PL187759B1 - Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów - Google Patents

Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów

Info

Publication number
PL187759B1
PL187759B1 PL96325338A PL32533896A PL187759B1 PL 187759 B1 PL187759 B1 PL 187759B1 PL 96325338 A PL96325338 A PL 96325338A PL 32533896 A PL32533896 A PL 32533896A PL 187759 B1 PL187759 B1 PL 187759B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ethyleneimine
inactivation
viruses
blood
virus
Prior art date
Application number
PL96325338A
Other languages
English (en)
Other versions
PL325338A1 (en
Inventor
Edward I. Budowsky
Original Assignee
V I Technologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by V I Technologies filed Critical V I Technologies
Publication of PL325338A1 publication Critical patent/PL325338A1/xx
Publication of PL187759B1 publication Critical patent/PL187759B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
    • A61L2/0088—Liquid substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/16—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using chemical substances
    • A61L2/18—Liquid substances or solutions comprising solids or dissolved gases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D203/00—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D203/04—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D203/06—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D203/08—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D203/00—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D203/04—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D203/06—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D203/08—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D203/12—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/06—Inactivation or attenuation by chemical treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2730/10163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2740/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
    • C12N2770/32461—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32463—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2795/18163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)

Abstract

1 . Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów w kompozycji biologicznej za- wierajacej biopolimery przez selektywna modyfikacje czasteczek kwasu nukleinowego w tej kompozycji zawierajacej biopolimery, znamienny tym, ze kontaktuje sie kompozy- cje zawierajaca biopolimer z roztworem oligomeru etylenoiminy o odpowiednim pH i sile jonowej, przy czym biopolimery w tej kompozycji zachowuja cala aktywnosc na poziomie inaktywacji. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów. Wynalazek należy do dziedziny chemii bio-organicznej, biologii molekularnej, biochemii, immunologii i wirologii oraz medycyny i weterynarii. Wynalazek rozwiązuje problemy związane z przygotowaniem odpowiednich sposobów a także wskazuje na możliwość utworzenia kompozycji do selektywnej chemicznej modyfikacji kwasów nukleinowych zawartych w takich ośrodkach jak ludzka krew, komórkowe składniki krwi, osocze krwi i biopolimery osocza oczyszczone z krwi (albumina, czynniki skrzepowe, gammaglobulina, fibrynogen itp.), składnikach hodowli komórkowych takich jak płodowa surowica bydlęca i świńska trypsyna, produktach nie pochodzących z krwi powstałych ze zwykłych lub rakowych komórek (np., techniką rekombinacji DNA), z których każdy jest zasadniczo wolny od zakaźnych wirusowych zanieczyszczeń i nadaje się do zastosowania leczniczego lub diagnostycznego.
Przenoszenie chorób wirusowych (np., zapalenia wątroby A i B, nabytego zespołu braku odporności (HIV), infekcji cytomegalowirusowych) przez krew lub produkty krwiopochodne jest znaczącym problemem w medycynie. Chociaż dobór dawców i selekcja krwi dawców pod względem markerów wirusowych pomaga ograniczać przenoszenie wirusów do odbiorców, sposoby selekcji są niepełne lub mniej niż 100% wrażliwe, ponieważ są przeznaczone tylko dla kilku konkretnych wirusów, i nawet w przypadku ich czułość jest niedostateczna. Pożądane jest inaktywowanie każdego wirusa zawartego w krwi dawcy lub produktach krwiopochodnych bez zmieniania struktury i funkcji ich wartościowych składników, np., czerwonych ciałek, płytek, leukocytów i biopolimerów osocza, takich jak białka, polisacharydy itp. Podobnie, inne kompozycje biologiczne, np. linie komórek ssaków i hybrydomy, produkty linii komórek, mleko, siara i sperma, mogą zawierać zakaźny wirus i korzystne będzie inaktywowanie wirusów zachowując wartościowe składniki lub produkty tych kompozycji. Na koniec, często nie wiadomo, czy krew lub produkty krwiopochodne, lub produkty komórek ssaka, zawierają zakaźne wirusy. W tym przypadku będzie korzystnie mieć kompozycje i sposoby przetwarzania takiej kompozycji zawierającej komórki lub biopolimery w celu inaktywowania wszelkich zakaźnych wirusów.
Wytwarzanie w pełni bezpiecznych i skutecznych szczepionek zawierających zabite drobnoustroje do stosowania w medycynie i weterynarii wymaga sposobów, które w pełni i w sposób pewny powodują niezakaźność żywych mikroorganizmów, np., wirusów i bakterii („dezaktywację”), lecz mają minimalny wpływ na ich immunogenność. Sposoby typowo sto4
187 759 sowane do dezaktywacji wirusów, takie jak przydatne do wytwarzania wirusowych szczepionek, ogólnie zmieniają lub niszczą funkcję i strukturę komórek, białek i innych antygenów.
Obecne sposoby inaktywacji, w tym zastosowanie formaliny, beta-propiolaktonu i nadfioletu, opracowano empirycznie, z niewielkim oparciem o fundamentalne chemiczne lub strukturalne zasady. Monomery etylenoiminy zastosowano w celu inaktywowania wirusa choroby pyska i racic (rosyjski opis patentowy nr SU 1915956). Monomery etylenoiminy zastosowano także w celu inaktywowania Mycoplasma i Acholeplasma (publikacja WO 92/18161) i ptasich infekcji (rumuński opis patentowy nr RO 101400). Podwójnej etylenoiminy użyto do inaktywacji kociego jelitowego koronawirusa, FECV, (opis patentowy nr EP 94200383). Polietylenoiminy użyto jako środka zwalczającego wirusa roślin (japoński opis patentowy nr JP 7882735). Poniższe sposoby i związki modyfikują mikroorganizmy, takie jak wirusy i bakterie, niespecyficznie, i są trudne do standaryzacji i stosowania w powtarzalny sposób. Ogólnie, liczne składniki mikroorganizmu, w tym ważne powierzchniowe czynniki określające antygenność, np. wirusowe białka kapsydowe, są naruszane przez obecnie stosowane środki inaktywujące, modyfikujące nie tylko kwasy nukleinowe, ale także inne biopolimery, takie jak białka, węglowodany i lipidy, naruszając ich funkcję. Zmienione antygeny lub inaktywacja ochronnych epitopów może prowadzić do obniżenia immunogenności, a więc zmniejszonej mocy (np., inaktywowanej szczepionki polio) lub zmiany antygenności i wzmocnienia choroby zamiast zapobiegania chorobie (np., szczepionki wirusa zespólniowego oddechowego i inaktywowanej szczepionki odry wytwarzanych przez inaktywację formaliną). Innym przykładem jest wytwarzanie szczepionka wirusa zapalenia wątroby B, gdzie zwykle ogrzewa się preparat w temperaturze ponad 80°C i traktuje formaldehydem. Taka obróbka nie tylko inaktywuje zakaźne wirusy, lecz także uszkadza białka i inne antygeny. Nośniki dodawane do szczepionki jako stabilizatory także mogą zostać niechcący zmodyfikowane, dając reakcje alergiczne, jak w przypadku albuminy ludzkiej surowicy w szczepionce przeciw wściekliźnie inaktywowanej beta-propiolaktonem. Ponadto niewiedza o chemicznych zmianach nadających mikroorganizmowi niezakaźność utrudnia stosowanie procesu w sposób powtarzalny. Wynikiem są periodyczne ataki choroby wynikające z niewłaściwej inaktywacji lub odwrócenia po inaktywacji. Główne ataki paralitycznej choroby Heinego-Mediny, choroby pyska i racic i wenezuelskiego zapalenia mózgu koni były spowodowane właśnie w taki sposób.
Tak więc żaden z obecnie dostępnych środków stosowanych do wytwarzania inaktywowanych wirusowych szczepionek nie jest dostatecznie selektywny, aby całkowicie inaktywować zakaźne wirusy zachowując antygenne właściwości cząstek wirusa, co najmniej w warunkach stosowanych dotychczas do inaktywacji genomu wirusowego.
Kolejnym problemem jest to, że pewne wirusy zanieczyszczające krew lub inne płyny biologiczne są zawarte w komórkach, jako pełne wirusy, fragmenty wirusowego DNA lub wirusowy kwas nukleinowy integrowany z genomem gospodarza. Na przykład, wirus HIV jest zawarty w leukocytach. Specjalną troską jest możliwość inaktywowania wolnych od komórek i zawartych w komórkach form wirusa, przy zachowaniu strukturalnej integralności komórek.
Problemy inaktywacji wirusów w mieszaninach biologicznych różnią się od problemów inaktywacji samych wirusów wskutek jednoczesnej obecności żądanych biopolimerów, takich jak białka, węglowodany i glikoproteiny w surowicy. Chociaż jest możliwe inaktywowanie wirusa zapalenia wątroby B z użyciem środków takich jak formaldehyd i środki utleniające, sposoby te nie są właściwe do inaktywacji wirusa w krwi, ponieważ zauważono, że większość tych środków aktywujących uszkadza biologiczną aktywność biopolimerów w surowicy lub komórkowych składników krwi. Zastosowanie światła nadfioletowego okazało się dezaktywować wirusy w koncentracie płytek krwi. Jednakże powstawały ostre uszkodzenia płytek krwi przy wyższych intensywnościach. Beta-propiolakton reaguje z kwasem nukleinowym i białkiem z podobną szybkością; tak więc, chociaż wirusy mogą być inaktywowane, traci się ponad połowę czynnika VIII z surowicy.
Możliwe są też trudności w uzyskaniu wartościowych biopolimerów ze źródeł poza krwią, ponieważ patogenne wirusy mogą także zanieczyszczać takie kompozycje. Źródła te obejmują między innymi siarę i mleko ssaka, płyn puchlinowy, surowicę, ślinę, ekstrakty
187 759 łożyska, linie tkankowych kultur komórek i ich ekstrakty, w tym np. transformowane komórki oraz produkty fermentacji.
Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów w kompozycji biologicznej zawierającej biopolimery przez selektywną modyfikację cząsteczek kwasu nukleinowego w tej kompozycji zawierającej biopolimery, polegający na tym, że kontaktuje się kompozycję zawierającą biopolimer z roztworem oligomeru etylenoiminy 0 odpowiednim pH i sile jonowej, przy czym biopolimery w tej kompozycji zachowują całą aktywność na poziomie inaktywacji.
W sposobie tym, korzystnie stosuje się biopolimery wybrane są z grupy zawierającej białka, węglowodany i lipidy.
W korzystnym aspekcie realizacji sposobu według wynalazku, biologiczna kompozycja obejmuje jedno lub więcej białek wybranych z grupy obejmującej fibrynogen, czynnik VII, czynnik VIII, czynnik IX, czynnik X, immunoglobiny, prealbuminy, białko wiążące retinol, albuminę, alfa-globuliny, gamma-globuliny, składniki uzupełniające, fibronektynę, antytrombinę III, hemoglobinę, interferon, czynniki wzrostu, aktywator plazminogenu, hormon wzrostu, insulinę i erytropoetynę.
Również korzystnie biologiczną kompozycję wybiera się z grupy obejmującej pełną krew ssaka, oczyszczone lub częściowo oczyszczone białka krwi, białka komórek krwi, mleko, ślinę, osocze krwi, osocze bogate w płytki, koncentrat osocza, osad z dowolnego frakcjonowania takiego osocza, supematant z dowolnego frakcjonowania osocza, surowicę, krioprecypitat, kriosupematant, lizat komórkowy, hodowle komórek ssaczych, ekstrakty łożyskowe, produkty fermentacji i białka indukowane w komórkach krwi.
Najkorzystniej sposób według wynalazku można zrealizować gdy biologiczną kompozycję stanowią komórki ssacze i nie-ssacze.
Również korzystnie biologiczną kompozycję można wybrać z grupy: koncentrat leukocytów, koncentraty czerwonych komórek krwi i/lub koncentraty płytek krwi.
Mikroorganizmy można wybrać z grupy wolnych od komórek postaci wirusów, wirusów przenoszonych przez krew i bakterii i pasożytów.
Korzystnie, wirusy wybiera się z grupy wirusów z otoczką i wirusów bez otoczki lub też mikroorganizmy wybiera się z grupy wirusów zawartych w komórkach, wirusów przenoszonych przez krew, bakterii i pasożytów.
Również korzystnie wirusy wybiera się z grupy obejmującej wirusy ospy, wirusy opryszczki, adenowirusy, wirusy papowa, parwowirusy, reowirusy, orbiwirusy, rotawirusy, alfawirusy, rubiwirusy, flawiwirusy, koronawirusy, paramiksowirusy, morbilliwirusy, pneumowirusy, wesikulowirusy, lissawirusy, pikomawirusy, ortomiksowirusy, wirusy bunya, flebowirusy, nairowirusy, hepadnawirusy, arenawirusy, retrowirusy, enterowirusy, rynowirusy i filowirusy.
W sposobie według wynalazku jako oligomer etylenoiminy można korzystnie stosować dimer etylenoiminy, ewentualnie również korzystnie, podstawiony oligomer etylenoiminy.
Podstawiony oligomer etylenoiminy posiada wzór ogólny P-Hal-(CH2-CH2-Nh)„H gdzie Hal oznacza atom chlorowca, a n oznacza liczbę od 2 do i0.
W sposobie według wynalazku, w etapie kontaktowania inkubuje się biologiczną kompozycję z około 0,000i M do około 0,015 M oligomerem etylenoiminy; przy pH około 6,5 do około 8,5; w roztworze o sile jonowej od około 0,1 M do około 0,2 M w temperaturze około i 5°C do około 30°C przez około i godzinę do około 500 godzin a bardziej korzystnie kompozycję można inkubować z około 0,007 M oligomerem etylenoiminy; przy pH około 7,0 do około 8,0; w roztworze o sile jonowej około 0,15 M. Bardzo korzystnie, jako oligomer etylenoiminy w sposobie według wynalazku można stosować trimer etylenoiminy lub ewentualnie tetramer etylenoiminy.
Korzystny wariant realizacji sposobu według wynalazku polega na tym, że kompozycja biologiczna jest odpowiednia do zastosowania terapeutycznego po selektywnej inaktywacji mikroorganizmów.
187 759
W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się kompozycję biologiczną wybraną z grupy obejmującej - pełną krew ssaka, koncentrat leukocytów, koncentrat krwinek czerwonych i koncentrat płytek krwi.
W sposobie według wynalazku korzystnie oligomer etylenoiminy jest wybrany z grupy obejmującej dimer etylenoiminy, trimer etylenoiminy i tetramer etylenoiminy, a bardziej korzystnie wspomniany oligomer etylenoiminy jest dimerem etylenoiminy. W takim przypadku, najkorzystniej wspomniana kompozycja biologiczna jest koncentratem krwinek czerwonych.
Sposób według wynalazku pozwala na selektywną modyfikację kwasu nukleinowego w obecności innych wartościowych biologicznych makrocząsteczek i komórek. Zgodnie z tym sposobem, kwas nukleinowy wirusów, innych mikroorganizmów i komórek, poddaje się selektywnej chemicznej modyfikacji, zachowując strukturę i funkcję nie będących kwasem nukleinowym składników.
Odkryto obecnie, że środki inaktywujące z oligomeru etylenoiminy mogą skutecznie i specyficznie inaktywować zakażające wirusy w biologicznej kompozycji, takiej jak kompozycja zawierająca komórki lub biopolimer. Przedmiotem wynalazku jest, zatem sposób selektywnej modyfikacji cząstek kwasu nukleinowego wirusów lub innych mikroorganizmów w kompozycji mieszanych biopolimerów, obejmujące zetknięcie kompozycji z inaktywującym oligomerem etylenoiminy. Odkryto obecnie, że chociaż większość obecnie dostępnych środków inaktywujących wirusy zmienia biopolimery, takie jak białkowy czynnik VIII krwi, nadając im biologiczną nieaktywność, inaktywujące oligomery etylenoiminy według wynalazku stosowane w warunkach inaktywacji, nie wywierają takiego wpływu. Odkryto, że gdy zawierająca biopolimer kompozycja, np., białka komórek krwi, osocze krwi, osad z frakcjonowania osocza krwi, supematant z frakcjonowania osocza krwi, krio-precypitat, kriosupematant, albo ich część lub pochodna, albo produkt z surowicy lub nie z krwi wytworzony z normalnych lub transformowanych komórek (np. technikami rekombinacji DNA) styka się przez dostateczny czas z inaktywującym oligomerem etylenoiminy, wirusy obecne w kompozycji ulegają inaktywacji w żądanym stopniu (co najmniej około 6 rzędów w pomiarze inaktywacji wirusowa lub co najmniej około 20 rzędów w obliczeniu) bez znaczących uszkodzeń biopolimerów, takich jak zawarte tam białka. Stykając mieszaninę lub koncentrat białka krwi z inaktywującym oligomerem etylenoiminy, można inaktywować wirusa, takiego jak zapalenia wątroby A lub B albo HIV, w żądanym stopniu, np., do mierzalnego stopnia inaktywacji co najmniej o 6 rzędów lub w obliczeniu co najmniej około 20 rzędów wielkości. Biopolimery takie jak białka, węglowodany i lipidy w potraktowanej kompozycji zachowują zasadniczo całą aktywność na poziomie sprzed inaktywacji.
Sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie zawierających biopolimery kompozycji, np., pochodnych komórek krwi (np., hemoglobiny, interferonu alfa, ludzkiego hormonu wzrostu, erytropoetyny, PDGF, tPA itd.), osocza krwi, frakcji osocza krwi, osadu osocza krwi (np. krioprecypitatu, etanolowego supematanta lub supematanta poli(glikolu etylenowego)), które są zasadniczo wolne od zakaźnego wirusa przy zachowaniu zasadniczo ilościowo aktywności białka obecnego przed inaktywacją. Ilość wirusa w kompozycji określa się mianem infekcyjności.
Sposób według niniejszego wynalazku opisano jako przetwarzanie osocza, frakcji osocza, koncentratów osocza lub ich składników. Sposób jest jednakże przydatny także do traktowania lizatów lub białek ulegających sekrecji z komórek. Rozważa się także traktowanie frakcji otrzymanych z płytek krwi, białych komórek (leukocytów), czerwonych komórek, fibroblastów, a także roztworów interferonu, hormonu wzrostu, tPA, czynnika VIII, czynnika przenoszącego, hemoglobiny, czynników wzrostu, EPO i DNAzy.
Przewiduje się także zastosowanie środków inaktywujących i sposobu według niniejszego wynalazku do traktowania świeżego mrożonego osocza, rozmrożonego mrożonego osocza, krioprecypitatu, kriosupematantów lub koncentratów z zamrożonego osocza, jak też produktów ich rozcieńczenia.
W tym samym sposobie opisanym tutaj wirus obecny w produktach normalnych lub transformowanych komórkach można inaktywować zachowując biopolimeryczną aktywność takich produktów. Na przykład, stosując inaktywujący oligomer etylenoiminy można inakty187 759 wować produkty wytwarzane z użyciem normalnych lub transformowanych komórek, wysięk z normalnych lub transformowanych komórek, hybrydomy i produkty wytwarzane metodą inżynierii genetycznej. Takie przetwarzanie nie wpływa zasadniczo ujemnie na żądany biopolimer, taki jak konkretne białko. Komórki użyte do wytwarzania żądanego białka mogą, oczywiście, pochodzić od ssaka, jak też nie pochodzić od ssaka.
Kompozycje, które można wytworzyć w oparciu o sposób według wynalazku, inaktywują zasadniczo wszystkie wirusy zawarte w próbce. Sposoby określania poziomu zakaźności są dobrze znane specjalistom. Patrz, np., Lennette, E.H. i Schmidt, N. J. (wyd.) (1985) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, wyd. 62, American Publisher^ Assn., Washington. D.C. Według wynalazku doświadczalnie mierzona inaktywacja wirusa osiąga co najmniej około „6-log” (6,0 logio). Oznacza to, że tam, gdzie wirus występuje w nietraktowanej kompozycji w takim stężeniu, że nawet po rozcieńczeniu 106 razy wirusową zakaźność można wykryć, w potraktowanej próbce wirus jest całkowicie inaktywowany do zakresu określonego studiami zakaźności, tak że po potraktowaniu nie można wykryć wirusa w nierozcieńczonej próbce. Co jest istotniejsze, po otrzymaniu precyzyjnego kinetycznego opisu procesu inaktywacji opisanego tutaj, można uzyskać obliczone zmniejszenie zakaźności zawierających wirusa kompozycji o co najmniej około 20 rzędów wielkości.
W pewnych odmianach inaktywującym oligomerem etylenoiminy jest trimer, liniowy tetramer lub rozgałęziony tetramer. Korzystne warunki inaktywacji obejmują inkubację kompozycji z około 0,0001 M do około 0,010 M inaktywującego oligomeru etylenoiminy; przy pH około 6,5 do około 8,5; w roztworze o sile jonowej około 0,01 M do około 0,5 M. Bardziej korzystne warunki reakcji to inkubacja kompozycji z około 0,001 M do około 0,01 M inaktywującego oligomeru etylenoiminy, przy pH około 6,9 do około 8,5; w roztworze o sile jonowej około 0,1 do mniej niż około 0,5 M. Najkorzystniejsze warunki inaktywacji to zetknięcie zawierających komórki lub biopolimer kompozycji z inaktywującym oligomerem etylenoiminy takim jak trimer, liniowy tetramer lub rozgałęziony tetramer w temperaturze w zakresie od około 4°C do 30°C.
Środek inaktywujący do selektywnej modyfikacji kwasów nukleinowych jest mieszaniną biopolimerów zawierającą około 0,0001 M do około 0,015 M oligomeru etylenoiminy; o sile jonowej od około 0,1 M do około 0,2 M; przy pH około 6,5 do około 8,5.
Sposób selektywnej inaktywacji funkcjonalnych kwasów nukleinowych w biologicznej kompozycji obejmuje zetknięcie kompozycji ze skutecznym stężeniem selektywnie inaktywującego oligomeru etylenoiminy.
W oparciu o sposób według wynalazku można wytworzyć szczepionki zawierającej zabite drobnoustroje metodą zetknięcia oczyszczonych lub nieoczyszczonych zawierających wirusa kompozycji z selektywnie inaktywującym oligomerem etylenoiminy w warunkach inaktywacji wirusa.
Tak wytworzona szczepionka zawiera zabite drobnoustroje lub skuteczną ilość inaktywowanych wirusów, to jest, ilość dostateczną do nadania żądanego stopnia odporności organizmowi, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, w którym wytwarza się inaktywowane wirusy w procesie inkubacji wirusów z inaktywującym i oligomerami etylenoiminy w warunkach inaktywacji wirusa skutecznie redukujących mierzalną zakaźność o co najmniej około 6,0 rzędów wielkości (lub w żądanym stopniu o co najmniej około 20 rzędów wielkości obliczeniowo). Szczepionkę można podawać pacjentowi lub zwierzęciu w celach leczniczych. Pacjenta uodpornia się na wirusa przez podawanie pacjentowi szczepionki zawierającej tak zabite drobnoustroje.
Urządzenia do zbierania krwi obejmuje pojemnik do zbierania krwi lub jej frakcji, zawierający etylenoiminowy środek inaktywujący w ilości skutecznie dezaktywującej wirusy w krwi lub jej frakcji pobieranej do pojemnika, a diagnostyczne reagenty i diagnostyczne próbki obejmują wirusy, które potraktowano środkami inaktywującymi wirusy w warunkach inaktywacji sposobem według wynalazku.
Figura 1. Struktura monomeru (I), dimeru (II), trimeru (III), liniowego i rozgałęzionego tetrameru (IV i V, odpowiednio) inaktywującego oligomeru etylenoiminy.
187 759
Figura 2. Krzywe miareczkowania potencjometrycznego etylenoiminy i jej oligomerów. Cyfry rzymskie odpowiadają strukturom obecnym na fig. 1.
Figura 3. Krzywe przeżywalności faga MS2 pod działaniem etylenoiminy (0,025 M, krzywa 1), jej dimeru (0,007 M, krzywa 2), trimeru (0,003 M, krzywa 3), i równomolowej mieszaniny liniowego i rozgałęzionego tetrameru (0,0015 M, krzywa 4) w 0,15 M NaCl, pH 7,5, 20°C.
Figura 4. Krzywe przeżywalności faga MS2 pod działaniem 0,007 M etylenoiminy w 0,15 M NaCl (20°C) przy pH 6,5, 6,9, 7,5, i 8,5 (krzywe 1, 2, 3, i 4, odpowiednio).
1. Definicje:
„Selektywne środki inaktywujące” odnosi się do oligomerów etylenoiminy zawierających ugrupowanie azyrydynowe i mających specyficzne powinowactwo do polianionów, np. polinukleotydów, w porównaniu z innymi biologicznymi cząsteczkami. Selektywne środki inaktywujące według wynalazku obejmują klasę względnie słabo toksycznych związków, które selektywnie wiążą się z kwasami nukleinowymi (jednoniciowym DNA, dwuniciowym DNA, lub RNA) obejmującymi genetyczny materiał wirusów i nieodwracalnie modyfikującymi funkcjonalne kwasy nukleinowe powodując nieaktywność wirusów przy stosowaniu w warunkach inaktywacji.
„Oligomer etylenoiminy” odnosi się do oligomerów etylenoiminy mających terminalną grupę azyrydynową i ewentualnie podstawionych. Korzystne oligomery etylenoiminy mają co najmniej trzy jednostki etylenoiminowe i obejmują, np., trimer lub tetramer, liniowy lub rozgałęziony. Syntezę oligomerów etylenoiminy prowadzi się stosując schematy syntezy dobrze znane specjalistom. Patrz np., Kostyanovskii, R.G. i in. (tłumaczone z Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimicheskaya, 11:2566-2577, 1988). Reprezentatywne oligomery etylenoiminy przedstawiono na fig. 1. W sposobie według wynalazku oligomery etylenoiminy mające mniej niż 10 jednostek są korzystne i oligomery etylenoiminy mające około 3 lub 4 jednostek są korzystniejsze.
Oligomery etylenoiminy mogą także być podstawione, jeśli tylko nie eliminuje to zasadniczej właściwości etylenoiminy. W jednej odmianie oligomery etylenoiminy są podstawione chlorowcami i mają ogólny wzór (-Hal-(CH2-CH2-NH)nH. Takie związki, często określane jako musztardy azotowe, syntetyzuje się metodą ilościowej konwersji chlorowodorem lub bromowodorem etylenoiminy lub jej oligomerów w β-chlorowcomono- lub oligoetyloaminy. Musztardy azotowe są silnymi elektrofilami i alkilują grupy nukleofilowe zasad nukleinowych bezpośrednio lub przez konwersję związku pośredniego w odpowiednie azyrydyny. Jako oligomery etylenoiminy, P-chlorowcooligo-etyloaminy mają wysokie powinowactwo do polianionów. Tak więc te oligomery etylenoiminy mają wysoką selektywność wobec kwasów nukleinowych, jednakże kinetyka modyfikacji będzie wymagała dostosowania.
Środek inaktywujący wykazuje „selektywność” wobec kwasów nukleinowych lub „selektywnie” reaguje z kwasami nukleinowymi, jeśli porównawcza szybkość reakcji środka inaktywującego z kwasami nukleinowymi jest większa niż szybkość reakcji z innymi biologicznymi cząsteczkami, np., białkami, węglowodanami lub lipidami. Poziom selektywności inaktywującego oligomeru etylenoiminy wobec kwasów nukleinowych w porównaniu z białkami jest nieoczekiwany z uwagi na monomer etylenoiminy, który jest podobnie selektywny wobec kwasów nukleinowych i innych środków alkilujących..
„Kwas nukleinowy” odnosi się do DNA i RNA jedno- i dwuniciowych.
„Biologiczna kompozycja” oznacza kompozycję zawierającą komórki lub biopolimery. Zawierające komórki kompozycje, w tym, np., pełna krew, koncentraty czerwonych komórek, koncentraty płytek krwi, koncentraty leukocytów, białka komórek krwi, frakcje białek osocza krwi, oczyszczone białka krwi, surowica, nasienie, siara i mleko ssaka, ekstrakty łożyskowe, produkty fermentacji, płyn puchlinowy, oraz produkty wytworzone w kulturze komórkowej z normalnych lub transformowanych komórek (np., przez rekombinacyjny DNA lub techniką monoklonalnego przeciwciała). „Biopolimer” lub „cząsteczka biologiczna” oznacza dowolną klasę organicznej cząsteczki zwykle występującą w żywych organizmach, w tym, np., kwasy nukleinowe, polipeptydy, potranslacyjnie zmodyfikowane białka (np. glikoproteiny), polisacharydy i lipidy. Zawierające biopolimer kompozycje obejmują, np., białka komórek krwi,
187 759 osocze krwi, osad z frakcjonowania osocza krwi, supematant z frakcjonowania osocza krwi, krioprecypitat, kriosupematant, albo ich część lub pochodną, albo produkt z surowicy lub nie z krwi wytworzony z normalnych lub transformowanych komórek (np. technikami rekombinacji DNA). Biologiczne kompozycje mogą nie zawierać komórek.
„Funkcjonalny kwas nukleinowy” oznacza kwas nukleinowy mający elementy sekwencji służące jako wzorzec w replikacji, transkrypcji, translacji lub innej aktywności cząsteczki kwasu nukleinowego. Takie elementy obejmują, np., sekwencje kodujące początek replikacji cząsteczki kwasu nukleinowego, transkrypcyjne elementy takie jak promotory/enhancery, terminatory transkrypcji i inne elementy regulacyjne; translacyjne elementy takie jak miejsca wiązania rybosomów, kodony startu translacji, sekwencje kodujące i kodony stopu w fazie; oraz sekwencje nadające katalityczną aktywność RNA.
„Zahamować aktywność biopolimeru” oznacza mierzalnie osłabić funkcję lub aktywność biopolimeru. Osłabienie funkcji lub aktywności można określić w dowolnej standardowej próbie stosowanej do mierzenia aktywności konkretnego biopolimeru. Na przykład, inhibicję aktywności enzymu (białka) lub antygenu można określić mierząc zmiany szybkości procesu enzymatycznego lub odpowiedź immunologiczną na antygen z użyciem konwencjonalnych prób. Innym przykładem takiej inhibicji jest inhibicja translacji RNA, którą można określić mierząc ilość białka kodowanego przez RNA wytwarzanego w odpowiednim systemie translacji in vitro lub in vivo.
„Inaktywowanie”, „inaktywacja” lub „inaktywować” w odniesieniu do funkcjonalnych kwasów nukleinowych oznacza zasadniczo wyeliminować aktywność DNA lub RNA, np., uszkadzając zdolność do replikacji, transkrypcji lub translacji wiadomości. Na przykład, inhibicję translacji RNA można określić mierząc ilość białka kodowanego przez skończoną ilość RNA wytwarzanego w odpowiednim systemie translacji in vitro lub in vivo. W odniesieniu do wirusów termin oznacza zmniejszenie lub eliminację zakaźnych cząstek wirusa mierzony jako spadek miana zakaźności lub liczby zakaźnych cząstek wirusa na ml. Taki spadek liczby zakaźnych cząstek wirusa określa się w próbach dobrze znanych zwykłym fachowcom. Lennette, E. H. i Schmidt, N.J. (wyd.) (1985) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, wyd. 62, American Publisher's Assn., Washington. D.C.
Eksperymentalnie spadek zakaźności można zmierzyć do co najmniej około „6 rzędów wielkości” w kompozycji zawierającej komórkę lub biopolimer, w której wirus jest inaktywowany w stopniu określonym przez badania zakaźności, przy czym wirus jest obecny w nietraktowanej surowicy w takim stężeniu, że nawet po rozcieńczeniu 106 razy wirusową aktywność można zmierzyć. Gdy nie można wytworzyć konkretnego wirusa z mianem 106, inaktywację określa się metodą ilościową pomiaru do miana utworzonego wirusa. Alternatywnie taki spadek liczby zakaźnych cząstek wirusa określa się metodą obliczenia opisanego tutaj do zakresu co najmniej około „20 rzędów” na podstawie kinetycznego opisu procesu inaktywacji opartego na dokładnym doświadczalnym określeniu zakaźności zawiesiny wirusa podczas inaktywacji, z uwzględnieniem chemicznych, fizycznych i biologicznych czynników wpływających na kinetykę inaktywacji.
„Warunki inaktywacji wirusowej” odnoszą się do warunków, w których wirusowe cząstki są inkubowane z selektywnie inaktywującymi oligomerami etylenoiminy według wynalazku, w tym, np., czasu przetwarzania, pH, temperatury, składu solnego i stężenia selektywnie inaktywującego środka, aby inaktywować wirusowy genom w żądanym stopniu. Warunki inaktywacji wirusa dobiera się spośród warunków opisanych poniżej przez selektywnej modyfikacji kwasów nukleinowych.
„Wirus” oznacza DNA i RNA wirusów. Wirusy obejmują osłonięte i nieosłonięte wirusy, np., wirusy ospy, wirusy opryszczki, adenowirusy, wirusy papowa, parwowirusy, reowirusy, orbiwirusy, pikomawirus, rotawirusy, alfawirusy, rubiwirusy, wirus grypy, typu A i B, flawiwirusy, koronawirusy, paramiksowirusy, morbilliwirusy, pneumowirusy, rhabdowirusy, lissawirusy, ortomiksowirusy, wirusy bunya, flebowirusy, nairowirusy, hepadnawirusy, arenawirusy, retrowirusy, enterowirusy, rynowirusy i filowirusy.
„Szczepionkę” stosuje się w jej zwykłym sensie na oznaczenie środka skutecznie nadającego odpowiedni stopień odporności organizmowi powodując tylko niewielki stopień
187 759 zachorowalności lub śmiertelności. Sposoby wytwarzania szczepionek są, oczywiście, przydatne w badaniu układu odpornościowego i w zapobieganiu chorobom ludzi i zwierząt.
„Farmaceutycznie dopuszczalne” oznacza względnie nietoksyczny dla zwierzęcia, któremu podaje się związek. „Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje dowolny ze standardowych farmaceutycznych nośników, buforów i zarobek, takich jak roztwór solanki buforowanej fosforanem, woda i emulsji, takich jak emulsje olej/woda lub woda/olej, oraz różne typy środków zwilżających i/lub adjuwantów.
Wynalazek jest oparty na niespodziewanym i zaskakującym odkryciu, że w porównaniu z wieloma środkami modyfikującymi kwasy nukleinowe, a w szczególności z monomerem etylenoiminy (azyrydyną), oligomery etylenoiminy, takie jak trimer i tetramer, są znacznie bardziej selektywne w modyfikacji kwasów nukleinowych w odróżnieniu od innych biopolimerów, takich jak białka. Oligomery etylenoiminy są bardziej selektywne niż monomer etylenoiminy o wiele rzędów wielkości, a w pewnych przypadkach, 6 rzędów wielkości. Zastosowanie selektywnie inaktywujących oligomerów etylenoiminy w sposobie według wynalazku jest szczególnie skuteczne dla kompozycji obejmujących kwasy nukleinowe ściśle związane z białkami, takie jak nukleoproteiny lub wirusy.
Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywnej aminoalkilacji cząsteczek kwasu nukleinowego w kompozycji zawierającej komórkę lub biopolimer, obejmujące zetknięcie kompozycji z inaktywującym oligomerem etylenoiminy. W wyniku tego procesu kwasy nukleinowe w kompozycji są modyfikowane chemicznie znacznie szybciej niż inne cząsteczki biologiczne. Sposób ten jest przydatny w dowolnym procesie, w którym korzystający chce zmodyfikować kwasy nukleinowe, ale pozostawić inne biologiczne cząsteczki względnie niezmienione. Na przykład, sposób według wynalazku jest przydatny w preferencyjnym znakowaniu kwasów nukleinowych w nukleoproteinie (np. chromatynie lub rybosomach) oligomerem etylenoiminy niosącym wykrywalny znacznik (radioaktywny, fluorescencyjny, enzymatyczny, itp.), np. do mapowania, lub inaktywacji genomu wirusa lub innego żywego organizmu.
Inaktywujące oligomery etylenoiminy w sposobie według wynalazku modyfikują kwasy nukleinowe korzystnie w reakcji protonowanej grupy azyrydynowej z zasadami nukleinowymi w polinukleotydach. Zdolność środka inaktywującego wirusa do wiązania z polianionem zależy, w części, od liczby protonowalnych grup na cząsteczkę i od łącznego stopnia protonowania w danych warunkach. Modyfikacja zachodzi przez związanie oligo-kationowego środka inaktywującego wirusa z polianionem kwasu nukleinowego. Stopień protonowania zależy, w części, od pH. Jak opisano tutaj, pH grupy azyrydynowej spada z długością polimeru. Jednakże zdolność inaktywujących oligomerów etylenoiminy do selektywnej asocjacji z kwasami nukleinowymi rośnie znacząco z długością inaktywującego oligomeru etylenoiminy. Odpowiednio, praktyk może skutecznie i selektywnie alkilować kwasy nukleinowe przy fizjologicznym odczynie pH.
Jedna z odmian sposobu selektywnej amino-alkilacji kwasów nukleinowych obejmuje etap zetknięcia kwasów nukleinowych z około 0,0001 M do około 0,015 M selektywnie inaktywującego oligomeru etylenoiminy przy pH około 6,5 do około 8,5 i korzystnie około 7,0 do około 8,0, a najkorzystniej, pH około 7,5. Stężenie inaktywującego oligomeru etylenoiminy zależy w części od liczby protonowalnych grup w inaktywującym oligomerze etylenoiminy, a dobór pH zależy od trwałości wirionu. Selektywnie inaktywującym oligomerem etylenoiminy jest korzystnie trimer, liniowy tetramer lub rozgałęziony tetramer etylenoiminy. W innej odmianie sposób obejmuje etap wystawienia lub zetknięcia kwasów nukleinowych z selektywnie inaktywującym oligomerem etylenoiminy w roztworze o sile jonowej około 0,1 M do około 0,5 M i korzystnie, około 0,15 M. Sole mogą być dowolnymi z normalnie stosowanych w biochemii, w tym sodowe, potasowe, fosforany lub octany, i tak dalej. Praktyk może zmienić pH roztworu stosując dowolne bufory zwykle stosowane w przypadku biopolimerów lub komórek, takie jak fosforanowy, octanowy, boranowy, Tris, HEpES, MOPS i tak dalej. MOPS i Tris są korzystnymi buforami. Wysokie stężenia fosforanu w buforach nie są korzystne. Praktyk może dopasować warunki reakcji w celu uzyskania żądanego pH i siły jonowej. Praktyk może także dopasować inne czynniki, takie jak stężenie reagentów, temperaturę, czas inkubacji zależny od warunków reakcji i żądanego stopnia inaktywacji zakaźności.
187 759
Jak, opisano tu poniżej; z użyciem podejścia kinetycznego powinno się określić punkt końcowy inaktywacji, jak też warunki spośród opisanych, dla aminoalkilowania kwasów nukleinowych w celu inaktywowania do określonego stopnia funkcjonalnych kwasów nukleinowych lub wirusów.
Praktyk może określić stopień alkilacji wirusowego kwasu nukleinowego przez stopień inaktywacji wirusowej zakaźności, stosując różne próby znane specjalistom, takie jak określenie efektów cytopatycznych (CPE) w tkankowych kulturach z użyciem seryjnych rozcieńczeń zawierających wirusa mieszanin wprowadzanych do podatnych komórek, a następnie inkubację w temperaturze 37°C. Modyfikacja białek, polisacharydów i glikoprotein oligomerami etylenoiminy doprowadzi do wprowadzenia dodatkowych dodatnich ładunków.
Stopień tej modyfikacji biopolimeru można określić znanymi sposobami, w tym, np., izoelektrycznym ogniskowaniem, autoradiografią, elektroforezą na żelu poliakryloamidowym, HPLC i innymi postaciami chromatografii.
Kompozycje do selektywnej modyfikacji, aminoalkilacji, kwasów nukleinowych w kompozycji zawierającej komórkę lub biopolimer, obejmują około 0,0001 M do około 0,015 M inaktywującego oligomeru etylenoiminy; o sile jonowej około 0,1 M.
Kompozycje do selektywnej modyfikacji, aminoalkilacji, kwasów nukleinowych w kompozycji zawierającej komórkę lub biopolimer, obejmują około 0,0001 M do około 0,015 M inaktywującego oligomeru etylenoiminy; o sile jonowej około 0,1 M do około 0,2 M i, korzystnie, około 0,15 15 ; oraz buforowanych przp pH około 6,5 do dk olo 8,5 i k orzyrtnie około 7,0 do około 8,0, oraz najkorzystniej około 7,5. Inaktywującym oligomerem etylenoiminy jest korzystnie trimer lub tetramer, liniowy lub rozgałęziony. Sole i bufory mogą być dowolnymi z opisanych powyżej. W jednej z odmian kompozycja na zawartość oligomeru etylenoiminy, siłę jonową i pH skuteczne dla aminoalkilacji funkcjonalnego kwasu nukleinowego. W innej odmianie kompozycja ma stężenia oligomeru etylenoiminy, siłę jonową i pH skuteczne dla ^aktywowania wirusów. Takie kompozycje są przydatne jako środki dezynfekujące lub jako wirycydy, oraz we wszystkich sposobach według wynalazku, opisanych tutaj.
Sposoby selektywnej inhibicji aktywności funkcjonalnych kwasów nukleinowych w biologicznej próbce, obejmują zetknięcie próbki ze skuteczną ilością selektywnie inaktywującego oligomeru etyleno^my. Sposoby te mają wiele zastosowań. Gdy funkcjonalny kwas nukleinowy jest niechronionym kwasem nukleinowym, jak plazmid lub segment DNA, inhibicja jest przydatna do obniżania zdolności cząsteczki do transformacji komórki, do której jest wprowadzana np. przez transfekcję. W wolnym od komórek systemie translacji inhibicja jest przydatna do obniżania translacji RNA. Gdy funZcjyhalnym kwasem nukleinowym jest katalityczny kwas nukleinowy, taki jak rybozym, sposoby są przydatne do inhibicji działania kwasu nukleinowego na jego miejscu docelowym.
Gdy funkcjonalny kwas nukleinowy jest wirusowym genomem będącym częścią zakaźnego wirusa, sposoby są przydatne do dezynfekcji obszaru, inaktywacji lub eliminacji wirusów z komórki lub zawierających biopolimer kompozycji, takich jak pełna krew, produkty krwiopochodne lub biologiczne produkty takie jak białka wytworzone w kulturze komórkowej, oraz do zdezaktywowama zakaźności wirusa do żądanego stopnia (np. co najmniej około 20 rzędów wielkości metodą obliczenia opisanego tutaj). Zawierająca biopolimer kompozycja może obejmować np. białka oczyszczone z pełnej krwi; produkty z krwi (takie jak np., czynniki skrzepowe takie jak czynnik VIII, hormony takie jak erytrypyetyha i tak dalej); produkty kultur komórkowych, takie jak ekstrakty komórkowe, pożywka wzrostowa wzbogacona cząsteczkami biologicznymi (np. sekymbinacyjnymi białkami); zawierające białko kompozycje przetwarzane z produktami z krwi (np. kompozycje inZubywahe z surowicą cielęcą) i produkty roślinne. Te sposoby są przydatne dla zapewnienia czystości i bezpieczeństwa tych produktów do stosowania w laboratorium i w terapii, przy zachowaniu krytycznych biologicznych właściwości biologicznego produktu w kompozycji.
Urządzenia do zbierania krwi, do zbierania i/lub przetwarzania próbek krwi i inaktywacji w nich wirusów obejmują pojemnik do zbierania krwi lub jej frakcji z etylenoiminowym środkiem inaktywującym w ilości skutecznie dezaktywującej wirusy w krwi lub jej frakcji. Jeden przykład tej odmiany obejmuje zakorkowane probówki próżniowe, które zawie12
187 759 rają inaktywujący oligomer etylenoiminy. Gdy próbkę krwi składa się do probówki, styka się ona z inaktywującym oligomerem etylenoiminy. Innym przykładem jest torebka na krew stosowana, np., w krwiodawstwie. Torebki na krew według wynalazku zawierają inaktywujący oligomer etylenoiminy stykający się z krwią wypełniającą torebkę.
Podobnie, jeśli funkcjonalny kwas nukleinowy jest bakteryjny lub jest częścią genomu innego organizmu, sposoby są przydatne w dezynfekcji lub eliminacji takiej bakterii lub innego organizmu.
Modyfikacja wirusowego genomu sposobami według wynalazku wyklucza reprodukcję wirusów, a więc wyklucza zakaźność szczepionek zawierających zabite drobnoustroje według wynalazku. Ponadto, ponieważ białka powłoki wirionu nie są modyfikowane w tym samym stopniu, szczepionka zachowuje znaczącą immunogenność. Ponieważ oligomery etylenoiminy są znacząco bardziej selektywne w modyfikowaniu kwasów nukleinowych w porównaniu z innymi selektywnymi środkami inaktywującymi, kompozycje według wynalazku zawierające oligomery etylenoiminy dają znaczące korzyści w porównaniu z innymi mniej selektywnymi środkami inaktywującymi stosowanymi obecnie.
W oparciu o sposób według wynalazku można wytwarzać szczepionki zawierające zabite drobnoustroje obejmujące skontaktowanie wirusa z selektywnie inaktywującym oligomerem etylenoiminy w warunkach inaktywacji wirusa. Warunki inaktywacji wirusa dobiera się spośród sposobów opisanych powyżej dla amino-alkilacji i inaktywacji kwasów nukleinowych wirusowych, bakteryjnych lub innych organizmów. Ogólnie, wirusa o wysokim mianie około 107 do 108 jednostek na ml inkubuje się z oligomerem etylenoiminy; przy pH około 6,5 do około 8,5, w roztworze o sile jonowej poniżej 0,50 M w temperaturze około 4°C do około 40°C. Czas traktowania (to jest, punkt końcowy inaktywacji) zależy od struktury i składu konkretnego wirusa, temperatury inkubacji, siły jonowej i liczby protonowalnych grup w oligomerach etylenoiminy. Jednakże kinetyczne badania wskazują, że w zależności od pH i inaktywowanego wirusa czas inkubacji może być tak krótki jak kilka sekund, a także może wynosić około 1 godziny, 5 godzin, 50 godzin, 100 godzin, 300 godzin lub 500 godzin. Korzystnie selektywnie inaktywującym oligomerem etylenoiminy jest trimer, liniowy tetramer lub rozgałęziony tetramer. Sposoby wytwarzania szczepionek są dobrze znane i można je znaleźć, np., w Vaccines (wyd. Slorein G., Martance E.) wyd. 2, 1994, Saunders, Harcourt-Brace, Phil, Toronto.
W zastosowaniu jako szczepionki martwy wirus można stosować bezpośrednio w kompozycji szczepionki, lub liofilizować w pojedynczych lub wielodawkowych pojemnikach do dalszego zmieszania z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Liofilizowane zabite wirusy trzyma się zwykle w temperaturze 4°C.
Szczepionkę można także podawać w adiuwancie, to jest, substancji, która wzmacnia odpowiedź immunologiczną przy stosowaniu w połączeniu z antygenem. Szczepionkę można podawać w dawce immunizującej. Dawką immunizującą jest ilość antygenu lub immunogenu konieczna do wytworzenia lub wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Ilość ta waha się w zależności od obecności i skuteczności różnych adiuwantów. Ilość będzie się wahać w zależności od zwierzęcia i immunogenu lub antygenu albo adiuwantu, lecz będzie ogólnie mniejsza niż około 100 mg na dawkę. Dawkę immunizującą można łatwo określić sposobami dobrze znanymi specjalistom, prowadząc istotne statystycznie badania immunizacji i prowokacji gospodarza zwierzęcego. Patrz, np. Manual of Clinical Immunology, H. R. Rose iH. Friedman, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980).
Sposoby traktowania kompozycji zawierającej komórki lub biopolimer lub wytwarzania szczepionek zawierających zabite drobnoustroje są szczególnie przydatne w inaktywacji wirusów znanych już z nieodwracalnej inaktywacji innymi środkami alkilującymi, takimi jak monomer etylenoiminy i β-propiolakton. Tak więc, chociaż środki według wynalazku mają szersze zastosowanie dzięki swojej selektywności, przy doborze wirusów do wytwarzania szczepionek lub biologicznych produktów do dekontaminacji praktyk posługuje się, w części, doświadczeniem w dziedzinie innych środków inaktywujących.
Szczepionka zawierająca zabite drobnoustroje może być złożona ze skutecznej ilości inaktywowanych sposobem według wynalazku wirusów i farmaceutycznie dopuszczalnego no187 759 śnika, gdzie inaktywowane wirusy wytwarza się w procesie traktowania wirusów w warunkach inaktywacji wirusa skutecznie zmniejszających zakaźność do żądanego zakresu (o co najmniej, około 6 rzędów wielkości w bezpośrednim pomiarze lub co najmniej około 20 rzędów wielkości w obliczeniu opisanym tutaj). Szczepionki takie są przydatne do zapobiegania chorobom ludzi i zwierząt. Szczepionki zdolne do nadawania żądanego stopnia odporności zawierają oczywiście ilość inaktywowanego wirusa skuteczną do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Wirusowy genom w tych szczepionkach w porównaniu z innymi szczepionkami jest alkilowany na endocyklicznym azocie nukleinowej zasady, lecz znaczącą różnicą jest fakt, że inaktywacja jest znacznie bardziej skuteczna, ponieważ względna szybkość modyfikacji kwasów nukleinowych w porównaniu z innymi biopolimerami w wirionie jest znacząco większa niż w przypadku dowolnych innych selektywnych środków inaktywujących. Przy wytwarzaniu szczepionek zawierających zabite drobnoustroje próbkę wirusa inkubuje się z selektywnym środkiem inaktywującym w ilościach i w takich warunkach, aby zdezaktywować wirusa z zachowaniem immunogenności.
Odpowiednie farmaceutyczne nośniki i ich kompozycje opisał Martin, Remingtońs Pharmaceutical Sciences, wyd. 19 (Mack Publishing Co., Easton 1995). Takie kompozycje będzie, ogólnie, zawierały skuteczną ilość związku wraz z odpowiednią ilością nośnika, aby utworzyć właściwą postać dawki do odpowiedniego podawania pacjentowi.
Leczniczym zastosowaniem sposobu według wynalazku są metody immunizacji pacjenta wobec wirusa przez podawanie pacjentowi szczepionki zawierającej zabite drobnoustroje. Pacjentem może być człowiek lub zwierzę. W praktyce, terapeutycznych skuteczną ilość związku opisanego powyżej, podaje się dowolnymi zwykłymi i dopuszczalnymi znanymi sposobami, same lub w kombinacji z innymi związkami według wynalazku.
W praktyce, konkretna dawka szczepionki podawanej pacjentowi będzie zależeć od wielu czynników, w tym natury wirusa, reżimu podawania, wieku i fizycznej charakterystyki pacjenta, i tak dalej. Właściwe dawki można ustalić stosując podejście kliniczne znane w medycynie.
Nie chcąc ograniczać się teorią, zwiększona specyficzność selektywnie inaktywujących oligomerów etylenoiminy dla kwasów nukleinowych oczywiście obejmuje następujące czynniki, którymi można manipulować w praktyce wynalazku. Monomer etylenoiminy i oligomery etylenoiminy zawierają pojedynczą grupę azyrydynową (fig. 1). Reaktywność azyrydyn jako elektrofilowych środków wzrasta ostro z protonowaniem azotu azyrydyny (Van Etten, R. L. i Dolhun, J. J. (1968) J. Org. Chem. 33:3904-3913), lecz tylko słabo reaguje na swoją alkilację (Earley, J. E. i in. (1958) J. Am. Chem. Soc. 80:3458-3462). Tak więc postać tych związków protonowanych na grupie azyrydynowej jest zapewne jedyną formą reaktywną. Szybkości zwykłych elektrofilowych reakcji azyrydyn powinny być proporcjonalne do stężenia ich protonowanych form w roztworze.
Związki I do V z fig. I różnią się znacząco od siebie pod względem pKa ich grup azyrydynowych i liczbą, wzajemnym ułożeniem i pKa grup aminowych (tabela 1). Tak więc udział reaktywnej formy tych związków, w których grupa azyrydynowa jest protonowana, i ich łączny średni dodatni ładunek zależy znacząco od pH (tabela 2).
Tabela 1
Wartości pKa protonowalnych grup oligoetylenoimin
azyrydyno amino pierwszorzędowe amino drugorzędowe amino trzeciorzędowe
monomer (I) 8,10 - - -
trimer (III) 4,10 10,0 7,35 -
tetramer (IV) (liniowy) 3,3 10,0 7,05* -
tetramer (V) (rozgałęziony) 3,0 10,0 - 6,4
*) średnia wartość dla dwu drugorzędowych grup aminowych **) średnia wartość dla dwu pierwszorzędowych grup aminowych
187 759
Działanie azyrydyn na białka i polinukleotydy prowadzi do amino-alkilacji grup nukleofllowych w resztach aminokwasowych i zasadach nukleinowych (Dermer, O. C. i Ham, G. E. (1969) Ethyleneimine And Other Aziridines, Acad. Press, NY - London 52:249-285). Azyrydyny, jak wiele elektrofilowych środków, modyfikują kwasy nukleinowe korzystnie przy N7, N3 i Nl puryn i w mniejszym stopniu przy N3 pirymidyn (Hemminki, K. i Ludlum, D.B. (1981) J. Natl. Cancer Inst. 73:1021-1027; Musser, S. M. i in. (1992) Chem. Res. Toxicol. 5:95-99; Singer, B. i Grunberger, D. (1983) Molecular Biology of Mutagens and Carcinogens, Plenum Press, New York-London; Loveless, A. (1966) Genetic and Allied Effects of Alkylating Agents. Butterworths, London; i Kochetkov, N.K. i Budowsky, E.I. wyd. (1972) Organic Chemistry of Nucleic Acids, część B, Plenum Press, London-New York). Wzorcowa synteza jest zatrzymywana środkami alkilującymi głównie wskutek względnie wolnego otwierania pierścienia imidazolowego alkilowanych N7 puryn, głównie guaniny (O'Connor, T.R. i in. (1988) Nucl. Acids Res. 16:5879-93; Hemminki, K. (1984) Chem.-Biol. Interactions, 48:249260). Na przykład, etylenoimina modyfikuje guanozynę z wytworzeniem N7(aminoetylo)guanozyny wykazującej znacznie większą szybkość otwierania pierścienia imidazolowego niż przy N7-alkiloguanozynie (Hemminki, K. (1984) Chem.-Biol. Interactions, 48:249-260; Hemminki, K. i in. (1989) Chem.-Biol. Interactions, 70:289-303).
Tabela 2
Łączny średni ładunek dodatni oligoetylenoimin (A) i stopień protonowania ich grupy azyrydynowej (B)
wartości pH A B
6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5
monomer (I) 0,96 0,80 0,28 0,98 0,80 0,28
trimer (III) 1,88 1,41 1,04 4,0-10-3 4,0-10-4 4,0-105
tetramer (IV) (liniowy) 2,67 1,41 1,01 6,3 ·10’4 6,3-10-5 6,3-10'6
tetramer (V) (rozgałęziony) 2,44 2,07 1,98 3,2· 10* 3,2 ·10’5 3,2-10‘6
Przejście monomeru (I) w tetramery (IV i V) przy pH 7,5 powoduje wzrost o ponad dwa rzędy wielkości skutecznej stałej szybkości inaktywacji zakaźności faga (k), obliczonej w oparciu o średnie stężenie środka w roztworze (tabela 3). Takie przejście prowadzi do spadku o 5 rzędów wielkości wartości pKa grupy azyrydynowej. Odpowiednio ułamek reaktywnej formy B środka spada przy tym pH o około 4 rzędy wielkości (tabela 2). Tak więc przejście od monomeru do tetramerów przy pH 7,5 prowadzi do wzrostu o około 6 rzędów wielkości stałej szybkości, obliczonej w oparciu o średnie stężenie reaktywnej formy środka w roztworze (ki).
Tabela 3
Stałe szybkości inaktywacji zakaźności fagaMS2 (M'1-min'1) pod działaniem oligoetylenoimin w 0,15 M NaCl w temperaturze 20°C obliczone w oparciu o łączne średnie stężenie reaktywnej formy środka (k, w nawiasach)
wartości pH 6,5 . 6,9 7,5 8,5
1 2 3 4 5
monomer (I) - - 1,5±0,07 (1,25) -
dimer (II) 102±3* 35±2,3 13±1,4 1,7±0,05
(2,4-103) (2,0-103) (2,9-103) (3,8-103)
trimer (III) - - 47±2,7 (1,5-106) -
187 759 cd. tabeli 3
1 2 3 4 5
tetramer** - - 150±12,5 (3,6-106) -
* stałą szybkości obliczono stosując początkową część krzywej przeżywalności. **równomolowa mieszanina liniowego i rozgałęzionego tetrameru.
Jako oligokationy, oligomery etylenoiminy mają wysokie powinowactwo do polinukleotydów, odzwierciedlone ich stałą asocjacji. Ta stała asocjacji, zmieniana elektrostatycznym oddziaływaniem, jest proporcjonalna do objętościowej gęstości ładunku oligokationu i polianionu, a więc wzrasta z łącznym średnim dodatnim ładunkiem oligokationu. Przejście od monomeru etylenoiminy do jego oligomerów daje znaczny wzrost łącznego średniego dodatniego ładunku cząsteczki (tabela 2). Ponadto odległości pomiędzy protonowalnymi grupami w oligomerach etylenoiminy są porównywalne z odległością pomiędzy międzynukleotydowymi grupami fosforanowymi w polinukleotydach. Wzrost liczby protonowalnych grup w oligoetylenoiminach od monomeru do tetrameru powinien więc prowadzić do wzrostu ich asocjacji z polinukleotydami, np. z wirusowymi RNA (Manning, G. S. (1978) Q. Rev. Biophys. 2:179-246; Thomas, T. J. i Bloomfield, V. A. (1984) Biopolymers 23:1295-1306; i Stevens, L. S. (1967) Biochem. J. 103:811-815).Wiele środków alkilujących stosowanych do modyfikacji kwasu nukleinowego nie ma wyraźnego powinowactwa do polinukleotydów. Porównanie zależności od pH polinukleotydowych modyfikacji z wartościami pK zasad nukleinowych pokazuje, że w zakresie pH 6,0-8,0 głównie obojętne postaci zasad nukleinowych podlegają alkilacji (Budowsky, E. I. i Zalesskaya, M. A. (1991) Vaccine, 9:319-325; Singer, B. i Grunberger, D. (1983) Molecular Biology of Mutagens and Carcinogens, Plenum Press, New York-London; Loveless, A. (1966) Genetic and Allied Effects of Alkylating Agents, Butterworths, London; i Kochetkov, N. K. i Budowsky, E. I. wyd. (1972) Organic Chemistry of Nucleic Acids, część B, Plenum Press, London-New York) 48, 50, 51). Dalszy wzrost pH powinien prowadzić do wzrostu ułamka bardziej reaktywnych deprotonowanych form guanozyny i urydyny, a wobec tego do wzrostu szybkości inaktywacji faga. Jednakże stała szybkości inaktywacji zakaźności faga przy pH 8,5 jest mniejsza niż przy pH 7,5 (tabela 3). Tak więc co najmniej w tym zakresie pH wpływ udziału reaktywnej formy środka na szybkość inaktywacji jest większa niż zasad nukleinowych. A więc przy obliczaniu stałej szybkości inaktywacji zakaźności w zakresie pH 6,0-8,5 zakładamy, że udział zasad nukleinowych w ich reaktywnej (deprotonowanej) formie jest zasadniczo stały. Dla oligoetylenoiminowej inaktywacji faga MS2, zależność od pH stałej szybkości inaktywacji jest więc spowodowana głównie udziałem reaktywnej formy i łącznym średnim dodatnim ładunkiem środka inaktywującego.
Występuje 60-krotny wzrost skutecznej stałej szybkości inaktywacji spowodowany spadkiem pH od 8,5 do 6,5. Koreluje to ze wzrostem reaktywnego udziału tego środka w roztworze (tabele 2 i 3). Tak więc w tym przypadku wpływ pH na szybkość inaktywacji określa się głównie ze zmiany stężenia reaktywnej formy w roztworze. Należy podkreślić jednakże, że zależność od pH łącznego średniego dodatniego ładunku dla trimeru i tetramerów jest silniej podkreślona niż dla monomeru etylenoiminy (tabela I), co prowadzi do większych wahań szybkości modyfikacji polinukleotydów dla trimeru i tetramerów w porównaniu z monomerami i dimerami.
Szybkość modyfikacji dowolnych składników wirionu tradycyjnymi środkami inaktywującymi jest zwykle uważana za funkcję średniego stężenia w roztworze środka. Jeśli środek o niskiej masie cząsteczkowej ma jednakże specyficzne powinowactwo do pewnego polimeru, lokalne stężenie środka w pobliżu tego polimeru jest wyższe niż średnie stężenie w roztworze środka i wykładniczo spada ze wzrostem odległości od polimeru (Dolar, D. i Peterlin, A., (1969) J. Chem. Phys., 50:3011-3015). Selektywność inaktywacji wirusowego genomu powinna być proporcjonalna do różnicy w lokalnym stężeniu środka w pobliżu tych biopolimerów·.
Tak więc nawet lokalny wzrost stężenia oligoetylenoiminy w pobliżu genomu powinien korzystnie zwiększyć jego szybkość modyfikacji. Jednakże, jak rozważono powyżej, tworze16
187 759 nie kompleksów pomiędzy oligomerami etylenoiminy i polinukleotydami powinno zwiększyć zakres protonowania grupy azyrydynowej, a zatem stałą szybkości (ki) modyfikacji polinukleotydu. Ze względu na wykładniczy spadek stężenia środka z odległością, w odległości 1-2 nm od polimeru lokalne stężenie środka jest praktycznie identyczne ze średnim stężeniem w roztworze (Dolar, D. i Peterlin, A., (1969) J. Chem. Phys., 50:3011-3015). Oczywiście, ułamek reaktywnej formy reagentu na tej odległości powinien być taki sam jak w wolnym (niezasocjowanym) stanie w roztworze. Tak więc wzrost stężenia środka inaktywującego w bliskości polinukleotydu, jak też asocjacja środka inaktywującego z polinukleotydem, nie powinny wpływać na szybkość modyfikacji składnika kapsydowego, szczególnie jego niosących antygen regionów na powierzchni wirionu. Selektywność inaktywacji wirusowego genomu jest polepszana dzięki zastosowaniu selektywnie inaktywujących oligomerów etylenoiminy wykazujących specyficzne powinowactwo do kwasów nukleinowych w porównaniu z tradycyjnymi środkami inaktywującymi.
Wszystkie te dane i rozważania pozwalają dobrać trimer lub tetramer etylenoiminy, z odpowiednim wzrostem powinowactwa polinukleotydu, ze wzrostem szybkości reakcji i selektywności modyfikacji wirusowego genomu. Jak przedstawiono powyżej, takie przejście prowadzi do wzrostu selektywności o co najmniej 6 rzędów wielkości. Tak więc, nawet jeśli selektywność monomeru etylenoiminy nie jest lepsza niż selektywność innych środków stosowanych obecnie do wytwarzania pełnowirionowych szczepionek zawierających zabite drobnoustroje, znaczący wzrost selektywności trimeru i tetrameru pozwala pominąć wpływ modyfikacji składnika wirionu na immunogenność, trwałość i inne właściwości wirionu.
Zastosowanie selektywnie inaktywujących oligomerów etylenoiminy o selektywności dla modyfikacji polinukleotydu stwarza nowe możliwości wytwarzania bezpiecznych i skutecznych szczepionek przeciwwirusowych zawierających zabite drobnoustroje. To samo podejście można także stosować do selektywnej inaktywacji wirusów, które są najszkodliwszymi zanieczyszczeniami krwi i surowicy dawców, jak też w preparatach medycznych i weterynaryjnych wydzielanych z tkanek zwierzęcych i kultur komórek. To samo podejście można stosować do selektywnej inaktywacji biologicznie aktywnych (np. transformujących) fragmentów DNA, które mogą zanieczyszczać kompozycje zawierające komórki lub biopolimery.
Poniższe przykłady są ilustracją wynalazku.
Przykład 1
Inaktywacja bakteriofaga Określenie kinetyczne
Bakteriofag MS2 wytworzono według konwencjonalnej procedury. Oczyszczanie przeprowadzono przez resedymentację na glikolu polietylenowym (PEG 6000, Serva) lub metodą chromatografii na DEAE-Sephadex A25 z liniowym gradientem NaCl (0,02-1,0 M, 20 mM Tris HC1, pH 7,4). Oczyszczonego faga umieszczono w zawiesinie w 0,15 M roztworze NaCl (2-10 mg/ml) i przechowywano w temperaturze +4°C. Zakaźność zawiesiny wirusa określono konwencjonalną techniką dwuwarstwową na agarze z peptonem i mięsem z Escherichia coli CA 180.
Etylenoiminę (I), jej trimer (III), oraz liniowy (IV) i rozgałęziony (V) tetramer wytworzono zgodnie ze sposobem Kostyanovsky'ego i in. (1988) Izv. Akad. Nauk SSSR 11:25662575. Dane PMR wskazały, że czystość tych związków przekraczała 95%. Roztwory etylenoimin wytworzono natychmiast przed użyciem dodając obliczoną objętość związku (gęstości w temperaturze 20°C wynoszą 0,836, 0,945, i 0,968 g · em3 dla związków I, III, i IV (V), odpowiednio) do 0,15 M roztworu NaCl. Wartości pKa protonowalnych grup etylenoimin w 0,15 M roztworze wodnym NaCl w temperaturze 25°C obliczono w oparciu o wyniki miareczkowania potencjometrycznego (fig. 2) HC1 z użyciem automatu do miareczkowania TTT-60 (Radiometer) z termostatowaną komorą na celkę. Dokładność określenia wartości pKa jest nie mniejsza niż 0,05. Udział reaktywnej (protonowanej na azocie azyrydyny) formy środka (Q) obliczono z następującego równania:
l+10pH_pK' (1)
187 759 gdzie pKj oznacza wartość pKa grupy azyrydynowej w odpowiednim związku.
Łączny średni dodatni ładunek cząsteczki (p) obliczono stosując następujące równanie:
p = £yd.(H„.An*) (2) gdzie d-(Hn-An+) oznacza udział środka mającego dodatni ładunek n przy danej wartości pH.
Przed zmieszaniem zawierającą fag kompozycję i świeżo wytworzony roztwór selektywnie inaktywującego oligomeru etylenoiminy trzymano w temperaturze 20°C i żądane pH uzyskano dodając rozcieńczone roztwory NaOH lub HCI. Próbki mieszaniny reakcyjnej inkubowane w temperaturze 20°C (końcowe stężenie środka inaktywującego podano w krótkim opisie fig. 3 i 4) pobierano w zdefiniowanych odstępach i po natychmiastowym 100-krotnym rozcieńczeniu użyto do określenia zakaźności (miana).
Skuteczne stałe szybkości inaktywacji zakaźności (k) obliczono z następującego równania:
k-^ioSSo/s, (3)
A -t gdzie A oznacza stężenie (łączne lub reaktywnej części) środka; So i St oznaczają zakaźność (miano) zawiesiny przed i t minut po rozpoczęciu inaktywacji.
Dobrze zdefiniowane kształty krzywych miareczkowania potencjometrycznego (fig. 2) odzwierciedlają zmiany w stanie jonowym inaktywującego oligomeru etylenoiminy. W przypadku monomeru pojedyncze plateau odpowiada protonowaniu grupy azyrydynowej. Obliczona wartość pKa (tabela 1) jest dość zgodna z danymi literaturowymi (O'Rourke, C. E., i in., (1956) J. Am. Chem. Soc., 78:2159-2160. Dla innych związków plateau odpowiadają protonowaniu grup aminowych i azyrydynowych (tabela 1). Zużycie kwasu przez oligomery II do V wskazuje, że każdy ma pojedynczą grupę zpKa 5,15-3,0, która odpowiada obecności pojedynczej grupy azyrydynowej w tych cząsteczkach. Cząsteczki II do V wykazują zwiększone azyrydynowe pKa względem etylenoiminy, ponieważ większa liczba silnie zasadowych grup aminowych podnosi łączny dodatni ładunek cząsteczki, zmniejszając w ten sposób protonowanie grup azyrydynowych. Mniej podkreślona różnica pKa pomiędzy cząsteczkami IV i V pochodzi prawdopodobnie od różnicy we wzajemnym ułożeniu grup azyrydynowych i aminowych w tych cząsteczkach. Jeden równoważnik kwasu jest wymagany do protonowania najbardziej zasadowych grup aminowych w przypadku związków II do IV, podczas gdy dwa są konieczne dla związku V.
Dane te korelują z obecnością jednej pierwszorzędowej grupy aminowej w każdym z pierwszych trzech związków, i dwu takich grup w V. Zużycie jednego i dwu równoważników kwasu, odpowiednio do występowania jednej i dwu drugorzędowych grup aminowych, jest konieczne do jonowych przemian związków III i IV przy pH 7,35 i 7,05, odpowiednio. Zużycie jednego równoważnika kwasu do jonowej przemiany związku V przy pH 6,4 odpowiada istnieniu jednej trzeciorzędowej grupy aminowej. W tych związkach wyższe wartości pKa pierwszorzędowych wobec drugorzędowych i trzeciorzędowych grup aminowych są zapewne spowodowane efektami elektronicznymi, jak też strukturą cząsteczki poliaminy (por. M. D. Bratek-Wiewiorowsak i in. (1986) Bull. Pol. Ac. Sci., Chem. 34:229-249). Dane te użyto do obliczenia łącznego średniego dodatniego ładunku i zakresu protonowania grupy azyrydynowej przy dowolnej wartości pH dla związków I do V (tabela 2).
Wykładniczy spadek zakaźności faga MS2 pod działaniem związków I do V przy pH
7,5 (fig. 3) wskazuje, że stężenie tych związków pozostaje stałe w użytych warunkach. Pozwala to na obliczenie skutecznych stałych szybkości (k) inaktywacji zakaźności w oparciu o otrzymane dane. Jak pokazano w tabeli 3, przejście monomeru etylenoiminy w jej tetramer prowadzi do wzrostu o dwa rzędy wielkości tej stałej szybkości.
Spadek pH od 8,5 do 6,5 powoduje 60-krotny wzrost szybkości inaktywacji zakaźności faga przez etylenoiminę (fig. 4, tabela 3). Zastosowanie tego związku przy pH 6,5 prowadzi do znaczącego odchylenia kształtu krzywej przeżywalności od wykładniczego (fig. 4). Zmiana ta wskazuje na szybki spadek stężenia związku II ze względu na jego kationową polimeryzację przy tym pH (por. Gembitsky, P. A., i in., (1791) Nauka, Moskwa). Stałą szybkości inaktywacji dla związku II przy pH 6,5 obliczono więc stosując tylko początkową część krzywej
187 759 przeżywalności. Stała szybkości dla zużywania związku II przy pH 6,5 wynosi około 0,02 min'1, jak obliczono stosując stałą szybkości we wczesnym okresie inaktywacji i końcowy zakres inaktywacji zakaźności (por. Budowski, E. I. i Zalesskaya, M. A., (1991) Vaccine, 9:319-325).
Przykład 2
Obliczanie punktu końcowego inaktywacji
Zakres zmniejszenia zakaźności zawierających wirusa kompozycji można kontrolować doświadczalnie o co najmniej około 6 rzędów wielkości, nawet gdy zwiększy się objętość próbki (w rozsądnych granicach) i wykorzystuje serię kolejnych przejść. Jednakże wytwarzanie bezpiecznych przeciwwirusowych szczepionek zawierających zabite drobnoustroje wymaga, aby zakaźność oryginalnej zawierającej wirusa kompozycji była zmniejszona o co najmniej około 20 rzędów wielkości. Tak więc, ogólnie, bezpieczeństwa przeciwwirusowych szczepionek zawierających zabite drobnoustroje, nie można określić tylko doświadczalnie i musi polegać na sposobie opisanym tutaj i może być ocenione bardziej znacząco przez obliczenie z użyciem podejścia kinetycznego. Wymaga to dokładnego kinetycznego opisu warunków inaktywacji dla wirusa z uwzględnieniem charakterystyki selektywnie inaktywującego środka według wynalazku. Dane można otrzymać z wczesnej (kontrolowanej doświadczalnie) części krzywej przeżywalności.
Dokładny kinetyczny opis powinien opierać się na dokładnym określeniu zakaźności wirusowej zawiesiny podczas inaktywacji. Specjalista powinien upewnić się, że określenie zakaźności (miana) jest dokładne, aby zapewnić określenie stałej szybkości inaktywacji i minimalnego czasu działania selektywnie inaktywującego środka (ti). Pewną wartość ti można otrzymać stosując podejście kinetyczne opisane powyżej, szczególnie gdy krzywe przeżywalności dają dobry kinetyczny opis do określonego stopnia obniżenia zakaźności. Zakładając, że modyfikacja wirusowego genomu nie jest zniekształcona biologicznymi czynnikami (takimi jak naprawa DNA) i zakładając, że tworzenie pierwszego inaktywującego uszkodzenia, niezależnie od jego położenia w wirusowym kwasie nukleinowym, blokuje pełną replikację genomu, krzywe przeżywalności dla wirusa podczas działania selektywnie inaktywującego środka według wynalazku spełniają następujące równanie:
S = So exp (-Akt) gdzie So i S są mianami infekcji zawierającej wirusa kompozycja przed i w czasie t po rozpoczęciu działania selektywnie inaktywującego środka, A oznacza stężenie selektywnie inaktywującego środka i k oznacza stałą szybkości inaktywacji, to jest, modyfikacji reszt nukleotydowych na genom.
Zakładając, że wartości A i k są stałe podczas inaktywacji, krzywe przeżywalności są wykładnicze. W tym przypadku czas inaktywacji wymagany do zmniejszenia zakaźności do danego można obliczyć z następującego równania:
Tj = [2,3/(Ak)log(S/Sc)
Stosując stałą szybkości inaktywacji otrzymaną w przykładzie 1 podaną w tabeli 3, czas inaktywacji, zakładając stężenie oligomeru etylenoiminy 10’3 M (dla tetrameru) i stałą szybkości inaktywacji, k=150, wzięta z tabeli 3 (pH 7,5) i log(S/So) jest żądanym stopniem inaktywacji, w tym przypadku co najmniej około 20, czas zmniejszania zakaźności w przykładzie 1 wynosi 15,3 minuty w temperaturze 20°C.
Według wynalazku punkt końcowy inaktywacji dla dowolnego wirusa i dowolnego selektywnie inaktywującego środka według wynalazku można określić w warunkach inaktywacji w oparciu o dane otrzymane z początkowej części krzywej przeżywalności.
Przykład 3
Pikomawirus. Zbadano wirusa zapalenia wątroby A (rodzaj enterowirus) i wirusa choroby pyska i racic (aftowirus) zawierające jednoniciowy RNA, łańcuch dodatni, z kapsydem zawierającym tylko białko wirusów. Wirusy wytwarza się według konwencjonalnych procedur obejmujących oczyszczanie i określanie zakaźności i trwałości. Selektywnie inaktywujący oligomer etylenoiminy według wynalazku wytwarza się jak opisano powyżej. Określa się wartości pKa etylenoimin w konkretnym roztworze soli i w konkretnej temperaturze. Wirusa
187 759 i wybrany środek inaktywujący wirusa, to jest, oligomer etylenoiminy, miesza się przy konkretnym pH, temperaturze i stężeniu stosując warunki dla każdego z wirusów, jak podano w tabeli 4.
Tabela 4
Czas inaktywacji zakaźności pewnych zwierzęcych wirusów (15-20 rzędów wielkości) pod działaniem tetrameru etylenoiminy w temperaturze 20°C.
Wirus Trwałość traktowania w warunkach Czas inkubacji w godzinach* Stężenie środka
1 mM 15 mM
pH 7,0 pH 8,0 pH 7,2 pH 8,0
Wirus pryszczycy umiarkowana 120 1200
Wirus grupy A umiarkowana 1-50 10-300 0,07-0,2 0,7-2
Wirus zapalenia wątroby A dobra 1-30 10-300 0,15-0,3 1,5-3
Wirus choroby pyska i racic umiarkowana 2-5 20-500 0,15-0,3 1,5-3
ł) zależy od typu i szczepu wirusa, sposobu oczyszczenia wirusa i składu mieszaniny reakcyjnej
Próbki mieszaniny reakcyjnej pobrane w odpowiednich odstępach czasu uzupełniano tiosiarczanem (końcowe stężenie 0,1 M) przez 30 minut w celu zalania nadmiaru środka inaktywującego i mierzy się miano zakaźności mieszaniny reakcyjnej jak opisano powyżej. Czas ti zmniejszania zakaźności wirusów o 20 rzędów wielkości oblicza się stosując równanie opisane powyżej. Na przykład, przy zastosowaniu stałej szybkości inaktywacji około 500 (znanej fachowcowi i opartej na porównaniu długości genomu wirusa zapalenia wątroby A w porównaniu z bakteriofagiem MS2, jak opisano w przykładzie 1), czas inaktywacji, przy założeniu stężenia oligomeru etylenoiminy 10'4 M (dla tetrameru) i stałej szybkości inaktywacji, k=500 (pH 7,5), a log(S/So) jest żądanym stopniem inaktywacji, w tym przypadku co najmniej około 20, to czas zmniejszania zakaźności w tym przykładzie wynosi 30 minut w temperaturze 20°C.
Przykład 4
Rhabdowirusy. Zbadano inaktywację wirusa pryszycy (VSV) zawierającego jednoniciowy RNA wirusa i osłonięty lipidami nukleokapsyd.
VSV hoduje się w ludzkich komórkach A549. Wytworzony zapas EMC to mysie komórki L929 lub ludzkie komórki A459. Procedury kultury i prób są znane fachowcom. Zakaźność VSV bada się w końcowych, 10-krotnych seryjnych rozcieńczeniach w kulturze DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą. Każdego rozcieńczenia używa się do szczepienia ośmiu powtarzanych dołków z ludzkimi komórkami A549 w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania. Cytopatologię indukowaną przez wirusa ocenia po 72 godzinach inkubacji przy 37°C, w 5% CO2. Podane miano wirusa ocenia się stosując znane sposoby.
Związane z komórkami VSV wytwarza się przez inkubację zlewającej się monowarstwy ludzkich komórek A549 z 5 ml 107 IDso/ml VSV w wolnym od surowicy DmEm przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, z 5% CO2 w kolbach do tkankowych kultur o pojemności 150 cm2. Wielokrotność infekcji w tych warunkach wynosi około 2,1 TCIDsc/komórkę. W celu ocenienia inaktywacji dodaje się selektywnie inaktywujący oligomer etylenoiminy do wirusa związanego z komórką w DMEM w 3 ml porcjach w probówkach polistyrenowych. Próbki mieszaniny reakcyjnej pobiera się w skończonych interwałach i uzupełnia tiosiarczanem (końcowe stężenie 0,1 M) przez 30 minut w celu zalania nadmiaru selektywnie inaktywującego środka. Komórki usuwa się przez odwirowanie i określa się miano zakaźności supematanta i ponownie zdyspergowanej grudki. Czas ti zmniejszania zakaźności wirusów o 20 rzędów wielkości oblicza się stosując równanie opisane powyżej.
Oceniono inaktywację pozbawionego komórek VSV dodanego do pełnej krwi (5x109 czerwonych ciałek krwi/ml) w obecności selektywnie inaktywującego oligomeru etylenoiminy.
187 759
Zakaźność wirusa ocenia się jak opisano tutaj. Czas t) zmniejszania zakaźności wirusów o 20 rzędów wielkości oblicza się stosując równanie opisane powyżej. Ocenia się strukturę i działanie czerwonych ciałek krwi.
Przykład 5
OstymiOsywisusy. Ocenia się inaktywację wirusa grypy A z pojedynczą pociętą nicią RNA, łańcuch ujemny, osłonięty lipidami kapsyd wirusa. Wirus wytwarza się według konwencjonalnych procedur obejmujących oczyszczanie i określanie zakaźności i trwałości. Selektywnie inaktywujący oligomer etylenoiminy według wynalazku wytwarza się jak opisano powyżej. Określa się wartości pKa oligomeru etylenyiminy w konkretnym roztworze soli i konkretnej temperaturze. Wirus grypy A i wybrany środek inaktywujący wirusa, to jest oligomer etylenoiminy, miesza się w konkretnym pH, temperaturze i stężeniu stosując warunki dla wirusa jak podano powyżej. Zakaźność wirusa ocenia się jak opisano tutaj. Czas ti zmniejszania zakaźności wirusów o 20 rzędów wielkości oblicza się stosując równanie opisane powyżej.
Przykład 6
Zbadano wirusa ludzkiego braku odporności (dwie kopie jednyniciywegy genomu RNA, często rautowane białka kapsydowe). HIV w postaci wolnej od komórek lub wewnątrzkomórkowej dodaje się do pełnej krwi lub koncentratu czerwonych ciałek w probówce. Dodaje się selektywnie inaktywujący oligomer etylenoiminy i po przetworzeniu próbek HIV dokonuje się pomiaru antygenu. Zakaźność wirusa ocenia się jak opisano tutaj. Czas ti zmniejszania zakaźności wirusów o 20 rzędów wielkości oblicza się stosując równanie opisane powyżej.
Z powyższego opisu można zrozumieć, że selektywnie ^aktywujące oligomery etylenoiminy i sposoby według wynalazku można stosować w celu zdezaktywowania niesionych przez krew wirusów, bakterii lub pasożytów w kompozycjach zawierających komórki lub biopolimer w różnych kontekstach, np., w szpitalu, laboratorium, jako część zestawu. Ponieważ kompozycje komórek także zawierają różne białka, sposób inaktywacji wirusa opisany tutaj nadaje się także do frakcji białek, szczególnie frakcji białek osocza krwi lub oczyszczonych produktów z krwi, w tym, między innymi, frakcji zawierających czynniki skrzepowe (takie jak czynnik VIII i czynnik IX), albuminę surowicy i/lub gammaglobuliny. Wirusową i bakteryjną inaktywację można wykonać przez poddanie frakcji białka lub oczyszczonego białka działaniu selektywnie inaktywującego oligomeru etylenoiminy opisanego tutaj.
Sposób według wynalazku można połączyć z innymi sposobami inaktywacji wirusów. Na przykład, pewne procesy stosowane w wytwarzaniu produktów medycznych (np. chromatografia w buforach przy niskim pH, lub przechowywanie czerwonych ciałek w kwasowych roztworach zawierających środki chelatujące wapń) mogą mieć przypadkowe właściwości maktywacji wirusa dla wybranych, wrażliwych wirusów, zwykle osłoniętych wirusów. Zastosowanie etyleno^in pomoże takim środkom w inaktywacji takich wirusów.
Przykład 7
Niezależność szybkości reakcji od stężenia otaczającego białka
Inaktywację faga MS2 oceniono w nieobecności i obecności białka w stężeniu do 3% (30 mg/ml) w celu ocenienia, czy duże stężenia białka w pożywce znacząco wpłynie na szybkość reakcji z wirusowym genomem. Fag MS2 w zawiesinie w 0,15 M NaCl dodano do równej objętości albuminy ludzkiej surowicy. Trimer lub tetramer yligyetylenyiminy dodano do zawiesin faga do końcowych stężeń 0,4 mM lub 0,2 mM odpowiednio i inZubywany przy pH 7,0, 25°C. Okresowo próbki usuwano i analizowano na resztową zakaźność (miano faga). Obliczone stałe szybkości pokazano w tabeli 5:
Tabela 5
Stałe szybkości ^aktywacji zakaźności faga MS-2 w obecności albuminy ludzkiej surowicy
Inaktywacja trimerem yligyetylehyimihy (0,4 mM) ^aktywacja trimerem yligyetylenyimmy (0,2 mM)
Stężenie albuminy (mg/ml) Stała szybkości (mM^U+błąd standardowy Stężenie albuminy (mg/ml) Stała szybkości (mM'1 hj+błąd standardowy
0 10,8±1,1 0 22,5±4,2
10 9,8±0,3 1 19,9±2,2
20 10,4±0,3 2 18,6±1,8
187 759
Brak wyraźnego wpływu dużych stężeń białek na szybkość inaktywacji wirusa potwierdza znaczny stopień selektywności reakcji etylenoimin z wirusowym genomem i potwierdza, że modyfikację kwasu nukleinowego można osiągnąć w płynach biologicznych lub innych zawierających w dużym stężeniu białko lub inne biopolimery.
Przykład 8
Specyficzność inaktywacji zakaźności faga (modyfikacji kwasu nukleinowego): brak modyfikacji białka przez oligomery etylenoiminy
Inaktywację zakaźności faga MS2 przez monomer etylenoiminy (25 mM), trimer (0,4 mM) i tetramer (0,2 mM) przeprowadzono w obecności 0,9% albuminy ludzkiej surowicy do różnych stopni inaktywacji w 0,02 M buforze fosforanowym, pH 7,0-7,2, w temperaturze 25°C. Po zakończeniu reakcji inaktywacji tiosiarczanem (0,1 M końcowego stężenia), próbki z każdej inkubacji porównano metodą 12,5% redukującej i nieredukującej SDS-PAGE i metodą ogniskowania izoelektrycznego (zakres pH 3 do 7).
Jak pokazano w tabeli 6, zredukowana i niezredukowana SDS-PAGE nie wykryły żadnej różnicy w albuminie po inaktywacji do 80 rzędów wielkości, wskazując na brak znaczniejszego wpływu inaktywacji na rozmiar białka.
Tabela 6
Brak modyfikacji białka przez oligomery etylenoiminy, analiza SDS-PAGE
Inaktywacja monomerem (25 mM) Inaktywacja trimerem (0,4 mM) Inaktywacja tetramerem (0,2 mM)
Stopień inaktywacji (logio) SDS-PAGE Stopień inaktywacji (logu,) SDS-PAGE Stopień inaktywacji (logio) SDS-PAGE
0 linia podstawowa* 0 linia podstawowa* 0 linia podstawowa*
11 brak zmiany** 11 brak zmiany** 11 brak zmiany**
32 brak zmiany** - - - -
41 brak zmiany** 40 brak zmiany** 40 brak zmiany**
83 brak zmiany** 79 brak zmiany** 81 brak zmiany**
*dla zredukowanej i niezredukowanej SDS-PAGE, pasmo główne przy około 68 kDa z około 5 słabymi pasmami o wyższej masie cząsteczkowej.
**brak zmian dla zredukowanej i niezredukowanej SDS-PAGE
Jednakże, jak pokazano w tabeli 7, analiza próbek albuminy metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF) wykazała, że inaktywacja monomerem etylenoiminy, ale nie trimerem lub tetramerem, spowodowała znaczący wzrost niejednorodności ładunku w albuminie, zwiększając jej zasadowość. Wskazuje to, że monomer etylenoiminy zmodyfikował albuminę, zmieniając jej ładunek. Przeciwnie, trimer i tetramer etylenoiminy, przy tym samym stopniu inaktywacji, do 81 rzędów wielkości, nie miał wykrywalnego wpływu na ładunek albuminy. Wskazuje to, że reakcja inaktywacji z oligomerami etylenoiminy jest silnie selektywna wobec kwasu nukleinowego, podczas gdy inaktywacja monomerem etylenoiminy w tych samych warunkach modyfikuje białka, jak też kwasy nukleinowe.
Tabela 7
Brak modyfikacji białka przez oligomery etylenoiminy, analiza ogniskowania izoelektrycznego
Inaktywacja monomerem (25 mM) Inaktywacja trimerem (0,4 mM) Inaktywacja tetramerem (0,2 mM)
Stopień inaktywacji (logio) wzór IEF Stopień inaktywacji (logio) wzórIEF Stopień inaktywacji (logio) wzór IEF
1 2 3 4 5 6
0 linia podstawowa* 0 linia podstawowa* 0 linia podstawowa*
187 759 cd. tabeli 7
1 2 3 4 5 6
11 poszerzone pasmo** 11 brak zmiany** 11 brak zmiany**
32 poszerzone pasmo** - - - -
41 poszerzone pasmo** 40 brak zmiany** 40 brak zmiany**
83 poszerzone pasmo** 79 brak zmiany** 81 brak zmiany**
*Pojedyncze główne pasmo przy pI około 5,5, **Poszerzone i rozmyte główne pasmo, głównie w kierunku zwiększonego dodatniego ładunku (bardziej zasadowe).
Przykład 9
Inaktywacja osłoniętego wirusa zwierzęcego W celu wykazania inaktywacji osłoniętego wirusa zwierzęcego, wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni („VE”) inkubowano z trimerem etylenoiminy (2 mM) lub tetramerem (0,5 mM) przez do 24 godzin w temperaturze 22 lub 37°C w 0,02 M buforze fosforanowym zawierającym 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Próbki periodycznie usuwano z mieszaniny inkubacyjnej i miareczkowano na resztowe stężenie wirusa. Stałe szybkości inaktywacji określano z danych przez pierwsze 7 godzin. Wyniki pokazano w tabeli 8 poniżej:
Tabela 8
Stałe szybkości inaktywacji wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni przez oligomery etylenoiminy
Temperatura (°C) Stała szybkości inaktywacji przez trimer etylenoiminy (mM''h'’) Stała szybkości inaktywacji przez tetramer etylenoiminy (mM^h1)
25 0,33 1,64
37 1,25 3,40
Przykład 10
Zachowanie antygenowych epitopów podczas inaktywacji osłoniętego wirusa zwierzęcego
W celu wykazania zachowania antygenowych epitopów podczas inaktywacji oligomerami etylenoiminy, wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni inaktywowano przez do 7 godzin trimerem etylenoiminy, 2 mM w temperaturze 37°C. Antygenność wirusa po 3 i 7 godzinach inaktywacji zbadano w próbie ELISA stosując trzy różne monoklonalne przeciwciała. Miana punktu końcowego określano i porównano z mianami wirusa przed inaktywacją. Stosowanymi monoklonalnymi przeciwciałami były 1A1B-9, 7A1A-1 i 7A3A-4. Przeciwciało 1A1B-9 rozpoznaje właściwy dla typu antygen, podczas gdy przeciwciała 7A1A-1 i 7A3A-4 rozpoznają utajony epitop, który jest prezentowany po rozwinięciu wirusowego antygenu kapsydu.
Jak pokazano w tabeli 9, nie wykryto żadnej zmiany w antygennej reaktywności po inaktywacji o ponad 8 rzędów wielkości (trzy godziny inaktywacji) lub po szacowanej o 18,7 rzędów wielkości (siedem godzin inaktywacji).
Tabela 9
Zachowanie antygenowych epitopów podczas inaktywacji wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni trymerem etylenoiminy (2 Mm)
Czas inkubacji (godziny)
0 3 7
Miano wirusa 2x108 0 0
Punkt końcowy, przeciwciało 1A1B-9 10’5 10-5 10'5
Punkt końcowy, przeciwciało 7A1A-1 10-3 10-3 10-3
Punkt końcowy, przeciwciało 7A3A-4 10-2 10-2 10-2
187 759
Przykład 11
Kinetyka inaktywacji faga MS2 solami bromkowymi oligomerów etylenoiminy W celu ocenienia kinetyki inaktywacji faga MS2 solami bromkowymi oligomerów etylenoiminy, faga inkubowano w temperaturze 25°C przez różne okresy do 24 godzin w jednym z kilku buforów przy pH 7,0 wraz z trimerem etylenoiminy, tetramerem etylenoiminy, bromowodorkiem trimeru etylenoiminy (tribromohydratem β-bromoetylo-dietylenotriaminy) lub bromowodorkiem tetrameru etylenoiminy (tetrabromohydratem β-bromoetylotrietylenotetraminy). Próbki periodycznie usuwano w celu ocenienia resztowej zakaźności i określano stałe szybkości inaktywacji zakaźności. Wyniki pokazane w tabeli 10 wskazują, że fag MS2 był inaktywowany przy inkubacji z solami bromkowymi przez konwersję w odpowiedni trimer lub tetramer etylenoiminy. Nieco mniejsza szybkość inaktywacji dla soli bromkowych w porównaniu z inaktywacją w obecności odpowiednich oligomerów etylenoiminy wskazuje, że konwersja wynosiła tylko około 30-40%. Niemniej zastosowanie soli chlorowców może być korzystne dzięki ich większej stabilności i dogodności. Dane ilustrują także, że anion fosforanowy inhibituje reakcję, zapewne z powodu jego dużego ładunku ujemnego zakłócającego oddziaływanie oligomerów etylenoiminy z kwasem nukleinowym.
Tabela 10
Stałe szybkości inaktywacji faga MS2 trimerem i tetramerem etylenoiminy i odpowiednimi solami bromkowymi
Bufor Stała szybkości (mM^h4)
Trimer etylenoiminy Tetramer etylenoiminy Tribromohydrat β-bromoetylodietylenotriaminy Tetrabromohydrat β-bromoetylotrietylenotetraminy
A 7,4±0,6 - - -
B 7,6±0,8 18,2±1,6 3,0±0,4 6,3±0,9
C 5,1±0,8 8,7±0,9 - -
D 0,26±0,03 0,32±0,04 0,17±0,02 0,29±0,04
A: 0,15 M NaCl
B: 0,075 M NaCl, 0,2 M MOPS
C: 0,1 M NaCl, 0,025 M fosforanu
D: 0,075 M NaCl, 0,2 M fosforanu
Chociaż opis dotyczy wirusów, należy rozumieć, że sposoby według niniejszego wynalazku są ogólnie także przydatne w celu zdezaktywowania wszelkich biologicznych zanieczyszczeń znajdowanych w przechowywanej krwi lub produktach krwiopochodnych, w tym bakterii i niesionych przez krew pasożytów.
Chociaż wynalazek opisano szczegółowo dla celów przejrzystości, będzie oczywiste, że pewnych modyfikacji można dokonać pozostając w zakresie załączonych zastrzeżeń.
Wszystkie publikacje i dokumenty patentowe cytowane w tym opisie są dołączane jako odnośniki w całości dla wszystkich celów tak, jak gdyby każda indywidualna publikacja i dokument patentowy był tak opisany indywidualnie.
II
III
IV
CH
2\
CH
CHCHCH
CH
NH
187 759 . N-CH->-CK->-NH2\ /
N-CK2-CH2-NH-CK2-CK2-NH2 2\
CH
ć\ n-ch2
-ch2-nh-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-nh2
CHCH
N-CH, / l
-ch2-n ch2-ch2-nh ck2 _ch2 -nk
FIG. 1
187 759
ι
Zużyci©
(moli na mol zwitku)
HC1
F/G. 2.
Czas traktowania (MIN)
120 240
F/G. 3.
187 759
Przeżywalność (LOG
FIG. 4.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (22)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów w kompozycji biologicznej zawierającej biopolimery przez selektywną modyfikację cząsteczek kwasu nukleinowego w tej kompozycji zawierającej biopolimery, znamienny tym, że kontaktuje się kompozycję zawierającą biopolimer z roztworem oligomeru etylenoiminy o odpowiednim pH i sile jonowej, przy czym biopolimery w tej kompozycji zachowują całą aktywność na poziomie inaktywacji.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biopolimery wybrane są z grupy zawierającej białka, węglowodany i lipidy.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że biologiczna kompozycja obejmuje jedno lub więcej białek wybranych z grupy obejmującej fibrynogen, czynnik VII, czynnik VIII, czynnik IX, czynnik X, immunoglobiny, prealbuminy, białko wiążące retinol, albuminę, alfaglobuliny, gamma-globuliny, składniki uzupełniające, fibronektynę, antytrombinę III, hemoglobinę, interferon, czynniki wzrostu, aktywator plazminogenu, hormon wzrostu, insulinę i erytropoetynę.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biologiczną kompozycję wybiera się z grupy obejmującej pełną krew ssaka, oczyszczone lub częściowo oczyszczone białka krwi, białka komórek krwi, mleko, ślinę, osocze krwi, osocze bogate w płytki, koncentrat osocza, osad z dowolnego frakcjonowania takiego osocza, supematant z dowolnego frakcjonowania osocza, surowicę, krioprecypitat, kriosupematant, lizat komórkowy, hodowle komórek ssaczych, ekstrakty łożyskowe, produkty fermentacji i białka indukowane w komórkach krwi.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biologiczną kompozycję stanowią komórki ssacze i nie-ssacze.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biologiczna kompozycja jest wybrana z grupy: koncentrat leukocytów, koncentraty czerwonych komórek krwi i/lub koncentraty płytek krwi.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmy wybiera się z grupy wolnych od komórek postaci wirusów, wirusów przenoszonych przez krew i bakterii i pasożytów.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wirusy wybiera się z grupy wirusów z otoczką i wirusów bez otoczki.
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmy wybiera się z grupy wirusów zawartych w komórkach, wirusów przenoszonych przez krew, bakterii i pasożytów.
  10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus wybiera się z grupy obejmującej wirusy ospy, wirusy opryszczki, adenowirusy, wirusy papowa, parwowirusy, reowirusy, orbiwirusy, rotawirusy, alfawirusy, rubiwirusy, flawiwirusy, koronawirusy, paramiksowirusy, morbilliwirusy, pneumowirusy, wesikulowirusy, lissawirusy, pikomawirusy, ortomiksowirusy, wirusy bunya, flebowirusy, nairowirusy, hepadnawirusy, arenawirusy, retrowirusy, enterowirusy, rynowirusy i filowirusy.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oligomer etylenoiminy stosuje się dimer etylenoiminy.
  12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oligomer etylenoiminy stosuje się podstawiony oligomer etylenoiminy.
  13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podstawiony oligomer etylenoiminy posiada wzór ogólny P-Hal-(CH2-CH2 -NH)nH gdzie Hal oznacza atom chlorowca, a n oznacza liczbę od 2 do 10.
  14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie kontaktowania inkubuje się biologiczną kompozycję z około 0,0001 M do około 0,015 M oligomerem etylenoiminy; przy pH około 6,5 do około 8,5; w roztworze o sile jonowej od około 0,1 M do około 0,2 M w temperaturze około 15°C do około 30°C przez około 1 godzinę do około 500 godzin.
    187 759
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że inkubuje się kompozycję z około 0,007 M oligomerem etylenoiminy; przy pH około 7,0 do około 8,0; w roztworze o sile jonowej około 0,15 M.
  16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oligomer etylenoiminy stosuje się trimer etylenoiminy.
  17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oligomer etylenoiminy stosuje się tetramer etylenoiminy.
  18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycja biologiczna jest odpowiednia do zastosowania terapeutycznego po selektywnej inaktywacji mikroorganizmów.
  19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że kompozycja biologiczna jest wybrana z grupy obejmującej pełną krew ssaka, koncentrat leukocytów, koncentrat krwinek czerwonych i koncentrat płytek krwi.
  20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że oligomer etylenoiminy jest wybrany z grupy obejmującej dimer etylenoiminy, trimer etylenoiminy i tetramer etylenoiminy.
  21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wspomniany oligomer etylenoiminy jest dimerem etylenoiminy.
  22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniana kompozycja biologiczna jest koncentratem krwinek czerwonych.
PL96325338A 1995-08-29 1996-08-29 Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów PL187759B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/521,245 US6114108A (en) 1995-08-29 1995-08-29 Methods and compositions for the selective modification of viral nucleic acids
PCT/US1996/014040 WO1997007674A1 (en) 1995-08-29 1996-08-29 Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL325338A1 PL325338A1 (en) 1998-07-20
PL187759B1 true PL187759B1 (pl) 2004-10-29

Family

ID=24075988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325338A PL187759B1 (pl) 1995-08-29 1996-08-29 Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6114108A (pl)
EP (2) EP1129728B1 (pl)
JP (2) JP2001520635A (pl)
KR (1) KR100486765B1 (pl)
AT (2) ATE217144T1 (pl)
AU (1) AU694892B2 (pl)
BR (1) BR9610306A (pl)
CA (1) CA2230671A1 (pl)
DE (2) DE69635871T2 (pl)
DK (1) DK0915648T3 (pl)
ES (1) ES2173314T3 (pl)
HK (1) HK1042254A1 (pl)
IL (1) IL123467A0 (pl)
NO (1) NO980881L (pl)
NZ (1) NZ316787A (pl)
PL (1) PL187759B1 (pl)
PT (1) PT915648E (pl)
WO (1) WO1997007674A1 (pl)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691132A (en) 1994-11-14 1997-11-25 Cerus Corporation Method for inactivating pathogens in red cell compositions using quinacrine mustard
US6177441B1 (en) 1995-06-05 2001-01-23 Cerus Corporation Treating red blood cell solutions with anti-viral agents
US6136586A (en) * 1995-08-29 2000-10-24 Vi Technologies, Inc. Methods for the selective modification of viral nucleic acids
US20040048235A1 (en) * 1995-08-29 2004-03-11 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
US20040053208A1 (en) * 1995-08-29 2004-03-18 V. I. TECHNOLOGIES, Inc. Methods to selectively inactivate parasites in biological compositions
DE19633684A1 (de) * 1996-08-12 1998-02-19 Dirk Dipl Ing Vollenbroich Verfahren zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren
US6093725A (en) * 1997-01-06 2000-07-25 Cerus Corporation Frangible compounds for pathogen inactivation
US6514987B1 (en) 1997-01-06 2003-02-04 Cerus Corporation Frangible compounds for pathogen inactivation
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6093564A (en) * 1997-10-03 2000-07-25 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
US6352695B1 (en) * 1997-10-03 2002-03-05 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
DE69826521T2 (de) 1998-01-06 2005-09-29 Cerus Corp., Concord Verfahren zum quenchen von pathogen-inaktivatoren in biologischen materialien
US6369048B1 (en) * 1998-01-12 2002-04-09 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for inactivating viruses
AU4435399A (en) 1998-06-11 1999-12-30 Cerus Corporation Inhibiting proliferation of arterial smooth muscle cells
DE19827750C1 (de) * 1998-06-22 1999-07-29 Centeon Pharma Gmbh Verfahren zum Abtrennen von HIV aus einer Flüssigkeit
US6099734A (en) * 1998-07-08 2000-08-08 Baxter International Inc. Apparatus, membranes and methods for removing organic compounds from a biological fluid
US6908553B1 (en) 1998-07-08 2005-06-21 Baxter International Inc. Composite membrane with particulate matter substantially immobilized therein
DE19836559A1 (de) 1998-08-12 2000-03-23 Antigen Gmbh Gefäß zur Entnahme von Blut
US6403359B1 (en) 1998-09-25 2002-06-11 V. I. TECHNOLOGIES, Inc. Solid phase quenching systems
US6617100B2 (en) * 1998-09-25 2003-09-09 V.I. Technologies, Inc. Solid phase quenching systems
CA2345230A1 (en) * 1998-09-25 2000-04-06 V.I. Technologies, Inc. Methods to selectively inactivate viruses in biological compositions
US6150109A (en) 1999-01-25 2000-11-21 V. I. TECHNOLOGIES, Inc. Lipophilic quenching of viral inactivating agents
US9044523B2 (en) 2000-06-15 2015-06-02 Terumo Bct, Inc. Reduction of contaminants in blood and blood products using photosensitizers and peak wavelengths of light
WO2002055095A2 (en) * 2000-11-06 2002-07-18 Vi Technologies Inc Use of aziridino-compounds in the treatment of immune dysfunctions
US6602718B1 (en) 2000-11-08 2003-08-05 Becton, Dickinson And Company Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
US20020131958A1 (en) * 2001-01-22 2002-09-19 John Chapman Method for purifying a biological composition
US6635679B2 (en) * 2001-05-14 2003-10-21 Akzo Nobel N.V. Methods and compositions for inactivating viruses
US20030127603A1 (en) * 2001-05-15 2003-07-10 Bernard Horowitz Apparatus for the inactivation of pathogens in protein-containing fluids and uses thereof
JP2005517023A (ja) * 2001-11-06 2005-06-09 ヴイ．アイ．テクノロジーズ，インコーポレーテッド アジリジン化合物の治療的使用
EP1459724B1 (en) 2001-12-28 2013-11-20 Terumo Kabushiki Kaisha Blood bag system and method of inactivating pathogenic microorganisms
US20050074743A1 (en) * 2003-10-06 2005-04-07 Purmal Andrei A. Method and composition for treating a biological sample
EP1838355B1 (en) 2004-10-29 2013-08-14 Cerus Corporation Improved quenching methods for red blood cell inactivation process
BRPI0911176B8 (pt) 2008-04-09 2021-05-25 Cerus Corp método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea, composição de célula vermelha sanguínea, e método de reduzir a desidratação em uma composição de célula vermelha sanguínea
BR112014029515A2 (pt) 2012-06-01 2017-07-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh vacina de vírus schmallenberg (sbv), métodos de produção e usos da mesma, virus schmallenberg, usos de seus antígenos e composição de matéria
US11473055B2 (en) 2015-11-01 2022-10-18 Glycobac, Llc Virus-free cell lines and methods for obtaining same
CA3022602A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 Najit Technologies, Inc. Inorganic polyatomic oxyanions for protecting against antigenic damage during pathogen inactivation for vaccine production
KR102198877B1 (ko) 2019-07-16 2021-01-05 정소영 블루 라이트 차단 필터
CN113322252A (zh) * 2020-12-28 2021-08-31 广州凯普医药科技有限公司 一种拭子样本保存液

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3492289A (en) * 1966-06-13 1970-01-27 Dow Chemical Co Polymers of alkylenimines
US4036952A (en) * 1973-02-24 1977-07-19 Bayer Aktiengesellschaft Ethyleneimine inactivated microorganisms
US4058599A (en) * 1973-02-24 1977-11-15 Bayer Aktiengesellschaft Ethyleneimine inactivated organisms
RU594771C (ru) * 1973-05-07 1993-07-07 Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт Средство дл инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов
US4841023A (en) * 1986-06-25 1989-06-20 New York Blood Center, Inc. Inactivation of viruses in labile protein-containing compositions using fatty acids
US5000951A (en) * 1987-03-09 1991-03-19 Diamond Scientific Company Multivalent canine distemper virus vaccine
US5055485A (en) * 1988-12-02 1991-10-08 New York Blood Center, Inc. Inactivation of viruses in cell- and protein-containing compositions using aryl diol epoxides
RU1768636C (ru) * 1989-08-16 1992-10-15 Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Способ получени антигена вируса болезни Гамборо
US5232844A (en) * 1990-05-15 1993-08-03 New York Blood Center Photodynamic inactivation of viruses in cell-containing compositions
US5120649A (en) * 1990-05-15 1992-06-09 New York Blood Center, Inc. Photodynamic inactivation of viruses in blood cell-containing compositions
US5565205A (en) * 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
JPH05502183A (ja) * 1990-09-04 1993-04-22 シャンブロム，エドワード 血液、組織および生物体液の保存
GB9108682D0 (en) * 1991-04-23 1991-06-12 Wellcome Found Production of vaccines
FR2679253B1 (fr) * 1991-07-15 1994-09-02 Pasteur Institut Proteines de resistance a la cycloheximide. utilisation comme marqueur de selection par exemple pour controler le transfert d'acides nucleiques.
EP0612532A3 (en) * 1993-02-26 1998-02-04 Solvay Animal Health, Inc. Canine coronavirus vaccine from feline enteric coronavirus
EP0773716A4 (en) * 1995-06-07 1999-08-04 Cerus Corp TREATMENT OF RED BLOOD CELL SOLUTIONS WITH ANTIVRAL ACTIVE SUBSTANCES

Also Published As

Publication number Publication date
BR9610306A (pt) 1999-07-06
JP2003176238A (ja) 2003-06-24
WO1997007674A1 (en) 1997-03-06
IL123467A0 (en) 1998-09-24
EP0915648B1 (en) 2002-05-08
DK0915648T3 (da) 2002-08-26
EP0915648A4 (pl) 1999-05-19
NZ316787A (en) 1999-11-29
KR19990044303A (ko) 1999-06-25
US6114108A (en) 2000-09-05
ATE319483T1 (de) 2006-03-15
EP0915648A1 (en) 1999-05-19
AU694892B2 (en) 1998-07-30
PT915648E (pt) 2002-09-30
JP2001520635A (ja) 2001-10-30
ATE217144T1 (de) 2002-05-15
AU6909996A (en) 1997-03-19
NO980881D0 (no) 1998-02-27
DE69621161T2 (de) 2002-11-21
HK1042254A1 (zh) 2002-08-09
DE69621161D1 (de) 2002-06-13
KR100486765B1 (ko) 2005-09-02
EP1129728A1 (en) 2001-09-05
EP1129728B1 (en) 2006-03-08
PL325338A1 (en) 1998-07-20
NO980881L (no) 1998-04-27
DE69635871D1 (de) 2006-05-04
CA2230671A1 (en) 1997-03-06
DE69635871T2 (de) 2007-05-24
ES2173314T3 (es) 2002-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL187759B1 (pl) Sposób selektywnej inaktywacji mikroorganizmów
AU750540B2 (en) Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
US6617157B1 (en) Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
AU741679B2 (en) Method for inactivating a virus
US5981163A (en) Process for the sterilization of biological compositions using irradiation and quenchers of type I and type II photodynamic reactions
US5712086A (en) Process for transfusing cell containing fractions sterilized with radiation and a quencher of type I and type II photodynamic reactions
US6548242B2 (en) Process for the sterilization of biological compositions and the product thereby
EP0702719B1 (en) Process for the sterilization of biological compositions and the product produced thereby
Weissenbacher et al. Cross-protection in nonhuman primates against Argentine hemorrhagic fever
US6352695B1 (en) Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
US20040048235A1 (en) Methods and compositions for the selective modification of nucleic acids
Kohase et al. Interferon induction with Newcastle disease virus in FS-4 cells: effect of priming with interferon and of virus inactivating treatments
Yamamura et al. Effect of diethylpyrocarbonate on the antiviral and interferon-inducing activities of viral and nonviral agents
CN117882727A (zh) 一种病毒灭活剂及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20050829