JP2002503084A

JP2002503084A - 腸管病原性細菌を減少させるための家畜粘膜の競争排除培養

Info

Publication number: JP2002503084A
Application number: JP51861398A
Authority: JP
Inventors: スターン，ノーマン，ジェイ; コックス，ネルソン，エイ; ベイレイ，ジェイ，スタン; クレイ，ポーラ，ジェイ
Original assignee: ザユナイテッドステイツオブアメリカ、アズリプレゼンティッドバイザセクレタリーオブアグリカルチュアー
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2002-01-29
Also published as: AU4907197A; CN1515667A; PL189717B1; AU738730B2; US6214335B1; WO1998016626A1; CZ294683B6; EP0932661A4; PL332621A1; UA73269C2; BR9712252A; CN1233285A; EP0932661A1; US5807546A; HUP0000148A2; CA2267233A1; HUP0000148A3; CZ120099A3

Abstract

(57)【要約】健康な動物の擦過物からの調整品は培養され、動物に投与される。本調製品は、現在のところヒトに容認不可能な高罹患率および高死亡率を引き起こし、家畜個体数の多産性を減少させるサルモネラ種、カンピロバクター種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性細菌によるその後のコロニー形成に対する保護の強硬な措置を与える。

Description

【発明の詳細な説明】腸管病原性細菌を減少させるための家畜粘膜の競争排除培養発明の背景発明の分野本発明は無病原体哺乳動物の腸管から調製された細菌の培養に関する。本発明はまた、上記培養の継代培養菌、ならびに腸管病原性細菌によるコロニー形成から家畜を保護するために継代培養菌を用いる方法に関する。関連技術の詳細サルモネラおよび大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７といった腸管病原体はヒトに容認不可能な高罹患率および高死亡率を引き起こし、家畜個体数の多産性を減少させることがある。ヒト胃腸内の病原体は一般的にヒトが消費する食肉の腸管汚染から導かれるものである。Data Needs to Evaluate Control Groupsが１９９５年１月に開催した飼育場から食卓へ食品で運ばれる病原体の追跡に関するシンポジウムで、尋ねられた質問は「食品で運ばれる病気がいかに重要か？」（飼育場から食卓へ食品で運ばれる病原体を追跡して:Data Needs to Evaluate Control Groups ,Washington,DC,3-29,1995）であった。米国では毎年６５０万から３，３００万件の食品で運ばれる病気の見積もりがあり、死者は９，０００人に及ぶと述べられている。米国農務省経済リサーチサービスは年問７種の食品で運ばれる病原体に対する米国の医療費ならびに生産性の損失を、年間５６億から９４億ドルと見積もっている。米国では年問あたり５００万件を超える食肉および家禽食品で運ばれる病気があり、大きな割合はサルモネラおよびカンピロバクター感染によるものであるとメニングは評価する（J.Am.Vet.Med.Assoc.,Volume 192,494-497， 1998）。ロバートはサルモネラ症の一人一人の患者に７００ドルの費用がかかると見積もっている(Amer.J.Agr.Econ.,Volume 71,468-474,1989）。他国の食品で運ばれる病気を評価するサーベイに基づいて、サルモネラが起炎と考えられる世界中の食品で運ばれる下痢の数はおそらく世界中で１，０００億人を超すと予測するのに対し、２５０億ドルを超える費用がかかると推定するのは桁外れなことではなかろう。これらの病原体は痛み、苦しみ、死亡の原因にもなる。その上、病原性細菌が家畜に感染することによって実質的な経済的損失をもたらすこともある。競争排除（ＣＥ）技術は家禽における病原性細菌のコロニー形成を減少させるために用いられる。ヌルミら（ネイチャー,Volume 241,210-211 1973）は、十分に成長した、健康な鶏からの調整品は、サルモネラのコロニー形成に対し、まだミクロフローラが形成されていないひなを保護することを発見した。ひなへの未定義のＣＥ調整品投与は新たに孵化した鳥の中で脳内フローラの成熟を早め、生育した雌鶏から子孫へミクロフローラの自然のままの遺伝過程の基盤を与える。 Snoeyenbosらは（米国特許第４，３３５，１０７、６月、１９８２年）は糞便排泄物を凍結乾燥し、本調整品を嫌気的に培養することによりサルモネラのコロニー形成を阻止するＣＥミクロフローラ技術を開発した。ミコラら（米国特許第４，６５７，７６２、４月、１９８７年）は腸内の糞便および盲腸内容物を、サルモネラのコロニー形成を阻止するＣＥミクロフローラ源として使用した。このタイプの培養での処理法は、嫌気性でかつＰＨが保たれている培地を要した。スターンら（米国特許第５，４５１，４００、９月１９日、１９９５年）は洗浄前の盲腸のムチン層が擦過され、無酸素状態に保たれている擦過物が嫌気的に培養される、サルモネラおよびカンピロバクターによるコロニー形成に対し家禽を保護する粘膜のＣＥ合成物を開示している。 Nisbetら（米国特許第５，４７８，５５７；１２月２６日、１９９６年）は家禽ならびにウマ、ブタ、ウシをも含む、しかしこれらに限られるわけではない様々な家畜動物から得られる微生物を開示している。Nisbetらは一定の定義付けされた微生物はむしろ生育した対象とする動物の糞便排泄物、盲腸および／あるいは大腸内容物から迅速に生産されたバッチ培養菌の連続培養によって得られると開示している。彼らはさらに、膨大な量の微生物は、酢酸濃度が約２０ｍＭかそれ以上、プロピオン酸濃度が約１０ｍＭかそれ以上、ブチル＋イソブチル酸濃度が１５ｍＭかそれ以上になるまでバッチ培養が続けられるバッチ培養菌かまたは連続培養菌のいずれかによって産生されるであろうと開示している。 Asplundら（Journal of Applied Bacteriology,Volume 81,217-223,1996）は、ブタの回脳および盲腸のミクロフローラ３に対しエルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）０の阻正を示すためブタの腸の試験管内モデルおよびその使用を報告している。盲腸および小腸の抽出部は収集されて嫌気性状況下に保たれ、内容物は収集、保存、培養される。盲腸および回腸の接種源は回腸フローラよりも若干効果的な盲腸フローラと共に、培養したエルシニア・エンテロコリチカの発育を抑制するために示される。体内での有効性は報告されなかった。本発明は哺乳動物の、特に家畜の病原性細菌によるコロニー形成を試験管内で減少および／あるいは阻止する合成物ならびに方法に初めて備える。発明の要約動物の病原性細菌のコロニー形成制御に関する継代培養から導かれるの動物粘膜を供することが本発明の目的である。本発明のもう一つの目的は、粘膜培養菌から導かれる調整品を用いて、動物の病原性細菌のコロニー形成を制御するための動物の処理方法を供することである。更なる目的および利点は以下に述べることから明らかとなろう。発明の詳細な説明ヒトの腸感染症の重要性は過去１２年以上にわたりますます高く認められてきている。家畜の汚染とヒトの感染の関係も同様によく述べられつつある。家畜のような動物の生産および加工の最中に、病原体を含んでいる糞便材料が食肉上を移動し、食品加工調理場内に残存している可能性がある。家禽、畜牛、海藻と共にブタはサルモネラの重要な保菌動物である（ビーンら，J.Food Protect.,Volu me 53,804-817,1990;ラマーディングら,J.Food Protect.,Volume 51,47-52,1988）。純粋な動物は汚染された飼料、個体群内に伝播された慢性的な保菌動物、感染したネズミ、あるいは汚染した農場職員から感染する（Heard,Vet.Rec.,Volume 85,482-484,1969;ウィリアムスら，J．Hyg． Camb.，Volume 66，281-293，1968;ウィルコックら，Diseases in Swine,Lemen et al,eds.,Iowa State University Press,Ames IA，570-583，1992;デュアメルら，Proc．12th Int．Symp．New and Emerging Infect.Dis.,San Diego,CA,381, 1992）。ブタに関して、屠殺場では、最初の汚染源は保菌ブタであり、伝播はブタからブタへの接触によるか、あるいは汚染された物理的環境に晒されて起こると考えられる（ニューウェルら,J.Am.Vet.Med.Assoc.,Volume 158,89-88,1971）。これら感染した動物は順番に、最終生産物の汚染へと導きながら家屋、器具そして職貞を汚染する（ウィリアムスら,Am.J.Pub.Health，Volume 60，926-929， 1970;ニューウェルら，supra;モルガンら，Epoidemiol．Infect.，Volume 98,32 3-330,1987）。しかしながら、最初の汚染源は依然として保菌ブタである。家畜における保菌個体群を同定し根絶するための最新の努力は、家畜におけるサルモネラ症の疫学ならびに病因論に関する情報の欠如により阻まれている。サルモネラ種は広く分布し、環境の中でうまく存続し、排除および制御が困難であったためである。ヒトの病因論に関連したサルモネラのビルレンスに関しては、かなりの量の情報がある。しかしながら、本感染要因の動物源に関する情報はほとんど入手不可能である。食品を生産する動物源における感染過程の理解は非常に重要なことであると仮定されたら、保菌動物の制御および排除は人畜共通感染症の伝播を防ぐことになるであろう。食品で運ばれる病気の制御は保菌個体群の同定および根絶によって最もよく行われる。保菌状態が動物の一生を通じていつでも起こり得る間は、誕生時の暴露は動物にとって病原体に晒されることになる初めての機会となる。食品を生産する動物における病原体コロニー形成の制御用の粘膜培養の応用が発見された。制御という用語は、病原性細菌のコロニー形成の減少あるいは阻止を意味する。食品生産動物という用語はヒトによって消費されるあらゆる動物を意味する。独特の細菌培養は無病原体動物の腸管の擦過物から得られる。動物はいかなる年齢でも差し支えないが、新生児と老齢の動物を保護するため、最も好ましいのは動物の子の使用である。この最初の培養菌は継代培養され、その後動物の子に投与される。本発明の方法は家畜化されていようと、野性であろうとあらゆる動物に適用可能であり、特にヒトの消費のために飼養され、対象病原体に対する保菌動物として扱われる家畜に適用可能である。家畜は畜牛、仔牛、去勢した雄ブタ、仔ブタ、ヒツジ、子羊、水牛、ヤギ、ウサギ、魚介類等を含む。分娩後最初の２４時間以内に２回、家畜粘膜の競争排除継代培養（ＬＭＣＥＳ）調整品を投与することが好ましい。しかしながら、調製品は断続的な基盤のような動物の生存中のあらゆる時期かあるいは動物の一生を通じて選ばれた時期にでもおそらく投与可能であろう。「断続的な基盤」という用語は絶え間ないＬＭＣＥＳの供給源が飲料水、飼料、経口胃管栄養、あるいはエアゾール化による投与によって備えられることを意味する。ＬＭＣＥＳは断続的な基盤に関して、飼料、水の中等に毎日、毎週、毎月、投与可能である。「動物の一生を通じて選ばれた時期」という用語は出産中、離乳期、疾病、抗生物質投与、高熱、脱水、感冒、生産過程での別の建物への移動中、屠殺場へ移送される前、等々に起こるような決定的な制御個所でのＬＣＭＥ培養菌の投与を意味する。対象とする病原体は、動物、特にヒトの消費用に飼養された家畜にコロニーを形成する可能性がある全てのヒト病原性細菌を含む。本文書中に用いられるように、「ヒト病原性細菌」とはヒト消化管にコロニーを形成する、あるいは消化管内に毒素を播種することが可能な、あるいはそうすることで知られている細菌で、ヒト宿主内で腸の病気を引き起こす可能性がある。ヒト病原性細菌の例として、サルモネラ種、カンピロバクター種および大腸菌が含まれるが、これに限られるわけではない。ＬＭＣＥＳは動物におけるサルモネラの制御に効果的な他の培養菌あるいは処理、例えば乳酸桿菌（ラクトバシラス）、フルクトオリゴサッカライドおよび酵母等を併用させることが可能である。他の従来の、あるいは既知の動物の処理方法は、特に病原体の阻止に関して、ＬＭＣＥＳ調整品の活性度に影響を及ぼさない限りＬＭＣＥＳに加えて差し支えない。本発明の方法では、家畜粘膜の競争継代培養菌（ＬＭＣＥＳ）の合成物は動物に投与されている。本文中に用いられるように、「投与」とは、当技術界で知られているように動物に経口的に合成物を送るためのあらゆる適当な方法、例えば経口胃管栄養、飼料、噴霧、あるいは母親の乳頭又は人工乳頭へのペーストの塗布、与えられたミルクによって等を包含する。ＬＭＣＥＳは終末腸開口部からの投与も可能である。調製品は当技術界で知られている投与に関するいかなる形状、例えば液状、ペースト状、ゼリー状カプセル、エアゾール状も可能である。ＬＭＣＥＳ調整品は動物の腸内で発見されたヒト病原性細菌を少なくも減少させるのに有効的な量で、新生児動物を含むあらゆる年齢の動物に投与される。本文中に用いられるように、「細菌の減少」あるいは「ヒト病原性細菌を少なくも減少させる」とは、本発明の方法により処理を受けなかった動物で予想される細菌の数と比較した細菌数での減少を意味する。当業者では明らかであるような動物の腸管に存在する細菌を測定し、数をカウントし、比較するあらゆる正確な方法がそのような比較のために用いられることがある。本文中に用いられるように、「有効的な量で」、「有効的な量」、あるいは「有効量」とは、投与されたＬＭＣＥＳ調整品の量を意味し、同投与の効果はあらゆる年齢の動物で発見されたヒト病原性細菌を少なくも減少させるよう作用する。調整品の量は扱われる動物の大きさおよび投与方法いかんで変化する。小さな新生児を含む小動物に対しては第２回目以降に接種された４８時間継代培養のＬＭＣＥＳ培養菌の約４−８ｍｌが経口胃管栄養によって投与されることが可能で、約５ｍｌが好ましい投与量である。大きな新生児を含む大きな動物に対しては、ＬＭＣＥＳの２回目以降の４８時間継代培養接種は、希釈液が例えばミルク、水などである液状懸濁掖中に、経口胃管栄養のために希釈されないかあるいは１０倍まで希釈されることが可能である。付加的な継代培養接種も用いられることがあるが、ほとんど効果はない。希釈された液体のＬＭＣＥＳ調整品および希釈されていない液体のＬＭＣＥＳ調製品は直接に投与可能である。新生児動物に対しては、ＬＭＣＥＳ調整品は出生から２−４８時間以内に与えられるが、出生から２−６時間が最も好ましく、次いで１８−２４時間後の２回目投与が好ましい。最も好ましい処理計画は、出生から６時間以内の最初の投与で、次いで出生後２４時間の第２回投与である。概して、最初の投与処理はおよそ２− ６時間の至適時間を伴う、離乳、移送、あるいは他の施設へ移動する前の２−４８時間に与えられる。これらの場合には、わずか１回の処理が要求されるが、２回目の処理が第１回目の処理後１８−２４時間に投与されることもある。処理計画における変化は、商業上の慣習に反映するであろう。追加的な投与量は離乳、生産施設の至るところへの移動前、あるいは屠殺場への移送前に与えられることもある。飼養あるいは飲料水に入れて与えるならば、毎日の投与が行われるであろう。ＬＭＣＥＳ調整品は無菌的に動物の盲腸を含む腸終末部を取り除き、滅菌容器にならべて調製される。本文書中に用いられるように、終末腸は胃の終末に始まって盲腸に至り、盲腸を包含する部分と定義される。本容器は培養菌の調整品全体を嫌気的環境に維持する。選定された腸全体は、当業界で既知のあらゆる方法で反転される。腸の内容物は洗浄ならびに擦過の組み合わせにより除去される。洗浄は適切な嫌気性媒剤で行われる。洗浄ステップは上述した目的に効果的な媒剤であれば水を含め、いかなるものを利用してもよい。好ましい媒剤は嫌気性の媒剤であり、特に前還元し、酸化還元電位が平衡状態にある嫌気性媒剤が好ましい。表面の擦過は、鈍な刃のついた器具で、例えば鈍な外科用メスの刃で行われる。擦過後、管腔は再び洗浄され、次いで、鋭利な刃のついた器具、例えば鋭利な外科用メスの刃あるいはその他の適した器具で擦過される。鋭利な刃のついた器具と管腔は媒剤で洗浄され、上述のように上皮細胞と固有のミクロフローラを得るため、洗浄物（液）は滅菌容器に収集される。組織もまた、培養剤の中で、最初の擦過を行わずに迅速に切断可能である。操作を始めたら、組織を還元した環境、例えば窒素の流れの中に維持するのが好ましい。洗浄物あるいは擦過物は、混在する上皮細胞およびミクロフローラと共に浮遊させ、内容物は培養のために滅菌した嫌気性培地に接種される。本文書中に用いられるように、ミクロフローラという用語は固有の細菌を含むことを意味する。培養菌は嫌気的に約３５ −４０℃でおよそ４８時間インキュベートされ、新鮮な嫌気性培養基に移され、約４８時問以上再インキュベートされる。この２回目のインキュベーションは２回目の４８時間継代培養接種であり、最も好ましいＬＭＣＥＳ調製品が用いられる。他の継代培養接種もまた上述のように用いられる。培養はその後ヒト病原菌の存在について、従来通りのあらゆる適切な分離技術を用いて測定される。無病原体培養菌は迅速に投与され、凍結した培養細胞として従来技術を用いて凍結乾燥あるいは凍結される。ドナー動物からの血液は、ヒトを含む、関連する宿主動物の病原体への抗体レベルについて、血清学的検査をしなければならない。血清変換を行っていない動物からの培養菌のみが使用されなければならない。次に述べる実施例はさらに発明を例示することにとどまるつもりであり、請求項で規定されるように発明の範囲を制限しようとするものではない。実施例１ウシ家畜粘膜のＣＥ培養菌の調整品健康な成長したウシの腸は地元の食肉解体施設で入手され、プラスチックバッグに詰めて滅菌した嫌気的環境で１時間以内に研究所まで搬送された。粘膜培養は脳管終末部から調製された。使用すべき腸の切片除去に先立ち、周辺部は腸内容物の漏出を防ぐため厳重に（血管を縛り）止血が行われた。およそ４から５インチの長さで無菌的に除去され、滅菌容器紀ならべられた。容器はその後、無酸素窒素ガスが絶えず流れている桶にならべられた。培養が嫌気的環境で得られるように維持するため、全操作が桶の縁の下で行われた。腸組織の全長は慎重に、内表に触れないよう滅菌ガラス棒で反転された。一旦反転させた内容物は洗浄・擦過の組み合わせで取り除かれた。洗浄は前還元したブレイン・ハート・インフュージョンブロス（PR-BHIB）の注射筒で行われた。いかなる他の適切な嫌気性培地剤も洗浄ステップに使用可能である。擦過は鈍な滅菌済みの外科用メスの刃で行われた。管腔は洗浄され、擦過され、再び洗浄された。この時点で上皮細胞は、擦過が好ましい状態で外科用メスの鋭利な側で丁寧に剥離された。しかしながら、組織は培地内で迅速に切断可能であった。反転させた腸を擦過した後、外科用メスおよび管腔壁の小片はブレイン・ハート・インフュージョンブロス（PR-BHIB）で再び洗浄された。この最終洗浄物は滅菌容器に収集された。洗浄物は、混在する上皮細胞および細菌性細胞と共に、滅菌した針付きのシリンジで吸引され、ゴム製の隔壁を通して滅菌したブレイン・ハート・インフュージョンブロス（PR-BHIB ）の試験管内に接種するために使用された。これら試験管は３５℃で４８時間インキュベートされ、移動されて、２度目の４８時間再インキュベートされた。培養はサルモネラ、大腸菌およびカンピロバクター種のような関心のあるヒト病原体の存在について検査された。培養がヒトおよび動物のいずれの病原体もなく安全であると思われるなら、実用性あるいは後の使用のための保管の準備完了である。実施例２ウシ粘膜のＬＭＣＥＳの有効性検査ウシ粘膜のＬＭＣＥＳ合成物は、上記実施例１で述べたように、出生から最初のおよそ２４時間以内に約２回、新生児の仔牛に投与された。培養菌は哺乳瓶を使用して経口的に与えられた。それぞれ処理された仔牛はそれぞれの用途で、ミルクに希釈されていないかあるいは約１０倍まで希釈されたおよそ５００ｍｌのＬＭＣＥＳを摂取した。投与後、仔牛は通常通り飼養を与えられた。投与から約２４時間後、それぞれの仔牛はおよそ１０８個のナリジクス酸耐性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞を経口胃管栄養によって与えられた。病原菌投与に続き、あらゆる移行期の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞が腸管を一掃するよう、仔牛は約７日間隔離されたチャンバーで育てられた。仔牛はその後、屠畜され、盲腸は無菌的に取り除かれ、滅菌したプラスチックバッグにならべられた。盲腸はその後大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の存在および量について分析された。グループ全体に対する盲腸１グラムあたりの対象病原体の平均対数はコロニー形成因子（ＣＦ）と呼ばれる。ＣＦの比（未処理コントロール／ＣＦ（処理グループ））は保護因子（ＰＦ）と呼ばれる。一つの粘膜のＣＥ培養菌のＰＦと他の培養菌のＰＦを比較することで、保護の程度に関する相対価が培養菌に対して得られる。実施例３家禽粘膜のＣＥ培養菌の調整品健康で、完全に成長するまでのおよそ生後１〜６ケ月の未熟な雄ブタは当業界で日頃用いられているようなドラッグ・カクテルで鎮静化された。８mg／kgのカタセット、６mg／kgのテラゾールおよび４mg／kgのロンピンの混合薬が使用された。ブタはその後、瀉血による犠牲となった。盲腸は無菌的に取り除かれ、滅菌したペトリ皿にならべられた。ペトリ皿はその後、絶え間なく無酸素窒素が流れている桶の中にならべられた。全操作は、培養菌が嫌気的環境で得られるように維持するため、桶の縁よりも下で行われなければならない。盲腸の全長は、内表に触れることなく滅菌した器具で慎重に反転された。一旦反転したところで、内容物は洗浄および擦過の組み合わせによって取り除かれた。洗浄は前還元したブロスの注射筒で行われた。擦過は滅菌した器具の刃の鈍な方で行われた。管腔は洗浄、擦過し、再び洗浄された。この時点で、盲腸上皮は外科用メスの鋭利な方で丁寧に擦過されるか小切片に切ってもよい（約５cm）。反転させた盲腸の擦過後、外科用メスおよび管腔壁は再び前還元したブレイン・ハート・インフュージョンブロスで洗浄された。この最終洗浄物あるいは盲腸の切片は滅菌容器に収集された。洗浄物は、混在した細菌性細胞と共に針のついた滅菌注射器で吸引され、ゴム製の隔壁を通じて、滅菌し前還元したブレイン・ハート・インフュージョンブロスの試験管内に接種するために用いられた。この試験管はおよそ３５℃で４８時間インキュベートされ、移動され、２回目の４８時間再インキュベートされた。培養はサルモネラ、大腸菌およびカンピロバクター種のような関心のあるヒト病原性細菌の存在について分析された。培養菌に病原体がなく安全であると思われるなら、実用性あるいは保管の準備完了である。実施例４ブタ家畜粘膜のＣＥ培養菌（ＬＭＣＥＳ）の有効性検査出産日が既知の雌ブタは隔離ユニットの出産桶に隔離された。最初のＬＭＣＥＳ培養が適時の手法で投与されることを確実にするため、それぞれのブタは既知の出産日の１日前から４時間毎に調べられた。出産時に、仔ブタは初乳を得たことを保証するため吸乳を許され、それぞれの仔ブタは出産後約２〜６時間のうちに経口胃管栄養によっておよそ５ｍｌのＬＭＣＥＳを投与された。仔ブタは出生後約４８時間(２４時間前が最後のＬＭＣＥＳ投与)に鼻腔内点滴注入（法）によって約１０３コロニー形成単位（ＣＦＵ）のサルモネラ・コレレスイス（S.chol eraesuis）による病原菌投与を受けた。調製品投与後、仔ブタは通常通り飼養された。直腸温および直腸スワブは、病原菌投与後７日間、それぞれの子ブタから毎日採取され、サルモネラに関する培養が行われた。病原菌投与後約７日間で、全ての仔ブタが屠畜され、剖検された。定性細菌検査のために組織は収集され、扁桃（ton）、下顎リンパ節（mln）、上腕リンパ節（bln）、肝臓、脾臓（spl）、回腸中央部、回結腸接合部（icj）、回結腸リンパ節、盲腸（cec）、盲腸内容物（cc）、大腸（col）、大腸リンパ節および胃壁（sw）が包含された。定性細菌検査は組織内のサルモネラのレベルを判定するため、盲腸内容物および回結腸接合部でも行われた。雌ブタが仔ブタと接触した可能性があるという影響を評価するため、雌ブタの糞便もまた出産直前、出産後約４８時間以内および仔ブタの病原菌投与後７日目に収集、培養された（雌ブタは直接的にはサルモネラ・コレレスイスを投与されなかった）。対照の仔ブタはＬＭＣＥＳを与えられたものの、生後約４８時間に病原菌投与されなかった。組織は収集され、上述のように処理された。臨床兆候は実験を通じて全ての仔ブタにおいて顕著ではなかった。直腸スワブからのサルモネラの回収は一定ではなかった。しかしながら、ＬＭＣＥＳ処理を行った仔ブタからの組織の約４１％が陽性であったのに対し、対照のブタからは６３％の組織が陽性であった（表１、試験に対する要約１および２）。陰性の雌ブタ（試験１の雌ブタ１、２、３、および試験２の雌ブタ２）から出生した仔ブタからは組織の３９％［１２０／３１０］が陽性であったのに対し、対照の雌ブタからは組織の７８％［４７／６０］（試験１の対照雌ブタ陰性）が陽性であった。サルモネラ減少はＣＥ未処理の仔ブタに対してＣＥ処理された仔ブタに分与された。対照と比較して、盲腸内容物（CC）および回結腸接合部（ICJ）におけるサルモネラのおよそ２乃至５対数減少がＬＭＣＥＳ処理の仔ブタで観察された（サルモネラは２および１の雌ブタからのそれぞれの仔ブタの回結腸接合部および盲腸内容物から排斥された）。試験１において、全ての雌ブタが無病原体であった。全ての雌ブタは当初、１つの血清グループにまとまろうとしたが、その後、出産前にとまった。出産時に雌ブタ１および対照ブタは血清グループＢにまとまった。試験２では、雌ブタ１および２から生まれた仔ブタはＢタイプのサルモネラのみにまとまろうとし、サルモネラ・コレレスイスの病原菌投与はなかった。試験１および２に対する対照はいかなるＬＭＣＥＳも摂取しておらず、病原菌投与した生物のみであった。また明らかに、病原菌投与した生物の減少したレベルのみならず、通常のコロニー形成の減少したレベルが存在した。病原菌投与で摂取した以外のサルモネラで既にコロニー形成された仔ブタにおいて減少が見られる一方で、哺乳ブタにおける早期投与はおそらく保証されると示唆しつつも、保護の程度は減少された。上述の詳細な説明は説明用に示したものである。前述の詳細は単に説明を目的とするものであり、熟練当業者は本発明の精神および範囲を逸脱せずに変形することが可能である。表１ＬＭＣＥ処理を受けた仔ブタ、あるいは受けなかった（対照）仔ブタにおけるサルモネラの発生率および量表２ＬＭＣＥ処理を受けた仔ブタ、あるいは受けなかった（対照）仔ブタの病原菌投与後２日目のサルモネラの発生率およびレベル試験１：全雌ブタは陰性組織試験２：全サルモネラ ^*Ｂのみ瀉血表２対照組織 C1のみ：組織

【手続補正書】【提出日】平成１１年９月３日（１９９９．９．３）【補正内容】特許請求の範囲１．無病原菌動物から導かれる家畜粘膜の競争排除培養菌を準備し、該培養菌を動物に投与することを備え、前記投与するステップを行わずに予想される病原性細菌と比較して該動物は少なくも減少したレベルのヒト病原性細菌を有することを含む家畜を処理する方法。２．前記培養菌は前記動物に少なくも出生から約４８時問以内に投与される請求項１に記載の方法。３．前記培養菌は出生から最初の約２４時間以内におよそ２回投与される請求項１に記載の方法。４．前記培養菌は前記動物に出生から６時問以内に、その後再び出生から２４時間以内に投与される請求項１に記載の方法。５．前記培養菌はストレス時の間に投与される請求項１に記載の方法。６．前記培養菌は動物の一生にわたって投与される請求項１に記載の方法。７．前記培養菌は嫌気性培養である請求項１に記載の方法。８．前記ヒト病原性細菌はサルモネラ、カンピロバクター、大腸菌およびそれらの混合物からなるグループから選ばれる請求項１に記載の方法。９．前記培養菌は前記動物のヒト病原性細菌のコロニー形成を少なくも減少させるのに有効的な量で投与される請求項１に記載の方法。１０．無病原体動物から導かれる家畜の競争排除継代培養菌を含む動物粘膜から導かれる合成物。１１．前記継代培養菌は嫌気性継代培養である請求項１０に記載の合成物。１２．前記培養菌は、前記無病原体家畜の腸管擦過物から得られる請求項１０に記載の合成物。１３．前記腸管は終末腸である請求項１２に記載の合成物。１４．前記合成物は、前記無病原体動物から無菌的に終末腸を取り除き、該腸を反転し、該反転した腸を洗浄し、前記反転した腸を擦過し、上皮細胞およびミクロフローラを得るために該洗浄および擦過のステップを繰り返し、接種原を形成するために滅菌した嫌気性培地に該洗浄物および擦過物を接種し、培養菌を発育させるために該接種原を４８時間培養し、前記合成物を得るために該培養菌を継代培養して調製される請求項１０記載の合成物。１５．前記合成物は、前記無病原体動物から無菌的に終末腸を取り除き、前記腸を反転し、前記反転した腸を洗浄し、前記反転した腸を擦過し、上皮細胞およびミクロフローラを得るために前記洗浄および擦過のステップを繰り返し、接種原を形成するために滅菌した嫌気性培地に前記洗浄物ならびに擦過物を接種し、培養菌を発育させるために前記接種原を４８時間培養し、前記合成物を得るため前記培養菌を継代培養して調製される、動物の腸管病原性細菌のコロニー形成を減少させる性質を有する無病原体動物から収集した家畜の腸管粘膜の合成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:42）Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 ＥＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 ＥＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コックス，ネルソン，エイ米国 30607 ジヨージア、アテネ、255 ゲートウッドサークル、 (72)発明者ベイレイ，ジェイ，スタン米国 30606 ジヨージア、アテネ、1290 クリークショウドライブ (72)発明者クレイ，ポーラ，ジェイ米国 50010 アイオワ、エイムス、2310 ブチャナンドライブ

Claims

【特許請求の範囲】１．無病原菌動物から導かれる家畜粘膜の競争排除培養菌を準備し、該培養菌を動物に投与することを備え、前記投与するステップを行わずに予想される病原性細菌と比較して該動物は少なくも減少したレベルのヒト病原性細菌を有することを含む家畜を処理する方法。２．前記培養菌は前記動物に少なくも出生から約４８時間以内に投与される請求項１に記載の方法。３．前記培養菌は出生から最初の約２４時間以内におよそ２回投与される請求項１に記載の方法。４．前記培養菌は前記動物に出生から６時間以内に、その後再び出生から２４時間以内に投与される請求項１に記載の方法。５．前記培養菌はストレス時の間に投与される請求項１に記載の方法。６．前記培養菌は動物の一生にわたって投与される請求項１に記載の方法。７．前記培養菌は嫌気性培養である請求項１に記載の方法。８．前記ヒト病原性細菌はサルモネラ、カンピロバクター、大腸菌およびそれらの混合物からなるグループから選ばれる請求項１に記載の方法。９．前記培養菌は前記動物のヒト病原性細菌のコロニー形成を少なくも減少させるのに有効的な量で投与される請求項１に記載の方法。