PL194123B1 - Atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria, plazmid oraz wektor i szczepionkają zawierające - Google Patents
Atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria, plazmid oraz wektor i szczepionkają zawierająceInfo
- Publication number
- PL194123B1 PL194123B1 PL98341530A PL34153098A PL194123B1 PL 194123 B1 PL194123 B1 PL 194123B1 PL 98341530 A PL98341530 A PL 98341530A PL 34153098 A PL34153098 A PL 34153098A PL 194123 B1 PL194123 B1 PL 194123B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- promoter
- cells
- plasmid
- bacterium
- host
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 109
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 108
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims description 32
- 241000186781 Listeria Species 0.000 title claims description 21
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title description 56
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 title 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 141
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 98
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 19
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims description 18
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 18
- 101100215631 Listeria phage A118 ply gene Proteins 0.000 claims description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 6
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 4
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims 1
- BUDBHJPMAKXMLD-UHFFFAOYSA-N ethyl 6-methyl-2-phenylquinoline-4-carboxylate Chemical compound N=1C2=CC=C(C)C=C2C(C(=O)OCC)=CC=1C1=CC=CC=C1 BUDBHJPMAKXMLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 21
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 27
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 26
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 26
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 22
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 8
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 7
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 6
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 6
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 101150050662 plcB gene Proteins 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000092431 Listeria monocytogenes EGD Species 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 3
- 101150100002 iap gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- -1 G-MCSF Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 101100452614 Listeria monocytogenes serotype 1/2a (strain EGD / Mackaness) inlC gene Proteins 0.000 description 2
- 241000123765 Listeria phage A118 Species 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 2
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000004429 Bacillary Dysentery Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102100036486 Cobalamin binding intrinsic factor Human genes 0.000 description 1
- 101710123904 Cobalamin binding intrinsic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 101710148896 Internalin A Proteins 0.000 description 1
- 101710148893 Internalin B Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000186806 Listeria grayi Species 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100022399 Ribosome biogenesis protein NOP53 Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 206010040550 Shigella infections Diseases 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002642 cobra venom Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 101150093386 prfA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 201000005113 shigellosis Diseases 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Atenuowana inwazyjna bakteria wewnatrzkomórkowa rodzaju Listeria zdolna do infekowania ssaczego gospodarza lub komórek wymienionego gospodarza, wykazujaca obnizona zdolnosc do ruchu wewnatrz- i miedzykomórkowego w wymienionym gospodarzu w porównaniu z bakteria szcze- pu dzikiego, stransformowana: (a) promotorem aktywowanym, gdy wymieniona bakteria obecna jest w cytoplazmie komórki gospodarza, przylaczonym w sposób umozliwiajacy dzialanie do genu strukturalnego lub fragmentu wymienionego genu kodujacego polipeptyd letalny dla bakterii, oraz (b) promotorem zgodnym z komórka gospodarza, przylaczonym w sposób umozliwiajacy dzia- lanie do genu strukturalnego lub fragmentu wspomnianego genu, kodujacego polipeptyd wykazujacy dzialanie lecznicze i/lub profilaktyczne. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria zdolna do zainfekowania ssaczego gospodarza, plazmid, wektor transformujący ssacze komórki gospodarza zawierający wymienioną bakterię, oraz szczepionka.
Wynalazek dostarcza sposobu wprowadzania sekwencji DNA i RNA do komórki ssaczej w celu uzyskania kontrolowanej ekspresji polipeptydu. Jest zatem użyteczny w terapii genowej, i dowolnym leczeniu, w którym polipeptyd należy dostarczyć do gospodarza lub komórek wymienionego gospodarza, jak również do wytwarzania polipeptydów w komórkach ssaczych np. w kulturze lub zwierzętach transgenicznych.
Terapia genowa jest zespołem sposobów leczenia chorób człowieka, opartym na przeniesieniu materiału genetycznego (DNA/RNA) do organizmu pacjenta. Gen można dostarczyć albo poprzez bezpośrednie wprowadzenie wirusa zawierającego gen lub DNA do krwi lub tkanki, lub pośrednio poprzez wprowadzenie komórek zmienionych laboratoryjnie tak, że niosą one obcy DNA (patrz np. Patent USA Nr 5,399,346). Ogromne, potencjalne możliwości terapii genowej hamowane są przez niską wydajność transferu gen. G.Parmiani, F.Arienti, J.Sule-Suso, C.Melani, PM Colombo, V.Ramakrishna, F.Belli, L.Mascheroni, L.Rivoltini i N.Cascinelli - Cytokine-based gene therapy of human tumors. An Overview. Discussion of Experimental Oncology D, Istituto Nazionale Tumori, Milano, Ltaly Folia Biol (Praha) 42: 305-9 (1996); P.Hess - Gene therapy: a review.American Association of Clinical Chemistry, Laboratory Corporation of America, Louisville, Kentucky, 40213, USA, Clin Lab Med 16: 197-211 (1996); i N.Miller, R.Vile - Targeted vectors for gene therapy, Laboratory of Cancer Gene Therapy, Rayne Institute, St Thomas' Hospital, London, United Kingdom, FASEB J 9: 190-9 (1995).
Zastosowanie kliniczne terapii genowej, jak również wykorzystanie zrekombinowanych wektorów retrowirusowych opóźniono ze względów bezpieczeństwa. Integracja egzogennego DNA z genomem komórki może spowodować uszkodzenie DNA i możliwe zmiany genetyczne w komórkach akceptora, predysponujące je do nowotworzenia. Sposoby umożliwiające uniknięcie tych potencjalnych problemów byłyby wysoce korzystne we wprowadzaniu bezpiecznej i efektywnej terapii genowej.
Szczepienie immunogennymi białkami wyeliminowało lub zmniejszyło występowanie wielu chorób; istnieją jednak nadal zasadnicze trudności w stosowaniu jako immunogenów białek związanych z innymi patogenami i stanami chorobowymi. Wiele białkowych antygenów nie jest zasadniczo immunogennych. Częściej nie są one efektywne jako szczepionki, ze względu na sposób działania systemu odpornościowego.
System odpornościowy ssaków obejmuje kilkanaście wzajemnie zależnych składników. Najlepiej scharakteryzowane i najważniejsze to części humoralna i komórkowa. Odporność humoralna obejmuje przeciwciała, białka wydzielane przez organizm, rozpoznające bezpośrednio antygeny. System odporności komórkowej opiera się na specjalnych komórkach, rozpoznających i zabijających inne komórki, które produkują obce antygeny. Podstawowy, funkcjonalny podział na wspomniane dwa systemy oddaje dwie różne strategie obrony organizmu. Odporność humoralna skierowana jest zasadniczo przeciw antygenom egzogennym dla organizmu zwierzęcia, podczas gdy odporność komórkowa odpowiada zasadniczo na stymulacje przez antygeny syntetyzowane aktywnie w komórkach zwierzęcia.
Przeciwciała są czynnikami efektorowymi odporności humoralnej i są one wydzielane przez komórki B, w odpowiedzi na stymulację antygenową. Przeciwciała mogą wiązać się i inaktywować antygen bezpośrednio (przeciwciała neutralizujące) lub mogą aktywować inne komórki systemu immunologicznego, które niszczą antygen.
Rozpoznawanie antygenów w ramach odporności komórkowej wymaga pośrednictwa specjalnej klasy komórek limfoidalnych: cytotoksycznych komórek T. Komórki te nie rozpoznają całego antygenu, lecz odpowiadają na zdegradowane fragmenty antygenów, pojawiające się na powierzchni komórek docelowych i związane z białkami kompleksu zgodności tkankowej typu I (MHC). Zasadniczo, wszystkie jądrzaste komórki posiadają cząsteczki klasy Ina swej powierzchni. Przyjmuje się, że białka produkowane w obrębie komórki ulegają stałej degradacji do peptydów w trakcie naturalnych procesów metabolicznych. Fragmenty te są wiązane z cząsteczkami MHC i transportowane do powierzchni komórki. Zatem, system odporności komórkowej stale nadzoruje zakres białek wytwarzanych w komórkach organizmu i nakierowany jest na eliminowanie wszystkich komórek wytwarzających obce antygeny.
PL 194 123 B1
Dużą grupę schorzeń można leczyć poprzez podanie terapeutycznych i/lub profilaktycznych polipeptydów. Polipeptydy takie obejmują np. limfokiny, takie jak interleukiny, czynnik nekrozy nowotworów (TNF), interferony; czynniki wzrostowe, takie jak czynnik wzrostu nerwów (NGF) i ludzki hormon wzrostu; komórkowy aktywator plazminogenu, czynnik VIIIC; czynnik stymulujący powstawanie kolonii granulocytów/makrofagów (G-MCSF); erytropoetynę; insulinę; kalcytoninę; kinazę tymidynową (TK) i podobne. Ponadto, lecznicze działanie może mieć selektywne dostarczanie toksycznych peptydów (takich jak rycyna, toksyna błonicy, toksyna kobry) komórkom chorym lub nowotworowym.
Szczepienie poprzez domięśniowe podawanie DNA kodującego antygen jest obiecującym sposobem leczenia (JJ Donnelly, JB Ulmer, MA Liu J Immunol Methods 176, 145 (1994); RM Conry i wsp Cancer Res 54, 1164 (1994); CH Hsu i wsp Nature Med 2, 540 (1996); RE Tascon i wsp Nature Med 2, 888 (1996), jednak sposób w jaki dokonuje się odpowiedź immunologiczna nie jest w pełni zrozumiały; przyjmuje się, iż to raczej komórki prezentujące antygen ze szpiku (APC), niż komórki mięśniowe indukują odpowiedź immunologiczną po ich migracji do śledziony (M Corr i wsp J Exp Med 184, 1555 (1996)). Domięśniowe wstrzyknięcie czystego plazmidowego DNA nadal stwarza wiele problemów: (i) wydajność pobierania DNA wydaje się niska i zależna od dawki, co oznacza, iż należy podać duże ilości plazmidowego DNA w celu wywołania ochronnej odpowiedzi immunologicznej (RR Deck i wsp., Vaccine 15, 71 (1997). Może to powodować szkodliwe efekty uboczne, np. poprzez stymulowanie odpowiedzi wobec bakteryjnych sekwencji DNA (DS Pisetski, J. Immunol 156, 421 (1996). (ii) domięśniowe wstrzyknięcie DNA nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej na odległych powierzchniach błon śluzowych (RR Deck i wsp., Vaccine 15, 71 (1997). (iii) w obrębie tkanki mięśniowej znajduje się stosunkowo niewiele komórek prezentujących antygen (APC), a zatem ochrona przed czynnikami infekcyjnymi po domięśniowym wstrzyknięciu plazmidowego DNA może być możliwa jedynie po podaniu bardzo aktywnych antygenów. Korzystne jest zatem podawanie DNA kodującego antygen bezpośrednio do komórek APC śledziony.
Ostatnio zastosowano atenuowany szczep Shigella flexneri (DR Siezemore, AA Branstrom, JC Sadoff, Science 270, 299 (1995) oraz inwazyjny szczep Escherichia coli (P Courvalin, S Gousard, C Grillot-Courvain, Life Sciences 318, 1207 (1995) dla dostarczenia plazmidu do kultury komórek ssaczych (świnki morskiej i myszy). Shigella flexneri i E.coli to bakterie Gram ujemne, posiadające otoczkę lipopolisacharydową (LPS) i wykazujące silną endotoksyczną odpowiedź w ssaków. Ponadto, bakterie te są użyteczne przy wprowadzaniu leczniczych cząsteczek jedynie do niektórych rodzajów komórek np. enterocytów (PJ Sansonetti, Pathogenesis of shigellosis. Curr Top Microbiol Immunol 180, 1-143 (1992).
Zatem, potrzeba nowych technik, by rozwiązać wspomniane wyżej problemy związane z uodparnianiem, terapią genową i dostarczaniem leczniczych polipeptydów do komórek, zarówno ex vivo, jak in vivo.
Atenuowana, inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria według wynalazku, zdolna do infekowania ssaczego gospodarza lub jego komórki, o zmniejszonej zdolności do ruchu wewnątrz- i międzykomórkowego w wymienionym gospodarzu, w porównaniu do bakterii szczepu dzikiego, jest stransformowana (a) promotorem aktywowanym w momencie gdy wymieniona bakteria obecna jest w cytoplazmie komórki gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub jego fragmentu kodującego polipeptyd letalny dla bakterii, oraz (b) promotorem zgodnym z komórką gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub jego fragmentu, kodującego polipeptyd wykazujący działanie lecznicze i/lub profilaktyczne, np. takie jak antygen, przy czym (a) i (b) mogą znajdować się na tym samym plazmidzie lub na różnych plazmidach lub (a) może być zintegrowany z chromosomem bakterii i (b) znajdować się w plazmidzie.
Korzystnie, bakteria należy do rodzaju Listeria monocytogenes, i korzystnie nie posiada operonu lecytynazy.
Korzystnie, polipeptyd będący letalnym dla bakterii jest lizyną bakteriofagową, promotor (a) jest promotorem PactA z Listeria, a promotor zgodny z komórką gospodarza (b) jest promotorem PCMV.
Polipeptyd będący letalnym dla bakterii może korzystnie powodować autolizę bakterii w cytoplazmie komórki gospodarza i może być produktem genu ply118.
Przedmiotem wynalazku jest także plazmid zawierający (a) promotor aktywowany, gdy jest obecny w inwazyjnej bakterii, która jest w cytoplazmie komórki ssaczego gospodarza, przyłączony w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego kodującego białko letalne dla bakterii, za4
PL 194 123 B1 wierający ponadto (b) promotor zgodny z komórką gospodarza, przyłączony w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego kodującego białko wykazujące działanie lecznicze i/lub profilaktyczne.
Korzystnie, w plazmidzie według wynalazku białko (b) wykazujące działanie lecznicze i/lub profilaktyczne może być antygenem, a białko (a) będące letalnym dla bakterii może być lizyną bakteriofagową.
Korzystnie, w plazmidzie promotor (a) jest promotorem PactA z Listeria, a promotor zgodny z komórką gospodarza (b) jest promotorem PCMV.
W korzystnym wykonaniu plazmidu białko (a) będące letalnym dla bakterii powoduje autolizę bakterii w cytoplazmie komórki gospodarza.
Wektor według wynalazku, transformujący ssacze komórki gospodarza in vivo lub in vitro, obejmuje atenuowaną wewnątrzkomórkową inwazyjną bakterię rodzaju Listeria zdolną do infekowania ssaczego gospodarza lub komórek wymienionego gospodarza, wykazującą obniżoną zdolność do ruchu wewnątrz- i międzykomórkowego w gospodarzu w porównaniu z bakterią szczepu dzikiego, stransformowaną:
(a) promotorem aktywowanym, gdy bakteria obecna jest w cytoplazmie komórki gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wymienionego genu kodującego polipeptyd letalny dla bakterii, oraz (b) promotorem zgodnym z komórką gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wspomnianego genu, kodującego polipeptyd wykazujący działanie lecznicze i/lub profilaktyczne.
Gen strukturalny (b) wektora kodować może antygen lub środek leczniczy, lub zdolny do sekrecji produkt białkowy.
Szczepionka według wynalazku zawiera wymienioną powyżej atenuowaną inwazyjną bakterię wewnątrzkomórkową do zastosowania jako lek. Szczepionka przedostaje się do monocytów ssaka, którymi są dojrzałe komórki prezentujące antygen (APC).
W szczepionce białko antygenu kodowane przez (b) ulega ekspresji i jest prezentowane przez komórki APC i w ten sposób wywołuje odpowiedź immunologiczną. Komórki ssaka zainfekowane bakterią niosącą szczepionkę są usuwane przez komórkowy układ odpornościowy pacjenta po prezentacji antygenu.
Szczepionka według wynalazku charakteryzuje się korzystnie tym, że jest podawana pacjentowi doustnie.
Przez termin atenuowana bakteria inwazyjna rozumie się np. bakterię która nadal może infekować gospodarza lub jego komórkę, lecz która nie jest patogenna. Atenuację można wykonać rutynowo np. poprzez mutagenezę. patrz np. (T Maniatis i wsp Molecular Cloning: A laboratory manual, wyd. 2 CSH, New York, 1989). na przykład atenuację można wykonać powodując mutację genów bakteryjnych kodujących patogenne lub toksyczne polipeptydy. Mutagenezę taką można prowadzić w sposób przypadkowy np. poprzez modyfikację chemiczną i selekcję cech np. utraty funkcji, lub może to być mutageneza kierowana np. poprzez delecje, insercje lub mutacje punktowe, w celu wyeliminowania funkcji niektórych genów kodujących polipeptydy związane z patogennością. Na przykład przez delecje całego operonu w wyniku delecji chromosomalnej np. szczep atenuowany D2 Listeria monocytogenes pochodzący z w pełni wirulentnego szczepu dzikiego EGD, nie posiadający pełnego operonu lecytynazy (składającego się z genów mpl, actA i plcB). W wyniku delecji chromosomalnej wymienionego operonu odpowiedź zapalna wywoływana przez Listeria monocytogenes w czasie infekcji ssaczego gospodarza zostaje znamiennie zmniejszona.
Atenuowana bakteria jest zmutowaną formą dzikiego szczepu Listeria, atakującą komórkę gospodarza i uwalnianą do cytoplazmy komórki zainfekowanej z podobną wydajnością co szczep dziki, jednak defektywną pod względem zdolności ruchu wewnątrz- i międzykomórkowego, tj. zmutowany szczep Listeria monocytogenes D2 nie jest zdolny do polimeryzowania aktyny gospodarza w cytoplazmie, które to zjawisko wykorzystuje szczep dziki do poruszania się wewnątrz komórki gospodarza. Ponadto ze względu na delecje genu plcB bakteria nie jest zdolna do lizowania błon komórkowych gospodarza, co umożliwia szczepowi dzikiemu zakażanie kolejnych komórek. Zmutowana bakteria jest zatem niezdolna do poruszania się między komórkami organizmu gospodarza. Ilustruje to zmniejszona zdolność (np. w porównaniu ze szczepem dzikim) do ruchu wewnątrz- i międzykomórkowego.
W korzystnym zastosowaniu atenuowana bakteria jest zmutowanym szczepem L. monocytogenes atakującą gospodarza i uwalnianą do cytoplazmy zainfekowanych komórek z wydajnością porównywalną do tej wykazywanej przez szczep dziki, lecz nie jest patogenna, to znaczy nie powoduje choPL 194 123 B1 roby. W bardziej korzystnym zastosowaniu zmutowana bakteria jest bakterią L. monocytogenes i pozbawiona jest całego operonu lecytynazy, obejmującego geny mpl, actA i plcB.
L. monocytogenes zdolna jest do infekowania wielu rodzajów komórek, szczególnie w hodowlach in vitro (M Kuhn, W Goebel Genetic engineering. vol. 17 ed. JK Setlow Plenum Press, New York, 1995). Ssaczym gospodarzem może być człowiek, pies, kot, krowa, owca lub świnia, i podobni gospodarze.
Gen strukturalny lub jego fragment kodujący polipeptyd letalny wobec komórki bakterii jest dowolnym polipeptydem, który, gdy ulega ekspresji w komórce bakterii, powoduje uwolnienie plazmidowego DNA i śmierć wymienionej bakterii np. w wyniku lizy bakterii. Taki polipeptyd może np. powodować autolizę komórki bakterii w cytoplazmie komórki gospodarza. Polipeptyd może być lizyną pochodzącą z bakteriofaga, korzystnie produktem genu ply118, lub inną lizyną kodowaną przez fagi infekujące Listeria np. hydrolazą mureiny kodowaną przez gen iap z L. monocytogenes lub inne geny zbliżone do iap, takiej jak szczególnie iap z L. grayi. Białko lizujące PLY118 jest późnym produktem bakteriofaga A118 infekującego Listeria, niezbędnym do uwalniania fagów potomnych. PLY118 jest białkiem wysoce aktywnym, enzymem hydrolizującym ścianę komórkową, specyficznym względem Listeria (MJ Loessner, G. Wendliner, S Scherer Mol Microbiol 16, 1231 (1995)).
Poprzez promotor aktywny wtedy, gdy infekująca bakteria obecna jest wewnątrz komórki gospodarza, rozumie się dowolny promotor, który włączany jest preferencyjnie wtedy, gdy bakteria znajdzie się wewnątrz komórki gospodarza i jest aktywny transkrypcyjnie. Na przykład można zastosować promotor PactA Listeria monocytogenes. promotor PactA kontroluje transkrypcję aktywatora PrfA, regulującego większość znanych genów L. monocytogenes i ulega specyficznej aktywacji w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Inne promotory, które zgodnie z wynalazkiem można zastosować obejmują np. inne promotory L. monocytogenes, takie jak kontrolujący ekspresję inlC i inne geny małych internalin (F Engelbrecht, SK Chun, C Ochs, J Hess, F Lottspeich, W Goebel, Z Sokolovic Mol Microbiol 21: 823-837 (1996); F Engelbrecht, C Dickneite, R Lampidis, M Goetz, U DasGupta, W Goebel - Sequence comparision of the chromosomal regions carrying internalin gene C (inlC) of Listeria monocytogenes i Listeria ianovii, w druku (1998)).
W kolejnym preferowanym zastosowaniu atenuowana bakteria zakaźna to L. monocytogenes i promotor aktywowany, wtedy, gdy bakteria znajdzie się wewnątrz komórki gospodarza to promotor PactA przyłączony w sposób umożliwiający działanie do genu ply118, kodującego białko lizyny PLY118.
Wynalazek dostarcza również szczepionki i/lub terapii genowej, w której gen kodujący pożądany polipeptyd np. antygen przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie do promotora aktywnego w komórce gospodarza, i obecny jest w bakterii. Według wynalazku zastosować można zarówno ekspresyjne cząsteczki DNA i mRNA, jak również nie ulegające ekspresji cząsteczki DNA i RNA np. antysensowne oligodeoksynukleotydy (ODN) lub rybozymy (RW Wagner Nature 372, 333 (1994), A Craig, D Vanstone, S Agrawal Exp Opin Ther Patents 7, 1175 (1997).
Promotor zgodny z komórką gospodarza według wynalazku tonp. dowolny promotor lub promotor/enhancer zdolny do inicjowania wystarczających poziomów transkrypcji homologicznego lub heterologicznego genu lub jego fragmentu, przyłączonego w sposób umożliwiający działanie do wspomnianego promotora, w wymienionej komórce gospodarza. Dowolny promotor lub promotor/enhancer wywołujący ekspresję polipeptydu użytecznego według wynalazku np. zdolnego wywołać efekt profilaktyczny i/lub leczniczy i/lub wywołać odpowiedź immunologiczną. Niektóre przykłady komórek ssaczych które można zastosować według wynalazku obejmują komórki nabłonkowe, fibroblasty, komórki dendrytyczne, i makrofagi z wspomnianymi promotorami, takimi jak np. promotor/enhancer wczesnego genu 1 z cytomegalowirusa (CMV) lub LTR z Rous Sarcoma Virus (RSV) lub promotor wirusa SV40 lub główny późny promotor adenowirusa 2 lub promotor Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV). Promotory wirusowe są zazwyczaj silniejsze niż promotory genów gospodarczych i wykazano, iż powodują ekspresję większych ilości genów reporterowych in vivo po wstrzyknięciu do mięśni myszy (M Manthrope, F Cornefert-Jensen, J Hartikka, A Runmdell, M Margalith, V Dwarrki - Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum Gen Ther 4: 419-431 (1993).
Promotory inne niż wirusowe to np. promotory komórkowych genów gospodarczych, albuminy, aktyny lub promotory konstytutywne. Silne promotory są korzystne dla osiągania wysokich poziomów ekspresji. W kolejnym zastosowaniu wynalazku można stosować promotor indukcyjny np. promotor indukowany przez leki, taki jak promotory indukowane przez hormony czy metale.
PL 194 123 B1
Zgodnie z wynalazkiem promotor zgodny z komórką gospodarza przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub jego fragmentu kodującego polipeptyd, mogący być użytecznym antygenem i/lub czynnikiem terapeutycznym i/lub profilaktycznym.
Antygen według wynalazku jest cząsteczką modulującą odpowiedź immunologiczną, wtedy gdy ulega ekspresji w pożądanej komórce gospodarza np. antygen wirusa grypy, NP, HA, HIV gp160, antygeny ludzkiego papilomawirusa, peptydy otoczki przejrzystej, IFN-b, autoantygen taki jak MBP, kolagen itp. Antygen może być pełnym białkiem obejmującym kilkanaście epitopów, lub wielokrotnymi, połączonymi epitopami, z tego samego lub różnych źródeł, pojedynczym epitopem itp.
Użyteczna lecznicza i/lub profilaktyczna substancja jest dowolna substancją używaną w leczeniu i/lub zapobieganiu powstania choroby i obejmuje np. limfokiny, takie jak interleukina, TNF, INF (a, b, g etc), czynniki wzrostowe, takie jak NGF, ludzki hormon wzrostu, tkankowe aktywatory plazminogenu, czynnik VIIIC, G-MCSF, erytropoetyna, insulina, kalcytonina, kinaza tymidynowa i podobne. Ponadto, duże znaczenie terapeutyczne może mieć selektywne dostarczanie toksycznych peptydów takich jak rycyna, toksyna błonicy lub toksyna jadu kobry do komórek dotkniętych chorobą lub nowotworowych. Inne przykłady użytecznych leczniczych i/lub profilaktycznych substancji obejmują np. enzymy lub hormony, których brakuje u niektórych chorych.
Badania nad rakiem w ciągu ostatnich dwu dziesięcioleci doprowadziły do opracowania koncepcji nowotworu, jako choroby genetycznej na poziomie komórkowym. Nowotwory tworzą się w wyniku wieloetapowego procesu, napędzanego dziedzicznymi i stosunkowo częstymi mutacjami somatycznymi, oraz następującej selekcji klonalnej zmienionych komórek, obdarzonych zdolnością agresywnego wzrostu. Co najmniej trzy istotne klasy genów: protoonkogeny, geny supresorowe nowotworów oraz geny związane z naprawą DNA, uwikłane są w proces mutagenezy zapoczątkowującej proces nowotworowy. Większość mutacji przyczyniających się do powstania nowotworu to mutacje somatyczne, tzn. obecne jedynie w komórkach neoplastycznych osoby chorej. Wprowadzenie do komórek nowotworowych specyficznego genu zmieni lub zahamuje złośliwy fenotyp, jak wykazano przykładowo w doświadczeniach, gdzie wprowadzenie normalnej kopii genu supresorowego np. p53 lub Rb do linii komórek nowotworowych przywróciło komórkom cechy normalnego wzrostu in vitro. Zatem wynalazek można zastosować do dostarczania produktów hamujących wzrost nowotworu lub produktów nieobecnych w komórkach nowotworowych, do komórek nowotworowych. Inna, pośrednia metoda terapii genowej nowotworów obejmuje wprowadzenie do komórek nowotworowych genu kodującego cytokiny lub inne produkty immunomodulujące, albo ex vivo (poza organizmem chorego) albo in vivo (bezpośrednio do organizmu) w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej nie tylko wobec zmodyfikowanych genetycznie komórek nowotworowych, lecz wszystkich komórek nowotworowych w organizmie chorego. Kolejny sposób obejmuje transdukowanie wspomnianą bakterią według wynalazku limfocytów infiltrujących nowotwór lub innych efektorowych komórek odpornościowych w celu zwiększenia ich specyficzności i/lub reaktywności wobec komórek nowotworowych. Możliwe jest wprowadzenie genu supresorowego (np. B lub Rb) lub genu indukującego apoptozę (np. genu ICE) do komórek nowotworowych z wykorzystaniem atenuowanej bakterii L. monocytogenes zmutowanego szczepu D2. Jak wskazano to wyżej efektywna terapia genowa wymaga wprowadzenia DNA do komórek docelowych, albo na zewnątrz organizmu (ex vivo) albo poprzez bezpośrednie wprowadzenia do organizmu chorego (in vivo). Choć w wielu przypadkach efektywna terapia genowa wymaga wprowadzenia leczniczego genu do konkretnych komórek lub tkanek docelowych, nie jest to zawsze element konieczny. Użyteczne komórki, takie jak fiboroblasty pełnić mogą rolę fabryki wytwarzającej białka działające po przedostaniu się do krwioobiegu lub po przedostaniu się do innych komórek organizmu (jak ma to miejsce w przypadku niektórych schorzeń enzymatycznych). W jednym z zastosowań wynalazku komórki można infekować bakteriami według wynalazku ex vivo lub in vivo. L. monocytogenes i inne bakterie według wynalazku wykazują tropizm komórkowy wobec ustalonych linii komórkowych in vitro, co wydaje się zależne od kilkunastu internalin niesionych przez L. monocytogenes i inne bakterie według wynalazku np. internalina A wyzwala inwazję komórek nabłonkowych, internalina B - hepatocytów.
L. monocytogenes to bakteria Gram dodatnia, fakultatywnie wewnątrzkomórkowa. Korzystnie, w porównaniu z bakteriami Gram ujemnymi, L. monocytogenes nie posiada otoczki lipopolisacharydowej (LPS) i zdolna jest ponadto infekować szerszy zakres gospodarza ssaczego, w komórkach którego się namnaża (DA Portnoy, T Chakraborty, W Goebel, P Cossart, Infect Immun 60, 1263 (1992). Ponieważ infekuje gospodarza poprzez powierzchnie śluzówki jelita, L. monocytogenes może być również stosowana w przygotowywaniu szczepionek doustnych. Krótko po infekcji bakteria znajdowana jest w śledzionie, w której znajdują się również w dużych ilościach dojrzałe komórki APC.
PL 194 123 B1
Dostarczenie plazmidowego DNAdo wspomnianych komórek jest zatem znacząco wzmożone, poprzez użycie użytecznych konstruktów L. monocytogenes. Atenuowana L. monocytogenes ulega lizie w cytoplazmie komórki gospodarza poprzez wytworzenie lizyny fagowej, której transkrypcja zależna jest od promotora PactA na plazmidzie, niosącym różne geny heterologiczne, znajdujące się pod kontrolą regionu środkowo/wczesnego promotora/enhancera z ludzkiego cytomegalowirusa (PCMV). Oprócz korzyści wynikających z uniknięcia stosowania antybiotyków, uwalnianie plazmidu zależne od lizyn jest wydajną metodą, porównywalną do eliminowania bakterii w wyniku działania antybiotyku.
Atenuowaną infekcyjną bakterię rodzaju Listeria według wynalazku można podawać jako produkt farmaceutyczny doustnie (korzystnie zamknięte w otoczce z ulegającego biodegradacji polimeru np. PLPG), domięśniowo lub dożylnie, choć sposób doustny jest preferowany. Bakterie można hodować w podłożu BHI lub w innym zwyczajowo stosowanym podłożu, zebrane bakterie można liofilizować i przetrzymywać w -20°C przez miesiące. Można je również przetrzymywać żywe w temperaturze +4°C przez dłuższe okresy czasu (np. do 3-4 miesięcy).
Podawana dawka zależy w dużej mierze od warunków i wielkości leczonego pacjenta, jak również częstości podawania i sposobu podawania. Sposób leczenia, obejmujący dawkowanie i częstość podawania, można opracować na podstawie odpowiedzi na pierwszą dawkę i oceny klinicznej pacjenta.
Przedmiot wynalazku w korzystnych przykładach wykonania przedstawiono na załączonym rysunku, na którym fig. 1 przedstawia ekspresję cDNA genu gfp i genu plu118, znajdujących się pod kontrolą promotora actA z L. monocytogenes, w bakterii w czasie hodowli w podłożu BHI lub w czasie infekcji makrofagów, natomiast fig. 2 przedstawia ekspresję genów heterologicznych w makrofagach z wykorzystaniem sposobu dostarczania plazmidowego DNA przez L. monocytogenes.
Figura 1 - Ekspresja cDNA genu gfp i genu plu118 pod kontrolą promotora actA z L. monocytogenes, w bakterii w czasie hodowli w podłożu BHI lub w czasie infekcji makrofagów (A) Spektrum emisyjne i intensywności fluorescencji rosnącego pozakomórkowo szczepu dzikiego EGD L. monocytogenes (c), szczep EGD(pERL3501) obejmuje kopie wielokrotne genu prfA (a) , mutant D2 (b) i DprfA (d) wszystkie niosące gen gfp znajdujący się pod kontrolą PactA. 2 x 106 bakterii w fazie logarytmicznego wzrostu w podłożu BHI przemyto buforem PBS i zawieszono w 2 ml PBS. Spektra emisyjne odczytywano dla wartości od 500 do 550 nm ze stałą falą wzbudzającą o długości 481 nm stosując fluorymetr SPEX FluoroMax. Szczep L. monocytogenes EGD nie zawierający plazmidu gfp stosowano jako próbę ślepą. Fotony mierzono przy długości 507 nm, stosując arbitralne jednostki (AU).
(B) Wewnątrzkomórkowa ekspresja genu polu118 w L. zmutowanym szczepie monocytogenes D2 znajdującym się pod kontrolą PactA w zainfekowanej linii makrofagów J774A.1 i P388D, prowadzi do częściowej inaktywacji L. monocytogenes w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Infekcja makrofagów szczepem D2(p3L118) i D2(pcDNA3L) wykonana została w podłożu kompletnym (12) zawierającym 10 mg/ml tetracykliny (Sigma) przy wartości MOI 1:1 (około 2.5 x 104 makrofagów na studzienkę). Makrofagi inkubowano przez 60 minut, przemywano 3 razy PBS i hodowano w podłożu kompletnym uzupełnionym 10 mg/ml gentamycyny (Boehringer) i 10 mg/ml tetracykliny. Makrofagi lizowano jak wskazano i oznaczano miano żywotnych bakterii, wysiewając serię rozcieńczeń na agar BHI. Przedstawiono połączone dane z trzech niezależnych eksperymentów.
Figura 2 - ekspresja genów heterologicznych w makrofagach z wykorzystaniem sposobu dostarczania plazmidowego DNA przez L. monocytogenes.
(A) Ekspresja GFP w komórkach P388D1 zainfekowanych zmutowanym szczepem L. monocytogenes D2 niosącym plazmid p3LGFP118, p3LGFP [w obecności lub nieobecności penicyliny (100 IU/ml) i streptomycyny (100 mg/ml) (P/S, Gibco) od 2 godzin w górę w celu zlizowania zlokalizowanych wewnątrz komórek makrofagów bakterii], i plazmidu kontrolnego pcDNA3L. 106 makrofagów na naczynko infekowano bakteriami przy wartości MOL 50:1. Podłoże zmieniano co 24 godziny. Komórki eksprymujące GFP oznaczano stosując mikroskopię fluorescencyjną, przy gęstości komórek co najmniej 5 x 104 na naczynko w każdym czasie dokonywania pomiaru. Przedstawiono połączone wyniki dwu eksperymentów (powtórzenie).
(B) Ekspresja CAT w komórkach P388D1 zainfekowanych zainfekowanych zmutowanym szczepem L. monocytogenes D2 niosącym plazmid p3LCAT118, p3LCAT [w obecności lub nieobecności penicyliny i streptomycyny, i plazmidu kontrolnego pcDNA3L. Komórki zbierano i aktywność CAT oznaczano w lizatach komórkowych zawierających 100 mg całkowitego białka [Test Bradforda, BioRad] oznaczano zgodnie z wskazaniami producenta (Invitrogen) stosując handlowo dostępny en8
PL 194 123 B1 zym CAT (Boehringer) jako standard. Przedstawiono połączone wyniki dwu eksperymentów (powtórzenie).
(C) Prezentacja epitopu OVA (257-264) po dostarczeniu przez D2(p3LOVA118). Bakterie dodano do przyczepionych do podłoża makrofagów szpiku kostnego C57BL/6 BMM (105 komórek na studzienkę), hodowane uprzednio w zmodyfikowanym przez Dulbecco podłożu Eagla (DMEM, zawierający 10% FCS, 2 mM L- glutaminę, 1 mM pirogronian sodowy) zawierającym 500 U/ml IFN-g i 10 mg/ml tetracykliny, przez 24 godziny. Po fagocytozie przez 1 godzinę, dodano 50 mg/ml gentamycyny i zainfekowane makrofagi inkubowano w 37°C w obecności 10% CO2 przez 24 godziny. Komórki przemyto trzy razy i utrwalono w 1% paraformaldehydzie w PBS. Następnie dodano komórki hybrydomy RF33.70 specyficzne wobec OVA (257-264)-Kb (105 komórek na studzienkę) w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 2 mm, L- glutaminy i 50 mg/ml gentamycyny i inkubowano przez 24 godziny. Ilość wydzielonej interleukiny-2 (IL-2) po 48 godzinach szacowano stosując test włączania 3H-tymidyny do I-2 niezależnych komórek CTLL, jak opisano to poprzednio (20). Wyniki przedstawiają trzy poszczególne doświadczenia.
Podane wartości temperatury podane są w stopniach C, natomiast wartości procentowe są procentami wagowymi (chyba że wskazano inaczej).
Przykłady
P r z y k ł a d 1:
Konstruowanie atenuowanej bakterii L. monocytogenes zmutowanego szczepu D2
Atenuowany, zmutowany szczep D2 Listeria monocytogenes jest pochodną szczepu dzikiego EGD. Mutant pozbawiony jest operonu lecytynazy, obejmującego geny mpl, actA i plcB (9) w wyniku ukierunkowanej delecji chromosomalnej. Mutant zakaża komórki gospodarza i uwalniany jest do cytoplazmy zainfekowanych komórek z wydajnością porównywalną do szczepu dzikiego, jednak wykazuje defekt ruchliwości zarówno wewnątrz- jak międzykomórkowej (10). Ponadto powoduje mniejszy odczyn zapalny w porównaniu z szczepem dzikim lub mutantem actA (9). W rezultacie infekcji myszy BALB/c mutantem D2 miano i.v. LD50 jest trzy razy wyższej w porównaniu ze szczepem dzikim L. monocytogenes EGD (1 x 107 bakterii dla szczepu D2 w porównaniu z 1 x 104 dla szczepu EGD).
P r z y k ł a d 2:
Wprowadzenie i ekspresja egzogennego DNA
Atenuowany szczep mutanta a2 Listeria monocytogenes stosowano w dostarczaniu do makrofagów wektora ekspresyjnego niosącego cDNA genu kodującego GFP (zielono fluoryzujące białko) i genów kodujących transferazę acetylową chloramfenikolu (CAT) oraz owalbuminę (OVA). Uwalnianie plazmidowego DNA w cytoplazmie komórek gospodarza wyzwalane było przez wewnątrzkomórkową liżę atenuowanej bakterii, w wyniku aktywacji promotora bakteryjnego, aktywowanego w cytoplazmie. Uzyskano ekspresję wewnątrzkomórkową zarówno sklonowanych genów, jak prezentację antygenu.
P r z y k ł a d 3:
Kierowana przez promotor PactA ekspresja genu gfp jest zależna w sposób ścisły od PrfA
Geny actA i plcB Listeria monocytogenes transkrybowane są z promotora PactA i znajdującego się pod kontrolą aktywatora transkrypcji PrfA, regulującego większość znanych genów związanych z wirulencją L. monocytogenes (8). Promotor PactA aktywowany jest preferencyjnie w cytoplazmie zainfekowanych komórek gospodarza. W oparciu o tę obserwację wprowadzono gen gfp za promotorem actA w wektorze przenośnikowym pLSV16 (11). Fluorescencja eksprymowana przez szczep dziki i zmutowany szczep D2 bakterii niosących plazmid PactA-gfp nie była zwiększona w porównaniu z wartością fluorescencji podstawowej dla szczepu EGD DprfA niosącego PactA-gfp (Fig. 1A), gdy bakterie hodowano w podłożu BHI. W tych warunkach fluorescencje można było wykryć jedynie dla szczepu EGD, eksprymującego z wysoką wydajnością PrfA (Fig. 1A). Fluorescencje obserwowano także gdy dwa szczepy bakterii (EGD i zmutowany szczep D2 niosący plazmid PactA-gfp) stosowano do infekcji linii komórek podobnych do makrofagów P388D1 (12). W tych warunkach fluorescencje bakterii obserwowano po około 2 godzinach po infekcji, tzn. w czasie gdy większość wewnątrzkomórkowych bakterii znajdowała się w cytoplazmie komórek gospodarza (13). Fluorescencja pozostawała na wysokim poziomie przez co najmniej 10 godzin (13). Jak oczekiwano, bakterie szczepu dzikiego rozprzestrzeniały się na komórki sąsiednie 6 godzin po infekcji (13), podczas gdy bakterie szczepu zmutowanego D2 gromadziły się w postaci mikrokolonii w obrębie zainfekowanych komórek. W komórkach tych nie obserwowano fluorescencji, gdy stosowano szczep zmutowany DprfA niosący plazmid PactA-gfp (dane nie przedstawione), co wskazuje iż ekspresja genu gfp z promotora PactA jest w sposób ścisły zależna od PrfA.
PL 194 123 B1
P r zyk ł a d 4:
Wydajna aktywacja przez cytoplazmę wytwarzania lizyny prowadzi do samozniszczenia bakterii
Białko lizujące PLY118 jest późnym produktem bakteriofaga zakażającego bakterie Listeria. A118 jest niezbędne do uwolnienia potomstwa fagowego. PLY118 jest białkiem wysoce aktywnym, enzymem hydrolizującym ścianę komórkową Listeria, specyficznym względem tej grupy bakterii (14). W celu autodestrukcji L. monocytogenes w obrębie komórki gospodarza, gen ply118 (kodujący białko PLY118) sklonowano za promotorem actA i wstawiono do plazmidu pcDNA3L uzyskując plazmid p3L118 (16). Jak oczekiwano, szczep zmutowany D2 niosący wspomniany plazmid p3L118 nie ulegał autolizie w trakcie wzrostu bakterii w podłożu BHI. Szybka liza bakterii następowała jednak w cytoplazmie zainfekowanych linii makrofagów J774A.1 i P388D1 (Fig. 1B). Szczep kontrolny niosący plazmid pcDNA8L namnażał się w cytoplazmie komórek linii J774.A przez 24 godziny i tylko przez 6 godzin w cytoplazmie komórek linii P388D1. Powody zmniejszonej ilości żywych bakterii w linii P388D1 pomiędzy 6 a 24 godziną po infekcji pozostają nieznane (16). Różnice we wzroście wewnątrzkomórkowym pomiędzy dwoma szczepami Listeria obserwowano 2 godziny po infekcji, w czasie gdy bakterie znajdowały się przede wszystkim w cytoplazmie komórek gospodarza, w przedziale komórkowym w którym promotor actA jest aktywowany (patrz wyżej), umożliwiając tym samym syntezę lizyny. Różnice w ilości żywych bakterii pomiędzy szczepem D2(pcDNA3L) i D2(p3L118) wynosiły około rzędu wielkości w obu liniach makrofagów po 6 godzinach wewnątrzkomórkowego wzrostu. Różnice te wzrosły do więcej niż dwu rzędów wielkości w linii J744A.1 w 24 godziny po infekcji, co wskazuje na wydajne wytwarzanie lizyny aktywowane przez cytoplazmę, prowadzące do autodestrukcji bakterii.
P r zyk ł a d 5:
Zależna od białka PLY118 liza cytoplazmatyczna L. monocytogenes prowadzi do wydajnego uwalniania DNA do cytoplazmy makrofagów.
Geny sklonowane w plazmidzie i znajdujące się pod kontrolą promotora PCMV mogą ulegać ekspresji w zainfekowanych komórkach gospodarza. Skonstruowana plazmidy p3LGFP118, p3LCAT118 i p3OVA118 niosące geny gfp (kodujący humanizowane białko zielono fluoryzujące), cat (kodujący transferazę acetylową chloramfenikolu, CAT) lub część genu ova (kodującego rozpoznawany przez komórki T epitop pochodzący z owalbuminy kury) znajdujące się pod kontrolą promotora PCMV. Szczepy obejmujące podobne plazmidy bez ply118 (odpowiednio: p3LGFP, p3LCAT, p3LOVA) zastosowano jako kontrole (17). Funkcjonalną integralność plazmidów (tj. ekspresję CAT i GFP) badano w teście przejściowej transfekcji komórek L929 (stosując p3LGFP118, p3LCAT118, p3LGFP, p3LCAT) (18).
P r zyk ł a d 6:
Plazmid przekazywany jest do makrofaga poprzez bakterię i GFP ulega ekspresji w komórce gospodarza.
Makrofagi linii P388D1 zainfekowano bakterią L. monocytogenes szczepu zmutowanego D2 (Fig. 2A) niosącą plazmid p3LGFP118, p3LGFP i pcDNA3L w ilości 50 bakterii na makrofag. Okazało się, iż 1 godzinę po infekcji większość makrofagów zawierała średnio jedną baterie na komórkę gospodarza. Ilość wewnątrzkomórkowych bakterii niosących plazmid bez ply118 wzrastała z czasem, podczas gdy ilość bakterii niosących plazmidy z PactA-ply118 pozostawała na poziomie wyjściowym. Działanie lizyny na bakterie w zainfekowanych makrofagach było znaczące (>90% bakterii zabitych w ciągu 6 godzin po infekcji), lecz nie osiągnęło poziomu uzyskiwanego w wyniku działania antybiotyków penicyliny i streptomycyny (które zabijały >99% bakterii w ciągu 6 godzin po infekcji). Około 0.03% makrofagów zainfekowanych zmutowanym szczepem D2 niosącym plazmid p3LGFP118 wykazywało ekspresję białka GFP pomiędzy 24 a 48 godziną po infekcji. Fluorescencja w makrofagach eksprymujących GFP rozmieszczona była równomiernie po całej cytoplazmie i nie koncentrowała się w bakterii, co obserwowano gdy GFP znajdował się pod kontrolą promotora actA. Obserwacja ta wskazuje iż plazmid przeniesiony zostaje do makrofagów przez bakterie i GFP ulega ekspresji w komórkach gospodarza. Infekcja szczepem D2(p3LGFP) prowadziła do ekspresji GFP w mniej niż 0.001% makrofagów. infekcja szczepem kontrolnym D2(pcDNA3L) nie prowadziła do powstawania komórek emitujących światło. Wydajne dostarczanie plazmidowego DNA do cytoplazmy komórek gospodarza L. monocytogenes stymulowane było wydajnie przez autodestrukcję bakterii poprzez ekspresję PLY118 w cytoplazmie gospodarza. Oprócz korzyści wynikających z uniknięcia stosowania antybiotyków, zastosowanie lizy kierowanej przez plazmid stanowi wydajną metodę eliminowania bakterii. Wykazano iż <0.01% makrofagów zainfekowanych szczepem D2(p3LGFP) eksprymuje GFP po potraktowaniu penicyliną i streptomycyną.
PL 194 123 B1
P r z y k ł a d 7:
Stabilność białka GFPw makrofagach
Makrofagi eksprymujące GFP po dostarczeniu przez zmutowany szczep D2(p3LGFP) przechodziły podziały komórkowe i można wyizolować je stosując technikę sortowania komórek aktywowanego przez fluorescencję (FACS) (19), i hodowanie w świeżej pożywce. Obserwowano stopniową utratę fluorescencji przez komórki w trakcie długotrwałego hodowania. Wykazano iż czas życia GFP w makrofagach jest długi. Gdy do pożywki w której hodowano makrofagi eksprymujące GFP dodano cykloheksimid w stężeniu 100 mikrogramów/ml w 48 godzin po infekcji szczepem D2(p3LGFP118), fluorescencje można było obserwować do 24 godzin po dodaniu cykloheksimidu. Ponadto dodanie inhibitora proteaz N-acetylo-L-leucynylo-L-leucynalo-L-norleucynalu (LLnL, w ilości 100 mg/ml, Sigma) lub N-karboksybenzoksylo-L-leucynylo-L-norvalinalu (MG115, w ilości 50 mg/ml, Sigma) w 48 godzin po infekcji nie powodowało wzrostu procentu makrofagów eksprymujących GFP lub fluorescencji w komórkach eksprymujących GFP (dane nie przedstawione). Dane te wskazują iż stosunkowo niewielki procent makrofagów eksprymujących GFP nie wynika z dużej niestabilności GFP w komórkach.
P r z y k ł a d 8:
Ekspresja CAT w makrofagach po dostarczeniu przez plazmid niesiony przez atenuowane, ulegające autodestrukcji bakterie L. monocytogenes
W celu określenia ilości heterologicznego białka eksprymowanego po dostarczeniu plazmidu w sposób opisany powyżej, makrofagi linii P388D1 infekowano zmutowanym szczepem D 2 niosącym albo plazmid p3LCAT118, p3LCAT lub pcDNA3L (Fig. 2B). Aktywność CAT obserwowano po raz pierwszy w 4 godziny po infekcji w ekstraktach makrofagów zainfekowanych bakteriami niosącymi plazmid p3LCAT118 i p3SLCAT, aktywność osiągała szczyt w 48 godzin po infekcji. W tym czasie aktywność CAT mierzona w makrofagach zainfekowanych D2(p3LCAT118) była około 10 razy wyższa niż w komórkach zainfekowanych D2(p3LCAT). Bakterie bez plazmidu nie wykazywały aktywności CAT, podczas wzrostu na BHI (dane nie przedstawione), co wskazuje że białko CAT było syntetyzowane w zainfekowanych komórkach po uwolnieniu plazmidowego DNA z internalizowanej komórki bakteryjnej. Liza z wykorzystaniem białka PLY118 prowadziła do bardziej wydajnego uwalniania plazmidui wyższej aktywności CAT niż zabijanie bakterii obecnych w cytoplazmie za pomocą antybiotyków.
P r z y k ł a d 9:
Wydajność prezentacji antygenu przez makrofagi po dostarczeniu plazmidu kodującego antygen przez bakterie
W celu określenia wydajności prezentacji antygenu przez makrofagi po dostarczeniu plazmidu kodującego antygen przez bakterie, zastosowano zmutowany szczep D2 niosący plazmid p3LOVA118. Plazmid obejmuje część genu ova, kodującego epitop H2K (OVA 257-264) z owalbuminy kury (20). Wydajna prezentacja epitopu w układzie MHC klasy I miała miejsce w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego, jako że hybrydomy komórek T specyficzne wobec OVA linii RF33.70 (20) rozpoznawały makrofagi zainfekowane D2(p2LOVA118), lecz nie makrofagi zainfekowane D2(pcDNA3L) (Fig. 2C).
P r z y k ł a d 10:
Integracja plazmidowego DNA z genomem gospodarza.
Jednym z głównych problemów pojawiających się przy stosowaniu szczepionek DNA jest możliwa integracja plazmidowego DNA z genomem gospodarza. W celu zbadania tej kwestii, zastosowano gen kodujący II fosfotransferazę neomycynową (neo) sklonowany w wektorze pcDNA8, będącym częścią każdego z wymienionych wcześniej konstruktów wektorowych. Zainfekowanie komórek linii P388D1 bakteriami szczepu D2(p3LCAT) przy wartości MOI 50:1 prowadziło do zainfekowania większości z komórek gospodarza. Selekcja skierowana na G418 prowadziła do powstania klonów opornych makrofagów, utrzymywanych w warunkach selekcyjnych przez ponad 12 tygodni. We wszystkich klonach wykrywano zintegrowany w chromosomalnym DNA plazmid p3LCAT, stosując technikę hybrydyzacji Southerna z wyznakowanym radioaktywnie plazmidem p3LCAT, podczas gdy nie wykrywano hybrydyzujących sekwencji w chromosomalnym DNA niezainfekowanych komórek linii P388D1. Gdy całkowity DNA z trzech różnych klonów strawiono enzymem Srfl (nie tnącym wektora p31CAT) i fragmenty rozdzielono stosując PFGE, wykryto w każdym przypadku pojedynczy prążek o dużej wielkości hybrydyzujący z sondą. Wolny, oczyszczony wektorowy DNA wykazywał obecność dwu prążków (prawdopodobnie formy OF i CCC) o wyższej ruchliwości w podanych warunkach. Każdy z trzech analizowanych klonów wykazywał różną intensywność hybrydyzacji dużego fragmentu DNA, co sugerowało różną liczbę kopii plazmidowego DNA zintegrowaną z genomem gospodarza. Wspomniane
PL 194 123 B1 kopie są ułożone tandemowo, jako że trawienie genomowego DNA enzymem Pstl, tnącym plazmid na dwa fragmenty prowadzi do powstania we wszystkich przypadkach takich samych dwu fragmentów, wykazujących taką samą różnicę w intensywności sygnału hybrydyzacyjnego, jak wspomniany nie przecięty, duży chromosomalny fragment DNA powstały w wyniku trawienia SrfI. Oszacowano, że integracja z genomem plazmidowego DNA w linii P388D1 wynosi 10-7. Dane te wskazują, że plazmid stosowany typowo w szczepionkach DNA może wydajnie integrować z genomem transfekowanych komórek gospodarza.
Problemy bezpieczeństwa związane ze stosowaniem szczepionek DNA były już wielokrotnie dyskutowane. Najwięcej uwagi przywiązuje się do zjawiska integracji plazmidowego DNA z chromosomami gospodarza (2, 21, 22).W większości prac przyjmuje się, że integracja „szczepionki DNA” jest nieprawdopodobna (22), jako że nie obserwowano tego zjawiska gdy plazmidowy DNA wstrzykiwano do mięśni myszy, nawet jeśli DNA trwał in situ przez okresy dłuższe niż 19 miesięcy (23). Jednak dwa różne doniesienia sugerują że możliwa jest integracja heterologicznego DNA do genomu komórek gospodarza, gdy plazmidowy DNA dostarczano do hodowli komórek ssaczych stosując bakterię E. coli (7) lub gdy DNA wektora fagowego M13mp18 podawano doustnie myszom (24). Dane przedstawione w tym zgłoszeniu wskazują, że plazmid p3LCAT, będący pochodną eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3, często używanego w szczepionkach DNA, zdolny jest do integracji z genomem makrofagów linii P388D1 z częstością około 10-7 w wyniku zastosowania opisanej powyżej procedury. Nieoczekiwanie wysoka częstość integracji plazmidu może wynikać z dużej liczby kopii plazmidu dostarczanego do większości zainfekowanych komórek, i może nie być prawdziwa dla wszystkich metod używanych do podawania szczepionek DNA. Wskazuje to jednakże, iż integracja takich plazmidów może mieć miejsce i że przedstawiony system oferuje użyteczną i wygodną metodę testowania in vitro możliwej integracji plazmidowego DNA, który miałby być wykorzystany w szczepionkach DNA w próbach klinicznych.
Z drugiej strony domięśniowe wstrzykiwanie szczepionek DNA kodujących silne antygeny może prowadzić do zniszczenia większości fibroblastów eksprymujących antygen, ze względu na działanie komórek T CD8+ skierowane przeciw wspomnianemu antygenowi (25). Dostarczenie plazmidowego DNA poprzez atenuowaną bakterię L. monocytogenes może nawet wzmocnić wspomniany efekt, jako że komórki fagocytujące i niefagocytujące szczepionego gospodarza infekowane L. monocytogenes wywołują silną odpowiedź CTL w wyniku obecności bakteryjnego białka p60 oraz listeriolizyn we wspomnianych komórkach (26). Oba białka jak to wykazano obejmują bardzo silne epitopy reaktywne wobec komórek T, które są prezentowane w kontekście białek MHC klasy I. Komórki gospodarza zainfekowane L. monocytgenes, włączają w to komórki ze zintegrowanymi sekwencjami plazmidowymi, powinny być zatem ostatecznie usunięte przez komórkowy system odpornościowy, zmniejszając tym samym możliwe niebezpieczeństwo związane z integracją plazmidu do genomu komórek gospodarza.
Integracja plazmidu p3LCAT z genomem makrofagów linii P388D1 badano jak następuje. Komórki makrofagów infekowano D2(p3LCAT) przy wartości MOI 50:1. Dwie godziny po infekcji pożywkę wzbogacano gentamycyną (10 mg/ml), tetracykliną (10 mg/ml), penicyliną (100 IU/ml) i streptomycyną (100 mg/ml) i w5 dniu hodowli G418 (600 mg/ml) (Gibco). Komórki makrofagów utrzymywano zmieniając podłoże każdego dnia, aż do wykrycia kolonii komórek opornych na G418, które zbierano i hodowano osobno. Klony hodowano do fazy wzrostu zlewnego w warunkach selekcyjnych. W 90 dniu po infekcji badano insercję plazmidu p3LCAT techniką hybrydyzacji genomowej.
Analizę integracji plazmidowego DNA przeprowadzono stosując elektroforezę w pulsującym polu elektrycznym (PFGE) i następnie hybrydyzację genomową: komórki makrofagów zatapiano w bloczki agarozowe i trawiono proteinazą K (Merck). Następnie DNA trawiono enzymem Srfl, rozdzielano techniką PFGE, przenoszono na membranę Hybond N i hybrydyzowano z trawionym enzymem BamHI plazmidem p3LCAT wyznakowanym 32P.
Analizę Southerna przeprowadzono dla trzech niezależnych klonów G418 odpornych makrofagów linii P388D1, Genomowy DNA izolowano, trawiono enzymem Pstl, rozdzielano w żelu agarozowym, przenoszono na membranę Hybond N (Amersham) i hybrydyzowano z trawionym enzymem BamHI plazmidem p3LCAT wyznakowanym 32P.
P r zyk ł a d 11:
Konstruowanie wektora przenośnikowego pFLO1
Wektor pFLO1 jest pochodną wektora B. cereus pBC16 [k Bernhardt i wsp J Bacteriol 113, 897 (1978)] i obejmuje dodatkowo miejsce startu replikacji ColEl E. coli. Miejsce ColE1 z wektora pUC19 [J Vieira, J Messing Gene 19, 259, 1982] powielono techniką PCR stosując oligonukleotydy:
PL 194 123 B1 ori19code2 (5'-AGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGAATTCTCATATAATAC-3') (podkreślono wprowadzane miejsce EcoRI) oraz ori19rev (5'-GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3'), uzyskany fragment DNA traktowano enzymem EcoRI i ligowano z 2,8 kb fragmentem EcoRI plazmidu pBC16. Wymieniony wektor jest mały i ulega replikacji w bakteriach Gram ujemnych (np. E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella, Vibrio) i Gram dodatnich (np. Listeria spp, Bacillus spp). Utrzymywany jest bardzo stabilnie w bakteriach Gram dodatnich bez konieczności selekcji antybiotykowej np. w komórkach Listeria monocytogenes stabilność plazmidu wynosi ponad 80% w trakcie wzrostu bakterii w pożywce BHI bez dodatku antybiotyku przez 6 godzin i ponad 70% po wzroście przez 24 godziny bez antybiotyku.
Klonowanie eukariotycznej kasetki ekspresyjnej w wektorze pFLO1
Sekwencje (np. gen gfp kodujący białko GFP) przyłączone w sposób umożliwiający działanie do promotora aktywnego w komórkach ssaczych np. promotora CMV, można również wstawiać do wektora pFLO1 lub jego pochodnych. Po dostarczeniu do komórek gospodarza stosując bakterie podobne do L. monocytogenes wektor taki eksprymuje polipeptyd kodowany przez gen znajdujący się pod kontrolą promotora eukariotycznego. Np. po dostarczeniu plazmidu pochodnego pFLO1 niosącego PCMVgfp do mysich makrofagów linii P388D1 przez atenuowaną bakterię L. monocytogenes ulegającą autodestrukcji, osiąga się wydajną ekspresję białka GFP w ssaczych komórkach gospodarza.
Odnośniki i uwagi
1. JJ Donnelly, JB Ulmer, MA Liu J Immunol Methods 176, 145 (1994); RM Conry i wsp Cancer Res 54, 1164 (1994); CH Hsu i wsp Nature Med 2, 540 (1996)
2. RE Tascon i wsp Nature Med 2, 888 (1996)
3. M Corri wsp J Exp Med 184, 1555 (1996)
4. RR Decki wsp Vaccine 15, 71 (1997)
5. DS Pisetsky J Immunol 156, 421 (1996)
6. DR Sizemore, AA Brandstrom, JC Sadoff Science 270, 299 (1995)
7. P Courvalin, S Goussard, C Grillot-Courvalin Life Sciences 318, 1207 (1995)
8. DA Portnoy, T Chakraborty, W Goebel, P Cossart Infect Immunol 60, 1263 (1992)
9. N Hauf, W Goebel, F Fiedler, Z Sokolovic, M Kuhn Proc Natl Acad Sci USA (w druku)
10. SW Schuller, S Kugler, W Goebel (wysłane do redakcji)
11. Plazmid pLSV16 [J Bohne i wsp Mol Microbiol 20, 1189 (1996)] obejmuje plazmid E. coli pUC18 i fragment 4.2 kpz obejmujący plazmid niosący oporność na tetracyklinę pBCE16, wyizolowany początkowo z Bacillus cereus [K Bernhard i wsp J Bacteriol 133, 897 (1978)], stabilny replikacyjnie w ilości około 30 kopii na komórkę w L. monocytogenes. Pozbawiony promotora, zmutowany fragment genu gfp wycięty z plazmidu pKEN2 jako fragment XbaI/PstI [BP Cormack, RH Valdivia, S Falkow Gene 173, 33 (1996)] wstawiono w miejsce XbaI/PstI plazmidu pLSV16. Region promotorowy actA zamplifikowano stosując reakcję PCR z dwoma starterami: PXAct5 (AGCGCTTCTAGAAGCAGCGAAAG) oraz PXAct3 (TCCTCTCTAGACGCTAATACAACC) niosące miejsce Xbal (wytłuszczone), strawiono następnie enzymem Xbal i wstawiono w miejsce Xbal przed genem gfp. Prawidłowość ligacji i orientacji fragmentu promotorowego sprawdzono analizą restrykcyjną, stosując enzymy Xbal, Pstl oraz stosując PCR z starterem PXAct5 i 3' starterem komplementarnym do sekwencji genu gfp. Uzyskany plazmid PactA-gfp wprowadzono następnie metodą elektroporacji do szczepu L. monocytogenes EGD, oraz jego izogeniczny mutant delecyjny DprfA [R Bockman i wsp Mol Microbiol 22, 543 (1996)] oraz D2 oraz EGD(pERL3501) (J Bohne i wsp 1996).
12. Linię komórek podobnych do makrofagów P386D1 hodowano w pożywce RPMI 1640 (Gibco BRL) uzupełnionej 10% FCS inaktywowaną ciepłem (Gibco) i 2 mM L-glutaminą (Gibco), oznaczaną jako podłoże pełne, w 37°C i w wilgotnej, zawierającej 5% CO2 atmosferze. 106 makrofagów infekowano bakteriami znajdującymi się w logarytmicznej fazie wzrostu w stosunku 1:10 w podłożu pełnym. Po inkubacji przez 45 minut usuwano pozostałe na zewnątrz komórek bakterie przemywając komórki trzy razy buforem PBS. W celu selektywnego usuwania zewnątrzkomórkowych bakterii zainfekowane makrofagi rutynowo hodowano w obecności 10 mg/ml gentamycyny. W różnych przedziałach czasu fluoryzujące bakterie analizowano mikroskopowo w zainfekowanej błonce makrofagów, stosując mikroskop o odwróconym obrazie (Leica) (przy powiększeniu 40 x) i dane zbierano stosując system wizualizacji Seescan CCD (INTAS).
13. E Domann i wsp EMBOJ 11, 1981 (1992)
14. MJ Loessner, G Wendlinger, S Scherer Mol Microbiol 16, 1231 (1995)
PL 194 123 B1
15. Wektor pBCE16 strawiono enzymem BamHI i wstawiono w miejsce Bglll plazmidu pCDNA3 (Invitrogen) uzyskując plazmid pcDNA3L. Gen lizynowy ply118 z bakteriofaga A118 zakażającego Listeria wycięto z wektora pHPL118 [MJ Loessner i wsp Appl Env Microbiol 62, 3057 (1996)] enzymami BamHI i SalI i wstawiono w miejsce BamHl-Sall plazmidu pUC118 uzyskując plazmid pUC118. Region promotorowy actA zamplifikowano techniką PCR stosując startery PactA5 (5'-TCCCAGGGTACCATGCGA-3') praz PactA3 (5'-TCCCACGGATCCTCCCTCC-3'), wprowadzając miejsca rozpoznawane przez enzymy KpnI i BamHI (odpowiednio; wytłuszczone). Produkt liczący 314 pz strawiono KpnI i BamHI i wstawiono w miejsce KpnI/BamHI plazmidu pUC118. Jednostkę transkrypcyjną PacaA-ply118 w wektorze pActPr118 wycięto stosując enzym PvuIL i uzyskany fragment o wielkości 1470 pz wstawiono w miejsce Smal plazmidu pcDNA3L. Uzyskany w ten sposób plazmid p3L113 jak również pcDNA3L wprowadzano metodą elektroporacji do komórek L. monocytogenes szczepu zmutowanego D2.
16. Możliwym wyjaśnieniem może być wyższa aktywność bakteriobójcza makrofagów linii P388D1 w porównaniu do J774A.1 i/lub wzmożona liza komórek P388D1 i następujące potem zabijanie uwolnionych, pozakomórkowych bakterii przez gentamycynę obecną w pożywce.
17. Plazmid p3LGFP118 i p3LGFP skonstruowano przecinając plazmid pCEP4-RG [Y Wang i wsp w: Bioluminescence and Chemiluminescence eds. JW Hastings, LJ Kricka, PE Stanley (John Wiley & Sons, Chichester, 1996) str. 419-422] enzymem Notl i wstawiając fragment 0.7 kpz zawierający humanizowaną wersję genu gfpdo przeciętego enzymem Notl wektora p3L118 i pcDNA3L. Wektor p3LCAT skonstruowano wstawiając fragment BamHI z pBCE16 do miejsca BglII plazmidu pcDNA/CAT (Invitrogen). Wstawienie jednostki transkrypcyjnej PacaA-ply118 do przeciętego enzymem PvuII plazmidu pActPr118 do miejsca Smal plazmidu p3LCAT uzyskując wektor p3LCAT118. Plazmidy p3LOVA i p3LOVA skonstruowano wstawiając linker obejmujący oligonukleotydy OVACODE {5'GGCCATGAAGAGCATCATCAACTTCGAGAAGCTGAAG-3') i OVAREV (5'-GGCCCTTCAGCTTCTCGAAGTTGATGATGCTCTTCAT-5') do miejsca Notl plazmidu p3L118 i pcDNA3L. W rezultacie ulegał ekspresji peptyd o sekwencji aminokwasowej MLSIINFEKLKGRSSMHLEGPIL. Wstawienie oligonukleotydów sprawdzono stosując sekwencjonowanie DNA techniką terminacyjną. Wszystkie plazmidy wprowadzono metodą elektroporacji do komórek L. monocytogenes szczepu zmutowanego D2.
18. Transfekcji dokonywano stosując Transfection MBS Mammalian Transfection Kit (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta, stosując metodę wapniową. Komórki badano 48 godzin po transfekcji, odpowiednio na obecność GFP lub aktywności CAT.
19. Makrofagi eksprymujące GFP oddzielano stosując sorter komórek Epics Elite ESP (Coulter). Fluorescencję GFP analizowano stosując filtr przepuszczający światło o długości fali od 515 do 535 nm i światło wzbudzenia o długości fali 488 nm (laser argonowy). Odsortowane komórki wykazywały wzrost fluorescencji o >25 razy.
20. M Kovacsovics-Bankowsky, KL Rock Science 267, 243 (1995)
21. JJ Donnelly i wsp Nature Med1, 583 (1995)
22. DE Hassett, JL Whitton Trends Microbiol 4, 307 (1996); HCJ Ertl, Z Xiang J Immunol 156, 3579 (1996); FR Vogel, N Sarver Clin Microbiol Rev 8, 406 (1995).
23. JA Wolff i wsp Hum Mol Gen1, 363 (1992)
24. R Schubbert i wsp Proc Natl Acad Sci USA 94, 961 (1997)
25. HL Davis, MJ Bevan J Exp Med 175, 1531-1538 (1992); EG Pamer J Immunol 152, 686
Claims (26)
1. Atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria zdolna do infekowania ssaczego gospodarza lub komórek wymienionego gospodarza, wykazująca obniżoną zdolność do ruchu wewnątrz- i międzykomórkowego w wymienionym gospodarzu w porównaniu z bakterią szczepu dzikiego, stransformowana:
(a) promotorem aktywowanym, gdy wymieniona bakteria obecna jest w cytoplazmie komórki gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wymienionego genu kodującego polipeptyd letalny dla bakterii, oraz
PL 194 123 B1 (b) promotorem zgodnym z komórką gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wspomnianego genu, kodującego polipeptyd wykazujący działanie lecznicze i/lub profilaktyczne.
2. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że (a) i (b) znajdują się w tym samym plazmidzie lub w różnych plazmidach.
3. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że (a) może być zintegrowany z chromosomem bakteryjnym i (b) znajduje się w plazmidzie.
4. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że należy do rodzaju Listeria monocytogenes.
5. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że nie posiada operonu lecytynazy.
6. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptyd będący letalnym dla bakterii jest lizyną bakteriofagową.
7. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że promotor (a) jest promotorem PactA z Listeria.
8. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że promotor zgodny z komórką gospodarza (b) jest promotorem PCMV.
9. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptyd będący letalnym dla bakterii powoduje autolizę bakterii w cytoplazmie komórki gospodarza.
10. Atenuowana inwazyjna bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptyd będący letalnym dla bakterii jest produktem genu ply118.
11. Plazmid zawierający (a) promotor aktywowany, gdy jest obecny w inwazyjnej bakterii, która jest w cytoplazmie komórki ssaczego gospodarza, przyłączony w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego kodującego białko letalne dla bakterii, zawierający ponadto (b) promotor zgodny z komórką gospodarza, przyłączony w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego kodującego białko wykazujące działanie lecznicze i/lub profilaktyczne.
12. Plazmid według zastrz. 11, znamienny tym, że białko (b) wykazujące działanie lecznicze i/lub profilaktyczne jest antygenem.
13. Plazmid według zastrz. 11, znamienny tym, że białko (a) będące letalnym dla bakterii tolizyna bakteriofagowa.
14. Plazmid według zastrz. 11, znamienny tym, że promotor (a) jest promotorem PactA z Listeria.
15. Plazmid według zastrz. 11, znamienny tym, że promotor zgodny z komórką gospodarza (b) jest promotorem PCMV.
16. Plazmid według zastrz. 11, znamienny tym, że białko (a) będące letalnym dla bakterii powoduje autolizę bakterii w cytoplazmie komórki gospodarza.
17. Wektor transformujący ssacze komórki gospodarza in vivo lub in vitro, obejmujący atenuowaną wewnątrzkomórkową inwazyjną bakterię rodzaju Listeria zdolną do infekowania ssaczego gospodarza lub komórek wymienionego gospodarza, wykazującą obniżoną zdolność do ruchu wewnątrzi międzykomórkowego w gospodarzu w porównaniu z bakterią szczepu dzikiego, stransformowaną:
(a) promotorem aktywowanym, gdy bakteria obecna jest w cytoplazmie komórki gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wymienionego genu kodującego polipeptyd letalny dla bakterii, oraz (b) promotorem zgodnym z komórką gospodarza, przyłączonym w sposób umożliwiający działanie do genu strukturalnego lub fragmentu wspomnianego genu, kodującego polipeptyd wykazujący działanie lecznicze i/lub profilaktyczne.
18. Wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że gen strukturalny (b) koduje antygen.
19. Wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że gen strukturalny (b) koduje środek leczniczy.
20. Wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że gen strukturalny (b) koduje zdolny do sekrecji produkt białkowy.
21. Szczepionka zawierająca bakterię z zastrz. 1, do zastosowania jako lek.
22. Szczepionka według zastrz. 21, znamienna tym, że szczepionka przedostaje się do monocytów ssaka.
23. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że monocyty to dojrzałe komórki prezentujące antygen (APC).
PL 194 123 B1
24. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że białko antygenu kodowane przez (b) ulega ekspresji i jest prezentowane przez komórki APC i w ten sposób wywołuje odpowiedź immunologiczną.
25. Szczepionka według zastrz. 24, znamienna tym, że komórki ssaka zainfekowane bakterią niosącą szczepionkę są usuwane przez komórkowy układ odpornościowy pacjenta po prezentacji antygenu.
26. Szczepionka według zastrz. 21, znamienna tym, że jest podawana pacjentowi doustnie.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/999,391 US6143551A (en) | 1997-12-29 | 1997-12-29 | Delivery of polypeptide-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated listeria suicide bacteria |
| PCT/EP1998/008345 WO1999034007A1 (en) | 1997-12-29 | 1998-12-18 | Delivery of polypeptide-encoding plasmid dna into the cytosol of macrophages by attenuated suicide bacteria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL341530A1 PL341530A1 (en) | 2001-04-23 |
| PL194123B1 true PL194123B1 (pl) | 2007-04-30 |
Family
ID=25546276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98341530A PL194123B1 (pl) | 1997-12-29 | 1998-12-18 | Atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria, plazmid oraz wektor i szczepionkają zawierające |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6143551A (pl) |
| EP (1) | EP1042495A1 (pl) |
| JP (1) | JP2002500017A (pl) |
| KR (1) | KR100606322B1 (pl) |
| AU (1) | AU753888B2 (pl) |
| BR (1) | BR9814546A (pl) |
| CA (1) | CA2317111A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0100994A3 (pl) |
| IL (2) | IL136455A0 (pl) |
| PL (1) | PL194123B1 (pl) |
| WO (1) | WO1999034007A1 (pl) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040242520A1 (en) * | 1997-09-06 | 2004-12-02 | Mayo Foundation For Medical Education And Research, A Minnesota Corporation | Expression of immonogenic substances |
| US6080849A (en) * | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) * | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| DE19949594A1 (de) * | 1999-10-14 | 2001-04-26 | Deutsches Krebsforsch | Rekombinante attenuierte Listerien zur Immuntherapie |
| WO2003103578A2 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-18 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Bacteriophage and enzymes lytic to salmonellae |
| US20050214264A1 (en) * | 2002-12-13 | 2005-09-29 | Cosenza Lawrence W | Sacromastigophoric therapeutic agent delivery system |
| JP4839209B2 (ja) * | 2003-02-06 | 2011-12-21 | アンザ セラピューティクス，インコーポレイテッド | 改変された自由生活微生物、ワクチン組成物、およびそれらの使用方法 |
| PT1592441E (pt) * | 2003-02-06 | 2012-05-21 | Aduro Biotech | Listeria atenuada relativamente à entrada em células não patogénicas, vacinas compreendendo a listeria e métodos para sua utilização |
| US7695725B2 (en) | 2003-02-06 | 2010-04-13 | Aduro Biotech | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
| DE10326189A1 (de) * | 2003-06-06 | 2005-01-05 | MedInnova Gesellschaft für medizinische Innovationen aus akademischer Forschung mbH | Bakterielle Träger für Nukleotidsequenzen kodierend für Wirkstoffe |
| US7390646B2 (en) * | 2003-09-17 | 2008-06-24 | The Regents Of The University Of California | Bacterial vectors and methods of use thereof |
| US20070298012A1 (en) * | 2003-12-16 | 2007-12-27 | Ivan King | Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules |
| US7842289B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-11-30 | Aduro Biotech | Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
| AU2005269641A1 (en) | 2004-07-23 | 2006-02-09 | Henkin-Laby, Llc. | Swimming pool cleaner debris container |
| WO2006137836A2 (en) * | 2004-08-17 | 2006-12-28 | Research Development Foundation | Bacterial vector systems |
| WO2006066048A2 (en) * | 2004-12-17 | 2006-06-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using same |
| CA2912012C (en) | 2005-05-05 | 2018-05-29 | Sensient Flavors Inc. | Production of beta-glucans and mannans |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| US8241623B1 (en) | 2009-02-09 | 2012-08-14 | David Bermudes | Protease sensitivity expression system |
| US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
| US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
| US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
| WO2014043518A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use |
| US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
| TWI658140B (zh) * | 2015-11-12 | 2019-05-01 | 昕穎生醫技術股份有限公司 | 表現異源基因的系統及其用途 |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2255561B (en) * | 1991-04-20 | 1995-06-21 | Agricultural & Food Res | Lysins from bacteriophages |
| AU3522795A (en) * | 1994-09-09 | 1996-03-27 | Jsd Technologies, Ltd. | Decomposition of bacteria cells by phage lysins |
| US5877159A (en) * | 1995-05-03 | 1999-03-02 | University Of Maryland At Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells and live invasive bacterial vectors for use in the same |
| WO1997008955A1 (en) * | 1995-09-06 | 1997-03-13 | Department Of The Army, Us Government | Bacterial delivery system |
-
1997
- 1997-12-29 US US08/999,391 patent/US6143551A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-18 AU AU20547/99A patent/AU753888B2/en not_active Ceased
- 1998-12-18 KR KR1020007007207A patent/KR100606322B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 IL IL13645598A patent/IL136455A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 WO PCT/EP1998/008345 patent/WO1999034007A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-18 CA CA002317111A patent/CA2317111A1/en not_active Abandoned
- 1998-12-18 HU HU0100994A patent/HUP0100994A3/hu unknown
- 1998-12-18 PL PL98341530A patent/PL194123B1/pl unknown
- 1998-12-18 BR BR9814546-0A patent/BR9814546A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-18 EP EP98965287A patent/EP1042495A1/en not_active Withdrawn
- 1998-12-18 JP JP2000526662A patent/JP2002500017A/ja active Pending
-
2000
- 2000-03-22 US US09/532,964 patent/US20020045587A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-30 IL IL136455A patent/IL136455A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999034007A1 (en) | 1999-07-08 |
| IL136455A0 (en) | 2001-06-14 |
| JP2002500017A (ja) | 2002-01-08 |
| BR9814546A (pt) | 2000-10-10 |
| EP1042495A1 (en) | 2000-10-11 |
| KR100606322B1 (ko) | 2006-08-02 |
| KR20010033684A (ko) | 2001-04-25 |
| US20020045587A1 (en) | 2002-04-18 |
| IL136455A (en) | 2007-06-03 |
| US6143551A (en) | 2000-11-07 |
| PL341530A1 (en) | 2001-04-23 |
| CA2317111A1 (en) | 1999-07-08 |
| HUP0100994A3 (en) | 2003-10-28 |
| HUP0100994A2 (hu) | 2001-07-30 |
| AU753888B2 (en) | 2002-10-31 |
| AU2054799A (en) | 1999-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL194123B1 (pl) | Atenuowana inwazyjna bakteria wewnątrzkomórkowa rodzaju Listeria, plazmid oraz wektor i szczepionkają zawierające | |
| JP6900054B2 (ja) | Ｒｎａ転写ベクター及びその使用 | |
| Dietrich et al. | Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes | |
| Brossart et al. | Virus-mediated delivery of antigenic epitopes into dendritic cells as a means to induce CTL. | |
| TWI772282B (zh) | 樹突細胞組成物 | |
| JP4975630B2 (ja) | 細菌ベクター | |
| US10143743B2 (en) | Non-replicating bacterial nanoparticle delivery system and methods of use | |
| US20060040382A1 (en) | Tagged epitope protein transposable element | |
| Hon et al. | bcl-xL is critical for dendritic cell survival in vivo | |
| US9018012B2 (en) | Vectors and methods for genetic immunization | |
| JP2008521410A (ja) | 哺乳動物細胞におけるＩｉ発現の抑制 | |
| WO2003064607A2 (en) | Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions | |
| EP1404847B1 (en) | Method of plasmid stabilisation by in vivo deleting the antibiotic resistence and selecting with an essential gene | |
| Xu et al. | Combination of immunotherapy with anaerobic bacteria for immunogene therapy of solid tumours | |
| Harui et al. | Vaccination with helper-dependent adenovirus enhances the generation of transgene-specific CTL | |
| JP2006502726A (ja) | 改善された免疫療法 | |
| US20230059344A1 (en) | Medical Uses of 4-1BBL Adjuvanted Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) | |
| US20020086837A1 (en) | Acne vaccine | |
| KR102424707B1 (ko) | 표적단백질발현을 증가시킨 진핵세포질 내 다중항원발현용 재조합벡터 및 진핵세포 내 벡터전달시스템용 살모넬라 티피뮤리움의 조합 조성물 | |
| Eslahi et al. | Fusogenic activity of vesicular stomatitis virus glycoprotein plasmid in tumors as an enhancer of IL-12 gene therapy | |
| MXPA00005816A (en) | Delivery of polypeptide-encoding plasmid dna into the cytosol of macrophages by attenuated suicide bacteria | |
| Souders et al. | Immunotherapeutic strategies against cancer using Listeria monocytogenes as a vector for tumor antigens | |
| Souders et al. | TUMOR ANTIGENS | |
| ZHIJIANG | Intravesical tumor necrosis factor-alpha gene therapy mediated by a novel liposome system in an orthotopic murine bladder cancer model |