PL189717B1 - Sposób wytwarzania kompozycji redukującej kolonizację ssaków inwentarza żywego przez bakterie patogeniczne jelitowo - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania kompozycji zmniejszajacej kolonizacje ssaków inwentarza zywego przez bakterie patogeniczne jelitowe, znamienny tym, ze pobiera sie wspólza- wodniczo eliminujaca kulture sluzówkowa ze ssaków inwentarza zywego, pochodzaca od zwierzecia wolnego od patogenów, subhoduje sie te kulture oraz przygotowuje sie kom- pozycje odpowiednia do podawania tej kultury zwierzeciu. PL PL PL PL

Description

WynaJlazek dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji redukującej kolonizację ssaków inwentarza żywego przez bakterie patogeniczne jelitowoo.

Patogeny jelitowe, takie jak Salmonella i Escherichia coli 0157:H7, powodują nieakceptowalnie dużą zapadalność na choroby i śmiertelność u ludzi oraz mogą zmniejszyć produktywność w populacjach inwentarza żywego. Patogeny przewodu pokarmowego u ludzi zwykle pochodzą z jelitowego zakażenia mięs spożywanych przez ludzi. Na sympozjum Tracking Foodbome Pathogens from Farm to Table: Data Needs to Evaluate Control Groups, które odbyło się w styczniu 1995, postawione zostało pytanie „Jak ważne są choroby pochodzące od żywności?” Tracking Foodbome Pathogens from Farm to Table: Data Needs to Eyaluate Control Groups, Waszyngton, DC, 3-29, 1995). Stwierdzono, że w Stanach Zjednoczonych jest szacunkowo 6,5 - 33 miliony przypadków chorób pochodzących od żywności każdego roku z liczbą przypadków śmiertelnych dochodzącą do 9θθ0. Służba Badań Ekonomicznych USDA ocenia, że koszty medyczne USA i straty produkcyjne spowodowane przez siedem patogenów pochodzących z żywności wynoszą 5,6-9,4 miliarda USD rocznie. Menning ocenia, że w Stanach Zjednoczonych jest rocznie ponad 5 milionów przypadków chorób pochodzących od żywności z mięsa i drobiu, przy czym dużą część można przypisać zakażeniom bakteriami Salmonella i Campylobacter (J. Am.-Vet. Med. Assoc., wol. 192,494 - 497, 1988). Roberts ocenia, że każdy przypadek sałmonelozy kosztuje 700 USD Amer. J. Agr. Econ. wol. 71, 468-474, 1989). Na podstawie badań oceniających choroby pochodzące od żywności w innych krajach nie byłoby nieuzasadnione twierdzenie, że liczba biegunek rocznie, które można przypisać bakterii Salmonella prawdopodobnie przewyższa 100 miliardów z szacunkowym kosztem przekraczającym 25 miliardów dolarów. Patogeny te powodują również ból, cierpienia i utratę życia. Ponadto bakterie jelitowo patogenetyczne mogą również powodować znaczne straty ekonomiczne przez zakażenie inwentarza żywego. Techniki eliminacji współzawodniczej (CE) są stosowane do zmniejszania kolonizacji drobiu przez bakterie jelitowo patogenetyczne. Nurmi i inni (Nature, wo. 241, 210 - 211, 1973) stwierdził, że preparaty z dojrzałych, zdrowych kurcząt powodowały ochronę przed kolonizacją bakteriami Salmonella młodych kurcząt, których mikroflora nie została jeszcze utworzona. Podawanie nieokreślonych preparatów CE kurczętom przyspiesza dojrzewanie właściwej flory u świeżo wyklutych ptaków i zapewnia podłoże dla naturalnego procesu przenoszenia mikroflory od dorosłej kury do jej potomstwa.

Z opisu patentowego USA nr 4.335.107, (czerwiec 1982, Snoeybos i inni) znana jest technika mikroflory CE do zapobiegania kolonizacji bakterii Salmonella przez liofilizowanie kału i hodowanie takiego preparatu w warunkach beztlenowych. Natomiast z opisu patentowego USA nr 4.657.762 (Mikola i inni, kwiecień 1987) znany jest sposób wykorzystywania kałowej zawartości jelita i zawartości jelita ślepego jako źródło mikroflory C do zapobiegania kolonizacji bakteriami Salmonella. Traktowanie tego typu kulturą wymagało, by media były beztlenowe i zrównoważone pod względem pH.

W opisie patentowym USA nr 5.451.400 (Stern i inni, 19 września 1995) opisano śluzówkową kompozycję Ce do ochrony drobiu przed kolonizacją bakteriami Salmonella i Campylobactor, gdzie zeskrobuje się warstwę mucynową wstępnie przepłukanego jelita ślepego, a wyskrobmy trzymane w środowisku pozbawionym tlenu poddaje się hodowli beztlenowej.

Z kolei w opisie patentowym USA nr 5.478.557 (Nisbet i inni, 26 grudnia 1996) opisano probiotyk, który można otrzymać od różnych zwierząt domowych, łąęznie z drobiem oraz końmi, trzodą chlewną i bydłem, ale bez ograniczenia tylko do nich. Nisbet i inni opisują, że stabilny określony probiotyk korzystnie uzyskuje się z kału, zawartości jelita grubego i/lub jelita ślepego dorosłego zwierzęcia docelowego. Opisują oni ponadto, że duże ilości probiotyku można wytwarzać przez hodowlę ciągłą lub prowadzoną partiami, przy czym hodowla partiami jest kontynuowana aż stężenie kwasu octowego stanie się większe niż lub równe około 20 mM, stężenie kwasu propionowego większe niż lub równe około 10 mM, a stężenie kwasu masłowego plus izomasłowego większe niż lub równe 15 mM.

Asplund i inni (Journal of Applied Bacteriology, wol. 81, 217 - 223, 1996) opisują model in vitro jelita świńskiego i jego zastosowanie, by pokazać hamowanie „ Yersinia enterocolitica 0:3 przez świńską mikroflorę z jelita krętego i ślepego. Zbiera się jelita ślepe i odległe części jelita cienkiego, trzyma się je w warunkach beztlenowych, a zawartość gromadzi się razem i hoduje. Wykazano, że inokula z jelita ślepego i krętego hamują wzrost hodowanych Y. enterolitica, przy

189 717 czym flora z jelita ślepego jest nieco skuteczniejsza niż flora z jelita krętego. Nie przedstawiono skuteczności in vivo.

Przedmiotowy wynalazek przedstawia po raz pierwszy kompozycję i sposób zmniejszania in vivo i/lub zapobiegania kolonizacji ssaków inwentarza żywego, przez bakterie patogenetyczne j elitowo.

Celem przedmiotowego wynalazku jest zatem opracowanie sposobu otrzymywania subkultury pochodzącej ze śluzówki zwierzęcej do kontrolowania kolonizacji zwierząt przez bakterie patogenetyczne jelitowo.

Celem przedmiotowego wynalazku jest również opracowanie sposobu traktowania zwierząt w celu kontrolowania kolonizacji zwierząt przez bakterie jelitowo patogenetyczne przez zastosowanie preparatu uzyskanego z kultury śluzówkowej. Dalsze cele i zalety staną się oczywiste z dalszej części opisu.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat coraz większą wagę przypisuje się infekcjom jelitowym u ludzi. Dobrze udokumentowano również zależność pomiędzy skażeniem inwentarza żywego a infekcją u ludzi. Podczas produkcji i przetwarzania zwierząt, na przykład inwentarza żywego, materiały fekalne zawierające patogeny mogą być przenoszone na mięso i dostawać się do kuchni przygotowujących pożywienie. Trzoda chlewna oraz drób, bydło i żywność pochodzenia morskiego są ważnymi nosicielami Salmonella (Bean i inni, J. Food Protect., wol. 53, 8094 - 17, 1990; Lammerding i inni, J. Food Protect., wol. 51, 47 - 52, 1988). Zwierzęta nie stykające się dotychczas z zarazkiem ulegają zakażeniu od zanieczyszczonej paszy, chronicznych nosicieli wprowadzonych do populacji, zakażonych gryzoni lub od zakażonego personelu farmy (Heard, Vet. Rec., wol. 85, 482 - 484, 1969; Williams i inni, J. Hyg. Camb., wol. 66, 281-293, 1968; Wilcock i inni, Diseases in Swine, Leman et al, eds., Iowa State University Press, Ames IA, 570 - 583, 1992; Duhamel i inni, Proc. 12^tó Int. Symp. New and Emerging Infect. Dis., San Diego, CA, 381, 1992). Dla nierogacizny w rzeźni początkowym źródłem zakażenia jest świnia-nosiciel, a przenoszenie zarazków odbywa się przypuszczalnie przez kontakt pomiędzy poszczególnymi zwierzętami lub na skutek narażenia na skażone środowisko fizyczne (Newell i inni, J. Am. Vet. Med. Assoc., wol. 158, 8 - 98, 1971). Te zakażone zwierzęta z kolei zakażają budynki, sprzęt i personel, co prowadzi do zakażenia gotowego produktu (Williams i inni, Am. J. Pub. Health, wol. 60, 926 - 929, 1970; Newel i inni, j.w.; Morgan i inni, Epidemiol. Infect., wól. 98, 323 - 330, 1987). Pierwotnym źródłem pozostaje jednak świnia-nosiciel. Obecne wysiłki w celu zidentyfikowania i zlikwidowania populacji nosicieli w inwentarzu żywym zostały wstrzymane przez brak informacji dotyczących epidemiologii i patogenezy salmonelozy u inwentarza żywego.

Ponieważ gatunki Salmonella są szeroko rozpowszechnione i dobrze utrzymują się w środowisku, eliminacja i kontrola jest trudna. Jest dość dużo informacji o wirulencji Salmonella w odniesieniu do patogenezy u człowieka. Bardzo mało jest jednak informacji o zwierzęcych źródłach tego czynnika infekcyjnego.

Zrozumienie procesu infekcyjnego u źródeł produkcji żywności pochodzenia zwierzęcego zyskało ważny priorytet, a kontrola i eliminowanie zwierzęcia-nosiciela uchroni przed odzwierzęcym przenoszeniem choroby. Kontrolowanie choroby nabytej poprzez pożywienie można najlepiej osiągnąć przez identyfikowanie i eliminowanie populacji nosicieli. Chociaż stan nosicielstwa może występować w dowolnym czasie w życiu zwierzęcia, narodziny będą pierwszą sposobnością narażenia zwierzęcia na patogen. Odkryto zastosowanie kultury śluzówkowej do kontrolowania kolonizacji patogenu u zwierząt wykorzystywanych do produkcji żywności.

Terminem „kontrolowanie” określa się zmniejszenie lub uniemożliwienie kolonizacji bakterii jelitowo patogenetycznych. Przez określenie „zwierzęta wykorzystywane do produkcji żywności” rozumie się zwierzęta zjadane przez ludzi.

Unikatową kulturę bakteryjną otrzymuje się z wyskrobin z przewodu jelitowego zwierząt pozbawionych patogenu. Zwierzęta te mogą być w dowolnym wieku, ale najkorzystniejsze jest użycie do tego celu zwierząt młodych, aby chronić noworodki i starsze zwierzęta. Tę początkową kulturę dzieli się na subkultury i następnie podaje młodym zwierzętom. Sposób według niniejszego wynalazku nadaje się do stosowania wobec każdego zwierzęcia udomowionego lub dzikiego, a zwłaszcza wobec inwentarza żywego ho189 717 dowanego na potrzeby żywienia ludzi, który to inwentarz mógłby służyć jako nosiciel docelowych patogenów. Inwentarz żywy obejmuje bydło, cielęta, wieprze, świnie, owce, jagnięta, bawoły, kozy, króliki, ryby, skorupiaki itp. Korzystne jest podawanie preparatu subkultury współzawodniczo eliminującego ze śluzówki inwentarza żywego (LMCES) dwa razy w ciągu pierwszych 24 godzin od urodzenia. Jednakże preparat ten może być podany w każdej chwili życia zwierzęcia np. w sposób ciągły lub w wybranych czasach w trakcie życia zwierzęcia. W sposób ciągły oznacza, że stałe źródło LMCES jest zapewnione przez podawanie poprzez wodę pitną, pokarm, przez zgłębnik lub za pośrednictwem aerozolu. Preparat LMCES może być podawany codziennie w paszy lub w wodzie, co tydzień, co miesiąc itd. w sposób ciągły. Zwrot „w wybranych chwilach w trakcie życia” zwierzęcia oznacza podawanie kultury LCME w krytycznych punktach kontroli, jakie występują podczas narodzin, odstawienia od matki, choroby, podawania antybiotyków, nadmiernego nagrzania, odwodnienia, oziębienia, podczas transportu, np. przy przemieszczaniu do innych budynków w procesie produkcyjnym i przed transportem do rzeźni itd. Docelowe patogeny obejmują wszystkie bakterie patogeniczne wobec jelita ludzkiego, zdolne do skolonizowania zwierząt, zwłaszcza inwentarza żywego hodowanego na żywność dla ludzi. Bakteriami patogenicznymi wobec jelita ludzkiego są bakterie zdolne do skolonizowania lub o których wiadomo, że kolonizują przewód pokarmowy człowieka, albo rozsiewające toksyny zawarte w nich, które to bakterie są zdolne do spowodowania chorób przewodu pokarmowego u człowieka będącego ich żywicielem. Przykłady bakterii jelitowo-patogenicznych u człowieka obejmują gatunki Salmonella, gatunki Campylobacter i Escherichia coli, ale bez ograniczenia tylko do nich.

Preparat LMCES można łączyć z innymi kulturami lub leczeniami skutecznymi w kontrolowaniu Salmonella u zwierząt, takimi jak np. Lactobacillus, fruktooligosacharydy i drożdże. Dodatkowo wobec preparatu LMCES można stosować inne konwencjonalne lub znane leczenia zwierząt, a zwłaszcza leki do hamowania rozwoju patogenów jelitowych, jeżeli tylko nie mają one wpływu na aktywność preparatu LMCES.

Według wynalazku sposób wytwarzania kompozycji zmniejszającej kolonizację ssaków inwentarza żywego przez bakterie patogeniczne jelitowo charakteryzuje się tym, że pobiera się współzawodniczo eliminującą kulturę śluzówkową ze ssaków inwentarza żywego, pochodzącą od zwierzęcia wolnego od patogenów, subhoduje się tę kulturę oraz przygotowuje się kompozycję odpowiednią do podawania tej kultury zwierzęciu.

Korzystnie we wspomnianym etapie otrzymywania usuwa się ze zwierzęcia wolnego od patogenów dolną część jelita, łącznie z jelitem ślepym i umieszcza się ją w sterylnym pojemniku.

Wspomniany pojemnik trzyma się korzystnie w środowisku beztlenowym przez cały czas przygotowywania kultur.

Najkorzystniej zawartość jelita usuwa się za pomocą płukania i skrobania. Skrobanie wykonuje się korzystnie za pomocą skalpela o tępej krawędzi.

Najkorzystniej po skrobaniu zawajrtość jelita płucze się ponownie, a następnie przeprowadza skrobanie za pomocą skalpela o ostrej krawędzi.

Ostrą krawędź skalpela i ściankę jelita korzystnie płucze się za pomocą medium, aby otrzymać komórki nabłonkowe i mikroflorę tubylczą.

Kulturę hoduje się beztlenowo korzystnie w temperaturze 35 - 40°C przez około 48 h, przenosi się do świeżego medium beztlenowego i powtórnie inkubuje się przez około 48 .h.

Następnie korzystnie przeprowadza się badanie na obecność ludzkich patogenów jelitowych za pomocą technik izolowania.

Korzystnie przeprowadza się następnie łączenie wymienionej kultury z co najmniej jedną inną kulturą skuteczną przy kontroli Salmonelli.

Korzystnie co najmniej jedna inna kultura jest wybrana z grupy zawierającej Lactobacillus, drożdże i ich mieszaniny.

Następnie korzystnie przeprowadza się zamrażanie kompozycji i/lub suszenie kompozycji przed podaniem zwierzęciu.

Korzystnie przed etapem subhodowania aseptycznie usuwa się dolną .część jelita z wymienionego zwierzęcia wolnego od patogenu, wywraca się wymienione jelito, wypłukuje się je, skrobie się je, a następnie powtarza się wymienione etapy płukania i skrobania w celu

189 717 otrzymania komórek nabłonkowych i mikroflory, wszczepia się wymienione wypłuczyny i wyskrobmy w sterylne medium beztlenowe w celu utworzenia inokulum i hoduje się to inokulum przez 48 godzin, by wytworzyć kulturę, oraz subhoduje się tę kulturę w celu otrzymania wymienionej kompozycji.

Korzystnie wspomniana subkultura jest subkulturą beztlenową.

Korzystniej wspomnianą kulturę otrzymuje się z wyskrobin z jelita pochodzących od wspomnianych ssaków wolnego od patogenu.

Wymienione jelito jest najkorzystniej dolną częściąjelita.

Zgodnie ze sposobami według przedmiotowego wynalazku zwierzętom podawane są kompozycje subkultur współzawodniczo eliminujących ze śluzówki ssaków, zwłaszcza inwentarza żywego. Użyte tu określenie „podawanie” obejmuje każdy odpowiedni sposób doustnego podawania tych kompozycji zwierzętom, jak to jest znane, np. za pomocą zgłębnika, przez karmienie, przez rozpylanie lub nakładanie pasty na brodawki sutkowe matek lub na sztuczne brodawki sutkowe, poprzez podawane mleko itd. Preparat LMCES może być również podawany poprzez dolny otwór jelitowy. Preparat może być podawany w dowolnej znanej postaci, np. w postaci cieczy, pasty, nakładki żelowej lub aerozolu. Preparaty LMCES są podawane zwierzętom w każdym wieku, łącznie ze świeżo urodzonymi, w ilościach skutecznych, by przynajmniej zmniejszyć w jelicie zwierząt ilość bakterii jelitowo-patogenicznych u człowieka. Użyty tu zwrot „zmniejszenie ilości bakterii” lub „przynajmniej zmniejszenie ilości bakterii jelitowo-patogenicznych u człowieka” odnosi się do zmniejszenia liczby bakterii w porównaniu z ich liczbą oczekiwaną u zwierzęcia, które nie otrzymało leczenia sposobami według niniejszego wynalazku. Do takich porównań można użyć każdego dokładnego sposobu mierzenia, zliczania i porównywania bakterii występujących w przewodzie jelitowym zwierząt, co jest oczywiste dla fachowców. Użyte tu zwroty „w skutecznych ilościach”, „skuteczna ilość” lub „ilość skuteczna” odnoszą się do takiej ilości podawanego preparatu LMCES, przy której wynikiem podawania jest przynajmniej zmniejszenie u zwierząt w każdym wieku ilości bakterii jelitowo patogenicznych u człowieka. Ilość preparatu będzie się zmieniać w zależności od wielkości leczonego zwierzęcia i od sposobu podawania. U małych zwierząt, łącznie z noworodkami małych zwierząt można podawać poprzez zgłębnik około 4-8 ml, drugiego lub późniejszego pasażu kultury LMCES objętej pasażowaniem subkultur przez 48 h, przy czym korzystną dawką jest 5 ml. Dla dużych zwierząt, łącznie z noworodkami dużych zwierząt drugi lub późniejszy pasaż LMCES z pasażowania subkultur przez 48 godzin można podawać nie rozcieńczony lub w rozcieńczeniu około 10-krotnym doustnie w zawiesinie w cieczy, gdzie rozcieńczalnikiem może być np. mleko, woda itd. Mogą być również wykorzystywane dalsze pasaże subkultur, ale prawdopodobnie będą mniej skuteczne. Można podawać bezpośrednio rozcieńczone i nie rozcieńczone ciekłe preparaty LMCES. W przypadku nowo narodzonych zwierząt preparat LMCES podawany jest w ciągu około 2-48 h od narodzenia, korzystniej około 2-6 h od narodzenia, a następnie podaje się drugą dawkę około 18-24 h później. Najkorzystniejsza procedura polega na podaniu pierwszej dawki w ciągu około 6 h od narodzenia, a następnie drugiej dawki około 24 h po narodzeniu. Zwykle pierwszą dawkę podaje się około 2-48 h przed odstawieniem od matki, transportem lub przemieszczeniem do innych budynków, przy czym korzystny czas wynosi około 2-6 h. W takich przypadkach może być potrzebne tylko jedno podanie preparatu, ale drugi raz preparat może być podany 18-24 h po pierwszym podaniu. Zmiany w procedurach będą odbiciem przemysłowych praktyk hodowlanych. Dodatkowe dawki mogą być podawane przy odstawianiu od matki, przed przemieszczaniem w warunkach produkcyjnych lub przed transportem do rzeźni. Przy podawaniu w paszy lub wodzie podawanie takie odbywa się codziennie.

Preparat LMCES przygotowuje się przez aseptyczne usunięcie dolnej części jelita zwierzęcia, łącznie z jelitem ślepym i umieszczenie go w sterylnym pojemniku. Dolną częścią jelita nazywana jest tu część zaczynająca się od końca żołądka aż do jelita ślepego włącznie. Pojemnik trzyma się w środowisku beztlenowym przez cały czas preparowania kultur. Wybrany odcinek jelita wywraca się dowolnym znanym sposobem. Zawartość jelita usuwa się przez płukanie i skrobanie. Płukanie przeprowadza się za pomocą odpowiedniego beztlenowego

189 717 medium. W etapie płukania można wykorzystywać każde medium nadające się do wymienionego celu, łącznie z wodą. Korzystnym medium jest medium beztlenowe, przy czym szczególnie korzystne jest medium beztlenowe uprzednio zredukowane, zrównoważone Eh. Skrobanie powierzchniowe przeprowadza się za pomocą narzędzia o tępej krawędzi, takiego jak np. ostrze skalpela o tępej krawędzi. Po skrobaniu światło jelita ponownie płucze się, po czym przeprowadza się skrobanie narzędziem z ostrą krawędzią, takim jak np. ostra krawędź skalpela lub innego odpowiedniego instrumentu. Narzędzie z ostrą krawędzią i wewnętrzną ścianką jelita płucze się za pomocą medium, jak opisano powyżej, aby otrzymać komórki nabłonkowe i mikroflorę tubylczą, a popłuczyny gromadzi się w sterylnym naczyniu. Można również ciąć tkankę bezpośrednio w medium kultury bez uprzedniego skrobania. Korzystne jest trzymanie tkanki w atmosferze zredukowanej, to znaczy w strumieniu azotu, kiedy rozpoczyna się procedurę. Wypłuczyny lub wyskrobmy wraz z komórkami nabłonkowymi i mikroflorą wykorzystuje się do utworzenia zawiesiny, a jej zawartość wszczepia się w sterylne beztlenowe medium w celu utworzenia kultury. Nazwą „mikroflora” objęto tu bakterie tubylcze. Kulturę hoduje się beztlenowo w temperaturze 35-40°C przez około 48 h, przenosi się do świeżego medium beztlenowego i powtórnie inkubuje się przez około 48 h. Ta druga inkubacja jest drugim pasażem subkultury 48 h i jest najkorzystniejszym z używanych preparatów LMCE. Można również wykorzystywać inne pasaże subkulturowe, jak to opisano powyżej. Kultura jest następnie badana na obecność ludzkich patogenów jelitowych za pomocą odpowiednich i konwencjonalnych technik izolowania. Kultury pozbawione patogenów są podawane bezpośrednio, liofilizowane lub zamrażone przy użyciu konwencjonalnych technik mrożenia hodowanych komórek. Krew zwierząt będących dawcami powinna być badana serologicznie na poziomy przeciwciał wobec odpowiednich patogenów zwierzęcia-żywiciela, łącznie z człowiekiem. Należy stosować tylko kultury pochodzące od zwierząt nie przechodzących serokonwersji.

Podane poniżej przykłady mają jedynie ilustrować wynalazek, a nie ograniczać jego zakresu, który jest określony przez zastrzezenia patentowe.

Przykład I realizacji wynalazku polega na wytwarzaniu bydlęcych kultur śluzówkowych.

Jelita zdrowego dorosłego bydła otrzymuje się z lokalnej rzeźni i transportuje w worku z tworzywa sztucznego do laboratorium w ciągu 1 godziny w sterylnym środowisku beztlenowym. Kulturę śluzówkową przygotowuje się z dolnej części jelita. Przed wycięciem kawałka jelita, który ma być użyty, otaczający obszar podwiązuje się sznurkiem, by uniemożliwić wyciekanie zawartości jelita. Odcinek o długości w przybliżeniu 10 - 13 cm (4 - 5 cal) wycina się aseptycznie i umieszcza w sterylnym pojemniku. Pojemnik ten umieszcza się następnie w wanience, która jest nieprzerwanie przepłukiwana gazowym azotem nie zawierającym tlenu. Wszystkie manipulacje przeprowadza się poniżej krawędzi wanienki, aby zapewnić zbieranie kultury w środowisku beztlenowym. Odcinek tkanki jelitowej wywraca się ostrożnie na sterylnym pręcie szklanym bez dotykania wewnętrznej powierzchni. Po wywróceniu zawartość usuwa się przez płukanie i skrobanie. Płukanie przeprowadza się przez doprowadzenie za pomocą strzykawki uprzednio zredukowanego infuzyjnego bulionu mózgowo-sercowego (PR-BHIB). Do płukania nadaje się każde inne odpowiednie medium beztlenowe. Skrobanie przeprowadza się tępą krawędzią ostrza sterylnego skalpela. Wewnętrzną stronę jelita przepłukuje się, skrobie i następnie ponownie przepłukuje. W tym etapie korzystne jest delikatne zeskrobywanie nabłonka jelita ślepego ostrą krawędzią skalpela. Można jednak tkankę ciąć bezpośrednio do medium hodowlanego. Po oskrobaniu wywróconego jelita skalpel i końcówkę ścianki wewnętrznej jelita ponownie przepłukuje się za pomocą PR BHIP. Te końcowe popłuczyny gromadzi się w sterylnym naczyniu. Popłuczyny z komórkami nabłonkowymi i bakteryjnymi zasysa się za pomocą sterylnej strzykawki i igły i wykorzystuje do inokulacji w probówce ze sterylnym PR-BHIB poprzez gumową przegrodę. Probówki są inkubowane w temperaturze 35°C przez 48 godzin, przenoszone i powtórnie inkubowane przez dalsze 48 godzin. Kulturę bada się na obecność interesujących ludzkich patogenów jelitowych, takich jak Salmonella, E. coli i Camplyobacter. Jeżeli kultura jest pozbawiona patogenów

189 717 zarówno ludzkich jak i zwierzęcych i uważana jest za bezpieczną, wówczas jest gotowa do podania lub przechowywania do późniejszego użycia.

Przykład II realizacji wynalazku polega na przeprowadzeniu testu skuteczności bydlęcego preparatu LMCES.

Bydlęce kompozycje LMCES, jak opisano powyżej w przykładzie I, podawane są nowo narodzonym cielętom w przybliżeniu 2-krotnie w ciągu pierwszych 24 godzin życia.

Kultura jest podawana doustnie za pomocą butelki ze smoczkiem. Każde cielę otrzymuje w przybliżeniu 500 ml preparatu LMCES bez rozcieńczenia lub w rozcieńczeniu w przybliżeniu 10-krotnym w mleku (przy każdym podawaniu). Po podaniu cielętom umożliwia się normalne pobieranie pożywienia. Około 24 godzin po podaniu każde cielę otrzymuje za pomocą zgłębnika dojelitowego w przybliżeniu 108 komórek odpornych na kwas nalidiksynowy E. coli 0157:H7. Po tej prowokacji cielęta są hodowane w odizolowanych pomieszczeniach przez około 7 dni, aby wszelkie tymczasowe bakterie E. coli, 0157:H7 mogły opuścić przewód pokarmowy. Następnie cielęta te są zabijane, wyjmuje się aseptycznie jelita ślepe i umieszcza się je w sterylnych workach z tworzywa sztucznego. Następnie jelita ślepe bada się na obecność i poziom E. coli 0157:H7. Logarytm ze średniej liczby docelowych patogenów na gram jelit ślepych dla całej grupy nazywany jest współczynnikiem kolonizacji (CF). Stosunek CF (grupa kontrolna bez leczenia)/CF (grupa leczona)) nazywany jest współczynnikiem ochrony (PF). Przez porównanie PF jednej śluzówkowej kultury CE z PF innej kultury otrzymuje się względną wartość stopnia ochrony tej kultury.

Przykład HI polega na wytwarzaniu kultur CE śluzówki świńskiej.

Młodą świnię, której pozostało w przybliżeniu 1-6 miesięcy do wieku pełnej dojrzałości, uspokaja się mieszaniną leków rutynowo stosowanych w tej dziedzinie. Zastosowano mieszaninę 8 mg/kg Ketaset, 6 mg/kg Telazol i 4 mg/kg Rompun. Następnie świnię uśmierca się przez wykrwawienie. Jelito ślepe usuwa się aseptycznie i umieszcza w sterylnej płytce Petriego. Płytkę tę umieszcza się następnie w wanience, która jest ciągle przepłukiwana gazowym azotem pozbawionym tlenu. Wszystkie manipulacje trzeba przeprowadzać poniżej krawędzi wanienki, aby zapewnić zbieranie kultury w środowisku beztlenowym. Odcinek jelita ślepego ostrożnie wywraca się na sterylnym narzędziu bez dotykania wewnętrznej powierzchni. Po wywróceniu zawartość usuwa się przez wypłukiwanie i skrobanie. Płukanie przeprowadza się przez doprowadzanie strzykawką uprzednio zredukowanego bulionu. Skrobanie przeprowadza się tępą krawędzią sterylnego narzędzia. Wewnętrzną stronę jelita płucze się, skrobie i następnie ponownie płucze. Potem nabłonek jelita ślepego delikatnie zeskrobuje się ostrą krawędzią skalpela lub też jelito można pociąć na małe kawałki (około 5 cm). Po wyskrobaniu odwróconego jelita ślepego skalpel i we ściankę ponownie przemyto za pomocą PR-BHIB. Te końcowe popłuczyny lub kawałki jelita ślepego zbiera się w sterylnym naczyniu. Popłuczyny wraz z komórkami bakteryjnymi zasysa się sterylną strzykawką i igłą i wykorzystuje się do wszczepienia w probówkę ze sterylnego PR-BHIB poprzez gumową przegrodę. Probówki takie są inkubowane przy temperaturze w przybliżeniu 35°C przez około 48 h, przenoszone i ponownie inkubowane przybliżeniu przez następne 48 h. Kulturę tę bada się na obecność interesujących ludzkich patogenów jelitowych, takich jak Salmonella, E. coli i Campylobacter. Jeżeli kultury są pozbawione patogenów i wydają się bezpieczne, są gotowe do użycia lub składowania.

Przykład IV polega na badaniu skuteczności kultury CE ze świńskiej śluzówki (LMCES).

Maciory o znanych datach oproszenia trzymano w klatkach prośnych w izolatkach. Każdą maciorę kontrolowano co 4 godziny zaczynając na jeden dzień przed znaną datą oproszenia, aby zapewnić, że pierwsza kultura LMCES będzie podana we właściwym czasie. Przy oproszeniu prosiętom pozwolono ssać, aby zapewnić im otrzymanie siary i każdemu prosięciu podano w przybliżeniu 5 ml preparatu LMCES za pomocą zgłębnika dojelitowego w czasie 2-6 h od urodzenia. Drugą dawkę w przybliżeniu 5 ml podano po około 24 h. Około 48 h od urodzenia (24 h od ostatniego podania preparatu LMCES) prosięta prowokowano przez wkroplenie do nosa około CFU S. choleraesuis. Po podaniu preparatu prosiętom pozwolono na

189 717 normalne pobieranie pokarmu. Codziennie przez około 7 dni od prowokacji u każdego prosięcia mierzono temperaturę w odbytnicy i pobierano wymaz z odbytnicy do hodowania bakterii Salmonella. W przybliżeniu 7 dnia od prowokacji wszystkie prosięta uśmiercono i przeprowadzono sekcję. Tkanki zbierane do ilościowego badania bakteriologicznego obejmowały migdałki (ton), żuchwowe węzły chłonne (min), płuca, barkowe węzły chłonne (bln), wątroby, śledziony (spi), środkowe jelita kręte, połączenia krętniczo-okrężnicze (icj), krętniczo-okrężnicze węzły chłonne, jelita ślepe (cec), zawartości jelit ślepych (cc), okrężnicę (col), węzły chłonne okrężnicy i ścianki żołądka (sw). Na zawartości jelita ślepego i na połączeniu okrężniczo-krętniczym przeprowadzano ilościowe badania bakteriologiczne w celu określenia poziomu Salmonella w tkankach.

Dla oceny wpływu, jaki maciory mogły mieć na prosięta, zbierano również kał macior przed oproszeniem, w ciągu 48 h od oproszenia i w przybliżeniu 7 dnia od prowokowania prosiąt i poddano hodowli (maciory nigdy nie były bezpośrednio prowokowane przez S. choleraesuls). Prosiętom kontrolnym nie podano preparatu LMCES, ale prowokowano je w wieku około 48 h. Tkanki gromadzono i badano jak opisano powyżej.

U wszystkich prosiąt objętych eksperymentem nie było widocznych żadnych oznak klinicznych. Pozyskiwanie bakterii Salmonella z wymazów odbytniczych było różne. Jednakże w przybliżeniu 41% tkanek dało wynik pozytywny w przypadku prosiąt potraktowanych preparatem LMCES w porównaniu z około 63% tkanek pozytywnych od prosiąt kontrolnych (tabela 1, Podsumowanie prób 1 i 2). W przypadku prosiąt pochodzących od macior z wynikiem negatywnym (próba 1 - maciory 1, 2, 3 i próba 2 - maciory 2) 39% [120/310] tkanek miało wynik pozytywny w porównaniu z 78% [47/60] (próba 1 - maciora kontrolna z wynikiem negatywnym) tkanek pozytywnych od maciory kontrolnej. W porównaniu z prosiętami, którym nie podano preparatu CE, u prosiąt, które potraktowano preparatem CE, obserwowana jest redukcja bakterii Salmonella. U prosiąt potraktowanych preparatem LMCES zaobserwowano redukcję bakterii Salmonella w zawartości jelita ślepego (CC) lub na połączeniu z jelitem krętym (ICJ) w przybliżeniu 2 - 5 log w porównaniu z prosiętami kontrolnymi (bakterie Salmonella były usunięte z ICJ i CC u prosiąt odpowiednio od macior 2 i 1) (tabela 2, Próby 1 i 2). W próbie 1 wszystkie maciory były wolne od patogenów. Wszystkie maciory pierwotnie odrzucały jedną grupę surowiczą, co ustało przed oproszeniem. Przy oproszeniu maciora 1 i maciora kontrolna odrzucały grupę surowiczą B. W próbie 2 prosięta od macior 1 i 2 odrzucały tylko Salmonella typu B, a nie prowokację S. choleraesuls. Prosięta kontrolne w próbach 1 i 2 nie otrzymały preparatu LMCES, a tylko organizm prowokujący. Jak można zauważyć, występują tu nie tylko zmniejszone poziomy organizmu prowokującego, ale również zmniejszone poziomy kolonizacji natywnej. Chociaż obserwuje się redukcję u prosiąt już skolonizowanych bakteriami Salmonella innymi niż otrzymane z prowokacji, stopień ochrony jest zmniejszony, co sugeruje, że u prosiąt ssących można zapewnić wcześniejsze podanie.

Powyższy szczegółowy opis przedstawiono szczegółowo tylko celem ilustracji, a fachowcy mogą tu wprowadzić zmiany bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku.

Tabela 1. Zachorowalność i poziomy Salmonella u prosiąt potraktowanych preparatem LMCE i u prosiąt me potraktowanych tym preparatem (kontr.).

Claims (17)

1. Sposób wytwarzania kompozycji zmniejszającej kolonizację ssaków inwentarza żywego przez bakterie patogeniczne jelitowe, znamienny tym, że pobiera się współzawodniczo eliminującą kulturę śluzówkową ze ssaków inwentarza żywego, pochodzącą od zwierzęcia wolnego od patogenów, subhoduje się tę kulturę oraz przygotowuje się kompozycję odpowiednią do podawania tej kultury zwierzęciu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że we wspomnianym etapie otrzymywania usuwa się ze zwierzęcia wolnego od patogenów dolną część jelita, łącznie z jelitem ślepym i umieszcza się ją w sterylnym pojemniku.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wspomniany pojemnik trzyma się w środowisku beztlenowym przez cały czas przygotowywania kultur.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zawartość jelita usuwa się za pomocą płukania i skrobania.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że skrobanie wykonuje się za pomocą skalpela o tępej krawędzi.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że po skrobaniu zawartość jelita płucze się ponownie, a następnie przeprowadza skrobanie za pomocą skalpela o ostrej krawędzi.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ostrą krawędź skalpela i ściankę jelita płucze się za pomocą medium, aby otrzymać komórki nabłonkowe i mikroflorę tubylczą.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kulturę hoduje się beztlenowo w temperaturze 35-40°C przez około 48 h, przenosi się do świeżego medium beztlenowego i powtórnie inkubuje się przez około 48 h.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że następnie przeprowadza się badanie na obecność ludzkich patogenów jelitowych za pomocą technik izolowania.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że następnie przeprowadza się łączenie wymienionej kultury z co najmniej jedną inną kulturą skuteczną przy kontroli Salmonelli.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że co najmniej jedna inna kultura jest wybrana z grupy zawierającej Lactobacillus, drożdże i ich mieszaniny.

12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że następnie przeprowadza się zamrażanie kompozycji przed podaniem zwierzęciu.

13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że następnie przeprowadza się zamrażanie i suszenie kompozycji przed podaniem zwierzęciu.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed etapem subhodowania aseptycznie usuwa się dolną część jelita z wymienionego zwierzęcia wolnego od patogenu, wywraca się wymienione jelito, wypłukuje się je, skrobie się je, a następnie powtarza się wymienione etapy płukania i skrobania w celu otrzymania komórek nabłonkowych i mikroflory, wszczepia się wymienione wypłuczyny i wyskrobiny w sterylne medium beztlenowe w celu utworzenia inokulum i hoduje się to inokulum przez 48 godzin, by wytworzyć kulturę, oraz subhoduje się tę kulturę w celu otrzymania wymienionej kompozycji.

,

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wspomniana subkultura jest subkulturą beztlenową.

16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wspomnianą kulturę otrzymuje się z wyskrobin z jelita pochodzących od wspomnianych ssaków inwentarza żywego wolnego od patogenu.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wymienione jelito jest dolną częściąjelita.