CZ120099A3

CZ120099A3 - Mukosální kompetitivní exklusivní kultura hospodářských zvířat pro snížení enteropathogenních bakterií

Info

Publication number: CZ120099A3
Application number: CZ991200A
Authority: CZ
Inventors: Norman J. Stern; Nelson A. Cox; Stan J. Bailey; Paula J. Cray
Original assignee: Spojené Státy Americké, Reprezentované The Secretary Of Agriculture
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 1999-07-14
Also published as: AU4907197A; CN1515667A; PL189717B1; AU738730B2; JP2002503084A; US6214335B1; WO1998016626A1; CZ294683B6; EP0932661A4; PL332621A1; UA73269C2; BR9712252A; CN1233285A; EP0932661A1; US5807546A; HUP0000148A2; CA2267233A1; HUP0000148A3

Description

Preparát z oškrabků střevného traktu zdravých zvířat se kutivuje a podává zvířatům. Tento preparát způsobuje výrazný rozsah ochrany proti následující kolonisaci enteropathogenními bakteriemi, včetně druhů Salmonelly, druhů Campylobacter a Escherichia coli 0157:H 7, které jsou běžně příčinou vysokého výskytu chorob a mortality u lidí a snižují produktivitu v produkci hospodářských zvířat.

w

Β · ΒΒ Β · Β ' ΒΒ ΒΒ '

ΒΒΒ 9 9 9 9 9 9 9 • Β Β ·· Β 9 9 9 9 9 9 Β

Β Β Β 9 9 9 9 9999 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9 9

MUKOSÁLNÍ KOMPETITIVNÍ EXKLUSIVNÍ KULTURA HOSPODÁŘSKÝCH ZVÍŘAT PRO SNÍŽENÍ ENTEROPATHOGENNÍCH BAKTERIÍ

Oblast techniky

Tento vynález se týká bakteriální kultury připravené ze střevního traktu zvířat třídy savců prostých pathogenů. Týká se rovněž subkultur takových kultur a metod použití subkultur k ochraně hospodářských zvířat před kolonisací enteropathogenními bakteriemi.

Dosavadní stav techniky

Enteropathogeny jako Salmonella a Escherichia coli 0157: H7 způsobují nepřijatelně vysoký výskyt chorob a úmrtnosti u lidí a mohou snižovat produktivitu populací hospodářských zvířat. Gastrointestinální pathogeny u lidí pocházejí typicky ze střevní kontaminace masy, která lidé požívají. Při symposiu Tracking Foodborne Pathogens from Farm to Table: Data Needs to Evaluate Control Groups konaném v lednu 1995 byla položena otázka Jak významné jsou choroby způsobené potravou? (Tracking Foodborne Pathogens from Farm to Table: Data Needs to Evaluate Control Groups, Washington, DC, 3-29, 1995). Bylo konstatováno, že ve Spojených Státech se odhaduje pro každý rok 6,5 milionu až 33 milionů případů potravou vyvolaných onemocnění, způsobujících až 9 000 úmrtí. Ekonomický výzkumný servis U.S. Department of Agriculture odhaduje u sedmi z potravy pocházejících pathogenů medicínské náklady a ztráty na produktivitě v U.S. A. na 5,6 miliard až 9,4 miliard dolarů ročně. Menning odhaduje, že ve Spojených Státech je ročně přes 5 milionů případů nemocí způsobených potravou z masa a drůbeže a mnoho procent z toho je třeba přičítat infekcím vyvolaným Salmonellou a Campylobacterem (J. Am. Vet. Med. Assoc., svazek 192, 494-497, 1988). Roberts odhaduje, že každý případ salmonelosy stojí 700 dolarů (Amer. J. Agr. Econ., svazek 71, 486-474, 1989). Na základě přehledů odhadujících potravou vyvolané choroby v jiných zemích není nelogické představit si, že na čelem světě roční počet potravou způsobených onemocnění diarrhoeou, které lze přičítat Salmonelle, pravděpodobně překračuje 100 miliard s odhadovanými náklady, které překračují 25 miliard dolarů.

Tyto pathogeny také odpovídají za bolest, utrpení a ztráty na životech. Vedle toho

00 • 0 0 • 0 0 00

0 0 0

0 0 0 ·· 0 • 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00000 0 000 000

0 0 0 0 0 0 00 mohou enteropathogenní bakterie způsobovat podstatné ekonomické ztráty infikováním hspodářských zvířat.

Kompetitivní eklusivní (CE) techniky se používají ke snížení kolonisace enteropathogenních bakterií u drůbeže. Nurmi a spol. (Nátuře, svazek 241, 201-211 1973) nalezli, že preparáty ze zralých, zdravých kuřat poskytly ochranu mladým kuřátkům, u kterých se ještě nevyvinula mikroflora proti kolonisaci Salmonellou. Podávání nedefinovaných CE preparátů kuřátkům urychluje zrání střevní flory u nově vylíhlých ptáků a poskytuje substrát pro přirozený proces přenosu mikroflory z dospělé slepice na jejího potomka.

Snoeyenbos a spol. (US patent č. 4,335,107, červen 1982) popisují CE techniku mikroflory pro prevenci kolonisace Salmonellou lyofilisací trusu a kultivací tohoto preparátu za anaerobních podmínek. Mikola a spol. (US patent č. 4,657,762, duben, 1987) použili jako zdroj CE mikroflory pro prevenci kolonisace Salmonellou intestinální obsahy fekální a caekální. Zpracování kultury tohoto typu vyžaduje, aby prostředí bylo anaerobní a s vyváženým pH.

Stern a spol. (US patent číslo 5,451,400, 19. září 1995) publikují mukosální CE komposici pro chránění drůbeže před kolonisaci Salmonellou a Campylobacterem, kde je z předepraného caeca seškrabána vrstva mucinu a v kyslíku prostém prostředí uchovávané oškrabky jsou anaerobně kultivovány.

Nisbet a spol. (US patent č. 5,478,557, 26. prosince 1996) publikují probioticum, které je možné získávat z rozličných domestikovaných zvířat neomezujících se jen na drůbež, ale zahrnujících také koně, prasata a hovězí dobytek. Nisbet a spol. uvádějí, že stabilní definované probiotikum se výhodně získá kontinuální kultivací dávek kultury produkované přímo z trusu, obsahu caeca a/nebo tlustého střeva zvolených dospělých zvířat. Uvádějí dále, že velká množství probiotika může být získáváno buď kultivací po dávkách nebo kontinuální kultivací, při čemž při kultivaci po dávkách se pokračuje dokud koncentrace octové kyseliny je větší než nebo rovná cca 20 mM, koncentrace propionové kyseliny je větší než nebo rovná cca 10 mM a koncentrace máselné plus isomáselné kyseliny je větší než nebo rovná 15 mM.

Asplund a spol. (Journal of Applied Bacteriology, svazek 81, 217-223, 1996) referují o modelu prasečího střeva in vitro a jeho použití vykazovat inhibici Yersinia enterocolitica 0:3 u ileální a ceacální mikroflory prasete. Caeca a vyluhované části tenkého střeva se shromáždí, uchovávají za anaerobních podmínek, nashromážděné • 4 * * • 4 4 • 4 4·· • · · • · · · · ·

4 4 ·· · ► · 44

4 4

144 444

4

44 obsahy se spojí a kultivují. Caecální a ileální očka prokázala, že potlačují růst kultivované Y. enterolitica v ceacální floře poněkud efektivněji než ve floře ileální. Účinnost in vivo popsána nebyla.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje poprvé komposici a in vivo metodu pro snižování a/nebo prevenci kolonisace enteropathogenními bakteriemi u savců, zejména hospodářských zvířat.

Předmětem předkládaného vynálezu je proto poskytnout ze zvířat mukosální subkulturu pro kontrolu kolonisace enteropathogenními bakteriemi u živočichů.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob ošetřování zvířat pro kontrolu kolonisace enteropathogenními bakteriemi u zvířat při použití preparátu pocházejícího z mukosální kultury.

Další cíle a výhody se stanou zřejmé z následujícího popisu.

Závažnost střevních infekcí u lidí byla stoupající měrou dobře rozpoznávána během posledních dvanácti let. Podobně byl i dobře prokázán vztah mezi kontaminací hospodářských zvířat a infekcí lidí. Během produkce a zpracování zvířat, jako hospodářských zvířat, může být fekální materiál obsahující pathogeny přenesen na maso a přetrvávat v potravě při kuchyňském zpracování. Vepř spolu s drůbeží, skot a mořské ryby, korýši a měkkýši jsou významnými nositeli Salmonelly (Beán a spol., J. Food Protéct., svazek 53, 804-817, 1990; Lammerding a spol., J. Food Protéct., svazek 51, 47-52, 1988). Nedotčená zvířata jsou infikována kontaminovaným krmením, chronickými bacilonosiči, zanesenými do populace, infikovanými hlodavci, anebo kontaminovaným personálem farmy (Heard, Vet. Rec., svazek 85, 482-484, 1969; Williams a spol., J. Hyg. Camb., svazek 66, 281293,1968; Wilcock a spol. Diseases in Svine, editoři Leman a spol., lowa State University Press, Ames IA, 570-583, 1992; Duhamel a spol., Proč. 12th Int. Symp. New and Emerging Infect. Dis., San Diego, CA, 381, 1992). Pro vepře na jatkách je prvotním zdrojem kontaminace prasečí bacilonosič a má se za to, že k přenosu dochází vzájemnými kontakty prasat anebo exposicí v kontaminovaném fysickém okolí (Newell a spol., J. Am. Vet. Med. Assoc., sv. 158, 89-98, 1971). Tato infikovaná zvířata následně kontaminují areál a budovy, vybavení a personál a to vede ke kontaminaci konečného produktu (Williams a spol., Am. J. Pub. Health, svazek 60, « · ··· ··♦ tototo· • ···· ···· ···· • ·· ··· ······ ··· ··· ······· · · ·· ·· ·· · ·· ··

926-929, 1970; Newell a spol., viz shora; Morgan a spol., Epidomiol. Infect., svazek 98, 323-330, 1987). Prvotním zdrojem však zůstává prasečí bacilonosič. Běžné pokusy identifikovat a vymýtit populaci bacilonosičů mezi hospodářskými zvířaty byly bráněny nedostatkem informací s ohledem na epidemiologii a pathogenesi salmonelosy u hospodářských zvířat. Eliminace a kontrola byla nesnadná, protože druhy Salmonelly jsou široce rozšířeny a přetrvávají dobře v daném prostředí. Existuje značné množství informací s ohledem na virulenci Salmonelly vztahující se k pathogenosi u lidí. Avšak k disposici je skutečně málo informací, které by se týkaly živočišných zdrojů tohoto infekčního agens. Pochopení průběhu infekce v potravě produkované ze zvířecích zdrojů získalo silnou prioritu a kontrola a eliminace zvířecího nosiče umožní prevenci přenosu nemoci ze zvířat na lidi. Ovládnutí choroby, jejíž původ je v potravě, lze nejlépe dosáhnout identifikací a vymýcením populace bacilonosiče. Zatímco bacilonosičem je možné stát se kdykoliv během doby života zvířete, exposice při narození bude u zvířete první příležitostí exposice pathogenem. Byla objevena aplikace mukosální kultury ke kontrole kolonisace pathogenu u zvířat pro produkci potravy. Termínem kontrola se rozumí snížení nebo prevence kolonisace enteropathogenních bakterií. Termínem zvířata pro produkci potravy se rozumí každé zvíře, které lidé konsumují.

Jedinečná bakteriální kultura se získává z oškrabků intestinálního traktu pathogenu prostých zvířat. Zvíře může být v jakémkoliv stáří, nejvíce se preferuje používat k ochraně nově narozených i starších zvířat, zvířata mladá. Prvotní kultura se zkultivuje a potom podává mladým zvířatům. Způsob podle tohoto vynálezu je použitelný pro jakékoliv zvíře ať již domestikované nebo divoké a zejména pak pro hospodářská zvířata pěstovaná pro konsumaci lidmi, která by mohla sloužit jako nosič pro cílové pathogeny. Hospodářská zvířata zahrnují hovězí dobytek, telata, vepře, selata, ovce, jehňata, bizony, kozy, králíky, mořské živočichy a podobné. Preferuje se podávat preparát mukosální kompetitivní exklusivní subkultury (LMCES) dvakrát během prvních 24 hodin po porodu. Avšak preparát je možné podávat kdykoliv během života zvířete jako na příklad na kontinuální basi nebo v čase voleném během doby života zvířete. Termínem na kontinuální basi se rozumí, že se konsistentní zdroj LMCES poskytuje podáváním v pitné vodě, krmení, při vykrmování do jícnu nebo pomocí aerosolu. LMCES může být podávána denně v krmení nebo vodě, týdně, měsíčně atd. na kontinuální basi. Termínem v čase voleném během doby života zvířete se rozumí podávání LMCES kultury v kritických ··

44 ·· 4

4 4 « · · • 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 · * bodech kontroly, ke kterým dochází během narození, odstavení mláděte, nemoci, podávání antibiotik, nepřiměřeném horku, dehydrataci, chladu, během transportu jako při přestěhování do jiných budov při produkčním procesu a před transportem na porážku atd.

Cílové pathogeny zahrnují všechny lidské enteropathogenní bakterie schopné kolonisovat zvířata, zejména pak hospodářská zvířata pěstovaná pro konsumaci lidmi. Jak se zde používá vazba lidské enteropathogenní bakterie, jde o bakterie schopné nebo známé, že kolonisují lidskou zažívací trubici, nebo do ní rozsévají toxiny, a které jsou schopny působit střevní nemoci u lidského hostitele. Příklady lidských enteropathogenních bakterií představují, ale neomezují se jen na druhy Salmonella, druhy Campylobacter a Escherichia coli.

LMCES je možné kombinovat s jinými kulturami nebo postupy účinnými pro kontrolu Salmonelly u zvířat jako jsou na příklad Lactobacillus, fruktooligosacharidy a kvasinky. Jiná konvenční nebo známá ošetření zvířat, zejména pro inhibici enteropathogenů, lze přidávat k LMCES tak dlouho pokud neovliní aktivitu LMCES preparátu.

Při postupech podle předkládaného vynálezu se zvířatům podávají komposice mukosálních kompetitivních exklusivních subkultur hospodářských zvířat (LMCES). Zde používaný termín podávání zahrnuje jakoukoliv vhodnou metodu orálního podávání komposic zvířatům, jak je to v praxi běžné, jako na příklad při vykrmování do jícnu, krmení, sprejování nebo aplikaci pasty na mateřské struky nebo na dudlík, v podávaném mléce atd. LMCES může být podávána také konečníkem. Preparát může být v jakékoliv formě v praxi pro podávání obvyklé, jako je na příklad kapalina, pasta, gelové tobolky nebo ve formě aerosolu. LMCES preparáty se podávají zvířatům při kterémkoliv stáří včetně nově narozených zvířat v množství účinném alespoň pro redukci lidských enteropathogenních bakterií zjištěných ve vnitřnostech zvířat. Zde používané redukce bakterií a alespoň redukování lidských enteropathogenních bakterií se vztahuje k redukci počtu bakterií ve srovnání s tím, co by se očekávalo u zvířete, které nebylo ošetřeno metodami podle předkládaného vynálezu. Pro takové srovnání může být použita každá přesná metoda měření, sčítání a srovnávání bakterií ve střevním traktu zvířat, jak to bude zřejmé odborníkům znalým oboru. Zde používané v množstvích účinných, účinné množství nebo množství účinné se vztahuje k podávanému množství LMCES preparátu, kdy účinek podávání způsobuje alespoň snížení féňtěropathogenních bakterií zjištěných

00 0 00 *0

4» 4 r · 000* · ·*· · 0 0 0 4 4 0 0 · 0 0 0 0 0 004* * 000 *00

0000000 0 0 00 04 04 W 00 00 při každém stáří zvířat. Množství preparátu se bude měnit v závislosti na velikosti zvířete, které se ošetřuje a na způsobu podávání. Pro malá zvířata, včetně malých nově narozených zvířat může být vykrmováním do jícnu podáváno kolem 4-8 ml druhé nebo 48 hodin později podávané pasáže subkultury LMCES kultury, přičemž kolem 5 ml je preferovaná dávka. Pro velká zvířata, včetně nově narozených velkých zvířat, druhá 48 hodinová nebo pozdější pasáž LMCES může být pro orální aplikaci nezředěná anebo až desetkrát zředěna v kapalné suspensi a rozpouštědlem může být například mléko, voda atd. I další pasáž subkultury je možné provést, avšak pravděpodobně bude méně účinná. Zředěné i nezředěné kapalné LMCES preparáty mohou být aplikovány přímo. U nově narozených zvířat se LMCES preparát podává přibližně během 2-48 hodin po narození, větší přednost se dává přibližně 2-6 hodinám a druhá dávka následuje o přibližně 18-24 hodin později. Nejvíce se dává přednost rozvrhu ošetřování, kdy první dávka se podává do asi 6 hodin po narození a druhá dávka následuje kolem 24 hodin po narození. Obvykle se první dávka při ošetření podává kolem 2 až 24 hodin' před odstavením, transportem nebo stěhováním do jiných budov, přičemž preferovaná doba je asi 2-6 hodin. V těchto případech se vyžaduje jen jedno ošetření, ale druhé ošetření může být uskutečněno 18-24 hodin po prvním ošetření. Variace rozvrhu ošetřování budou odrážet obchodní praktiky hospodářství. Další dávky mohou být podávány při odstavení, před stěhováním v produkčním zařízení nebo před transportem na porážku. Pokud jsou podávány v krmení nebo vodě, měla by aplikace probíhat denně.

LMCES preparát se připravuje aseptickým odstraněním spodní části střev včetně caeca ze zvířete a umístěním do sterilního kontejneru. Spodní část střev, jak se tu uvádí, je definována jako část začínající na konci žaludku až do caeca. Tento kontejner je uchováván v anaerobním prostředí během celé přípravy kultury. Vybraná délka střev se obrátí některým ze způsobů v oboru běžných. Obsahy střev se odstraní kombinací vymývání a oškrabování. Vymývání se provede vhodným anaerobním mediem. Pro vymývací krok lze využít jakékoliv medium pro daný účel, včetně vody. Preferovaným mediem je medium anaerobní, přednost má zvláště předredukované anaerobní medium s vybalancovaným Eh. Oškrabávání se provádí nástroji s tupým ostřím například tupým břitem čepele skalpelu. Po oškrabání se vnitřek střeva znovu vymyje a následuje oškrabávání ostře nabroušenými nástroji jako například ostrým břitem skalpelu nebo jinými vhodnými instrumenty. Ostře nabroušené nástroje a vnitřní stěna střeva se vymývají shora popsaným mediem, ·· · · ·· · · · ·· ~ *·· · · · · · · · ί 9 · ··· · · · · · flfl · β flfl flflfl · ···· · ·«· flflfl flfl··*·· · · • fl flfl ·· · flfl flfl aby se získaly epiteliální buňky a vlastní mikroflora a podíly prací kapaliny včetně se shromáždí ve sterilní nádobě. Tkáň může být také přímo nařezána do kultivačního media bez prvního oškrabání. Přednost má přechovávání tkáně ve změněné atmosféře, tj. pod proudem dusíku, když se procedura začíná. Prací kapalina nebo odřezky spolu s epiteliálními buňkami a mikroflorou se suspendují a celý obsah se naočkuje do sterilního anaerobního media ke kultivaci. Pod zde užívaným termínem mikroflora jsou myšleny vlastní bakterie. Kultura se podrobí anaerobní inkubaci při circa 35-40° C na přibližně 48 hodin, přenese do čerstvého anaerobního media a znovu podrobí inkubaci na dalších zhruba 48 hodin. Tato druhá inkubace je druhou 48 hodinovou pasáží subkultury a je nejvíce. preferovaným užívaným LMCES preparátem. Mohou být použity i jiné pasáže subkultury tak jak je shora popsáno. Kultura se potom podrobí assayi na přítomnost lidských enteropathogenů za použití kterékoliv z vhodných a konvenčních isolačních technik. Kultury prosté pathogenů se aplikují přímo, lyofilisované nebo zmrazené za použití technik běžných pro zmrazování kultivovaných buněk. Krev zvířecích dárců má být serologicky testována na hladiny protilátek vztahujících se k pathogenům hostitelských zvířat, včetně lidí.

Měly by se používat pouze kultury zvířat, jejichž sérum je nezměněno.

Dále uváděné příklady jsou uváděny pouze pro další ilustraci vynálezu a nejsou míněny, aby omezovaly rozsah vynálezu jak je definován patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava mukosálních CE kultur hovězího dobytka

Střeva zdravých dospělých kusů hovězího dobytka byla získána z místních jatek a v plastickém vaku ve sterilním anaerobním prostředí byla během jedné hodiny transportována do laboratoře. Mukosální kultura byla připravena ze spodní části střevního traktu. Před odejmutím části střeva, které má být použito, se okolní oblast podváže motouzem, aby nedošlo k vytečení střevního obsahu. Asepticky se odejme přibližné 4 až 5 palců (10,16 až 12,7 cm) délky a vloží se do sterilního kontejneru. Kontejner se potom umístí do kádě, která je kontinuálně proplachována dusíkem kyslíku prostým. Všechny manipulace se provádějí pod okrajem kádě, aby se kultura, která se má získat, uchovala v anaerobním prostředí. Střevní tkáň se opatrně po délce obrátí na sterilní skleněné tyčce, aniž by došlo k dotyku vnitřního povrchu.

• · « • · • · ·· ·· · • ·

Jakmile je obráceno, odstraní se obsah kombinací vymývání a oškrabování. Vymývání se provádí pomocí injekční stříkačky ph aplikaci pre-reduced brain hearth infusion broth (PR-PHIB) [předredukované infusní živné půdy pro mozek a srdce]. Pro vymývací krok lze používat každé jiné vhodné anaerobní medium. Oškrabání se provede tupým břitem čepele skalpelu. Vnitřní povrch střeva se vymyje, oškrábe a znovu vymyje. Nyní se ceacální epithelium jemně oškrábe a pro oškrábání je nejlépe použít ostrý břit skalpelu. Avšak tkáň může být nařezána přímo do kultivačního media. Po oškrabání obráceného střeva se skalpel a vršek vnitřní stěny znovu omyje PR-BHIB. Toto konečné omytí se shromáždí ve sterilní nádobě. Vymývací kapalina doprovázená spolu s epitheliálními a bakteriálními buňkami se natáhne do injekční stříkačky s jehlou a použije k naočkování do sterilní zkumavky s PR-PHIB skrze gumové septum. Tyto zkumavky se 48 hodin inkubují při 35° C, transferují a znovu inkubují dalších 48 hodin. Kultura se vyzkouší na přítomnost lidských enteropathogenů, o které je zájem, takových jako Salmonella, E. coii a druhy Campylobacter. Pokud je kultura prosta jak lidských tak zvířecích enteropathogenů a považována za bezpečnou je nyní připravena k aplikaci nebo ke skladování pro pozdější použití.

Příklad 2

Test účinnosti hovězí LMCES

Hovězí LMCES komposice popsaná svrchu v příkladu 1, byla dvakrát podána nově narozeným telatům během přibližně prvních 24 hodin života. Kultura byla podána orálně pomocí lahve s dudlíkem. Každé ošetřované tele při každé aplikaci obdrželo kolem 500 ml LMCES nezředěné nebo až desetinásobně zředěné v mléce. Po administraci byla telata krmena jako obvykle. Asi dvacetičtyři hodin po administraci, bylo každému teleti krmením do jícnu podáno kolem 10® buněk E. coli 0157:H7 resistentní vůči nalidixové kyselině. Po tomto otestování byla telata chována kolem sedmi dní v isolovaných komorách, aby bylo přechodným buňkám E. coli 0157:H7 umožněno vyčistit střevní trakt. Pak byla telata zabita, asepticky byla odstraněna caeca a uložena do plastických vaků. Caeca byla potom testována na přítomnost a hladinu E. coli 0157.H7. Průměrně zaznamenaný počet sledovaných pathogenů na gram caeca pro celou skupinu se nazývá kolonisační faktor (CF). Poměr CF neošetřené kontrolní skupiny ku CF ošetřené skupiny se nazývá ·· ·· • · • · · · ·* · ·· ·· » · · «

I · · <

protekční faktor (PF). Relativní hodnota stupně ochrany pro kulturu se získává porovnáním PF jedné CE mukosální kultury s PF jiné kultury.

Příklad 3

Příprava prasečích mukosálních CE kultur

Zdravé mladé prase ve stáří od 1 do 6 měsíců až do úplné dospělosti bylo trankvilisováno směsí narkotik, jak je to v oboru rutinně používáno. Byla použita směs 8 mg/kg Ketasetu, 6 mg/kg Telazolu a 4 mg/kg Rompunu. Prase bylo potom vykrvácením zabito. Jedno caecum bylo asepticky vyjmuto a umístěno do sterilní Petriho misky. Miska byla potom vložena do kádě, která byla kontinuálně proplachována dusíkem kyslíku prostým. Všechny manipulace se musí provádět pod okrajem kádě, aby kultura, která má být získána, byla uchovávána v anaerobním prostředí. Caecum se po délce opatrně obrátí na sterilním nástroji, bez dotyku vnitřního povrchu. Jakmile je obráceno, obsah se odstraní kombinací vymývání a oškrábání. Vymytí se provede předredukovaným živným roztokem za pomoci injekční stříkačky. Oškrábání se provede tupým břitem sterilního instrumentu. Vnitřní povrch se omyje, oškrábe a potom znovu vymyje. Nyní se caecální epithelium jemně oškrábe ostrým břitem skalpelu nebo může být nařezáno na krátké kousky (kolem 5 cm). Po oškrábání obráceného caeca se skalpel a vršek vnitřní stěny znovu vymyje PR-BHIB. Toto finální vymytí nebo kousky caeca se shromáždí do sterilní nádoby. Vymývací kapalina spolu s doprovázejícími bakteriálními buňkami se natáhnou do sterilní injekční stříkačky s jehlou a skrze gumové septum se použijí k naočkování do zkumavky se sterilní PR-BHIB. Tyto zkumavky se inkubují přibližně při 35° C po asi 48 hodin, transferují a znovu inkubují dalších přibližně 48 hodin. Kultura se vyzkouší na přítomnost lidských enteropathogenů, o které je zájem, takových jako Salmonella, E. coli a druhy Campylobacter. Pokud je kultura prosta jak lidských tak zvířecích enteropathogenů a považována za bezpečnou, je nyní připravena k aplikaci nebo ke skladování pro pozdější použiti.

Příklad 4

Test účinnosti mukosální CE kultury (LMCES) prasečího dobytka

Prasnice se známým datem vrhu selat se držela v porodních klecích v isolovaných jednotkách. Každá prasnice byla kontrolována každé čtyři hodiny počínaje jeden den před známým datem vrhu, aby se zajistilo, že první LMCES • · « « « w V - - - ~ ······· ···· · ·<

• · · · · · · • · ·· ·· · ·<

kultura byla podána včas. Po vrhu se podsvinčata nechala nakojit, aby se zajistilo, že dostala kolostrum, a každému podsvinčeti se mezi asi 2 a 6 hodinami po vrhu krmením do jícnu podalo 5 ml LMCES. Druhá dávka přibližně 5 ml byla podána asi za 24 hodin. Selata byla stimulována kolem 10³ CFU S. choleraesuis intranasálnim nakapáním asi 48 hodin po vrhu (24 hodin po posledním podání LMCES). Po podání preparátu byla podsvinčata připouštěna k obvyklému krmení. Po zhruba 7 dní po stimulaci byla denně u každého selete měřena rektální teplota a byl prováděn a na Salmonellu kultivován rektální výtěr. Zhruba za 7 dní po stimulaci byla všechna selata zabita a pitvána. Tkáně byly shromažďovány pro kvalitativní bakteriologii a zahrnovaly mandle (ton), mandibulární lymfatické uzliny (min), plíce, brachiální lymfatické uzliny (bln), játra, slezinu (spi), prostřední ileum, ileotračníkové spojení (icj), ileotračníkové lymfatické uzliny, caecum (cec), caecální obsahy, tračník (col), tračníkové lymfatické uzliny a žaludeční stěnu (sw). Kvantitativní bakteriologie byla prováděna také na caecálním obsahu a ileotračníkovém spojení, aby se stanovila úroveň Salmonelly uvnitř tkání.

Aby se zjistil vliv, který mohly mít prasnice na selata, shromažďovaly se také výkaly prasnic a kultivovaly se před vrhem, během asi 48 hodin po vrhu a kolem sedmého dne po stimulaci selat (prasnice nikdy nebyly přímo stimulovány pomocí S. choleraesuis). Kontrolním selatům nebyla podávána LMCES, byla však stimulována ve stáří kolem 48 hodin. Tkáně byly shromažďovány a zpracovávány tak jak je svrchu popsáno.

Klinické příznaky nebyly u všech selat podrobených experimentu zřejmé. Nalezení Saimoneíly v rektálních výtěrech bylo kolísavé. Avšak u selat ošetřených LMCES bylo kolem 41 % tkání positivních proti 63 % positivních tkání u kontrolních selat (Tabulka 1, souhrn pro pokusy 1 a 2). Pro selata pocházející od negativních prasnic (pokus 1- prasnice 1, 2, 3 a pokus 2- prasnice 2) bylo positivních 39 % [120/310 ] tkání proti 78 % [47/60] (pokus 1-kontrolní negativní prasnice) positivních tkání z kontrolní prasnice. Snížení Salmonelly se ukázalo u selat ošetřených CE proti selatům neošetřeným. Zaznamenána byla 2 až 5 násobná redukce Salmonelly v caecálním obsahu (CC) nebo ileotračníkovém spojení (ICJ) u selat ošetřených LMCES, když se porovnávalo s kontrolami (Salmonella vymizela z ICJ respektive CC u selat od prasnic 2 a 1) (Tabulka 2, pokusy 1 a 2). V pokusu 1 byly všechny prasnice bez pathogenů. Původně všechny prasnice vykazovaly jednu skupinu sera, potom před vrhem přestaly. Při vrhu prasnice 1 a kontrolní prasnice

4 • 44 · · · · · ·

4 · 4 · 4 4 4 · 44 4 • 44 4 · 4 · 4444 · 4·4 444 vykázaly Β skupinu sera. V pokusu 2 podsvinčata z prasnice 1 a 2 vykázaly pouze B typ Salmonelly a nikoliv stimulaci S. choleraesuis. Kontroly pro pokusy 1 a 2 nedostaly žádnou LMCES, pouze stimulační organismus. Jak lze vidět, nejsou zde jenom snížené úrovně stimulačního organismu, ale také snížené úrovně přirozené kolonisace. I když u podsvinčat již kolonisovaných Salmonellou bylo zaznamenáno jiné snížení než bylo získáno při stimulaci, snižuje se stupeň ochrany, což naznačuje, že u kojených podsvinčat může být dřívější včasná administrace oprávněná.

Účelem předcházejícího detailního popisu je ilustrace. Ten nebo onen detail má pouze tento účel a odborníci znalí oboru mohou v tom vytvářet variace, aniž by opustili ducha a rozsah vynálezu.

Tabulka 1

Incidence a úrovně Salmonelly u podsvinčat, jimž bylo poskytnuto ošetření LMCE a jimž nebylo poskytnuto ošetření (Ctrl)

Souhrn

						Log10/g
	Výtěry	% positiv.	Tkáně	% positiv.	CC	ICJ
CE	57/281	20,3	157/380	41,3	3,19	3,13
Ctrl	72/114	63,2	95/150	63,3	5,09	5,45

Tabulka 2

Incidence a úrovně Salmonelly 2 dny po stimulaci u podsvinčat, jimž bylo poskytnuto ošetření LMCE a jimž nebylo poskytnuto ošetření (Ctrl)

Pokus 1
Prasnice/ počet podsvinčat	Počet pasáží	Počet positivních výtěrů	Počet positivních tkání	% positivních tkání	log 10 CC	log 10 ICJ
1-ΓΛ/2	0	36/40	90	3,86	3,65
2- IW 2	1	21/60	35	2,51	3,35
3- /12	4/5	2	43/120	36	1,5	0
Suma		Ns	100/220	45	3,16	3,14
Kontrola	C/6	0	47/60	79	5,39	5,74

• · · ·

• ft · • ftft • ft

Všechny prasnice negativní Tkáně

	ton	bln	plíce	játra	spi	col	icj	cec	CC	sw
1(4)	3	4	4	3	4	4	4	3	4	3
2(6)	0	3	3	3	3	0	4	2	2	1
3(12)	2	12	9	7	6	0	3	1	3	0
c(6)	4	4	5	5	5	5	5	5	5	4

Pokus 2:
Všechny salmonelly
Prasnice/ počet pod- svinčat	Počet pasáží	Počet positivních výtěrů	Počet positivních tkání	% positivních tkání	log 10 CC	Iog10 ICJ
1 +/7	4/4	50/56^a	37/70	53	2,32	1,38
2-/9	6/7	4/49^a	20/90	22	-0-	-0-
Suma	na	57/160	36	2,02	1,08
C +/9	72/72^a	48/90	53	3,33	4,23

^a vykazují pouze B

Tkáně

	ton	bln	plíce	játra	spi	col	icj	cec	CC	sw
1(7)	2	6	6	5	4	4	4	2	4	0
2(9)	1	5	3	2	3	1	1	2	2	0
c	2	3	3	3	2	6	9	9	9	2

Pouze Cl :
Prasnice/ počet pod- svinčat	Počet pasáží	Počet positivních výtěrů	Počet positivních tkání	% positivních tkání	log 10 CC	log 10 ICJ
1 +/7	4/4	na	19/70	27	-0-	-0-
2-/9	6/7	na	18/90	20	-0-	-0-

• 4 44 44 · 44 44

444 444 444* ·444 4 4 4 · · 44 4 • 44 4·· ······ 444 44·

4 4 4 4 4 4 · 4

44 44 4 44 44

Suma		na	37/160	23	-0-	-0-
C +/9		na	16/98	18	2,98	4,23

Tkáně

	ton	bln	plíce	játra	spi	col	icj	cec	cc	sw
1(7)	1	5	5	4	4	0	0	0	0	0
2(9)	1	5	3	2	3	1	1	1	1	0
c	1	3	3	2	2	1	1	1	1	1

·· ·· ♦ · · • · · · · • · · · • · · · ·♦ » »· ·· • · · ♦ · · · • 9 · · · ·· · • 999999 999 999

9 9 4 9

9 99 99

PATENTOVÉ NÁROKY tv /w-*?

Claims

'Mryf' —o

1. Způsob ošetřování hospodářských zvířat vyznačující se tím, ž e zahrnuje poskytnutí mukosální kompetitivní exklusivní kultury pocházející ze zvířat pathogenů prostých a podávání uvedené kultury zvířatům, přičemž uvedené zvíře má alespoň sníženou úroveň lidských enteropathogenních bakterií ve srovnání s úrovní, očekávanou bez uvedeného podávání.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se uvedená kultura podává uvedenému zvířeti nejméně během kolem 48 hodin po narození.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se uvedená kultura podává přibližně dvakrát během prvních kolem 24 hodin života.
4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se uvedená kultura podává uvedenému zvířeti během kolem 6 hodin po narození a potom znovu kolem 24 hodin po narození.
5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se uvedená kultura podává během období stresu.
6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se uvedená kultura podává po celý život zvířete.
7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedená kultura je anaerobní kulturou.
8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedené lidské enteropathogenní bakterie jsou zvoleny ze skupiny, kterou tvoří Salmonella, Campylobacter, E. coli a jejich směsi.

Φ· ·Φ • · φ φ φ φ φ φ • φ φ φ · φ φφ ·· φφ φ • φ
9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedená kultura je podávána v množstvích efektivních, aby alespoň snižovala kolonisaci lidskými enteropathogenními bakteriemi u uvedeného zvířete.
10. Ze zvířat získaná komposice mukosálního původu, vyznačující se tím, že obsahuje kompetitivní exklusivní subkulturu hospodářských zvířat pocházející ze zvířat prostých pathogenů.
11. Komposice podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedená subkultura je anaerobní subkulturou.
12. Komposice podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedená kultura je získána z oškrabků střevního traktu uvedených hospodářských zvířat prostých pathogenů.
13. Komposice podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedeným střevním traktem je spodní část střev.
14. Komposice podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedená komposice je získána aseptickým odstraněním spodní části střev z uvedeného zvířete prostého pathogenů, obrácením uvedených střev, vymytím uvedených obrácených střev, oškrabáním uvedených obrácených střev, opakováním uvedených vymývacích a oškrabávacích zákroků pro získání epitheliálních buněk a mikroflory, naočkováním uvedených podílů vymývání a oškrabků do sterilního anaerobního media k vytvoření inokula, kultivací uvedeného inokula po dobu 48 hodin pro získání kultury a subkultivací uvedené kultury pro získání uvedené komposice.

• ·· • ···· • ·· ·· • ·· · • to ·« ·· • to ·· · • ·· • ··· • · · · · · toto ·· • ·· · • ·· · ··· ··· • · • · toto
15. Mukosální komposice ze střevního traktu hospodářských zvířat prostých pathogenů, která má schopnost omezovat kolonisaci enteropathogenních bakterií střevního traktu zvířat vyznačující se tím, že uvedená komposice je získána aseptickým odstraněním spodní části střev z uvedeného zvířete prostého pathogenů, obrácením uvedených střev, vymytím uvedených obrácených střev, oškrabáním uvedených obrácených střev, opakováním uvedených vymývacích a oškrabávacích zákroků pro získání epitheliálních buněk a mikroflóry, naočkováním uvedených podílů vymývání a oškrabků do sterilního anaerobního media k vytvoření inokula, kultivací uvedeného inokula po dobu 48 hodin pro získání kultury a subkultivací uvedené kultury pro získání uvedené komposice.