JP2001514868A

JP2001514868A - 共生細菌による、ウシにおける腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の制御

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Publication number: JP2001514868A
Application number: JP2000509292A
Authority: JP
Inventors: マイケルピー．ドイル，; トンツァオ，; バリージー．ハーモン，; キャシーアンブラウン，
Original assignee: ユニバーシティーオブジョージアリサーチファウンデーション，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2001-09-18
Also published as: CN1126454C; US5965128A; AU735914B2; CN1266351A; EP1005273A4; WO1999008532A1; KR100447903B1; KR20010022906A; AU8409598A; CA2296763A1; BR9811179A; EP1005273A1; NZ502420A

Abstract

(57)【要約】優勢共生細菌株が単離された。反芻動物に与えられた単離細菌株は、動物における病原体、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の確立を予防し得る。この株は、接種後約２８日で、接種された動物の胃腸管内容物から再単離され得る。以前、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７によって感染された動物は、本発明の優勢共生細菌のいずれかを投与することによって、この病原体を減少または除去するために処置され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（合衆国支援の研究開発についての陳述）本発明の基礎となる研究の一部は、米国農務省からの補助金番号９７−４３３
の支援で実施された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

【０００２】（発明の背景）出血性大腸炎および溶血性尿毒症症候群を引き起こす重要なヒト病原体である
Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、過去１０年間、ヒトの疾病の原因としての頻
度が増加していることが報告されている（概説については、Ｂｅｌｌ、Ｐ．Ｂら
（１９９４）ＪＡＭＡ、２７２：１３４９−１３５３；Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｐ．Ｍ
ら（１９９１）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６０−９８；Ｐａｄｈｙｅ
、Ｎ．Ｙら（１９９２）Ｊ．ＦｏｏｄＰｒｏｔ．５５：５５５−５６５を参照
のこと）。ウシ、特に若いウシは、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の主要なリザ
ーバーとして関係し、食物に十分に調理されないウシ挽き肉は、起因する発生の
主要な媒体である。フルーツ、フルーツジュース、野菜（レタス）および水（娯
楽用の湖水を含む）に関連する発生の数が近年、急激に増加している。

【０００３】ＵＳＤＡＮａｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＭｏｎｉｔｏｒ
ｉｎｇＳｙｓｔｅｍによってなされた近年の国家調査によって、１．６％のフ
ィールドロットウシが糞便によってＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を発散し、そ
して、０．４％のフィールドロットウシがＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：ＮＭを発散
することが示されている（Ｄａｇａｔｚ、Ｄ．（１９９５）ＵＳＤＡ：ＡＰＨＩ
Ｓ：ＶＳ、Ｃｅｎｔｅｒｓｆｏｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄａｎ
ｉｍａｌｈｅａｌｔｈ、ＦｏｒｔＣｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ（私信））。酪農
場における仔ウシの主要な研究によって、離乳してから４ヶ月齢の間の１．５％
が、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を糞便において発散することが示された（Ｚ
ｈａｏ、Ｔら、（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６１：１２９０−１２９３）。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の仔ウシおよび成
体ウシへの実験的感染は、同じ年齢の群の動物間で広く異なっている。しかし、
成体ウシより仔ウシにおいて長く保持され、以前の感染は、同じ株のＥ．ｃｏｌ
ｉＯ１５７：Ｈ７による再感染を妨げない（Ｃｒａｙ、ＣＷら、（１９９５）
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１５８５−１５９０）
。ニワトリ、シカおよびヒツジのようなほかの動物もまた、延長された期間でＥ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を保持する能力を持つことが決定されている。

【０００４】多くの公衆健康の懸念は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の食物汚染に関連し
て起っている。そのような懸念は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の特殊な酸耐
性によって高められている。適切な調理は、食物においてＥ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７を死滅させる有効な方法である。しかし、食物調理における非衛生的な
習慣は、しばしば食物に起因する病気を生じ、それ故、ウシにおけるＥ．ｃｏｌ
ｉＯ１５７：Ｈ７の保持を減少あるい除去する方法は、食物および環境におけ
る病原体への公衆の曝露を減じるため必要とされる（Ｗａｎｇ、Ｇ．ら（１９９
６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２５６７−２５７
０）。

【０００５】ワクチン接種は、有害な細菌の保持からウシを保護する伝統的なアプローチで
ある。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、ウシに付着も、感染もしない
。仔ウシのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７局在化の最初の部位は、第１胃および
結腸である。第１胃は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の長期間保持の最も重要
な部位であるようであり、そして結腸で認められる細菌の供給源として働き得る
（Ｂｒｏｗｎ、Ｃ．ら、（１９９５）Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．３２：５８７）。
結腸組織の組織学的検査によって、結腸組織へのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７
の付着の証拠は示されていない。それ故、結腸におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７
：Ｈ７の存在は、一過的状態であると思われ、これによって、この細菌は、結腸
をコロニー化するよりむしろ通過している。ワクチンは、ウシによって保持され
、そして発散されるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量を減らすのに有効である
とは思われない。

【０００６】仔ウシによって保持されたＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量は、栄養および
管理状態によって影響を受け得る。Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（（１９９３）ＦＥＭ
ＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１４：７９−８４）は、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１５７：Ｈ７が絶食したウシから集められた第１胃液で制限を受けずに増殖す
ることを決定した。

【０００７】Ｅ．ｃｏｌｉのうちのいくつかの株は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７の株を含む下痢
原性（ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ株に対してインビトロで阻害
するコリシンを産生し得る（Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｄ．Ｅ．ら、（１９９１）Ｃａｎ
Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：９７−１０４；Ｍｕｒｉｎｄａ、Ｓ．Ｅ．ら
（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３１９６
−３２０２）。Ｍｕｒｉｎｄａらは、２４のＥ．ｃｏｌｉコリシン産生株をアッ
セイし、そして、評価された全Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７株がマイトマイシ
ンＣを含む寒天上でＣｏｌＥｌからＥ８、ＫおよびＮに対して感受性であり、
そしてルリアアガー（Ｌｕｒｉａａｇａｒ）上でＣｏｌＧ、Ｃｏｌ．Ｈおよび
ＭｃｃＢ１７に対しても感受性であることを決定した。コリシン感受性および耐
性のパターンは、株同定のため使用されている。バクテリオシン感受性に基づい
た細菌株の生物学的制御は成し遂げられていない。しかし、Ｄｏｙｌｅら（米国
特許第５，３０２，３８８号）は、家禽盲腸のコロニー形成部位に対してＣａｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｏｒｊｅｊｕｎｉと競合でき、そしてＣ．ｊｅｊｕｎｉの増
殖を阻害することができる選択された細菌株を投与することによる、家禽のＣ．
ｊｅｊｕｎｉコロニー形成の予防または阻害を開示した。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、特定の株の共生Ｅ．ｃｏｌｉ、それらの単離体、特徴および反芻動
物によるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持を予防または処置するために使用
する方法を含む。「共生（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」とは、有効用量の上記共生細菌
を先に投与された反芻動物においてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の確立を予防
する特性を有する細菌を意味する。例えば、共生細菌のうちの１つの株の有効量
を最初に投与され、後にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を投与された仔ウシは、
Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のキャリア（保持者）にはならない。一方、Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与された仔ウシは、数週間この株を保有し続け
、この細菌を糞便において環境に発散する。本研究で単離された１８共生株の内
、４株が接種の約２８日後、接種された動物の胃腸管内容物から再単離され得る
ことを意味する「優勢（ｄｏｍｉｎａｎｔ）」として同定された。

【０００９】優勢共生細菌はまた、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を先に接種され、そして
この病原体を保有している仔ウシからＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を減少また
は除去し得ることが示された。

【００１０】従って、本発明によって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の曝露の前に反芻動
物に対して共生細菌の株または株の組み合わせの有効量を投与する工程により、
反芻動物によるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７の保有を予防する方法が提供される。こ
の方法は、環境に存在し得るＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７に曝露する前に、若
年で、仔ウシのような若い反芻動物の処置にとって特に有用である。この方法は
また、フィールドロットでの汚染からフィールドロットに輸送された動物を予防
するためにも有用である。

【００１１】本発明はさらに、有効量の優勢共生細菌株または株の組み合わせを有効量投与
することによって、反芻動物からＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を減少または除
去する方法を提供する。この方法は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を含まない
ようウシ群を維持し、そして屠殺前にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持を減
少するのに有用である。

【００１２】共生細菌の投与は、有効量の共生細菌を含む餌補充物もしくは添加物の給餌に
よって、または、動物の飲料水への水処理添加物もしくは接種の供給によって達
成される。従って、本発明は、共生細菌を含む餌補充組成物および共生細菌を含
む水添加物を提供する。

【００１３】本発明は、さらに寒天上でＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の増殖を阻害する能
力について、糞便または腸から単離された株の増殖上清をスクリーニングするこ
とを含む共生細菌を単離する方法を包含する。優勢共生細菌の同定のための方法
は、反芻動物に共生細菌株の混合物を接種し、次いで所定期間、例えば約４週間
後にこの動物からこの株を単離する工程を包含する。この再単離株は、首尾よく
この動物で維持されている株である。それ故、優勢共生細菌という用語である。
優勢共生株の再単離と同定はマーカー形質の使用によって容易になり得、これら
の特性は、内因性か、選択されたかまたは操作されたもので、各株を混合物から
同定および／または選択できるものである。

【００１４】共生細菌単離法、優勢共生細菌単離法、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持
を予防する方法、および動物からＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を減少または除
去するための動物の処置法は、ウシ以外の他の動物（特に他の反芻動物）のすべ
てに適用でき、これらの動物はまた、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を保持する
ことが観察されている。現在、ウシは、最も巨大なＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ
７のキャリアである。優勢共生株の単離および使用方法は、ウシで行なわれた研
究によって成し遂げられる。多くの数の株が共生細菌の基準、そして優勢共生細
菌の基準に合致し得る天然の供給源から利用可能である。本明細書に記載された
単離プロセスの反復は、本明細書中に記載されたものと同じまたは異なった株を
生じ得る。そのような株は、本明細書に記載されるような共生細菌および優勢共
生細菌の一般的な分類に含まれる。

【００１５】（発明の詳細な説明）結腸組織の組織学的検査によって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のウシ結腸
組織への付着の証拠は認められなかった。第１胃は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：
Ｈ７の長期間保持の最も重要な部位であると思われる。結腸におけるＯ１５７：
Ｈ７細菌の存在は、一過的状態であると考えられ、細菌は、この第１胃供給源か
ら通過し、糞便で発散されている。動物は、最初、汚染された草、食物または水
の摂取によって感染し得る。現在の研究結果は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７が
単一の摂取用量の後、３０日まで未処理ウシの第１胃に残り、そして同じ期間を
通じて糞便において発散されることを示している。従って、Ｏ１５７：Ｈ７細菌
は、動物の消化管に常在の任意の他の微生物株と共にウシによって保持される。
本発明の目的のために、組織または糞便中でＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７が検
出され得るウシおよび他の動物は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を保持すると
いわれている。動物によって保持されるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量は、
様々な組織からのサンプリングを含む様々な方法で測定し得る。最も簡便には、
Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の存在は、糞便において測定され得る。そのよう
な測定は、実用的な重要性を持っている。なぜなら、糞便汚染は、明確な食肉汚
染源であり、そして他の動物の再導入および感染源でもあるからである。本明細
書中に示したように、糞便によって発散されたＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の
量は、第１胃において測定可能な量で反映される。従って、糞便におけるＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量は、動物によって保持される量の測定である。Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の定量的測定は、１ｇの糞便または１ｍｌの第１胃（
液）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として表される。

【００１６】「共生（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」は、本明細書中では天然の供給源から単離され
、そしてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の増殖を阻害する特性を有する細菌を記
載するための形容詞として使用される。本明細書で使用される阻害試験は、固体
培上でのインビトロ試験であり、固体培地の表面に施用した場合、候補単離細菌
の培養上清をＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の増殖を阻害する特性について観察
した。代表的には、候補株の培養上清をしみ込ませたペーパーディスクをＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を接種した寒天プレートの表面に置いた。共生細菌上清
は、ディスク近傍でＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の阻害を示す透明な寒天また
は減少した増殖密度の輪を引き起こした。インビトロまたはインビボでの直接的
増殖競合試験を含む、入手可能であるかまたは考案され得る他の阻害試験が存在
する。そしてそれは、本明細書中で記載されたものと類似した共生細菌のパネル
を作り得る。任意のそのような試験によって同定された細菌株は、本明細書中で
使用される様な共生細菌の分類の中に入る。

【００１７】用語「優勢共生」は、細菌が投与された動物で維持し、そしてその動物から再単
離され得る共生細菌に適用される。本明細書中に記載された実施例で使用される
基準は、接種後２６日の再単離であった。仔ウシは、１８の共生株の混合物を与
えられ、次いで、様々な組織、消化内容物および糞便から接種２６日後にサンプ
リングされた。４株が回収可能であり、優勢共生株と命名された。接種とサンプ
リングとの間のより短いまたはより長い期間を含む他の基準が使用され得る。優
勢共生株の維持によって、動物で保持されたＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量
の有用な減少が供給され得るに十分長い期間を選ぶことは、得策である。

【００１８】優勢共生細菌の単離は、本明細書中に記載された原理および手順に従って、当
業者によって実行され得る。ウシの糞便および組織から単離された１２００のコ
ロニーの内、１８コロニーが共生であり、そして４コロニーが優勢共生であった
。従って、同様の数の独立単離物の試験は、首尾よく優勢共生細菌を得るのにか
なり有望である。

【００１９】優勢共生細菌の投与は、消化管に生物体を導入しやすい任意の方法によって成
し遂げられ得る。この細菌は、キャリアと混合し、そして液体、固体餌または飲
料水へ適用され得る。このキャリア物質は、細菌および動物に対して無毒である
べきである。好ましくは、このキャリアは、保存中に細菌の生存度を促進する成
分を含む。この細菌はまた、動物の口に直接注入される接種物ペーストとして処
方され得る。この処方物は、嗜好性の改善、保管期限の改善、栄養的利点を与え
るなどのため添加された成分を含み得る。もし、再現性があり、測定された用量
が所望である場合、この細菌は、第１胃カニューレによって本明細書に記載され
たように投与され得る。投与されるべき優勢共生細菌の量は、効力に影響を与え
る因子によって支配を受ける。本研究では、１０¹⁰ＣＦＵが単一用量として投与
された。より低い用量が有効であり得る。餌または飲料水で投与される場合、投
与は、数日または数週間でさえ広がり得る。数日わたって投与されたより低い用
量の累積効果は、１０¹⁰ＣＦＵの単一用量より大きくなり得る。優勢共生細菌の
投与前、投与中および投与後に糞便におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の数
をモニタリングすることによって、当業者は、動物によって保持されたＥ．ｃｏ
ｌｉＯ１５７：Ｈ７の量を減少するのに必要な用量レベルを容易に確認し得る
。１以上の株の優勢共生細菌が共に投与され得る。株の組み合わせは有益となり
得る。なぜなら、個々の動物は、所定の個々において最も持続する株が異なり得
るからである。

【００２０】優勢共生細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を現在保持していない動物が
、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７が存在する他の動物または環境への曝露によっ
てこの株を獲得しないように、予防剤として投与され得る。フィールドロットの
ような新しい場所に移されようとしている若い仔ウシおよび成熟動物は、予防投
与のための魅力的候補である。

【００２１】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を保持している動物の処置は、動物で保持され
ているＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の量を減少または除去するために、Ｅ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７感染動物に優勢共生細菌を投与することによってなされ
得る。糞便にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を発散することが知られている動物
またはＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の存在が知られている動物は、優勢共生細
菌での処置に適切な候補である。

【００２２】優勢共生細菌を投与する方法は、予防のためであっても処置のためであっても
基本的に同じである。従って、最初にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７がこの動物
によって保持されているか決定する必要性は、除外される。全ての動物群に効果
量を日常的に投与することによって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７による汚染の
危険は、十分に減少し、または予防および処置の組み合わせによって除去し得る
。

【００２３】

【実施例】

（実施例１．共生細菌の単離）共生細菌をウシ糞便またはウシ胃腸組織（腸および結腸）から単離した。糞便
サンプルを糞便試験によって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７について陰性であ
ることが確かめられたウシから回収した。糞便サンプルを、０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で段階希釈し（１：１０）、そして、０．１ｍｌの
各希釈物をＳｏｒｂｉｔｏｌＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（ＳＭＡ）プレートに
プレートした。プレートを、３７℃で１６時間インキュベートし、１０コロニー
までを無作為に選択し、そして各々を１０ｍｌのＴｒｉｐｔｉｃａｓｅｓｏｙ
ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（ＢＢＬ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｃｏｃ
ｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む試験管に移した。培養物を、３７℃で１６時
間インキュベートした。組織サンプル（各１ｇ）を１分間、９５００ｒｐｍでホ
モジナイズし（Ｕｌｔｒａ−ＴｕｒｒａｘＴ２５ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｊａｎｋｅ＆ＫｕｎｋｅｌＩＫＡ−ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｇｅｒｅｍａ
ｎｙ）、次いで０．１ｍｌの部分をＳＭＡプレートの表面にプレートした。プレ
ートを、３７℃で１６時間インキュベートした。１０までのコロニーをそれぞれ
１０ｍｌのＴＳＢを含む試験管に移し、そして３７℃で１６時間インキュベート
した。各培養物の上清液をフィルター滅菌した（０．２μｍ酢酸セルロース膜
、ＮａｌｇｅｎｅＣｏ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）。

【００２４】（実施例２．抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７特性についての培養物のスク
リーニング）５株のＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７混合物（９３２（ヒト単離物）、Ｃ７９
２７（ヒト単離物）、Ｅ００９（食肉単離物）、Ｅ００１８（ウシ単離物）およ
びＥ０１２２（ウシ単離物）を含む）を抗Ｅ．ｃｏｌｉ代謝物について培養上清
をスクリーニングするために用いた。０．１ｍｌで各株のほぼ等しい集団のＥ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７、およそ１０⁷個を２連のＳＭＡおよびＴＳＡプレートに表面プレートした。ディスク（直径１２ｍｍ）を各ＳＭＡおよびＴＳＡプレ
ートの表面にプレートし、そして単一培養物からのフィルター滅菌した０．１ｍ
ｌの上清をディスク表面に適用した。さらに、７０％エタノールを有するディス
ク（陽性コントロール）およびＰＢＳを有するディスク（陰性コントロール）が
各プレートに適用した。培養物を３７℃で１８時間インキュベートし、そして阻
害域を観察した。１ｍｌより多い透明域を陽性反応としてみなした。

【００２５】（実施例３．Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７培養物の調製）上記の同じ５株混合物を使用した。これらの細菌単離物の計数を促進するため
に、この株をナリジクス酸（５０μｇ/ｍｌ）に対する耐性を誘導した。各株のナリジクス酸抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７をナリジクス酸（５０μｇ/ ｍｌ）を含むトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）１０ｍｌに移し、振盪（１５
０ｒｐｍ）しながら３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。各単離物の２
ｍｌ懸濁液を３００ｍｌのＴＳＢに移した。３７℃で１６〜１８時間インキュベ
ートした後、この細菌を、遠心分離（４，０００×ｇ、２０分間）で沈殿させ、
そしてＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳを６３０ｎｍで０．５の光学密度（Ｏ．Ｄ
．）を得るために必要な量で沈殿した細菌に加えた（１０⁸ＣＦＵ/ｍｌ）。Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の５単離物（各株の２×１０⁹ＣＦＵ）の混合物を仔ウシの経口接種の直前に、２％滅菌スキムミルク２５０ｍｌで混合した。細菌数
をＴＳＡおよびナリジクス酸含有ＳＭＡ（５０μｇ/ｍｌ、ＳＭＡ−ＮＡ）プレートで計数によって確認した。

【００２６】（実施例４．共生細菌の調製）全ての共生細菌単離物を糞便における計数の容易性のため、ナリジクス酸耐性
（５０μｇ/ｍｌ）について選択した。この細菌を１０ｍｌのナリジクス酸含有ＴＳＢ（５０μｇ/ｍｌ）で個々に増殖させた。各単離物１ｍｌ部分を１００ｍｌのＴＳＢに移した。１６〜１８時間、３７℃でインキュベートした後、この細
菌を、遠心分離によって沈殿させ、洗浄し、そして上記の方法を使用して６３０
ｎｍでの光学密度０．５に調整した。この１８株の共生細菌（１０¹⁰ＣＦＵ）を
ウシの経口接種の直前に２５０ｍｌの２％滅菌スキムミルク中で混合した。この
細菌数を２連でＴＳＡおよびＳＭＡ−ＮＡプレート上の段階希釈物の計数によっ
て確認した。

【００２７】（実施例５．仔ウシの調製）１５頭の単一供給源を持つ幼齢の雄性乳牛をミルクリプレイサー（ｍｉｌｋ
ｒｅｐｌａｃｅｒ）で育て、ジョージア大学に移す前に、６週齢で離乳させた。
仔ウシを気候制御ＢＬ−２コンクリート室に個々に収容した。各部屋は、個々の
床排水を有し、毎日１回清掃された。仔ウシにアルファルファペレットおよび甘
い飼料の混合物を一日２回給餌し、そして水を自由に手に入れられるようにした
。２週間の馴化期間中、全ての仔ウシの糞便を、サンプリングし、そして蛍光抗
体染色でウシウイルス性下痢、コロナウイルス、ロタウイルス、Ｅ．ｃｏｌｉピ
リ線毛抗原およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａについて陰性であることを試験
した。腸寄生虫についての糞便浮上分離、そしてＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＥ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７についての細菌培養を実施し、そして糞便のｐＨを
測定した。２週間の前馴化期間の後、仔ウシを外科的に第１胃カニューレ（フレ
キシブルな第１胃カニューレ）に適合させた。少なくとも１０日が、実験が始め
られる前の外科的回復および後療法に与えられた。

【００２８】（実施例６．第１胃カニューレ挿入）飼料をウシに１２時間与えなかった。左の側腰窩（ｌｅｆｔｐａｒａｌｕｍ
ｂａｒｆｏｓｓａ）を標準の外科的調製のためにはさみ、そして磨いた。この
窩を「Ｌ」ブロックを反転させた、脊椎骨傍神経ブロック；リドカイン（局所麻酔
よりわずかに小さい）を使用して麻酔した。カニューレの直径よりわずかに小さ
い円形切開をし、そしてこの円形の皮膚小片、下に存在する小皮および外部の腹
斜筋を取り除いた。脈管を必要な場合連結し、そして内部腹斜筋、横行筋、およ
び腹膜を適当に分離し、そして第１胃壁を露出させるための開口を作るために収
縮させた。この第１胃壁を第１胃を体外に出す牽引のために２つの大きなタオル
クランプでつかんだ。次いで、この第１胃壁を＃３腸線または連続した縫合パタ
ーンを有する筋肉層を組み込んだｖｅｔａｆｉｌを使用して皮膚に縫合した。こ
の第１胃壁を切開し、第１胃の円形片を取り除き、そしてカニューレを挿入した
。仔ウシを手術の５日間後にプロカインペニシリンＧで筋肉内処置した。カニュ
ーレと第１胃管の領域は、ベタジン溶液で毎日、緩やかに洗浄した。

【００２９】（実施例７．仔ウシの接種）１２時間の絶食に続いて、仔ウシに共生細菌を含む２５０ｍｌのスキムミルク
を第１胃カニューレ挿入によって接種した。４８時間後、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７の５株混合物を同じ経路を介して接種した。コントロール仔ウシをＥ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の５株混合物のみでチャレンジした。チャレンジの後
、仔ウシを毎日、機能低下、発熱、下痢、および食欲不振を含む臨床的な兆候に
ついて検査した。直腸糞便またはフィステル（ｆｉｓｃｕｌａｒ）管から集めら
れたサンプルをｐＨを測定し、そしてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７および共生
細菌を計数した。

【００３０】細菌接種物の単離および計数：１０ｇの糞便または第１胃内容物のサンプルは
、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７接種後に毎日、直腸回収または第１胃カニュー
レ挿入を介して集めた。サンプルを５℃に保たれた１５ｍｌのＣａｒｙ−Ｂｌａ
ｉｒ移行培地を含むチューブに置き、そしてＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｏｏｄ
ＳａｆｅｔｙａｎｄＱｕａｌｉｔｙＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔに分析のため
輸送した。１ｇの糞便を含む一容量を（１：１０）０．８５％ＮａＣｌで１０^-6 まで段階希釈し、そして０．１ｍｌの各希釈物を２連でＳＭＡ−ＮＡにプレート
した。剖検で集められた完全な胃腸管の組織サンプルを分析まで５℃に保持した
。各セグメントからの各組織の内容物を分離し、重量を測定し、そしてこの組織
を１００ｍｌのＰＢＳでリンスした。このリンスした組織を９ｍｌのＰＢＳに添
加し、そしてＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ組織ホモジナイザーで９，５００ｒｐｍ
にて、１分間ホモジナイズした。０．１ｍｌの組織または組織内容物懸濁液のサ
ンプルをＳＭＡ−ＮＡプレートに４連で接種し、そしてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７
：Ｈ７または共生細菌の計数のために３７℃で２４時間インキュベートした。こ
れらの細菌がダイレクトプレーティング法で検出されない場合、選択的増強法（
ｓｅｌｅｖｔｉｖｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄ）（１７）（５０μ
ｇ/ｍｌナリジクス酸を含む改変ＴＳＢ）を行った。サンプルをそれぞれ１００ｍｌの選択的増強培地に置き、そして１５０ｒｐｍの攪拌で３７℃で、２４時間
インキュベートした。培養物の希釈物をＳＭＡ−ＮＡにプレートし、そして単離
物を選択し、さらに試験した。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７（ソルビトール陰
性）を代表するコロニーをＳＭＡ−ＮＡに再プレートし、そして生化学的な方法
でＥ．ｃｏｌｉとして、そして血清学的方法でＯ１５７およびＨ７として確認し
た。共生細菌をパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）でＤＮＡフィンガプ
リントによって確認した。

【００３１】（実施例８．細菌単離物のゲノムフィンガープリンティング）以前に記載されたものと同様のＰＦＧＥ手順を使用した（１４）。細菌を２０
０ｒｐｍの攪拌で３７℃にて２４時間、１０ｍｌのＴＳＢ中で増殖させた。この
細菌を遠心分離（４０００×ｇ、２０分）で沈殿させ、２５ｍＭＥＤＴＡを含
む７５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＳＥ）で３回洗浄し、そして０．５ｍｌの
ＳＥに再懸濁した。この細菌懸濁液を１０ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭＭｇＣｌ ₂ 、および０．１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＭＥ）、ｐＨ７．５からなる緩衝液中の０．５ｍｌの２％（Ｗ/Ｖ）低融点アガロースと混合した。この混合物をサンプル型に分配し、そしてこのアガロースプラグをプロテナーゼＫ（２ｍｇプロテイ
ナーゼＫ、５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＥＤＴＡ、１％Ｎ−ラウロイルサ
コシン／ｍｌ、ｐＨ８．０）で５６℃にて、一晩消化した。このサンプルを１０
ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５（ＴＥ）で洗浄し、そして５０
ＵのＸｂａＩで消化した。一晩、３７℃でインキュベートした後、この反応を２
０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えて停止した。このＤＮＡサンプルをコンター
クランプ（ｃｏｎｔｏｕｒ−ｃｌａｍｐｅｄ）均一電場デバイス（ＣＨＥＦＭ
ＡＰＰＥＲ、ＢｉｏＲａｄ）で０．５×ＴＢＥ緩衝液中の１．２％アガロースゲ
ルで電気泳動した。５〜５０秒のパルス時間で２００Ｖ、２４時間、直線傾斜お
よび電場角１２０度、１４℃での電気泳動の後、ゲルをエチジウムブロマイドで
染色し、そしてバンドを、可視化し、そしてＵＶトランスイルミネーションで撮
影した。３つの優勢共生株（２７１、７８６、７９７）の結果を図９および１０
に示す。

【００３２】（実施例９．仔ウシの剖検）仔ウシを静脈内にペントバルビタールナトリウムを与えることにより安楽死さ
せた。この胃腸管を食道および直腸でクランプし、全て取り除いた。４〜６ｃｍ
長の十二指腸、近位、中位および遠位の空腸、近位および遠位の回腸、近位およ
び遠位の盲腸、上行結腸の近位ループ、らせん状結腸の求心および遠心ターン、
横行結腸および下行結腸を組織および最小の交差汚染を有する内容物の両方にお
けるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７および共生細菌の計数のためのすべての切片
のサンプリングを可能にするために２重に結んだ。第１胃、第２胃、第３胃、お
よび第４胃の切片および内容物、ならびに腎臓、脾臓、肝臓、胆嚢、空腸リンパ
節、回腸リンパ節、盲腸リンパ節および扁桃の切片もまた、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１
５７：Ｈ７および／または共生細菌の培養および計数のために集めた。これらの
全ての部位からの切片、ならびに前肩甲リンパ節、骨格筋、皮膚、扁桃、甲状腺
、胸腺、食道、心臓、膵臓、へそ、副腎、膀胱、および精巣の切片もまた、組織
学的検査のために１０％の緩衝化ホルマリンに置いた。

【００３３】（実施例１０．組織の組織病理学および免疫組織化学）固定された組織を標準法によりパラフィン上に包埋し、５μｍに切片化し、そ
してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。選択した切片をグラム染色した
。多くの表面、または管腔細菌を組織学的に示す切片を選択し、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１５７：Ｈ７を同定するためにアルカリホスファターゼ免疫染色手順で処理し
た。組織をキシレンで１０分間脱パラフィン化し、段階的なアルコールで再水和
し、そしてＰＢＳでリンスした。この切片をＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７特異
的抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でカバーし、そして室温で多湿チャン
バーにおいてインキュベートした。ＰＢＳにおける１０分間のリンスの後、スラ
イドを２０分間、室温（ＲＴで）、多湿チャンバーにおいてビオチンで標識した
２次抗体でカバーした。このスライドをＰＢＳで１０分間リンスし、多湿チャン
バーに戻し、そしてこの組織切片をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビ
ジンでカバーした。２０分間室温でインキュベートした後、このスライドをＰＢ
Ｓで１０分間洗浄し、多湿チャンバーに置き、そして基体溶液で１５分間覆った
。このスライドをＰＢＳで１０分間リンスし、３分間、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマト
キシリンで対比染色し、水性培地に続いて非水性マウント培地でマウントし、そ
して顕微鏡で検査した。

【００３４】（実施例１１．共生細菌の非存在および存在下で保持されたＥ．ｃｏｌｉ
Ｏ１５７：Ｈ７の量）Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７に対して阻害性の代謝物を分泌する可能性のあ
る共生細菌のインビトロスクリーニング。ウシ組織および糞便から単離された１
，２００コロニーの内の１８個が、インビトロでＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７
を阻害した。それらの中で、５コロニーを糞便から単離し、５コロニーを小腸か
ら、および８コロニーを結腸から単離した。この１８コロニーの内の１７個をＥ
．ｃｏｌｉとして同定し、そして他のコロニーをＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉ
ｌｉｓとして同定した。全てをＳｈｉｇａ毒素産生についてアッセイし、そして
Ｓｈｉｇａ毒素を産生するものはなかった。ＰＦＧＥゲノムＤＮＡフィンガープ
リンティングによって、１８単離物中の１３の異なるプロフィールが明らかとな
った。

【００３５】共生細菌による仔ウシのコロニー形成。最初に１頭の仔ウシに、１株の共生細
菌を給餌した（１０¹⁰ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ）。この仔ウシは正常であると思わ
れ、そしてこのＥ．ｃｏｌｉは、実験の終了時（１２日目）に回腸および盲腸の
みこの増強手順によって回復した。次いで、２頭の仔ウシに混合物として完全な
１８株（おおよそ等しい濃縮物、各５×１０⁸ＣＦＵ）の共生細菌（一頭の仔ウシ当たり１０¹⁰ＣＦＵ）を給餌した。この仔ウシ糞便は、正常な粘度を有し、そ
してこの細菌は、２７日間まで胃腸管をコロニー化した（この研究の終了時に数
値は糞便１ｇあたり５０〜２００ＣＦＵであった）。

【００３６】ＰＦＧＥによる優勢共生細菌株の測定。扁桃、第３胃、第２胃、第１胃、近位
回腸、遠位盲腸、上行結腸の近位ループ、横行結腸および糞便から接種後２６日
目に単離された２１コロニーをＰＦＧＥによって分析した。４つのＤＮＡプロフ
ィールを有する単離物は優勢であり、そして全てはＥ．ｃｏｌｉであった。２１
コロニー中、９個が＃７９７株、７個が＃７８６株、３個が＃２７１株、そして
２個が＃１０１９株であった。

【００３７】共生細菌による仔ウシの病理学的変化。いくつかの株の接種された細菌を剖検
で異なった胃腸管部分由来の組織標本から回収したが、アッセイされたどの組織
サンプルにも病理学的変化はなかった。

【００３８】仔ウシにおけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持減少における共生細菌の
効率。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与された９頭の仔ウシのうち、すべ
てが発熱または下痢の証拠もなく健康なままであった。接種後３週間の間に、Ｅ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を断続的にすべての動物の第１胃液から単離した（
図１）。様々なレベルで糞便におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の発散がこ
の実験を通じて（平均２８日）続いていた（図２）。剖検では、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１５７：Ｈ７を１０頭の内８頭の第１胃内容物から単離し、そして１０頭の仔
ウシの内１０頭の結腸から単離した。病理学的変化は、検査されたどの組織サン
プルにおいても観察されなかった。

【００３９】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７での処理の２日前において共生細菌を投与され
たすべての仔ウシは、発熱および下痢の証拠も無く健康なままであった。Ｅ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７が、フィステル管で集められた第１胃サンプルで検出さ
れた（２頭で９日まで、１頭で１６日、２頭で１７日、そして１頭で２９日間ま
での間に）（図３）。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、一頭で各、１１、１５
、１７、１８、１９および２９日目（実験の終了時）までに糞便において検出さ
れた（図４）。剖検で（平均３０日）、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、これ
らの６頭のいずれからの第１胃サンプルからも回収されなかった。しかし、これ
らの細菌は、この６頭のうち１頭の結腸から回収された。このＥ．ｃｏｌｉＯ
１５７：Ｈ７陽性動物は、この研究中、接種後２日間の間（１６、１７日および
２３、２４日）、２回絶食された。この６頭の共生細菌処理動物の内の４頭がこ
のプロトコールに従って絶食された。

【００４０】（実施例１２．ウシにおけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の減少/除去のための処置としての優勢共生細菌の効力）優勢共生細菌の調製。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７に阻害性であることが以
前に決定された４株のＥ．ｃｏｌｉ（２７１、７９７、７８６および１０１９）
を糞便における計数の容易さのためにナリジクス酸耐性（５０μｇ/ｍｌ）について選択した。各４株のほぼ等しい個体数を仔ウシへの投与のために５０ｍｌの
２％滅菌スキムミルクに混合した（計１０¹⁰ＣＦＵ）。このＥ．ｃｏｌｉ個体数
を２連のＴＳＡおよびＳＭＡ−ＮＡプレートで計測によって確認した。

【００４１】仔ウシの接種。１６頭の仔ウシの全部を使用した。２４時間の絶食の後、各々
に、カニューレを使用して、５０ｍｌの２％滅菌スキムミルク（１０¹⁰ＣＦＵ）
中でＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の５株混合物を投与された。２頭の仔ウシを
カニューレを使って、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の投与の１日後に共生細菌
（１０¹⁰ＣＦＵ）で処理した。２頭の更なる仔ウシをＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：
Ｈ７の投与の３日後に共生細菌（１０¹⁰ＣＦＵ）で処理した。カニューレを使っ
て集められた第１胃サンプル、および直腸糞便をＥ．ｃｏｌｉＯ１５７；Ｈ７
および共生細菌について毎日計数した。

【００４２】仔ウシでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持の減少/除去における共生細菌の処理の効率。陽性コントロールとしてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみを
投与された１２頭の仔ウシの内、Ｏ１５７を１頭から２週間までに、３頭から３
週間までに、８頭から４週間までに断続的に第１胃から単離した（図５）。１２
頭の仔ウシの内の１１頭の糞便における様々なレベルでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７の連続した発散が、この研究を通して起こった（図６）。剖検で、Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、１２頭の仔ウシの内の９頭の第１胃内容物、およ
び１２頭の仔ウシの内の１０頭の結腸から単離した。

【００４３】４頭の仔ウシを４株の共生細菌（株２７１、７８６、７９７および１０１９）
の混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の投与の１〜３日後に処理した。Ｅ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、１頭で６日間まで、２頭で８日間、そして１頭
で９日間までに第１胃サンプルで検出された（図７）。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７
：Ｈ７は、２頭では１０日間まで、１頭は１１日まで、および１頭は１５日まで
に糞便において検出された（図８）。剖検で（２２日で２頭、および２７日で２
頭）、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７は、これらの４頭のいずれからの第１胃お
よび結腸のサンプル（組織および内容物）からも回収されなかった。２７１、７
８６、および７９７株の共生細菌のみが、この研究の終わりに４頭の動物から回
収された。１０１９株は、剖検時にいずれの動物においても検出されなかった。

【００４４】前述の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を保持している動物に対して
共生細菌または優勢共生細菌を投与することによって、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７
：Ｈ７の保持を予防および処置する原理および実施を例示する。２７１、７８６
および７９７株のＥ．ｃｏｌｉは、単離され、そして優勢共生細菌であることが
示された。単離の容易さおよび得られた株の数から、他の優勢共生細菌株が単離
され得、そしてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持を予防または処置するため
に、ウシまたは他の動物を接種するために使用され得ることは明白である。異な
る株は、動物種、品種、年齢、餌、生息環境および管理実行に依存する異なる適
用に有利であり得る。動物によって保持されるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７量
の効果的な減少または除去のため、本明細書に一般に記載されたように単離およ
び/または使用されるすべてのこのような細菌株は、本発明の範囲内である。動物に対して有効な用量の共生細菌または優勢共生細菌を提供できる投与法は、細
菌を含む様々な処方物を使用する、当業者に既知の様々な給餌、飲用および他の
経口投与方法を包含しており、これらはすべて本発明の範囲内である。本明細書
中の教示および開示に基づくかまたはそれに由来するすべてのこのような変更お
よび改変は、添付された請求の範囲の範囲内であると思われる。

【００４５】以下の株は、３７ＣＦＲ１．８０１−１．８０９にしたがって、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託される：Ｅ．ｃｏｌｉ２７１ＡＴＣＣ寄託番号２０２０２０、１９９７年８月１
３日Ｅ．ｃｏｌｉ７８６ＡＴＣＣ寄託番号２０２０１８、１９９７年８月１
３日Ｅ．ｃｏｌｉ７９７ＡＴＣＣ寄託番号２０２０１９、１９９７年８月１
３日。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与した仔ウシの第１胃液におけるＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである。矢印は、増強手順のみで
のＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図２】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与した仔ウシの糞便におけるＥ．ｃｏｌ
ｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである。矢印は、増強手順のみでのＥ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図３】共生細菌を投与し、２日間後にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を投与した仔ウ
シ第１胃液におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである
。矢印は、増強手順のみでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図４】共生細菌を投与し、２日間後にＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を投与した仔ウ
シの糞便におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである。
矢印は、増強手順のみでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図５】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与した仔ウシの第１胃液におけるＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである。矢印は、増強手順のみで
のＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図６】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のみ投与した仔ウシの糞便におけるＥ．ｃｏｌ
ｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフである。矢印は、増強手順のみでのＥ
．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図７】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の投与の１〜３日後に優勢共生細菌で処置した
仔ウシの第１胃液におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフ
である。矢印は、増強手順のみでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す
。

【図８】Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の投与の１〜３日後に優勢共生細菌で処置した
仔ウシの糞便におけるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の消長を示したグラフであ
る。矢印は、増強手順のみでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の検出を示す。

【図９】パルスフィールドゲル電気泳動による優勢共生細菌のゲノムＤＮＡのＸｂａＩ
消化物をプロフィールする。左右のレーンは両方とも、λラダ−（４８．５ｋｂ
）である。レーン１〜８は２７１株である。

【図１０】パルスフィールドゲル電気泳動による優勢共生細菌のゲノムＤＮＡのＸｂａＩ
消化物をプロフィールする。左右のレーンは両方とも、λラダ−（４８．５ｋｂ
）である。レーン１は、７８６株、そしてレーン２〜６は７９７株である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ツァオ，トンアメリカ合衆国ジョージア 30269，ピーチツリーシティ，モーガンズターン 206 (72)発明者ハーモン，バリージー. アメリカ合衆国ジョージア 30606，アセンス，ヒルズボロードライブ 110 (72)発明者ブラウン，キャシーアンアメリカ合衆国ジョージア 30622，ボガート，ハノーバードライブ 165 Ｆターム(参考） 4B063 QA06 QQ06 QR75 QS10 4B065 AA26X AC20 BA23 CA43

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｅ．ｃｏｌｉ２７１、Ｅ．ｃｏｌｉ７８６、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ７９７、およびＥ．ｃｏｌｉ１０１９からなる優勢共生細菌の群から選択
される、微生物。
【請求項２】優勢共生細菌を選択する方法であって、以下の工程：反芻動物の組織、体液、消化内容物または糞便から天然に存在する細菌株を単
離し、単離された株を得る工程；液体または固体培地において該単離された株を培養する工程；インビトロでのＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の増殖を阻害する各単離された
株の能力を個々に試験する工程であって、これによって、インビトロでのＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の増殖を阻害する能力を有する株が共生細菌として同定
される、工程；該共生細菌を継代培養し、共生細菌の１以上の株を反芻動物に投与し、そして
所定の時間後に、再単離可能な共生細菌を該動物の消化内容物または糞便から再
単離する工程であって、これによって、該再単離可能な共生細菌が優勢共生細菌
として同定される、工程、を包含する、方法。
【請求項３】前記共生細菌が、選択マーカー形質を用いて提供される、請
求項２に記載の方法。
【請求項４】前記共生細菌がＤＮＡ制限フラグメント消化パターンによっ
て互いに区別可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記動物がウシである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】反芻動物によるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の保持を予防
または処置するための方法であって、請求項３に記載の方法によって選択された
優勢共生細菌の１以上の株の有効量を該動物の消化管に投与する工程を包含する
、方法。
【請求項７】前記優勢共生細菌がＥ．ｃｏｌｉ２７１、Ｅ．ｃｏｌｉ
７８６、またはＥ．ｃｏｌｉ７９７の群から選択される、請求項６に記載の方
法。
【請求項８】前記優勢共生細菌が飲用水と併用した一連の用量で投与され
る、請求項６に記載の方法。
【請求項９】前記優勢共生細菌が餌と併用した一連の用量で投与される、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】前記動物がウシである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】接種組成物であって、キャリアー、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
２７１ＡＴＣＣ２０２０２０、Ｅ．ｃｏｌｉ７８６ＡＴＣＣ２０２
０１８、およびＥ．ｃｏｌｉ７９７ＡＴＣＣ２０２０１９からなる群より
選択される優勢共生細菌の１以上の株を含む組成物。
【請求項１２】前記キャリアーが水を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】前記キャリアーがウシの飼料となる物質を含む、請求項１
１に記載の組成物。