KR100447903B1 - 프로바이오틱 박테리아에 의한 가축에서의 장내 출혈성 이.콜리오 157:에이치 7의 조절 - Google Patents

프로바이오틱 박테리아에 의한 가축에서의 장내 출혈성 이.콜리오 157:에이치 7의 조절 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 우성 프로바이오틱 박테리아 균주가 분리되었다. 반추동물에 공급된 분리 박테리아 균주는 동물에서 병원체E. coliO157:H7의 부착을 방지할 수 있다. 균주들은 접종 후 약 28일 후에 접종된 동물의 위장관으로부터 재분리될 수 있다.E. coliO157:H7에 의해 이미 감염된 동물들은 본 발명의 우성 프로바이오틱 박테리아를 투여하므로서 병원체를 감소 또는 제거하도록 처리될 수 있다.

Description

프로바이오틱 박테리아에 의한 가축에서의 장내 출혈성 이. 콜리 오157:에이치7의 조절{CONTROL OF ENTEROHEMORRHAGIC E. COLI O157:H7 IN CATTLE BY PROBIOTIC BACTERIA}
출혈성 대장염 및 용혈성 요독증을 야기하는 중요한 인간 병원체인E coliO157:H7은 지난 수십년 동안 인간 질병의 원인으로서 빈도가 증가하는 것으로 보고되었다[벨.피.비(Bell, P.B)등, (1994)JAMA 272:1349-1353 ; 그리핀, 피.엠(Grittin, P.M.)등 (1991)Epidemiol. Rev. 13:60-98 ; 파다이, 엔. 와이(Padhye, N.Y.)등(1992)J. Food Prot. 55:555-565 참조] 가축, 특히 어린 동물들이E. coliO157:H7의 기본적인 저장소로서 포함되어 왔는데 요리되지 않은 생고기가 음식 매개 발발의 운반자(vehicle)이다. 또한, 과일-, 과일쥬스-, 야채(상추)-및 물-(레크레이션 호수를 포함) 관련 발발의 수도 최근 수년간 증가되어 왔다. USDA 내셔날 애니몰 헬스 모니터링 시스템(National Animal HealthMonitoring System)에 의해 수행된 최근의 미국 국내 조사에서는 가축사육장 가축 중 1.6%가 배설물에서E. coliO157:H7 을 나타냈으며 0.4%가E. coliO157:NM을 나타냈다고 밝히고 있다. [다가츠, 디.(Dagatz, D) (1995) USDA:APHIS:VS, 전염병 및 동물 건강 센터. 콜로라도, 포트 콜린스(개인적 통신)]. 낙농장 송아지에 대한 주요 연구에서는 이유기에서 4개월 사이의 송아지 중 1.5%가 배설물에서E. coliO157:H7을 나타냈다.[자오, 티.(Zhao, T)등(1995)Appl. Environ. Microbiol. 61:1290-1293].E. coliO157:H7으로의 송아지와 어른 소에 대한 실험적 감염은 같은 나이 그룹의 동물에서 광범위하게 다양하지만 어른소에서 보다 송아지에서 보다 길게 지속되었으며 조기 감염은E. coliO157:H7의 동일한 균주에 의한 재감염을 방지하지 못한다[크레이. 씨 더블유(Cray, C.W.)등 (1995) Appl. Environ, Microbiol.61:1585-1590]. 닭, 사슴 및 양과 같은 다른 동물들도 오랜기간동안E. coliO157:H7을 갖는 것으로 측정되었다.
많은 공중 보건 문제들이 음식의E. coliO157:H7 오염과 관련하여 제기되어 왔다. 그러한 문제들은E. coliO157:H7의 독특한 산 내성에 의해 증가되어 왔다. 적절한 요리가 음식에서E. coliO157:H7을 죽이는 효과적인 방법이다. 그러나, 음식을 준비하는데 있어서 비위생적인 처리는 종종 음식 매개 질병을 가져오고, 따라서 소에서E. coliO157:H7의 운반을 감소 또는 제거하기 위한 방법이 음식 및 환경에서 병원체에 대한 공중의 노출을 감소시키기 위해 요구된다.[왕,지(wang, G)등 (1996) Appl. Environ, Microbiol.62:2567-2570].
백신화(Vaccination)는 해로운 박테리아의 운반으로 부터 소를 보호하기 위한 전통적인 접근이었다. 그러나,E. coliO157:H7은 소에 부착되거나 감염시키지 않는다. 송아지에서E. coliO157:H7 국소화의 일차부위는 제 1위(rumen)과 결장이다. 제 1위는E. coliO157:H7의 장기간 운반을 위한 가장 중요한 부위인 것으로 나타나는데 결장에서 발견된 박테리아 원으로서 제공된다.[브라운, 씨.(Brown, C.)등(1995)Vet. Pathol. 32:587]. 결장 조직의 조직 검사에서는 결장 조직에 대한E. coliO157:H7의 부착 증거가 나타나지 않았다. 따라서, 결장에E. coliO157:H7의 존재는 박테리아가 결장에 있다기 보다는 그곳을 통과하는 일시적인 상대인 것으로 보인다. 따라서, 백신은 소에 의해 운반되어 영향을 미치는E. coliO157:H7의 양을 감소시키는데 효과적인 것으로 보이지 않는다.
송아지에 의해 운반된E. coliO157:H7의 양은 영양 및 관리방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 라즈뮤센(Rasmussen) 등[(1993) FEMS Microbiol. Lett.114:79-84]은E. coliO157:H7가 단식시킨 소에서 수집된 제 1위 액에서 무제한적으로 성장한다고 측정했다.
어떤E. coli균주는 혈청액 O157:H7의 균주를 포함하는 선사 유전성 E. coli 균주에 대하여 시험관 내에서 억제하는 콜리신을 생성할 수 있다. [브래들리, 디.이.(Bradley, D.E.)등 (1991)Can J.Microbiol.37:97-104 ; 뮤린다, 에스.이.(Murinda, S.E.)등 (1996)Appl. Environ. Microbiol. 62:3196-3202]. 뮤린다 등은 24개의E. coli콜리신 생성 균주를 동정하고 평가된 모든E. coli O157:H7균주가 미토마이신-C-함유 한천 상에서 Col E1~E8, K 및 N에 대하여 민감하고 루리아(Luria) 한천(Agar) 상에서 Col G, Col H 및 MccB17에 대하여 민감하다는 것을 측정했다. 콜리신 감수성 및 내성의 패턴을 균주 확인에 사용하였다. 박테리오신-감수성에 기초한 박테리아 균주의 생물학적 조절은 달성되지 않았다. 그러나, 도일(Doyle)등의 미국 특허 제 5,302,388호는 닭의 맹장에 있는 집락부위에 대하여 Campylobacter jejuni와 경쟁할 수 있고 C. jejuni의 성장을 억제할 수 있는, 선택된 박테리아 균주를 투여하므로서 닭의 C. jejuni 집락화(colonigation)를 방지 또는 억제하는 것을 기술하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 프로바이오틱E. coli의 특정 균주, 그들의 분리, 특성 및 반추동물에 의한E. coliO157:H7 운반을 방지 또는 치료하기 위한 사용방법을 포함한다. "프로바이오틱(probiotic) 이란 용어는 효과적인 양의 프로바이오틱 박테리아가 기투여된 반추동물에서E. coliO157:H7의 정립을 방지하는 특성을 갖는 박테리아를 의미한다. 예를들면, 먼저 효과적인 양의 프로바이오틱 박테리아 균주를 투여하고 이어서E. coliO157:H7가 투여된 송아지는E. coliO157:H7의 운반자가 되지 않고, 반면에E. coliO157:H7만을 투여한 송아지는 수주동안 균주를 계속 운반하여 배설물로 환경에 박테리아를 만연시킨다. 본 연구에서 분리된 18 프로바이오틱 균주 중 4개가 "우성(dominant)"로서 확인 되었는데 이것은 그들이 약 28일 후 접종에서 비 접종된 동물의 위장관 내용물로부터 재분리될 수 있다는 것을 의미한다.
우성 프로바이오틱 박테리아는 또한 이미E. coliO157:H7로 접종되어 병원체를 갖고 있는 송아지로부터E. coliO157:H7를 감소 또는 제거할 수 있는 것으로나타났다.
따라서, 본 발명은E. coliO157:H7에 노출되기 전에 반추동물에서 효과적인 양의 프로바이오틱 박테리아 균주 또는 균주들의 조합물을 투여하는 단계에 의해 반추동물에 의한E. coliO157:H7의 운반을 방지하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 주변환경에 존재할 수 있는E. coliO157:H7에 노출되기 전에 이른 단계에서 송아지와 같은 어린 반추동물을 치료하는데 특히 유용하다. 또한, 이 방법은 가축 사육 장소에 수용된 동물들이 그곳에서 오염되는 것을 방지하는데도 유용하다.
본 발명은 또한 효과적인 양의 우성 프로바이오틱 박테리아 균주 또는 균주들의 조합물을 투여하므로서 반추동물로부터E. coliO157:H7를 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 이 방법은 가축무리들을E. coliO157:H7 없게 유지하고 도축전에E. coliO157:H7의 운반을 감소시키는데 유용하다.
프로바이오틱 박테리아의 투여는 효과적인 양의 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 사료 보충물 또는 첨가물을 공급하거나 동물의 식수에 수처리 첨가제 또는 접종물을 공급하므로서 달성된다. 따라서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 사료 보충 조성물 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 물 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 한천 상에서E. coliO157:H7의 성장을 억제하는 능력을 위해 배설물 또는 장으로부터 분리된 균주의 배양 상청액을 스크리닝하는 것을 포함하는 프로바이오틱 박테리아 분리방법을 제공한다. 우성 프로바이오틱 박테리아를확인하기 위한 방법으로는 프로바이오틱 박테리아 균주의 혼합물로 반추동물을 접종하고 소정의 기간, 예를들면 4주후에 동물로부터 균주를 분리하는 단계를 포함한다. 재분리된 균주들은 동물에서 성공적으로 살아남는 것을 즉, 우성 프로바이오틱 박테리아이다. 우성 프로바이오틱 균주들의 재분리 및 확인은 각 균주가 혼합물로부터 확인 및/또는 선택되도록하는 내생의, 선택되거나 가공된 마커 특성을 사용하므로서 용이하게 될 수 있다.
프로바이오틱 박테리아를 분리하는 방법, 우성 프로바이오틱 박테리아를 분리하는 방법,E. coliO157:H7의 운반을 방지하는 방법 및 동물에서E. coliO157:H7가 감소 또는 제거되도록 동물을 치료하는 방법들은 모두 소 이외의 다른 동물, 특히E. coliO157:H7를 지니는 것으로 관찰된 다른 반추동물에게 적용가능하다. 현재로서는 소가 가장 많은E. coliO157:H7의 운반체이다. 우성 프로바이오틱 균주의 분리 및 사용방법은 소에 대해 수행된 연구에 의해 달성된다. 다수의 균주가 프로바이오틱 및 우성 프로바이오틱 박테리아의 기준을 충족하는 천연원으로부터 입수가능하다. 여기에 기술된 분리공정의 반복은 여기에 기술된 것과 같거나 다른 균주를 생산할 수 있다. 그러한 균주는 여기에 기술된 프로바이오틱 및 우성 프로바이오틱 박테리아의 일반적인 카테고리에 속한다.
미연방에서 후원한 연구개발과 관련한 설명
본 발명에 따른 연구는 부분적으로 유나이티드 스테이츠 디파트먼트 오브 어그리컬츄어(United States Department of Agriculture)의 허여번호 제 97-433호의 지원으로 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 특정의 권리를 갖는다.
도 1은E. coliO157:H7만을 투여한 송아지의 제 1위액에서E. coliO157:H7의 죽음을 도시한 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 2는E. coliO157:H7만을 투여한 송아지의 배설물에서E. coliO157:H7의 죽음을 도시한 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 3은 프로바이오틱 박테리아와 2일 후에E. coliO157:H7를 투여한 송아지의 제 1위액에서E. coliO157:H7의 죽음을 도시한 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 4는 프로바이오틱 박테리아와 2일후에E. coliO157:H7를 투여한 송아지의 배설물에서E. coliO157:H7의 죽음을 도시한 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 5는E. coliO157:H7만을 투여한 송아지의 제 1위액에서E. coliO157:H7 죽음의 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 6은E. coliO157:H7만을 투여한 송아지의 배설물에서E. coliO157:H7 죽음의 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 7은E. coliO157:H7 투여 1-3일 후 우성 프로바이오틱 박테리아로 처리한 송아지의 제 1위액에서의E. coliO157:H7 죽음의 그래프이다. 화살표는 단지 강화과정에 의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 8은E. coliO157:H7 투여 1-3일 후 우성 프로바이오틱 박테리아로 처리한 배설물에서의E. coliO157:H7 죽음의 그래프이다. 화살표는 단지 강화 과정에의한E. coliO157:H7의 검출을 나타낸다.
도 9는 펄스 장(pulsel field) 겔 전기 영동법에 의한 우성 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA의 Xbal 소화를 프로파일할 것이다. 왼쪽과 오른쪽 레인 모두 λ래더(ladder)(48.5Kb)이다. 레인 1-8은 균주 271이다.
도 10은 펄스장 겔 전기영동법에 의한 우성 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA의 Xbal 소화를 프로파일한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 모두 λ래더(48.5Kb)이다. 레인 1은 균주 786이고 레인 2-6은 균주 797이다.
결장 조직의 조직 검사에서는 소 결장 조직에 대한E. coliO157:H7의 부착증가가 없는 것으로 나타났다. 제 1위가E. coliO157:H7의 장기간 운반을 위한 가장 중요한 부위인 것으로 나타난다. 결장에 O157-H7의 존재는 일시적인 상태인 것으로 보이고 박테리아는 제 1위를 근원으로하여 결장 통과 후 배설물로 배출된다. 동물들은 초기에 오염된 풀, 사료 또는 물의 섭취에 의해 감염될 수 있다. 본 연구의 결과에서는E. coliO157:H7가 단일 접종물 복용 후 30일까지 치료되지 않은 송아지의 제 1위에서 지속되고 그 기간에 걸쳐 배설물로 배출된다는 것이 입증되었다. 따라서, O157:H7 박테리아는 동물들의 소화관에 서식하는 어떤 다른 미생물 균주와 함께 소에 의해 운반된다. 본 발명의 목적으로, 조직 또는 배설물에서E. coliO157:H7가 검출될 수 있는 소 및 다른 동물들은E. coliO157:H7를 지니는 것으로 칭해진다. 동물에 의해 운반되는E. coliO157:H7의 양은 다양한 방법으로 측정가능한데 이 방법으로는 다양한 조직들로부터의 샘플링을 포함한다.가장 편리하게는,E. coliO157:H7의 존재가 배설물에서 측정될 수 있다. 그러한 측정은 배설물 오염이 고기 오염 및 다른 동물로의 재도임 및 감염에 대한 명백한 근원이 되기 때문에 실질적으로 중요하다. 여기에서 나타난 바와같이 배설물에 배출된E. coliO157:H7의 양은 제 1위에서 측정가능한 양에 반영된다. 따라서, 배설물에 있는E. coliO157:H7의 양은 동물에 의해 운반되는 양의 척도이다.E. coliO157:H7의 정량적인 측정은 배설물 g당 또는 제 1위의 내용물 ㎖당 콜로니 형성 유니트(CFU)로서 표현된다.
"프로바이오틱"은 천연원으로 부터 분리된,E. coliO157:H7의 성장을 억제하는 특성을 지닌 박테리아를 기술하기 위한 형용사로서 여기에 사용된다. 여기에 사용된 억제 시험은 후보가 분리된 박테리아의 배양 상청액이 고체 배지의 표면에 도포되었을 때E. coliO157:H7 성장을 억제하는 특성이 관찰된, 고체 배지상에서의 시험관내 시험이었다. 일반적으로, 후보 균주의 배양 상청액으로 포화된 종이 디스크를E. coliO157:H7가 접종된 한천 플레이트의 표면상에 위치시켰다. 프로바이오틱 박테리아 상청액은 깨끗한 한천의 고리를 야기했으며 디스크 근처에서E. coliO157:H7의 억제를 나타내는 성장밀도를 감소시켰다. 이용가능하거나 고안될 수 있는, 억제에 대한 다른 시험들이 있는데 이들로는 여기에 기술된 것과 유사한 프로바이오틱 박테리아의 패널을 생성할 수 있는, 시험관에 또는 생체내에서의 직접 성장 경쟁 시험을 포함한다. 그러한 시험에 의해 확인된 박테리아 균주들은 여기에 사용된 용어인 프로바이오틱 박테리아의 카테고리내에 있다.
"우성 프로바이오틱"이란 용어는 프로바이오틱 박테리아가 투여되는 동물에서 지속되고 그 동물로 부터 재분리가능한 프로바이오틱 박테리아에 적용된다. 여기에 기술된 작업에 사용된 기준 접종 26일 후 재분리였다. 송아지에게 18프로바이오틱 균주의 혼합물을 공급하고 다양한 조직으로부터 소화내용물 및 배설물을 접종 26일 후에 샘플링했다. 4개의 균주가 재회수 가능했는데 이들을 우성 프로바이오틱 균주라 명명했다. 다른 기준도 사용될 수 있는데 이들로는 접종과 샘플링 사이가 더 짧거나 더 긴 기간을 포함한다. 우성 프로바이오틱 균주들이 동물에 의해 운반되는E. coliO157:H7 양의 감소를 유용하게 제공하도록 충분히 긴 기간을 선택하는 것이 권유된다.
우성 프로바이오틱 박테리아의 분리는 여기에 기술된 원리 및 과정에 따라 본 기술분야에서 통상적인 기술로 수행될 수 있다. 소배설물 및 조직에서 분리된 1200 콜로니 중 18이 프로바이오틱이고 4개가 우성 프로바이오틱이었다. 따라서, 유사한 수의 독립적인 분리물을 시험하는 것이 우성 프로바이오틱 박테리아를 성공적으로 생산할 수 있다고 보는 것이 타당한다.
우성 프로바이오틱 박테리아의 투여는 소화관으로 유기체를 도입할 수 있는 어떤 방법으로도 수행될 수 있다. 박테리아는 캐리어와 혼합되어 액체 또는 고체 사료 또는 식수에 가해질 수 있다. 캐리어 물질은 박테리아와 동물에 비독성이어야 한다. 캐리어는 저장 중에 박테리아의 생존 능력을 촉진할 수 있는 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 박테리아는 또한 동물의 입으로 직접 주입될 수 있도록 접종 페이스트(paste)로 제형화될 수도 있다. 그 제제는 미감 및 저장 수명을 개선하고 영양적인 잇점등을 부여하도록 첨가되는 성분들을 포함할 수 있다. 재현가능하고 측정된 용량이 바람직할 경우에는 박테리아가 여기에 기술된 바와같이 제 1위 캐뉼러(cannular)로 투여될 수 있다. 투여될 우성 프로바이오틱 박테리아의 양은 효능에 영향을 미치는 요소에 의해 조정된다. 본 연구에서는 단일 용량으로 1010CFU가 투여되었다. 보다 적은 용량이 효과적일 수 있다. 사료 또는 식수에 투여되었을때 적량이 수일에 걸쳐 또는 심지어 수주동안에 걸쳐 보급될 수 있다. 수일에 걸쳐 투여된 보다 적은 용량의 축적 효과가 1010CFU의 단일 용량보다 클 수 있다. 우성 프로바이오틱 박테리아의 투여 전, 투여 중 및 투여 후에 배설물에서의E. coliO157:H7 수를 모니터하므로서 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진자는 동물에 의해 운반되는E. coli의 양이 감소되는데 필요한 적량 수준을 쉽게 확인할 수 있다. 하나 이상의 우성 프로바이오틱 박테리아가 함께 투여될 수 있다. 개개의 동물에 있어서 주어진 개체에서 가장 지속적인 균주가 다르기 때문에 균주들의 조합물이 바람직할 수 있다.
우성 프로바이오틱 박테리아는E. coliO157:H7가 존재하는 동물 또는 환경에 대한 노출에 의해 현재E. coliO157:H7를 지니지 않는 다른 동물들이 균주를 갖게되는 것을 방지하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 가축 사육장과 같은 새로운 장소로 이송되는 어린 송아지 및 성숙한 동물이 예방적 투여를 위한 좋은 후보이다.
E. coliO157:H7를 지닌 동물의 치료는E. coliO157:H7 감염 동물에게 우성 프로바이오틱 박테리아를 투여하므로서 동물에 의해 운반되는E. coliO157:H7의양을 감소시키거나 제거하도록 수행될 수 있다. 배설물에E. coliO157:H7를 배출하는 것으로 알려진 동물들 또는E. coliO157:H7가 존재하는 것으로 알려진 장소에 있는 동물들이 우성 프로바이오틱 박테리아로 치료하기 위한 적절한 후보이다.
우성 프로바이오틱 박테리아를 투여하기 위한 방법은 기본적으로 예방차원이나 치료목적인지에도 불구하고 동일하다. 따라서,E. coliO157:H7가 동물에 있는지를 먼저 측정할 필요가 없어진다. 가축 무리에 있는 모든 동물에게 효과적인 양을 단순히 투여하므로서E. coliO157:H7에 의한 오염 위험이 예방 및 치료의 조합으로 실질적으로 감소 또는 제거될 수 있다.
실시예 1 프로바이오틱 박테리아의 분리
소의 배설물 또는 소의 위장조직(장 및 결장)으로 부터 프로바이오틱 박테리아를 분리했다. 배설물 시험에 의해E. coliO157:H7에 대해 음성으로 확인된 소로부터 배설물 샘플을 수집했다. 배설물 샘플들을 0.1M 포스페이트 완충액, pH7.2(PBS)에서 연속적으로 희석(1:10)시키고 0.1㎖의 각 희석액을 Sorbitol MacConkey 한천(SMA) 플레이트 상에 위치시켰다. 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 배양하고 10이하의 콜로니를 임의로 선택한 다음 각각은 10㎖의 Trypticase 콩 즙(TSB)[(BBL, 메릴랜드, 콕키스빌, 벡톤 디킨슨)]을 함유하는 시험관으로 이송했다. 배양물을 37℃에서 16시간동안 배양했다. 조직 샘플(각각 1g)을 1분동안 9,500rpm으로 균질화(Ultra-Turrax T25 호모지나이저(homogeniger), Janke & Kunkel IKA-lobortechnik, 독일) 시키고 0.1㎖ 부분을 SMA 플레이트의 표면에 위치시켰다. 플레이트를 37℃에서 16시간동안 배양시켰다. 10이하의 콜로니를 각각 10㎖ TSB함유 시험관으로 이송하고 37℃ 에서 16시간 동안 배양시켰다. 각 배양물로부터의 상청액을 여과-살균(0.2㎛ 셀룰로오즈 아세테이트 멤브레인, 뉴욕, 로체스터, Nalgene Co.) 시켰다.
실시예 2 항- E. coli O157:H7 특성을 위한 배양물 스크리닝
항-E. coliO157:H7 대사 산물에 대한 배양 상청액을 스크린하기 위해 932(인간 분리물), C7927(인간 분리물), E009(고기 분리물), E0018(소 분리물) 및 E0122(소 분리물)를 포함하는E. coliO157:H7의 5균주 혼합물을 사용했다. 각 균주의 거의 동일한 개체군의 약 107 E. coliO157:H7 0.1㎖를 중복 SMA 및 TSA의 표면에 위치시켰다. 디스크(12mm직경)를 각 SMA 및 TSA 플레이트 표면에 위치시키고 단일 배양물로 부터의 여과살균된 상청액 0.1㎖를 디스크 표면상에 도포하였다. 또한, 70%의 에탄올을 갖는 디스크(양성 대조군) 및 PBS를 갖는 디스크(음성 대조군)을 각 플레이트에 적용하였다. 배양물을 37℃에서 18시간 동안 배양하고 억제구역을 관찰하였다. 1mm이상의 깨끗한 구역을 양성반응으로 간주하였다.
실시예 3 E. coli O157:H7 배양물의 제조
상기한 바와같은 동일한 5 균주 혼합물을 사용하였다. 이들 박테리아 분리물의 계산을 용이하게 하기 위하여 균주에 대하여 날리딕신산 (50㎍/㎖)에 대한 저항성을 유도했다. 날리딕신 산 저항성E. coliO157:H7의 각 균주를 10㎖의 날리딕신산 함유 트립틱 콩즙(TSB)(50㎍/㎖)으로 이송하고 교반(150rpm)하면서 37℃에서 16-18시간 동안 배양했다. 각 분리물의 20㎖ 현탁액을 300㎖의 TBS의 이송했다. 37℃ 에서 16-18시간 동안 배양한 후 원심분리 (4,000 ×g, 20분)하여 박테리아를 침강분리하고 PBS에서 3번 세척하였다. 630nm에서 0.5의 광학밀도를 얻는데 필요한 양 (108CFU/㎖)으로 침강분리된 박테리아에 PBS를 첨가하였다.E. coliO157:H7의 5분리물(각 균주당 2 ×109CFU)의 혼합물을 송아지에 구강 접종 하기 바로 전에 250㎖의 2% 살균 탈지 우유에 혼합했다. 중복해서 TSA 및 SMA-NA 플레이트에 대한 연속 희석을 계산하여 박테리아 군을 확인하였다.
실시예 5 송아지의 준비
15 마리의 단일 원 수컷 젖먹이 송아지를 목장에서 사육하여 유니버시티 오브 죠지아로 이송하기 전인 생후 6주에서 이유시켰다. 송아지들을 기후 조절된 BL-2 콘크리트 축사에 개별적으로 넣었다. 각 축사는 개별적인 바닥 배수구를 가졌으며 매일 한번씩 청소했다. 송아지에서 알팔파 펠릿과 단 사료의 혼합물을 매일 두번씩 공급하고 물을 마시지 않게 했다. 그 주의 조건화 기간동안 모든 송아지로부터의 배설물을 샘플링하고 형광 바이러스 염색을 통해 소바이러스 설사, 코로나바이러스, 포타바이러스,E. coli털(pilus) 항원 및 Cryptosporidia 에 대하여 음성인지를 시험했다. 위장 기생충에 대한 배설물 부유 및 살모넬라와E. coliO157:H7에 대한 박테리아 배양을 수행하고 배설물 pH를 측정하였다. 2주의 조건화 기간 후에 송아지에 수술로 제 1위 캐뉼라(가요성 제 1위 캐뉼라)를 장착시켰다. 실험이 시작되기 전에 최소한 10일의 수술회복 및 치료했다.
실시예 6제 1위 삽관법(connulation)
12시간 동안 송아지에게 사료공급을 중단시켰다. 좌측 파라요추와(paralumbar fossa)를 표준 수술준비를 위해 협자를 사용한 후 수세했다. 그 와를 국소마취보다 약간 더 적은 척추방 신경차단법, 전화된 "L"차단 ; 라이도케인(Lidocaine)을 사용하여 마취시켰다. 캐뉼러의 직경보다 약간 더 작은 원형 절개부를 만들고 피부 그리고 하부소피 및 외사경 복부근육의 원형편을 제거했다. 용기를 필요에 따라 결찰하고 내사경 복부 가로근과 복막을 절개하여 분리하고 제 1위벽을 노출시키기 위한 개구를 생성하도록 수축시켰다. 제 1위를 외부로 보이기 위한 견인용의 두개의 큰 타월 클램프로 제 1위벽을 고정했다. 연속적인 봉합 패턴으로 #장선(catgut) 또는 근육층을 도입한 베타필(vetafil)을 사용하여 제 1위벽을 피부에 봉합했다. 제 1위벽을 절개하고 제 1위의 원형편을 제거한 다음 캐뉼러를 삽입했다. 수술 후 5일 동안 송아지를 프로케인 페닐실린 G로 근육내 치료를 행하였다. 캐뉼러와 제 1위벽 사이 지역을 매일 베타틴 용액으로 부드럽게 세척했다.
실시예 7 송아지의 접종
12시간 내항시킨 후 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 250㎖의 탈지우유로 제 1위 삽관을 통하여 송아지에게 접종했다. 48시간 후, 같은 경로를 통하여E. coliO157:H7의 5균주 혼합물을 접종했다. 공격후에 송아지에 대해서 매일 억울증, 발열, 설사 및 식용결핍을 포함하고 임상적 징후를 검사했다. 직장 배설물 또는 삽입관으로 부터 수집된 샘플에 대하여 pH 및E. coliO157:H7와 프로바이오틱박테리아의 계산을 했다.
박테리아 접종물의 분리 및 개산 : 10g의 배설물 또는 제 1위 내용물 샘플을E. coliO157:H7 접종 후 매일 직장 및 제 1위 삽관을 통하여 수집했다. 15㎖의 블레어(Blair) 이송 매체를 함유하는 튜브에 샘플을 위치시키고 5℃로 유지시키면서 분석을 위해 식품 안정 및 품질 강화 센터(Center for Food Safety and Quality Enhancement)로 이송시켰다. 1g 배설물 함유량을 0.85% NaCl에서 10-6까지 연속적으로 희석(1:10)시키고 0.1㎖의 각 희석물을 SMA-NA상에 중복하여 위치시켰다. 부검에서 수집된 전체 위장관의 조직 샘플을 분석시까지 5℃로 유지시켰다. 각 세그먼트로 부터의 각 조직 내용물을 분리하고 중량을 단 후 조직을 100㎖의 PBS로 세척했다. 세척된 조직을 9㎖의 PBS에 첨가하고 Ultra-Turrax 조직 호모지나이저로 9,500rpm에서 1분동안 균질화시켰다. 0.1㎖ 조직 또는 조직 내용물 현탁액 샘플을 SMA-NA 플레이트 상에 4배수로 접종하고E. coliO157:H7 또는 프로바이오틱 박테리아의 계산을 위해 24시간동안 37℃에서 배양시켰다. 직접적인 플레이팅 법에 의해 이들 박테리아가 검출되지 않은 경우에는 선택적인 강화법(17)(50㎍의 날리디신산/㎖를 함유하는 변성 TSB)을 수행하였다. 샘플을 각각 100㎖의 선택적인 강화배지에 위치시키고 150rpm으로 교반하면서 24시간동안 37℃에서 배양시켰다. 배양물의 희석액을 SMA-NA상에 위치시키고 분리물을 선택하여 더 시험했다.E. coliO157:H7의 전형적인 콜로니들(소르비톨 음성)을 SMA-NA상에 재위치시켜 생화학적 방법에 의해서는E. coli, 그리고 혈청학적 방법에 의해서는 0157 및 H7으로 확인했다. 프로바이오틱 박테리아는 펄스장 겔 전기영동법(PFGE)에 의한 DNA 지문으로 확인했다.
실시예 8 박테리아 분리물의 게놈 지문(fingerprinting)
상기한 것과 유사한 PFGE과정을 사용했다(14). 박테리아를 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 37℃로 10㎖의 TSB에서 성장시켰다. 박테리아를 원심분리(4000×g, 20분)으로 침강시키고 75mM NaCl 함유 25mM EDTA, pH7.4(SE)에서 세번 세척한 다음 0.5㎖의 SE에서 재현탁 시켰다. 박테리아 현탁액을 10mM Tris, 10mM MgCl2및 0.1mM EDTA(TME), pH7.5로 이루어진 완충액에서 0.5㎖dml 2%(W/V) 저융점 아가로즈와 혼합했다. 이 혼합물을 샘플 주형으로 분배하고 아가로즈 플러그들을 56℃에서 밤새 프로테이나제 K(2㎎ 프로티나제 K, 50mM Tris, 50mM EDTA, 1% N-라우로일사코신/㎕, pH8.0)로 소화시켰다. 이 샘플들을 10mM Tris, 5mM EDTA, pH7.5(TE)에서 세척하고 50U의 Xbal 로 소화시켰다. 37℃에서 밤새 배양한 후 20㎕의 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. DNA 샘플을 콘투어 클램프 균질화 전장 장치(CHEF MAPPER, BioRad)로 0.5 ×TBE 완충액에 있는 1.2% 아가로즈 겔상에서 전기 영동했다. 5-50초의 펄스시간 그리고 선형램핑 및 14℃에서 120°의 전장 각으로 200V에서 24시간동안 전기영동한 후 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 가시화시킨 다음 UV투조하여 촬영했다. 3개의 우성 프로바이오틱 박테리아, 271, 786 및 797에 대한 결과를 도 9 및 도 10에 도시하였다.
실시예 9 송아지의 부검
송아지에 소듐 펜토바르비탈을 정맥내 주사하여 안락사시켰다. 위장관을 식도와 직장에서 클램프하고 토토(toto)에 제거했다. 4-6cm길이의 십이지장, 기부에 가까운쪽, 중앙쪽 및 말초부의 공장(jejunum), 기부 가까운쪽 및 말초부의 회장(ileum), 기부가까운쪽 및 말초부의 맹장, 상승 결장의 기부가까운쪽 루프, 나선형 결장의 구심력에 의한 회전 및 원심력의 회전, 가로방향 결장 및 하향 결장을 이중으로 묶어서 모든 절편들의 샘플링을 조직 및 내용물에서 최소의 교차 오염을 갖는E. coliO157:H7 및 프로바이오틱 박테리아의 계산을 위해 행하였다. 제 1위, 봉소위, 중판위 및 추위의 절편들 및 신장, 비장, 간, 담낭, 공장의 임파선, 회장의 임파선, 맹장의 임파선 및 편도선의 절편들도E. coliO157:H7 및/또는 프로바이오틱 박테리아의 배양 및 계산을 위해 수집했다. 이들 모즌 부위의 절편들 뿐만아니라 전견 갑골 임파선, 골격근, 피부, 편도선, 갑상선, 흉선, 식도, 심장, 췌장, 배꼽, 부신, 방광 및 고환의 절편들도 조직 검사를 위해 10% 완충 포르말린에 위치시켰다.
실시예 10 조직의 조직 생리학 및 면역조직화학
고정된 조직들을 표준방법으로 파라핀에 넣고 5㎛로 절개한 다음 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 선택된 절편들을 그람(Gram) 염색했다. 다수의 표면 또는 루미날성 박테리아를 조직 생리학적으로 나타내는 절편들을 선택하여 알칼린 포스파테이즈 면역-염색 과정으로 처리하므로서E. coliO157:H7를 확인했다. 조직들을 10분동안 크실렌에서 파라핀 제거하고 등급화 알콜을 통하여 재수화시킨 다음 PBS에서 세척했다. 절편들을E. coliO157:H7-특이항체(Kirkgaard & PerryLaboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 덮고 RT로 30분동안 가습챔버에서 배양시켰다. 슬라이드들을 PBS에서 10분동안 세척한 다음 가습 챔버로 되돌려 보낸다음 조직 절편들을 알칼린 포스파테이즈 콘쥬게이트된 스트랩트아비딘으로 덮었다. RT로 20분동안 배양시킨 후 슬리이드를 PBS에서 10분동안 세척하고 가습챔버에 위치시킨 다음 15분동안 기질요액으로 덧씌웠다. 슬라이드들을 PBS에서 10분동안 세척하고 마이어(Mayer's) 헤마톡실
린으로 3분동안 대비염색하며 수성 배지에 이어 미수성 배지에 위치시킨 다음 현미경적으로 검사했다.
실시예 11 프로바이오틱 박테리아의 존재 및 부존재하에서 갖는 E. coli O157:H7의 양
E. coliO157:H7에 대한 대사 역제인자를 분비하는 잠재적 프로바이오틱 박테리아의 시험관내 스크린 : 소 조직 및 배설물로부터 분리된 1200 콜로니들 중 18콜로니 시험관내에서E. coliO157:H7를 억제했다. 그들 중 5콜로니는 배설물로 부터 분리되었으며 5콜로니는 소장, 8콜로니는 결장으로부터 분리되었다. 18콜로니들 중 17콜로니가E. coli로서 확인되었으며 나머지가 Proteus mirabilis 로 확인되었다. 이들 모두를 시가(Shiga) 독소에 대하여 평가한 결과 어느것도 시가 독소를 생성하지 않았다. PFGE 게놈 DNA 지문은 18분리물 중 13개의 다른 프로파일을 나타냈다.
프로바이오틱 박테리아에 의한 송아지의 콜로리화 : 초기에 한마리의 송아지에게 한 균주의 프로바이오틱 박테리아(1010CFU 의E. coli)를 공급했다. 이 송아지는 정상적인 것으로 보였으며, 이E. coli를 실험종료시(12일)에 회장 및 맹장에서만 강화과정에 의해 회수했다. 두마리의 송아지에게 전체 18균주(거의 동일한 농도, 각각 5 ×108CFU)의 프로바이오틱 박테리아(송아지당 1010CFU)를 혼합물로서 공급했다. 이 송아지들은 정상 소견을 보였으며 박테리아는 27일 이하동안 위장관을 콜로니화했다(연구종료시에 수는 50-200CFU/배설물 g이었다).
PFGE에 의한 우성 프로바이오틱 박테리아의 측정 : 접종 후 26일째에 편도선, 중판위, 봉소위, 결장, 기부에 가까운 회장, 말초 맹장, 상승 결장의 기부에 가까운 루프, 가로상 결장 및 배설물로 부터 분리된 21 콜로니들을 PFGE로 분석했다. 4DNA 프로파일을 갖는 분리물이 우성이었으며 모두E. coli였다. 21콜로니들 중 9콜로니는 균주 #797, 7콜로니는 균주 #786, 3콜로니는 균주 #271 이었으며 그 콜로니는 균주 #1019였다.
프로바이오틱 박테리아에 의한 송아지에서의 병리학적 변화 : 접종된 박테리아들 중 어떤 균주들은 위장관의 다른 부분으로부터의 조직 표본으로 부터 부검에서 회수되었지만 평가된 어떤 조직 샘플에서도 병리학적 변화는 없었다.
송아지에서E. coliO157:H7의 운반을 감소시키는데 있어서 프로바이오틱 박테리아의 효율성 :E. coliO157:H7만을 투여한 9송아지들 중 모두가 발열 또는 설사의 소견 없이 건강을 유지했다. 접종 후 3주 동안 모든 동물의 제 1위액에서 간헐적으로E. coliO157:H7를 분리했다(도 1). 배설물에서 다양한 수준의E. coliO157:H7 배출이 실험전체(평균 28일)에 걸쳐 계속되었다(도 2). 부검에서 10마리 중 8마리의 제 1위 내용물로부터, 그리고 10마리의 송아지 중 10마리의 결장으로부터E. coliO157:H7를 분리하였다. 검사된 어떤 조직 샘플에서도 병리학적 변화는 관찰되지 않았다.
E. coliO157:H7로 처리 2일전에 프로바이오틱 박테리아를 투여받은 모든 송아지들은 발열 또는 설사의 소견없이 건강함을 유지했다. 두마리는 9일 동안, 한마리는 16일동안, 두마리는 17일동안, 한마리는 29일 동안 관을 통하여 수집된 제 1위 샘플에서E. coliO157:H7를 검출했다(도 3). 한마리씩 각각에서 11, 15, 17, 18, 19 및 29일(실험종료시) 동안 배설물에서E. coliO157:H7를 검출했다(도 4). 부검(평균 30일)에서 이들 6마리 중 어느 것에서도 결장으로 부터E. coliO157:H7가 회수되지 않았다 ; 그러나, 6마리 중 1마리의 결장에서 이들 박테리아가 회수되었다.E. coliO157:H7양성동물들은 연구 중 접종 후 2일(16,17일 및 23,24일)동안 두번 단식시켰다. 6마리의 프로바이오틱 처리 동물 중 4마리에게 이 프로토콜에 따라 단식시켰다.
실시예 12 소에서 E. coli O157:H7를 감소/제거 시키기 위한 처리로서 우성 프로바이오틱 박테리아의 효율성
우성 프로바이오틱 박테리아의 제조 :E. coliO157:H7의 억제인자인 것으로 이미 측정된E. coli의 4균주(271,797,786 및 1019)를 배설물에서 계산의 용이성을 위해 날리디신산 내성(50㎍/㎖)대해 선택하였다. 4균주 각각의 거의 동일한 개체군을 송아지에게 투여하기 위해 50㎖의 2% 살균 살지우유에 혼합(총 1010CFU)하였다.E. coli개체군을 이중 TSA 및 SMA-NA 플레이트 상에서의 계산에 의해 확인했다.
송아지의 접종 : 총 16마리의 송아리를 사용하였다. 24시간 단식시킨 후 각 송아지에게 50㎖의 2% 살균 탈지우유에 있는E. coliO157:H7의 5균주 혼합물(1010CFU)를 캐뉼러관을 통하여 투여했다. 두마리의 송아지를E. coliO157:H7 투여 1일 후에 캐뉼러관을 통하여 프로바이오틱 박테리아(1010CFU)로 처리했다. 캐뉼러관을 통하여 수집된 제 1위 샘플 및 직장 배설물에 대하여 매일E. coliO157:H7를 및 프로바이오틱 박테리아를 매일 계산했다.
송아지의E. coliO157:H7 운반을 감소/제거하는데 있어서 프로바이오틱 박테리아 처리의 효율성 : 양성 대조군으로서E. coliO157:H7만을 투여한 12마리의 송아지에서, 1마리에서는 2주동안, 3마리에서는 3주동안, 8마리에서는 4주동안 제 1위로부터 간헐적으로 O157을 분리했다(도 5). 12마리의 송아지 중 11마리의 배설물에서 다양한 수준의E. coliO157:H7 연속배출이 연구 전체에 걸쳐 발생하였다(도 6). 부검에서, 12마리의 송아지 중 9마리의 제 1위 내용물로부터 그리고 12마리의 송아지 중 10마리의 결장으로부터E. coliO157:H7를 분리하였다.
4마리의 송아지를E. coliO157:H7 투여 1-3일 후에 프로바이오틱 박테리아의 4균주 (균주 271,786,797 및 1019) 혼합물로 처리하였다. 1마리에서는 6일동안, 2마리에서는 8일, 한마리에서는 9일 동안 배설물에서E. coliO157:H7가 검출되었다(도 8). 부검(22일째에 2마리 및 27일째에 2마리)에서 이들 4마리 중 어떤 것으로 부터도 제 1위 또는 결장(조직 또는 내용물)에서E. coliO157:H7가 회수되지 않았다. 프로바이오틱 박테리아 중 균주 271,786 및 797만이 연구 종료시에 이들 4마리로부터 회수되었다. 부검시에 어떤 동물에서도 균주 1019는 검출되지 않았다.
상기 실시예는E. coliO157:H7를 지닌 동물에 프로바이오틱 또는 우성 바이오틱 박테리아를 투여하므로서E. coliO157:H7의 운반을 예방 및 치료하는 원리 및 실시를 설명한 것이다.E. coli의 균주 271,786 및 797이 분리되어 우성 프로바이오틱 박테리아 인것으로 나타났다. 분리의 용이성 및 다수의 얻어진 균주에 있어서, 다른 우성 프로바이오틱 균주도 분리되어E. coliO157:H7의 운반을 예방 또는 치료하기 위하여 소 또는 다른 동물에 접종될 수 있음이 명백하다. 다른 균주들도 동물종, 사육, 연령, 식습관, 생활환경 및 관리체제에 따라 다른 적용에도 바람직할 수 있다. 동물이 갖는E. coliO157:H7의 양을 효과적으로 감소 또는 제거하기 위해 상기 일반적으로 기술한 바와같이 분리 및/또는 사용된 모든 그러한 박테리아 균주들도 본 발명의 범위내에 있다. 동물에게 효과적인 용량의 프로바이오틱 또는 우성 프로바이오틱 박테리아를 제공할 수 있는 투여 방법으로는 박테리아를 함유하는 다양한 제형을 사용하여, 다양한 사료섭취, 식수섭취 및 다른 경우 투여방법을 포함하는데 이들 모두 본 발명의 범위내에 있다. 여기에 기술된 가르침과 설명이 기초하거나 유도된 모든 그러한 변화 및 변경은 첨부된 청구범위내에있는 것으로 간주된다.
하기 균주들은 37CFR 1.801-1.809에 따라 아메리칸 타입 컬츄어 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
E coli271 ATCC 기탁번호 202020, 1997. 8. 13.
E coli786 ATCC 기탁번호 202018 1997. 8. 13.
E coli797 ATCC 기탁번호 202019 1997. 8. 13.

Claims (17)

  1. E . coli 217 ATCC 202020, E . coli 786 ATCC 202018 및 E . coli 797 ATCC 202019로 이루어진 우성 프로바이오틱 박테리아의 그룹으로부터 선택된 미생물.
  2. 동물 조직액, 소화 내용물, 또는 배설물로부터 박테리아 균주를 분리하고, 분리된 균주를 획득하는 단계;
    분리된 균주를 액체 또는 고체 배지에서 배양하는 단계;
    각각의 분리된 균주에 대하여 시험관 내에서E. coliO157:H7의 성장을 억제하는 능력을 개별적으로 시험하여, 시험관 내에서E. coliO157:H7의 성장을 억제하는 능력을 가진 균주를 프로바이오틱 박테리아로서 식별하는 단계; 및
    프로바이오틱 박테리아를 계대배양하고, 반추동물에 하나 이상의 프로바이오틱 박테리아를 투여하고, 그러한 박테리아를 검출할 수 있는 시간이 지난 후에 상기 동물의 소화 내용물이나 배설물로부터 재분리 가능한 프로바이오틱 박테리아를 재분리하여, 재분리가능한 프로바이오틱 박테리아를 우성 프로바이오틱 박테리아로서 식별하는 단계;
    를 포함하는, 우성 프로바이오틱 박테리아를 선택하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아에 선택가능한 마아커 특성이 제공되는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아가 DNA 제한 단편 소화 패턴에 의해 서로 구별가능한 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 동물이 소인 방법.
  6. 제3항의 방법에 따라 선택된 하나 이상의 우성 프로바이오틱 박테리아 균주를 반추동물의 소화관에 투여하는 것을 포함하여, 반추동물에 의한 E . coli O157:H7의 운반을 예방 또는 처리하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 우성 프로바이오틱 박테리아가 E . coli 217 ATCC 202020, E . coli 786 ATCC 202018 및 E . coli 797 ATCC 202019로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 우성 프로바이오틱 박테리아가 식수와 함께 투여되는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 우성 프로바이오틱 박테리아가 사료와 함께 투여되는 방법.
  10. 제 6항에 있어서, 동물이 소인 방법.
  11. E. coli271 ATCC 202020,E. coli786 ATCC 202018 및E. coli797 ATCC 202019호 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 우성 프로바이오틱 박테리아의 균주 및 캐리어를 포함하는 접종 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 캐리어가 물을 포함하는 조성물.
  13. 제 11항에 있어서, 캐리어가 소에 의해 식용가능한 물질을 포함하는 조성물.
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7504251B2 (en) 1999-06-03 2009-03-17 Biobalance Llc Bacterial strain, processed plant extracts, compositions containing same, processes for their preparation and their therapeutic and industrial applications
IL130303A0 (en) 1999-06-03 2000-06-01 M G Novobiotech Ltd A bacterial strain processed plant extracts and probiotic compositions for human and veterinary use
US7241443B1 (en) * 1999-07-15 2007-07-10 Camas Incorporated Immunogen adherence inhibitor and method of making and using same
US7238351B2 (en) * 1999-07-15 2007-07-03 Peter Nash Immunogen adherence inhibitor directed to lactic acid producing organisms and method of making and using it
DE19943644A1 (de) * 1999-09-13 2001-03-15 Rolf Reissbrodt Anwendung eines probiotischen Escherichia coli Isolates zur Hemmung der Shiatoxinproduktion und des Wachstums von enterohämorrhagischen E.coli (EHEC)-Stämmen
FR2808276B1 (fr) * 2000-04-26 2004-04-02 Renaud Nalin Procede d'extraction indirecte de l'adn d'organismes non cultivables et adn susceptible d'etre obtenu par ledit procede
US6541013B1 (en) 2000-07-13 2003-04-01 Idaho Research Foundation, Inc. Methods and compositions for suppressing bovine leukemia virus with a Shiga toxin polypeptide
US7135173B2 (en) * 2000-07-13 2006-11-14 Idaho Research Foundation, Inc. Antiviral activity of Shiga toxin
KR20030082549A (ko) * 2000-11-30 2003-10-22 더 바이오 밸런스 코포레이션 박테리아 균주, 처리된 식물 추출물, 이를 함유하는조성물, 이의 제조방법 및 치료적 용도 및 산업적 용도
IL156490A0 (en) 2000-12-18 2004-01-04 Probiohealth Probiotic compounds derived from lactobacillus casei strain ke01
US7214370B2 (en) * 2000-12-18 2007-05-08 Probiohealth, Llc Prebiotic and preservative uses of oil-emulsified probiotic encapsulations
US7323166B2 (en) 2002-06-19 2008-01-29 Board Of Regents University Of Nebraska Lactic acid bacteria cultures that inhibit food-borne pathogens
TWI350174B (en) * 2003-03-12 2011-10-11 Wyeth Corp Adjuvanted bovine vaccines
CA2523711A1 (en) * 2003-04-28 2004-11-11 Alpharma, Inc. Method for formulation of microbial feed additives with feed
IE20030773A1 (en) * 2003-10-17 2005-04-20 Teagasc Agric Food Dev Authori Use of probiotic bacteria in the treatment of infection
WO2005074706A1 (en) 2004-02-03 2005-08-18 Universite De Montreal Use of live bacteria for growth promotion in animals
MXPA06010457A (es) * 2004-03-15 2006-12-14 Univ Iowa State Res Found Inc Alternativas de antibioticos novedosas.
US7592159B2 (en) * 2004-03-15 2009-09-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Antibiotic alternatives
WO2005112658A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Agtech Products, Inc. Method and composition for reducing e. coli disease and enhancing performance using bacillus
AU2006251827B2 (en) * 2005-05-26 2012-05-31 Chr. Hansen A/S Bacterial management in animal holding systems
EP1883304A4 (en) * 2005-05-26 2009-12-09 Chr Hansen As PROCESS FOR TREATING ANIMAL WASTE
US7754469B2 (en) * 2005-11-30 2010-07-13 Agtech Products, Inc Microorganisms and methods for treating poultry
CA2649992A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-08 University Of Manitoba A colicinogenic strain of e. coli
US20100151097A1 (en) * 2007-05-08 2010-06-17 Biotechnology Research And Development Corporation Optimization of colicin production
US8021654B2 (en) 2008-03-14 2011-09-20 Danisco A/S Methods of treating pigs with Bacillus strains
WO2009146205A1 (en) 2008-04-17 2009-12-03 Agtech Products, Inc. Bacillus strains useful for animal odor control
US8540981B1 (en) 2008-07-07 2013-09-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bacillus strains useful against calf pathogens and scours
GB2473523A (en) * 2009-09-10 2011-03-16 Solus Scient Solutions Ltd Nalidixic acid and lithium in a base medium for the culture of Listeria
IT1398875B1 (it) 2010-03-03 2013-03-21 Italstarter S R L Composizioni contenti l. mucosae per uso medico.
EP2394920A1 (en) * 2010-06-14 2011-12-14 Nestec S.A. Dispensing container for probiotics
US8557234B1 (en) 2011-05-18 2013-10-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods of controlling pit foam
EP2748300B1 (en) 2011-08-24 2018-09-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Enzyme producing bacillus strains
WO2014012172A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Prevtec Microbia Inc. Non-pathogenic f18 e. coli strain and use thereof
US8906668B2 (en) 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
EP2951283A4 (en) * 2013-02-04 2017-01-25 Seres Therapeutics, Inc. Compositions and methods
BR122021010444B1 (pt) 2013-02-04 2022-07-12 Seres Therapeutics, Inc Composição terapêutica compreendendo uma população purificada de bactérias formadoras de esporos, método para a produção da composição e uso da composição
CA2906921A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Seres Therapeutics, Inc. Network-based microbial compositions and methods
AU2014352643A1 (en) 2013-11-25 2016-06-30 Seres Therapeutics, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
EP3082431A4 (en) 2013-12-16 2017-11-15 Seres Therapeutics, Inc. Bacterial compositions and methods of use thereof for treatment of immune system disorders
MX2020001774A (es) 2017-08-14 2020-09-09 Seres Therapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar enfermedad colestásica.
US20220233612A1 (en) * 2019-05-31 2022-07-28 South Dakota Board Of Regents Technology Transfer Office Probiotics to inhibit enteric pathogens
EP3808896B1 (de) * 2019-10-16 2021-12-01 Papierfabrik Meldorf GmbH & Co. Kommanditgesellschaft Verfahren zum herstellen von altpapier- und grasfasern enthaltendem papier

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3956482A (en) * 1973-06-25 1976-05-11 W. R. Grace & Co. Milk production
US4138498A (en) * 1976-12-07 1979-02-06 W. R. Grace & Co. Ruminant feed additive
US4335107A (en) * 1978-06-05 1982-06-15 Snoeyenbos Glenn H Mixture to protect poultry from salmonella
FI59925C (fi) * 1980-01-11 1981-11-10 Esko Viljo Nurmi Foerfarande foer framstaellning av ett bakteriepreparat anvaendbart foer foerhindrande av salmonellainfektion hos fjaederfae
US4794080A (en) * 1984-04-16 1988-12-27 Igene Biotechnology, Inc. Microbial co-culture production of propionic acid
GB9107305D0 (en) * 1991-04-08 1991-05-22 Unilever Plc Probiotic
US5302388A (en) * 1991-11-13 1994-04-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Control of campylobacter jejuni colonization
US5308615A (en) * 1992-01-17 1994-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of Salmonella
US5478557A (en) * 1992-07-29 1995-12-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of salmonella
US5340577A (en) * 1992-07-29 1994-08-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Probiotic for control of salmonella
US5549895A (en) * 1993-05-17 1996-08-27 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method and colicin composition for inhibiting Escherichia coli 0157:H7 in food products
US5798260A (en) * 1994-06-24 1998-08-25 Children's Hospital And Medical Center Escherichia coli O157:H7 epithelial adhesin

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Publication number Publication date
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JP2001514868A (ja) 2001-09-18

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