuszczowe bogate w omega-3 jest foka. Termin foka stosuje się w niniejszym tekście ogólnie w odniesieniu do wielu gatunków. Nieograniczające przykłady gatunków obecnych w Oceanie Atlantyckim obejmują: fokę harfową, fokę kapturową (Cystophora cristata), fokę pierścieniową (Pusa hispida), fokę portową (Phoca vitulina, spotykaną również w Oceanie Spokojnym), fokę szarą (Halichoerus grypus) i fokę brodatą (Erignathus barbatus).

Godne uwagi jest to, że eksperci zajmujący się zdrowiem doszli do wniosku, że u 80% wszystkich Amerykanów stwierdzono niedobór podstawowych kwasów tłuszczowych. Niektóre, lecz nie jedyne, oznaki i symptomy typowe dla niedoboru podstawowych kwasów tłuszczowych to: zmęczenie, depresja, sucha skóra i włosy, suche błony śluzowe, łamliwe paznokcie, niestrawność, zaparcie i brak wytrzymałości. Długotrwały niedobór wiąże się z wyższym ryzykiem chronicznych chorób zwyrodnieniowych. Aż 60 schorzeń wiąże się z tym niedoborem lub też stwierdzono, że suplementcja kwasami omega-3 w ich przypadku przynosi korzyści. Obejmują one trądzik, alergie, chorobę Alzheimera, artretyzm, stwardnienie tętnic, torbiele piersi, raka, zwłóknienie torbielowate, cukrzycę, egzemę, nadciśnienie, nadczynność, zaburzenia jelitowe, dysfunkcję nerek, białaczkę i stwardnienie rozsiane, miopatię, otyłość, łuszczycę i chorobę naczyniową. Dowiedziono, że olej z foki obniża cholesterol w surowicy krwi bez działań ubocznych jakie wiążą się z przepisywanymi lekami, a jego zdolność do zmniejszenia płytek w krwi może służyć jako alternatywa dla aspiryny w zapobieganiu udarowi. Otrzymane frakcje znajdują więc zastosowanie w wielu niedoborach lub zaburzeniach. Trzy najważniejsze kwasy tłuszczowe o długich łańcuchach to EPA, DHA i DPA. Te kwasy tłuszczowe zyskały względny rozgłos w świecie medycznym stając się dzisiaj jednym z najważniejszych i najpopularniejszych suplementów zdrowotnych na rynku.

Opisano zatem również kompozycje zawierające jedną lub więcej niż jedną otrzymaną frakcję do leczenia jednego lub więcej niż jednego niedoboru lub schorzenia, w przypadku których zaleca się dodatek omega-3, a konkretniej niedoborów lub schorzeń przedstawionych powyżej i/lub do zapewnienia ochrony przed nimi.

Co się tyczy podawania ich ludziom lub innym zwierzętom, profesjonalista (profesjonalista medyczny lub ekspert w dziedzinie zdrowotnych dodatków spożywczych) ustali ostatecznie właściwe postać i dawkowanie dla danego osobnika i można się spodziewać, że będą się one zmieniać zależnie od wybranych środków leczniczych lub zapobiegawczych, reakcji i stanu osobnika, jak również stopnia zaawansowania choroby lub schorzeń.

Kompozycja objęta zakresem niniejszego wynalazku powinna zawierać składnik aktywny (np. olej bogaty w kwasy tłuszczowe omega-3) w ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego leczniczego i/lub zapobiegawczego działania, przy czym powinno się unikać szkodliwych działań ubocznych. Ponieważ otrzymany olej ma poziom witaminy A umiarkowany do niskiego, można podawać go w wysokich dawkach (wię cej niż 100 ml), godne uwagi jest to, ż e Eskimosi znani są z tego, ż e zjadają olbrzymie ilości tłuszczu, równowartość 250-500 ml oleju takiego jak przedstawiono. Zwykle olej można wiec podawać ssakom (np. ludziom) w dawkach zawartych w zakresie 2-10 ml dziennie (w odniesieniu do średniej osoby ważącej 150 funtów). Preparaty akceptowane pod względem farmaceutycznym są

PL 199 081 B1 dobrze znane w technice (Remington's Pharmaceutical Science, 16 Wyd., Mack Ed.). Frakcję proteinową uzyskaną sposobem według niniejszego wynalazku można stosować jako źródło protein, na przykład, dla ryb, ptaków lub ssaków.

Krótki opis rysunków

Po ogólnym opisaniu w ten sposób wynalazku teraz zaprezentuje się załączone rysunki, przedstawiając za pomocą ilustracji korzystny przykład wykonania wynalazku, w którym:

Rysunek 1 przedstawia chromatografię cienkowarstwową obojętnych lipidów i fosfolipidów olejowych ekstraktów tłuszczu, wątroby, mięśnia i trzustki;

Rysunek 2 przedstawia działanie proteolityczne proteinowych ekstraktów mięśnia i trzustki;

Rysunek 3 przedstawia działanie proteolityczne proteinowych ekstraktów trzustki na proteinowe ekstrakty mięśnia i

Rysunek 4 przedstawia działanie proteolityczne proteinowych ekstraktów wątroby.

Inne przedmioty, korzyści i cechy niniejszego wynalazku staną się bardziej oczywiste po przeczytaniu poniższego nieograniczającego opisu korzystnych przykładów wykonania w nawiązaniu do załączonego rysunku, który jest przykładowy, i nie powinien być interpretowany jako ograniczenie zakresu niniejszego wynalazku.

Opis przykładu wykonania

Uzyskano tkanki foki i wybrane tkanki trzymano oddzielone zamrożone w -20°C. Wytwarzanie wszystkich próbek tkankowych i ekstrakcje lipidowe przeprowadzono w 4°C. Odpowiednie próbki tkankowe pocięto na kawałki i przepuszczono przez wilk do mięsa. Lipidy ekstrahowano ze zważonych zmielonych próbek albo stosując ciśnienie mechaniczne albo rozpuszczając w acetonie w róż nych okresach czasu stosownie dla każdej tkanki. Wyekstrahowane lipidy oddzielono od materiałów nielipidowych przez odwirowanie lub odfiltrowanie zależnie od tkanki. Lipidy wyekstrahowane za pomocą rozpuszczalnika uzyskano przez odparowanie rozpuszczalnika w przyrządzie Rotavapor™.

Ogólne sposoby ekstrakcji przedstawione powyżej zastosowano do konkretnych tkanek foki, takich jak tłuszcz, mięśnie, trzustka i wątroba.

Tabela 1 przedstawia wydajność lipidów wyekstrahowanych z tkanek mięśniowych, trzustkowych i wątrobowych. Wydajności lipidów 2,6-3,0% otrzymano po ekstrakcji przez całą noc i czasie przemywania 30 minut z trzustki i wątroby. W przeciwieństwie do tego procedura ekstrakcyjna z tłuszczu dała przynajmniej 70% półprzezroczystego oleju. Fakt, że olej jest półprzezroczysty jest inną korzyścią sposobu. Ponadto olej z tłuszczu nie jest kolorowy.

T a b e l a 1

Ilość lipidów wyekstrahowanych za pomocą acetonu przy różnych okresach ekstrakcji

Tkanka	Ciężar G	Czas ekstrakcji Godzina	Czas przemywania Minuty	Ilość lipidów
g	%
Mięsień	274	22,5	30	6,28	2,3
Mięsień	257	19	30	6,93	2,6
Mięsień	250	17	30	7,61	3,0
Mięsień	250	3,5	20	4,70	1,9
T rzustka	109	2	15	2,03	1,9
Wątroba	151	1	15	2,25	1,5
Mięsień	250	4	5	3,56	1,4

Tabela 2 przedstawia ogólny skład tkanek mięśniowych wyekstrahowanych według jednego przykładu. Wytwarza się dwie kolejne frakcje lipidowe i suchą pozostałość bogatą w proteiny.

PL 199 081 B1

Wyniki podane w tabelach 1 i 2 wskazują na to, że odzysk lipidów mieści się między 2,6-3,0%. Aby zobaczyć, czy można by uzyskać więcej lipidów pozostałość mięśniową przemyto za pomocą 100 ml czystego octanu etylu. Można było uzyskać dodatkowe 1,6-2,4%.

T a b e l a 2

Ogólny skład tkanek mięśniowych

	Nr 1	Nr 2
Wilgotność %	70,8	70,5
Sucha masa %	29,2	29,5
Całkowite lipidy %	4,7	2,5
Frakcja lipidowa 1 %	4,6	2,3
Frakcja lipidowa 2 %	0,1	0,2
Pozostałość %	24,5	27,0
Pozostałe lipidy %	2,4	1,6

Ekstrakcja porównawcza za pomocą sposobu Folcha (1957) wskazuje na to, że pod względem wydajności odzysk całkowitych lipidów z mięśni przy zastosowaniu procedury Folcha jest nieco lepszy niż w przypadku niniejszego sposobu. Jednakże sposobu Folcha nie można zastosować przy uzyskiwaniu lipidów do stosowania handlowego z powodu toksyczności, której przyczyną jest użycie metanolu. Toksyczność metanolu jest dobrze znana.

Rysunek 1 i Tabela 3 wskazują na to, że lipidami tłuszczowymi są w 98% triglicerydy. Około połowa lipidów wątrobowych jest obojętna z wolnymi kwasami tłuszczowymi (32%) jako głównym typem, a pozostała połowa składa się głównie z fosfatydylocholiny (23%) i fosfatydyloetanoloaminy (17%). Około trzy czwarte lipidów mięśniowych jest obojętne z triglicerydami (67%), które stanowią ich większość, natomiast pozostała jedna czwarta zawiera sfingolipidy/lizofosfatydylocholinę (13%) i fosfatydylocholinę (10%). W przeciwień stwie do tego 44% lipidów trzustkowych są to wolne kwasy tłuszczowe, a głównymi fosfolipidami są fosfatydylocholina (21%) i fosfatydyloetanoloamina (15%). W ekstrakcie trzustkowym nie wykryto triglicerydu.

T a b e l a 3

Udział kategorii lipidowych w olejach z tłuszczu, wątroby, mięśni i trzustki

Kategoria lipidowa	Tłuszcz	Wątroba	Mięsień	Trzustka
Całkowite obojętne lipidy	100,1	52,8	77,2	58,4
Ester cholesterylowy	0,4	5,7	1,0	5,3
Triglicerydy	98,6	12,4	66,6	0
Wolne kwasy tłuszczowe	0,7	31,8	7,1	43,8
Mono- i Diglicerydy	0,4	2,8	2,7	9,3
Całkowite fosfolipidy	0	47,2	22,5	41,6
Kwas fosfatydowy	0	1,3	0	0
Fosfatydyloetanoloamina	0	16,7	0	14,6
Fosfastydylocholina	0	22,6	9,5	21,4
Sfingolipidy/lizofosfatydylocholina	0	4,6	12,9	5,7

Tabela 4 przedstawia wybrane fizyczne i chemiczne własności tranu i oleju mięśniowego. Liczba zmydlenia i liczba jodowa sugerują, że lipidy obu tkanek zawierają kwasy tłuszczowe o krótkich

PL 199 081 B1 łańcuchach i duże ilości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. W nienasyconych kwasach tłuszczowych z tłuszczu tworzy się mniej grup nadtlenkowych niż w kwasach wyekstrahowanych z mięśni. Olej mięśniowy zawiera 0,84% substancji lotnej i wilgoć. W przeciwieństwie do tego w tranie nie można było wykryć wilgoci ani substancji lotnej. Rzeczywiście poddanie działaniu temperatury 125°C łatwo utleniało tran. Skład kwasów tłuszczowych obu tkanek przedstawia Tabela 5. Oba typy olei mają wysokie proporcje kwasów tłuszczowych 20:5 i 22:6 (cecha charakterystyczna olei morskich).

T a b e l a 4

Fizyczne i chemiczne własności tranu i oleju mięśniowego

	Tran	Olej mięśniowy
Liczba jodowa	164	122
Liczba nadtlenkowa	2,6	14
Liczba zmydlenia	191	199
Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych	1%	6,6%
Wilgoć i substancje lotne	<0,05%	0,84%
Współczynnik załamania (24°C)	1,4765	1,4789

T a b e l a 5

Skład głównych kwasów tłuszczowych (mg/100 mg) tranu i oleju mięśniowego

Kwas tłuszczowy	Tłuszcz	Mięsień Frakcja 1	Mięsień Frakcja 2
14:0	5,5	5,2	0,7
16:0	12,7	19,5	27,2
18:0	1,1	3,3	8,1
nasycony	21,9	29,1	36,1
16:1n-7	22,2	17,0	3,6
18:1n-9	13,1	16,7	23,4
jednonienasycony	53,3	48,8	36,2
18:2n-6	0,9	1,2	2,0
20:4n-6	0,3	1,0	3,9
n-6 wielonienasycone kwasy tłuszczowe	1,5	2,5	6,1
18:3n-3	0,4	0,3	0,1
20:4n-3	0,2	0,3	1,5
20:5n-3	11,2	9,7	12,0
22:5n-3	3,3	2,6	1,5
22:6n-3	8,2	6,9	6,5
n-3 wielonienasycone	23,2	19,7	21,7
kwasy tłuszczowe

Pozostałości proteinowe otrzymane po ekstrakcji lipidów mogą być użyteczne jako źródło enzymów i protein. Dla sprawdzenia tego określono skład aminokwasowy protein mięśniowych i aktywności proteolityczną i amylolityczną pozostałości proteinowych. Tabela 6 wskazuje na to, że w proteinach mięśniowych są obecne wszystkie podstawowe aminokwasy. Jednakże jedynie 10% protein mięśniowych rozpuszcza się w wodzie. Rysunki 1 do 4 wykazują, że proteinowe ekstrakty trzustki hamują pewne aktywności proteolityczne, ale żadne proteinowe ekstrakty mięśni i wątroby nie wykazały znaczącej aktywności.

PL 199 081 B1

T a b e l a 6a

Skład aminokwasowy protein mięśni

Alanina	0,66	Izoleucyna	8,25	Treonina	0,44
Arginina	15,00	Leucyna	7,84	Tryptofan	0,44
Asparginian	14,64	Lizyna	1,18	Tyrozyna	6,23
Cysteina	3,61	Metionina	1,95	Walina	7,12
Glutaminowy	3,05	Fenyloalanina	1,21	Glicyna	0,62
Prolina	5,91	Histydyna	5,68	Seryna	6,59

T a b e l a 6b

Zestawienie bilansowe izolatu proteinowego

Proteiny	80,6% (94,5% w przeliczeniu na suchą masę)
Popioły	5,2%
Woda	14,7%

Minerały %

Wapń	4,4 mg
Sód	116 mg
Potas	708 mg
Rtęć	<0,02 mg
Kadm	<0,01 mg

Tabela 7 wskazuje na to, że trzustka hamuje jedynie słabe właściwości amylolityczne, a wiec nie jest dobrą tkanką do oczyszczania amylazy. Tym niemniej tabela wykazuje, że tkankę ssaka morskiego można stosować jako źródło protein (poza olejem bogatym w omega-3), które zachowują działanie enzymatyczne. Oczywiście osoba posiadająca zwykłe doświadczenie mogłaby stosować trzustkę foki (lub inny narząd) jako źródło protein, o którym mowa w niniejszym tekście.

T a b e l a 7

Aktywność amylolityczna proteinowych ekstraktów trzustki

Tkanka	Aktywność ^mole/min/mg)
Proteinowy ekstrakt trzustki	1,2
Zamrożona trzustka	1,2

Niniejszy wynalazek ilustrują bardziej szczegółowo następujące nieograniczające przykłady.

P r z y k ł a d 1

Ekstrakcja z tłuszczu foki

Podskórną tkankę tłuszczową (tłuszcz) obkrojono z zanieczyszczających rozciętych tkanek. Próbki tłuszczu zamrożone w -20°C zmielono natychmiast w wilku do mięsa w 4°C i olej wytłaczano z tkanek tłuszczowych stosując ciśnienie mechaniczne. Po odwirowaniu z zastosowaniem 4000 obrotów/minutę w ciągu 15 minut uzyskano tran i zważono go razem z pozostałością w celu oszacowania względnego procentowego uzysku każdej frakcji.

P r z y k ł a d 2

Ekstrakcja z mięśniowych tkanek foki

Mięśnie tkankowe obkrojono z widocznych tkanek niemięśniowych. Próbki tkanek mięśniowych zmielono w wilku do mięsa i mieszano w mieszalniku w ciągu 2 minut przy dużej szybkości, z zimnym (-20°C) acetonem, w stosunku 5 obję tości acetonu na g tkanki. Po starannym mieszaniu lipidy ekstrahowano w acetonie mieszając w różnych okresach czasu w 4°C. W podanych czasach z mieszaniny oddzielono rozpuszczalnik przez filtrowanie. Odfiltrowany rozpuszczalnik odzyskano, a fazę stałą przemyto ponownie w zimnym (-20°C) acetonie jak przedstawiono powyżej. Dwie frakcje

PL 199 081 B1 rozpuszczalnikowe połączono, a wyekstrahowane lipidy uzyskano przez odparowanie w przyrządzie Rotavapor™. Frakcje lipidowe rozpuszczono w 100 ml octanu etylu i uzyskano po całonocnej dekantacji (lipidy tkankowe). Pozostały materiał suszono na powietrzu przez całą noc w temperaturze pokojowej, zważono, sproszkowano (izolat proteinowy) i trzymano zamrożony w (-20°C) w celu przeprowadzenia dalszej analizy enzymów.

P r z y k ł a d 3

Ekstrakcja z trzustkowych i wątrobowych tkanek foki

Próbki tkankowe zmielono i wyekstrahowano tak jak podano dla tkanek mięśniowych, z tym wyjątkiem, że otrzymanej frakcji lipidowej nie rozpuszczono w octanie etylu. Pozostały ekstrakt suszono na powietrzu przez całą noc, następnie sproszkowano i trzymano zamrożony w (-20°C) w celu przeprowadzenia dalszej analizy enzymów.

P r z y k ł a d 4

Porównanie wydajności ekstrakcji sposobu Folcha i sposobu według niniejszego wynalazku

W celu porównania wydajności procesu ekstrakcyjnego do tkanki mięśniowej zastosowano klasyczną metodę (Folch et al. 1957) z zastosowaniem chloroformu i metanolu. Metoda ta jest standardowym sposobem mierzenia wydajności procesu ekstrakcyjnego. Uzyskanie lipidów oszacowano przez zawieszenie frakcji lipidowych w małych ilościach ich początkowych rozpuszczalników i zmierzenie za pomocą grawimetrii, małych jednakowych objętości roztworu po odparowaniu.

P r z y k ł a d 5

Analiza składu lipidowego

Aby dokonać analizy składu lipidowego znane ilości każdego ekstraktu ładuje się na płytki silikażelowe i frakcjonuje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej TLC (Bowyer et al. 1962) z zastosowaniem następujących rozpuszczalników: lipidy obojętne: heksan, eter etylowy, kwas octowy (90:10:1, objętość/objętość) i fosfolipidy: chloroform, metanol, woda, kwas octowy (80:25:2:2, objętość/objętość). Skład kwasów tłuszczowych w tranie i oleju mięśniowym poddano analizie za pomocą chromatografii w układzie gaz-ciecz GLC (Bowyer et al. 1962) z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, inkubacja dwugodzinna w 65°C zamiast jednogodzinnej w 80°C, trzy przemywania za pomocą heksanu zamiast dwóch oraz nie przemywano za pomocą wody. (Beaudoin et al. 1970).

Aby pozbyć się śladów rozpuszczalników organicznych i materiału lotnego frakcje lipidowe ogrzewano do 125°C w ciągu około 15 minut w atmosferze gazu obojętnego.

Lipidowe ekstrakty tłuszczu i mięśni scharakteryzowano za pomocą: (1) liczby jodowej zgodnie z Nagendrappa et al. (1998); (2) liczby nadtlenkowej i liczby zmydlenia, składu kwasów tłuszczowych, wilgoci i substancji lotnej oraz współczynnika załamania zgodnie z American Oil Chemist's Society (AOCS); (3) wolnych kwasów tłuszczowych zgodnie z He et al. (1999) po oddzieleniu kwasów tłuszczowych przez TLC.

P r z y k ł a d 6

Analiza składu proteinowego

Ilość protein w tkankach mięśniowych oszacowano za pomocą klasycznego sposobu Kjeldahla. Zawartość mineralną oszacowano za pomocą spektrofotometrii atomowej według znanych sposobów.

Aktywności proteolityczne zmierzono przez wydzielenie grup aminowych za pomocą analizy spektrofotometrycznej stosując jako odczynnik aldehyd ftalowy. Jeden procent homogenatów ekstraktów tkankowych w 50 Mm buforu fosforanu potasu, pH 7,0, inkubowano w 37°C w obecności i przy braku trypsyny. W podanych czasach dodano kwas trichlorooctowy, a ilość grup aminowych zmierzono w sklarowanej cieczy nad roztworem według sposobu Churcha et al. (1983, J Dairy Sci 66: 1219 -1227), z wyjątkiem tego, że badanie przeprowadzono na mikropłytkach.

Aktywności amylolityczne określono według sposobu Bernfelda (1951).

Wnioski

Przedstawiono zatem prosty i opłacalny sposób otrzymywania oleju ze ssaków morskich, bogatego w kwasy tłuszczowe omega-3, który można następnie stosować w różnego rodzaju kompozycjach, takich jak dodatki spożywcze w celu zapobiegania różnym rodzajom schorzeń lub zaburzeń lub w celu leczenia ich. Różne ssaki morskie można wykorzystywać jako materiał wyjściowy do oczyszczania oleju. W korzystnym przykładzie wykonania ssakiem morskim jest foka. Poza tym, że ma ona duże stężenie kwasów tłuszczowych omega-3 korzystne jest również to, że foka jest zwierzęciem, które obecnie łowi się wyłącznie dla futra. Wiele tkanek foki zatem marnuje się. Niniejszy

PL 199 081 B1 wynalazek przedstawia zatem środki przetwarzania tych tkanek, które często wyrzuca się, na produkty o zwiększonej wartości, które mogą być korzystne, szczególnie dla ludzi. Korzystne tkanki stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku obejmują tłuszcz, mięśnie i każdy pożądany narząd wykazujący proteiny, a bardziej szczegółowo proteiny, które hamują pożądane działanie enzymatyczne. Przykład takich organów obejmuje, nieograniczając się do nich, wątrobę i trzustkę. W następnym przykładzie wykonania przedstawiono drugi etap, który umożliwia oczyszczanie frakcji proteinowej, która jest zasadniczo czysta, i która może służyć jako pasza zwierzęca dla ryb, ptaków, ssaków i tym podobnych.

Chociaż niniejszy wynalazek przedstawiono powyżej za pomocą korzystnych przykładów wykonania, można go modyfikować bez odchodzenia od charakteru i istoty przedmiotowego wynalazku zdefiniowanego w załączonych zastrzeżeniach.

Odniośniki literaturowe

Beaudoin, A.B., 1970, Metabolisme des lipides au cours du developpement du Tripolium confusum Duval (coleoptere, Tenebrionidae), Praca doktorska, Laval University.

Bernfeld P., 1951, Advances in Enzymol. 12:379.

Bowyer et al., 1962, BBA 70:423-431.

Church et al., 1983, J. Dairy Sci. 66:1219-1227.

Folch et al., 1957, J. Biol. Chem. 226:497-509.

Nagendrappa et al., 1998, JAOCS 75:1219-1221.

Claims (17)

1. Sposób ekstrakcji protein z tkanki ssaka morskiego, znamienny tym, że

a) proteiny strąca się z zastosowaniem przynajmniej jednego rozpuszczalnika organicznego;

b) odzyskuje się lipidy w fazie ciekłej z etapu a) przez odparowanie przynajmniej jednego rozpuszczalnika organicznego, oraz

c) odzyskuje się zasadniczo czyste i pozbawione znaczących ilości metali ciężkich lub pestycydów proteiny z osadu otrzymanego w etapie a).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jeden rozpuszczalnik organiczny wybiera się z grupy obejmującej aceton, alkohol, etanol i octan etylu lub stosuje się kombinację przynajmniej dwóch wymienionych rozpuszczalników organicznych.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że alkohol wybiera się z grupy obejmującej etanol, izopropanol i propanol.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się etanol.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się aceton.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się kombinację acetonu i etanolu.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik stosuje się kombinację acetonu i octanu etylu.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymuje się proteiny, które zachowują pewną aktywność enzymatyczną.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przynajmniej jeden rozpuszczalnik organiczny stosuje się rozpuszczalnik organiczny nietoksyczny dla zwierząt.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssak morski jest wybrany z grupy obejmującej walenie, foki i morsy.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że ssakiem morskim jest foka.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako tkankę ssaka morskiego stosuje się tkankę nietłuszczową.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tkankę ssaka morskiego stanowi trzustka.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tkankę ssaka morskiego stanowi wątroba.

PL 199 081 B1

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tkankę ssaka morskiego stanowi tkanka mięśniowa.

16. Kompozycja suplementu diety zawierająca odpowiedni nośnik, znamienna tym, że zawiera proteiny ze ssaka morskiego uzyskane sposobem określonym w zastrz. 1.

17. Zastosowanie protein ze ssaka morskiego uzyskanych sposobem określonym w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji suplementu diety.