KR100486765B1 - 핵산의 선택적 변형방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물을 삼량체 또는 사량체의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시킴으로써 단백질 또는 기타의 생체고분자물질의 현저한 변형 없이 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물 내의 바이러스 및 기타의 유기체들을 불활성화하는 방법 및 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 생-유기화학(bio-organic chemistry), 분자생물학, 생화학, 면역학, 및 바이러스학 및 의학 및 수의학 분야에 관련된 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 사람 혈액, 혈구(blood cell) 성분들, 혈장 및 혈액으로부터 정제된 혈장 생체고분자물질(biopolymer)[알부민, 응고 인자(clotting factors), 면역글로불린, 피브리노겐 등], 우태아혈청 및 돼지 트립신과 같은 세포배양 성분들, 정상 세포 또는 암세포로부터 생성된(예컨대, 재조합 DNA 기술에 의해) 비-혈액 제품들과 같은 조성물 내에 포함된 핵산을 각각이 감염성 바이러스 오염균을 포함하지 않고 치료 또는 진단용으로 적합하게 되도록 선택적으로 화학변형시키는 방법 및 조성물에 관계한다. 특히 본 발명은 사균백신(killed vaccines)의 조제와 다른 의학 제품 내의 바이러스, 세균 및 세포 게놈을 불활성화하는 방법에도 관계한다.
혈액 또는 혈액 제품에 의한 바이러스 질병(예컨대, A 및 B형 간염, 후천성 면역결핍증후군(HIV), 사이토메갈로바이러스 감염)의 전염은 의학계의 심각한 문제이다. 공여자 선정 기준 및 공여자 혈액의 바이러스 마커에 대한 선별검사가 수혜자에게 바이러스가 전염되는 것을 감소시킬 수는 있지만, 선별검사법은 불완전하거나 감도(sensitivity)가 100% 미만이고, 기껏해야 소수의 상이한 바이러스들에 대해서만 검사되는데, 이러한 경우조차도 그들의 감도는 불충분하다. 적혈구, 혈소판, 백혈구, 및 단백질, 다당류 등과 같은 혈장 생체고분자물질과 같은 일례의 유용한 성분들의 구조 및 기능은 변형시키지 않고 공여자 혈액 또는 혈액 제품에 포함된 임의의 바이러스들을 불활성화하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 포유동물 세포주 및 하이브리도마 세포주, 세포주의 생성물, 우유, 초유 및 정자와 같은 다른 생물학적 조성물들도 감염성 바이러스를 포함할 수 있어, 이들 조성물들의 유용한 성분들 또는 생성물들은 그대로 보존하면서 상기 바이러스(들)을 불활성화하는 것이 유익할 것이다. 끝으로, 자주 혈액 또는 혈액 제품, 또는 포유동물 세포제품들이 감염성 바이러스를 포함하는지 여부를 알 수 없는 경우가 있다. 이 경우에는, 이러한 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물을 그 안에 존재하는 임의의 감염성 바이러스를 불활성화하도록 처리하는 조성물 및 방법이 있다면 매우 유익할 것이다.
사람용 또는 수의학 용도의 가장 안전하고 효과적인 사균백신의 제조는 바이러스 및 세균과 같은 살아 있는 미생물들을 완전하고도 신뢰성 있게 비감염성("불활성화된")으로 만들면서도 그들의 면역원성에는 최소한의 영향을 미치는 방법을 필요로 한다. 바이러스 백신 제조에 유용한 방법들과 같은, 바이러스의 불활성화에 일반적으로 이용되는 방법들은, 대개 세포, 단백질, 및 기타의 항원들의 기능 및 구조를 변형시키거나 파괴한다.
포르말린, 베타-프로피오락톤, 및 자외선 조사의 이용을 포함하는 현재의 불활성화 방법들은 기본적인 화학적 또는 구조적 원리에 거의 기초하지 않고 실험적으로 개발되었던 것이다. 에틸렌이민 단량체들은 구제역(foot-and-mouth) 바이러스를 불활성화하는데 이용되었다(러시아 특허 SU 1915956). 에틸렌이민 단량체들은 또한 마이코플라스마(Mycoplasma) 및 아콜레플라스마(Acholeplasma) (국제공개 92/18161) 및 조류 감염(루마니아 특허 RO 101400)을 불활성화하는데 이용되었다. 2성분(binary) 에틸렌이민은 고양이 장 코로나바이러스. FECV(feline enteric coronavirus)의 불활성화에 이용되었다 (유럽특허 94200383). 폴리에틸렌이민은 식물바이러스 억제제로 이용되었다(일본특허 7882735). 전술한 방법들 및 화합물들은 바이러스 및 세균과 같은 미생물들을 비특이적으로 변형시키기 때문에, 표준화 및 반복재현적인 적용이 곤란하다. 일반적으로, 바이러스 캡시드 단백질과 같은 예의 중요한 표면 항원 결정부위를 포함하는 미생물의 여러 가지 성분들은 현재 이용되고 있는 불활성화제에 의해 영향을 받는데, 이러한 약제들은 핵산뿐만 아니라 단백질, 탄수화물 및 지질과 같은 생체고분자물질을 변형시키고 그들의 기능을 손상시킨다. 변형된 항원들 또는 보호 에피톱의 불활성화는 면역원성을 감소시켜 효능을 저하시키거나(예컨대, 불활성화된 소아마비 백신), 항원성을 변화시켜 질병의 예방 대신에 질병의 면역반응항진을 초래할 수 있다(예컨대, 포르말린 불활성화에 의해 생산된 호흡기합포체바이러스(respiratory syncytial virus) 및 불활성화된 홍역 백신). 다른 하나의 예는 B형 간염 백신 제제인데, 이러한 제제에서는 제제를 80℃를 초과하는 온도로 가열하고 포름알데하이드로 처리하는 것이 일반적이다. 이러한 처리는 바이러스 감염력을 불활성화할 뿐만 아니라 단백질 및 기타의 항원들을 파괴시킨다. 안정제로 백신에 첨가된 담체 물질(carrier substances)들도 베타-프로피오락톤에 의해 불활성화된 광견병 백신 내의 사람 혈청 알부민에서 일어나는 것과 같이 우연히 변형되어, 알러지 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 미생물을 비감염성으로 만드는 화학적 변형을 모르면 상기 방법을 반복재현적으로 적용하기 어렵게 된다. 부적절한 불활성화 또는 불활성화에 이은 회복에 의한 질병의 주기적인 발증(periodic outbreaks)이 결과된다. 이러한 문제 때문에 마비성회백수염, 구제역 및 베네수엘라 말 뇌염의 발증이 일어난다.
따라서 현재 이용 가능한 불활성화된 바이러스 백신의 제조에 이용되는 약제들은 적어도 바이러스 게놈의 불활성화에 이용된 조건하에서, 바이러스 입자들의 항원 특성은 보존한 채로 감염성 바이러스를 안전하게 불활성화할 만큼 충분히 선택적이지 못하다.
또 다른 문제점은 혈액 또는 기타의 생물학적 유체(biological fluid)들을 오염시키는 바이러스들이 완전한 바이러스, 바이러스 DNA 단편 또는 숙주 게놈 내에 도입된 바이러스 핵산의 형태로 세포내에 포함된다는 것이다. 예를 들어, HIV 바이러스는 백혈구 내에 포함된다. 세포들의 구조적 완전성은 보존한 채로 세포-유리(cell-free) 및 세포-포함(cell-contained) 형태의 바이러스들을 불활성화할 수 있는 것이 최대의 관심사이다.
혈장 내의 단백질, 탄수화물, 및 당단백질과 같은 유용한 생체고분자물질들의 공존 때문에, 생물학적 혼합물 내의 바이러스의 불활성화의 문제는 바이러스만의 불활성화의 문제와 다르다. 포름알데하이드 또는 산화제와 같은 약제에 의해 B 형 간염 바이러스를 불활성화시키는 것은 가능하지만, 이들 불활성 약제들은 대부분 혈장 또는 혈액의 세포 성분 중의 생체고분자물질의 생물학적 활성을 손상시키기 때문에 이들 방법들은 혈액 중에 있는 바이러스들을 불활성화시키는데는 적합하지 않다. 자외선 광의 이용은 혈소판 농축물 내의 바이러스들을 불활성화하는 것으로 입증되었다. 그러나, 고강도에서는 심각한 혈소판 손상이 초래되었다. 베타-프로피오락톤은 유사한 속도로 핵산 및 단백질과 반응한다; 따라서, 바이러스가 불활성화됨과 동시에 혈장의 인자 Ⅷ 성분의 반 이상이 소실된다.
비-혈액 출처(non-blood sources)로부터 유용한 생체고분자물질을 수득하는 경우에도 문제들은 여전히 존재하는데, 이는 병원성 바이러스들이 이러한 조성물들도 오염시킬 수 있기 때문이다. 이러한 출처들은 포유동물 초유 및 우유, 복수, 혈청, 타액, 태반 추출물, 예컨대, 형질전환된 세포들을 포함하는 조직배양 세포주 및 이들의 추출물들, 및 발효생성물을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 목적은 다른 유용한 생물학적 거대분자들 및 세포의 존재하에서 핵산을 선택적으로 변형시킬 수 있는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 따라, 핵산 이외의 성분들의 구조 및 기능을 보존한 채로 바이러스, 다른 미생물 및 세포들의 핵산이 선택적으로 화학 변형된다. 본 발명의 다른 목적은 바이러스, 다른 미생물 및 세포들의 면역원성을 보존하고 최대의 반복재현성을 달성하면서 이들을 불활성화하는 선택적 불활성화제를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 효과적인 바이러스 사균백신을 제조하는 것이다.
[발명의 요약]
이제 에틸렌이민 올리고머 불활성화제가 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물과 같은 생물학적 조성물 내의 오염 바이러스들을 효과적으로 그리고 선택적으로 불활성화할 수 있다는 사실이 발견되었다. 본 발명은 혼합된 생체고분자물질의 조성물을 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 조성물 내에 존재하는 바이러스 또는 다른 미생물들의 핵산 분자를 선택적으로 변형시키는 방법을 제공한다.
대부분의 현재 이용 가능한 바이러스 불활성화제들은 혈액 단백질 인자 Ⅷ과 같은 생체고분자물질들을 변형시켜 생물학적으로 불활성화하는 반면에, 본 발명의 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 불활성화 조건하에서 이러한 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 혈구 단백질, 혈장, 혈장 분별 침강물, 혈장 분별 상청액, 저온형침강물(cryoprecipitate), 저온형상청액(cryosupernatant), 또는 이들의 일부분 또는 유도체 또는 혈청 또는 정상 세포 또는 형질전환 세포로부터 생성된(예컨대, 재조합 DNA 기술을 통해) 비-혈액 제품과 같은 생체고분자물질-함유 조성물이 충분한 기간동안 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉될때, 상기 조성물 내에 포함된 단백질과 같은 생체고분자물질의 현저한 손상 없이, 상기 조성물 내의 바이러스들이 바람직한 정도(바이러스 불활성화 측정시, 적어도 약 6 로그(6.0 log10) 또는 계산시 적어도 약 20 로그)로 불활성화된다는 사실이 발견되었다. 혈액 단백질 혼합물 또는 농축물을 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시킴으로써, A형 및 B형 간염 바이러스 또는 HIV와 같은 바이러스가 바람직한 정도로, 예컨대, 적어도 약 6 로그를 초과하는 측정가능한 불활성화 정도로 또는 계산에 의할 때 적어도 약 20 자리(orders of magnitude)정도 불활성화될 수 있다. 처리된 조성물 내의 단백질, 탄수화물 및 지질과 같은 생체고분자물질들은 그들의 모든 활성을 불활성화 이전 수준과 동일한 수준으로 그대로 보유한다.
본 발명의 불활성화제 및 불활성화 방법은 양적으로 불활성화 이전에 존재하는 단백질의 활성은 그대로 보유하면서도 감염성 바이러스는 포함하지 않는, 혈구유도체(예컨대, 헤모글로빈, 알파 인터페론, 사람성장호르몬, 에리트로포이에틴, PDGF, tPA 등), 혈장 혈장 분획, 혈장 침강물(예컨대, 저온형침강물, 에탄을 상청액 또는 폴리에틸렌글리콜 상청액)과 같은 예의 생체고분자물질-함유 조성물들을 제공한다. 이들 조성물들은 조성물 내의 바이러스의 양은 감염력 적정(infectivity titration)에 의해 측정된다.
본 발명의 방법은 혈장, 혈장 분획, 혈장 농축물 또는 이들의 성분들의 관점에서 기술되었다. 그러나, 상기 방법은 용해물(lysates) 또는 세포들에 의해 분비된 단백질들의 처리에도 유용하다. 또한, 혈소판, 백혈구, 적혈구, 섬유아세포로 부터 유래된 분획들의 처리도 예상되며, 인터페론, 성장호르몬, tPA, 인자 Ⅷ, 전이인자(transfer factor), 헤모글로빈, 성장인자들, EPO, 및 DNAse의 용액들도 포함된다.
본 발명의 불활성화제 및 방법을 이용하여, 사람들은 새로운 냉동된 혈장, 해동된 냉동 혈장, 저온형침강물, 저온형상청액, 또는 냉동된 혈장의 농축물 및 이들의 희석 제품들을 처리할 수 있다는 것도 예상된다.
본원에 기술된 것과 동일한 방법에 의해, 정상 또는 형질전환된 세포의 제품내에 존재하는 바이러스는 그 제품내의 생체고분자물질 활성은 보존한 채로 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 에틸렌이민 올리고머 불활성화제를 이용하여, 사람들은 정상 또는 형질전환된 세포를 이용하여 제조된 제품, 정상 또는 형질전환된 세포의 삼출액, 하이브리도마 및 유전공학에 의해 생성된 제품을 불활성화할 수 있다. 이러한 처리는 실질상 특정 단백질과 같은 바람직한 생체고분자물질에 해로운 영향을 미치지 않는다. 목적 단백질의 생산에 이용되는 세포들은 당연히 포유동물 세포는 물론 비-포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물들은 실질상 시료 내에 포함된 모든 바이러스들을 불활성화한다. 감염력 레벨(infectivity level)을 측정하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예컨대, Lennette, E.H. 및 Schmidt, N.J. (eds) (1985) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 62nd ed, American Publisher's Assn., Washington, D.C. 참조. 본 발명에 따라, 적어도 "6 로그" (6.0 log10) 정도의 실험적으로 측정 가능한 바이러스의 불활성화가 달성된다. 즉. 바이러스가 비처리 조성물 내에 희석 후라도 106 바이러스 감염력의 역가로 검출될 수 있는 농도로 존재하는 경우에, 처리된 시료에서는, 바이러스가 감염력 연구에서 측정된 정도로 완전히 불활성화되어, 처리 후에는 희석되지 않은 재료 내에서 바이러스가 발견되지 않는다, 더욱 중요하게, 본원에 기술된 불활성화 방법의 정확한 동력학적 설명(Kinetic description)을 가지고, 사람들은 적어도 약 20 자리의 바이러스-함유 조성물의 감염력의 계산된 감소를 수득할 수 있다.
특정한 구현예에 있어서, 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 삼량체, 직선상(linear) 사량체, 또는 분지상(branched) 사량체이다. 바람직한 불활성화 조건은 조성물을 약 0.0001 M 내지 약 0.015 M 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께; 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5에서; 약 0.01 M 내지 약 0.5 M의 이온강도를 갖는 용액내에서 인큐베이션하는 것이다. 더욱 바람직한 반응 조건은 조성물을 약 0.001 M 내지 약 0.01 M 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께; 약 PH 6,9 내지 약 pH 8.5에서; 약 0.1 M 내지 약 0.5 M 미만의 이온강도를 갖는 용액 내에서 인큐베이션 하는 것이다. 가장 바람직한 인큐베이션 조건은 약 4℃ 내지 30℃의 온도 범위에서 세포 또는 생체고분자물질-함유 조성물들을 삼량체, 직선상 사량체, 또는 분지상 사량체와 같은 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 것이다.
본 발명은 약 0.0001 M 내지 약 0.015 M 에틸렌이민 올리고머 불활성화제를 포함하고; 약 0.1 M 내지 약 0.2 M의 이온강도를 가지며; 약 PH 6.5 내지 약 pH 8.5인 생체고분자물질의 혼합물 내의 핵산의 선택적 변형을 위한 불활성화제 조성물도 제공한다.
본 발명은 생물학적 조성물을 유효농도의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제화 접촉시키는 과정을 포함하는 생물학적 조성물 내의 기능적 핵산의 선택적 불활성화 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 정제되거나 정제되지 않은 바이러스-포함 조성물들을 바이러스 불활성화 조건하에서 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시킴으로써 사균백신을 제조하는 방법에도 관계한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 유효량, 즉, 유기체에 목적 정도의 면역성을 부여하는데 충분한 양의 불활성화된 바이러스와 약제학상 허용가능한 담체를 포함하는 사균백신으로서, 여기서 상기 불활성화된 바이러스들이 백신이 치료 목적으로 환자 또는 동물에게 투여될 수 있도록 측정 가능한 감염력을 적어도 약 6.0 log10 (또는 계산에 의할 때 적어도 약 20로그의 바람직한 정도)까지 감소시키는데 효과적인 바이러스 불활성화 조건하에서 바이러스들을 본 발명의 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께 인큐베이션하는 방법에 의해 제조되는 사균백신을 제공한다.
치료 방법에 있어서, 본 발명은 시술 대상에게 본 발명의 사균백신을 투여함으로써 시술 대상을 바이러스에 대해 면역시킨다.
본 발명은 용기 내에 담긴 혈액 또는 그의 분획 내의 바이러스를 불활성화하는데 효과적인 양의 에틸렌이민 불활성화제를 포함하는, 혈액 또는 그의 분획을 담기 위한 용기를 구비하는 혈액-수집장치(blood-collection devices)도 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 불활성화 조건하에서 본 발명의 바이러스 불활성화제에 의해 처리된 바이러스들을 포함하는 진단시약 및 진단표본(diagnostic specimen)에 관계한다.
도 1. 에틸렌이민 올리고머 불활성화제(들)의 단량체(I), 이량체(Ⅱ), 삼량체(Ⅲ), 직선상 및 분지상 사량체(각각 Ⅳ 및 V)의 구조.
도 2. 에틸렌이민 및 그의 올리고머들의 전위차 적정곡선(potentiometric titration curve). 로마숫자는 도 1에 제공된 구조와 일치한다.
도 3. pH 7,5, 20℃인 0.15 M NaCl내의 에틸렌이민(0.025 M, 곡선 1), 그의 이량체(0.007 M. 곡선 2), 삼량체(0.003 M, 곡선 3), 및 직선상 및 분지상 사량체의 등몰(equimolar) 혼합물(0.0015 M, 곡선 4)의 작용 하에서의 파아지 MS2 생존곡선.
도. 4. pH 6.5, 6.9, 7.5, 및 8.5(각각 곡선 1, 2, 3 및 4)에서의 0.15 M NaCl(20℃)내의 0.007 M 에틸렌이민의 작용 하에서의 파아지 MS2 생존곡선.
1. 정의.
"선택적 불활성화제(selective Inactivating agents)"란 아지리디노 부분(aziridino moiety)을 갖고, 다른 생물학적 분자들보다 다음이온(polyanions) 예컨대, 폴리뉴클레오타이드에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 에틸렌이민 올리고머 시약을 의미한다. 본 발명의 선택적 불활성화제는 비교적 낮은 독성 클래스의 화합물들을 포함하는데, 이 화합물들은 바이러스의 유전물질을 포함하는 핵산(단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 또는 RNA)에 특이적으로 결합하여 불활성화 조건하에서 이용될 때, 기능적 핵산을 비가역적으로 변형시켜 바이러스들을 불활성화한다.
본 발명에 따른 "에틸렌이민 올리고머"란 말단 아지리디노기를 가지고 있으며 선택적으로 치환된 에틸렌이민의 올리고머를 가리킨다. 본 발명의 바람직한 에틸렌이민 올리고머는 적어도 3개의 에틸렌이민 단위들을 갖고 예를 들어, 삼량체, 또는 직선상이거나 분지상인 사량체를 포함한다. 본 발명의 에틸렌이민 올리고머의 합성은 당업자들에게 잘 알려져 있는 합성방법에 따라 행해진다. 예를 들어, 코스탸노브스키 알.지. 등(Translated from Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimicheskaya, 11:2566-2577, 1988) 참조. 대표적인 에틸렌이민 올리고머들은 도 1에 도시하였다. 본 발명의 방법에서는, 10단위 미만의 에틸렌이민 올리고머들이 바람직하고 약 3 또는 4 단위의 에틸렌이민 올리고머가 더욱 바람직하다.
에틸렌이민 올리고머들은 치환이 에틸렌이민의 근본적인 특성을 제거하지 않는 한 치환될 수도 있다. 하나의 실시양태에 있어서, 에틸렌이민 올리고머는 할로겐으로 치환되어 β-Hal-(CH2-CH2-NH)nH의 일반식을 갖는다. 때로 나이트로젠 머스타드(nitrogen mustards)로 불리는 이러한 화합물들은 에틸렌이민 또는 그의 올리고머의 염화수소 또는 브롬화수소의 2-할로게노모노 또는 올리고-에틸아민으로의 정량적 변환(quantitative conversion)에 의해 합성된다. 나이트로젠 머스타드는 강한 친전자체로 핵염기(nucleic bases)의 친핵성기를 직접 또는 중간 변환을 통해서 각자의 아지리딘으로 알킬화한다. 에틸렌이민 올리고머와 마찬가지로, β-할로게노올리고-에틸아민들은 다음이온(pdyanions)에 대해 높은 친화성을 갖는다. 따라서, 이들 에틸렌이민 올리고머들은 핵산에 대해 높은 선택성을 갖지만, 변형의 동력학(kinetics of modification)은 조정을 필요로 할 것이다.
불활성화제와 핵산의 반응의 상대 속도가 단백질, 탄수화물 및 지질과 같은 다른 생물학적 분자들과의 반응속도 보다 빠르다면, 불활성화제는 핵산에 대해 "선택성" 을 갖거나 핵산과 "선택적으로" 반응한다. 다른 단백질에 우선하는 핵산에 대한 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 선택성의 레벨은 에틸렌이민 단량체의 견지에서는 의외인데, 이것은 다른 알킬화제만큼 핵산에 대해 선택적이다.
"핵산"이란 단일가닥 및 이중가닥인 DNA 및 RNA를 의미한다.
"생물학적 조성물"이란 세포들 또는 생체고분자물질들을 포함하는 조성물을 의미한다. 세포-함유 조성물(cell-containing composition)은, 예를 들어, 전혈, 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 백혈구 농축물, 혈구 단백질, 혈장 단백질 분획, 정제된 혈액 단백질, 혈청, 정액, 포유동물 초유 및 우유, 태반 추출물, 발효 생성물, 복수, 정상 세포 및 형질전환된(예컨대, 재조합 DNA 또는 단클론 항체 기술에 의해) 세포에 의해 세포배양액 내에서 생산된 제품들을 포함한다. "생체고분자물질" 또는 "생물학적 분자"란 예를 들어, 핵산, 폴리펩타이드, 해독후 변형된 단백질들(예컨대, 당단백질), 다당류 및 지질을 포함하는, 살아 있는 유기체 내에서 정상적으로 발견되는 임의의 클래스의 유기분자를 의미한다. 생체고분자물질-함유조성물들은, 예를 들어, 혈구 단백질, 혈장, 혈장 분별 침강물, 혈장 분별 상청액, 저온형침강물, 저온형상청액, 또는 이들의 일부분 또는 유도체 또는 혈청 또는 정상 세포 또는 형질전환 세포로부터 생성된(예컨대, 재조합 DNA 기술을 통해) 비-혈액 제품을 포함한다. 생물학적 조성물들은 세포에서 유리된 것일 수 있다.
"기능적 핵산 (functional nucleic acid)"이란 복제, 전사, 해독 또는 기타의 핵산 분자의 활동에서 주형으로 기능하는 서열 요소들을 갖는 핵산을 의미한다. 이러한 요소들은 예를 들어, 핵산분자의 복제기점을 코드화하는 서열, 프로모터/인헨서와 같은 전사 요소, 전사 종결서열 및 기타의 조절 요소들; 리보좀 결합 부위, 해독개시 코돈, 코드화 서열 및 동상(in-phase) 종결코돈과 같은 해독 요소들; 및 RNA 촉매 활성을 부여하는 서열들을 포함한다.
"생체고분자물질의 활성을 억제한다"는 것은 그 생체고분자물질의 기능 또는 활성을 뚜렷이 감소시키는 것을 의미한다. 기능 또는 활성상의 감소는 특정 생체고분자물질의 활성을 측정하는데 이용되는 표준 분석방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 효소(단백질) 또는 항원 활성의 억제는 종래의 방법을 이용하여 효소반응 또는 항원에 대한 면역반응의 속도 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. 이러한 억제의 다른 예는 적당한 생체내 및 생체외 해독 시스템 내에서 생성되는 RNA에 의해 코드화된 단백질의 양을 측정함으로써 확인될 수 있는 RNA 해독의 억제이다.
기능적 핵산과 관련하여 "불활성화하기", "불활성화" 또는 '불활성화하다"는 것은 예를 들어, 복제, 전사 또는 해독 능력을 파괴함으로써 DNA 또는 RNA의 활성을 실질적으로 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, RNA 해독의 억제는 적당한 생체내 또는 생체외 해독 시스템 내에서 생성된 일정한 양의 RNA에 의해 코드화된 단백질의 양을 측정함으로써 확인될 수 있다. 바이러스를 언급할 때, 상기 용어는 감염 역가(infectious titer) 또는 밀리리터당 감염성 바이러스 입자의 수의 감소로 측정되는 감염성 바이러스 입자들의 수의 감소 또는 이들의 제거를 의미한다.
이러한 감염성 바이러스 입자의 감소는 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 측정될 수 있다. Lennette, E.H. 및 Schmidt, N.J. (eds) (1985) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 62nd ed, American Publisher's Assn., Washington, D.C. 참조.
바이러스가 비처리 조성물 내에 희석 후라도 106 농도로 존재하는 경우에, 감염력 연구에 의해 결정된 정도로 바이러스가 불활성화되는 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물에서 감염력의 감소는 실험적으로 적어도 약 "6 로그"까지 측정될 수 있고 바이러스 활성도 측정될 수 있다. 특수한 바이러스가 106 역가로 만들어질 수 없을 때, 불활성화는 생산된 바이러스의 역가까지 측정된 직접적인 정량에 의해 측정된다. 그렇지 않으면, 이러한 감염성 바이러스 입자들의 수의 감소는 불활성화 동력학(inactivation kinetics)에 영향을 미치는 화학적, 물리적, 및 생물학적 인자들을 고려하고 불활성화 과정 중에 바이러스 현탁액의 감염력의 정확한 실험적 측정에 기초한 불활성화 과정의 동력학 설명에 기초하여 적어도 약 "20 로그"의 정도로 본원에 설명된 바와 같은 계산에 의해 측정된다.
"바이러스 불활성화 조건"이란 예컨대, 처리 시간, pH, 온도 염농도, 및 선택적 불활성화제의 농도를 포함하는, 바이러스 게놈을 바람직한 정도까지 불활성화시키도록 바이러스 입자들이 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께 인큐베이션되는 조건을 의미한다. 바이러스 불활성화 조건은 핵산의 선택적 변형을 위해 후술하는 조건들로부터 선택된다.
"바이러스"란 DNA 및 RNA 바이러스를 모두 의미한다. 바이러스는 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 파포바바이러스, 파르보바이러스, 레오바이러스, 오르비바이러스, 피코르나바이러스, 로타바이러스, 알파바이러스, 루비바이러스, 인플루엔자바이러스 A형 및 B형, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 파라믹소바이러스, 모르빌리바이러스, 뉴모바이러스, 라브도바이러스, 리사바이러스. 오르토믹소바이러스, 부냐바이러스, 플레보바이러스, 나이로바이러스, 헤파드나바이러스, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 및 필로바이러스와 같은 엔벨로프 및 비-엔벨로프 바이러스들을 모두 포함한다.
"백신"이란 용어는 그의 통상의 의미로 사용되었는데, 매우 낮은 정도의 질병률 또는 사망률만을 유발하면서 유기체에게 필요한 정도의 면역성을 부여하는데 효과적인 약제를 의미한다. 백신의 제조방법은 물론 면역계의 연구 및 동물과 사람의 질병을 예방하는데 유용하다.
"약제학상 허용가능한"이란 화합물이 투여되는 동물에게 비교적 독성이 없는 것을 의미한다. "약제학상 허용가능한 담체"란 인산염 완충 식염수(PBS), 물, 수중유 또는 유중수 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 아쥬반트와 같은 표준 약제 담체, 버퍼, 및 부형제를 포함한다.
2. 일반적인 사항:
본 발명은 핵산을 변형시키는 다수의 약제, 특히 에틸렌이민 단량체(아지리딘)에 비해, 삼량체 및 사량체 형태의 에틸렌이민 올리고머가 단백질과 같은 다른 생체고분자물질에 우선하여 핵산의 변형에 있어 더욱 선택적이라는 의외의 놀라운 발견에 기초한다. 에틸렌이민 올리고머들은 에틸렌이민 단량체보다 여러 자리(order of magnitude) 만큼 더 선택적인데, 몇몇 경우에는 6 자리만큼 더 선택적이다. 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 이용은 핵단백질 또는 바이러스와 같이 단백질과 함께 핵산을 포함하는 조성물의 경우에 특히 유용하다.
본 발명은 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물을 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 과정을 포함하는, 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물 내의 핵산분자의 선택적인 아미노-알킬화 방법 및 조건들을 제공한다. 이러한 방법의 결과로, 상기 조성물 내의 핵산들은 다른 생물학적 분자들에 비해 훨씬 빠른 속도로 화학적으로 변형된다. 상기 방법은 개업의사가 핵산은 변형시키고 싶어하지만 다른 생물학적 분자들은 비교적 변화되지 않은 상태로 보존하고자 하는 모든 과정에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 예컨대, 바이러스 또는 다른 살아 있는 유기체의 게놈의 지도를 작성하거나 또는 불활성화하기 위해, 핵단백질(예컨대, 염색질 또는 리보좀)내의 핵산들을 검출가능한 표지(방사능, 형광, 효소 등)를 포함하는 에틸렌이민 올리고머에 의해 우선적으로 표지하는데 유용하다.
본 발명의 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 양성자첨가된(protonated) 아지리디노기(aziridino group)와 폴리뉴클레오타이드의 핵염기들 사이의 반응을 통해서 핵산을 우선적으로 변형시킨다. 바이러스 불활성화제의 다음이온과 연합하는 능력은, 부분적으로, 분자마다의 양성자첨가 가능한 기의 수 및 주어진 조건하에서의 양성자첨가반응(protonation)의 전체 정도에 의존한다. 변형은 올리고양이온 바이러스 불활성화제와 핵산 다음이온 사이의 연합을 통해서 일어난다. 양성자첨가의 정도는 부분적으로 pH에 의존한다. 본원에 기술된 바와 같이, 아지리딘기의 pK는 폴리머가 길어짐에 따라 감소한다. 그러나, 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 핵산과 선택적으로 연합하는 능력은 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 길이에 따라 현저하게 증가한다. 따라서, 개업의사는 생리적 pH에서 효과적으로 및 선택적으로 핵산을 알킬화할 수 있다.
핵산을 선택적으로 아미노-알킬화하는 방법의 하나의 구현예는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 바람직하게 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0, 및 가장 바람직하게 약 pH 7.5에서 핵산을 약 0.0001 M 내지 약 0.015 M의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 농도는 부분적으로 에틸렌이민 올리고머 불활성화제에 있는 양성자첨가 가능한 기들(protonizable groups)의 수에 의존하고, pH의 선정은 비리온(virion)의 안정성에 의존한다. 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 바람직하게, 에틸렌이민 삼량체, 직선상 사량체, 또는 분지상 사량체이다. 다른 구현예에 있어서. 본 발명의 방법은 핵산을 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 바람직하게 약 0.15 M의 이온강도를 갖는 용액 내에서 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제에 노출시키거나 접촉시키는 과정을 포함한다. 염들은 나트륨, 칼륨, 인산염 또는 초산염 등의 생화학 분야에서 통상적으로 이용되는 것들 중 임의의 것일 수 있다. 개업의사는 인산염, 초산염, 붕산염, Tris, HEPES, MOPS 등과 같은, 생체고분자물질 또는 세포들을 취급하기 위해 당업계에서 관례적으로 이용되는 버퍼에 의해 용액의 pH를 조정할 수 있다. MOPS와 Tris는 바람직한 버퍼이다. 버퍼중의 고농도의 인산염은 바람직하지 않다. 개업의사는 바람직한 pH 및 이온강도가 달성되도륵 반응조건을 조절할 수 있다. 개업의사들은 반응조건 및 목적하는 감염력 불활성화의 정도에 의존하여 반응물의 농도, 온도, 인큐베이션 시간과 같은 다른 인자들을 조절할 수도 있다. 후술하는 바와 같이, 동력학적 접근방법을 이용할 때, 핵산을 아미노 알킬화하는 것으로 기술된 조건들 중에서 소정의 정도로 기능적 핵산 또는 바이러스를 불활성화하는 조건들은 물론 불활성화 종점(inactivation end point)이 측정될 것이다.
개업의사들은 감염되기 쉬운 세포들에 도입된 후 37℃에서 인큐베이션된 바이러스-함유 혼합물의 연속 희석물(serial dilutions)을 이용하여 조직 배양물내의 세포변성 효과(CPE; cytopathic effect)의 측정과 같은 당업자들에게 알려져 있는 여러 가지 분석방법을 이용하여, 바이러스 감염력 불활성화의 정도로 바이러스 핵산의 알킬화의 정도를 측정할 수 있다. 에틸렌이민 올리고머에 의한 단백질, 다당류 및 당단백질의 변형은 추가의 양전하의 도입을 초래할 것이다. 생체고분자 물질의 변형 정도는 등전집중(isoelectric focusing), 자동방사선사진술(autoradiography), 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, HPLC 및 다른 형태의 크로마토그래피를 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 약 0.0001 M 내지 약 0.015 M 에틸렌이민 올리고머 불활성화제를 포함하고; 약 0.1 M 내지 약 0.2 M, 바람직하게 약 0.15M의 이온강도를 가지며; 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 바람직하게 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0 그리고 가장 바람직하게 약 pH 7.5로 완충된 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물 내의 핵산의 선택적 변형, 즉 아미노 알킬화를 위한 조성물에도 관계한다. 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 바람직하게, 삼량체, 또는 직선상 또는 분지상 사량체이다. 염 및 버퍼는 상술한 것들중 어느 하나일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 조성물은 기능적 핵산을 아미노-알킬화하는데 효과적인 에틸렌이민 올리고머의 양, 이온강도 및 pH를 갖는다. 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 바이러스들을 불활성화하는데 효과적인 에틸렌이민 올리고머의 농도, 이온강도 및 pH를 갖는다. 이들 조성물들은 소독제(disinfectants) 또는 바이러스살멸제(viricides)로 유용하고 본원에 기술된 본 발명의 모든 방법에 유용하다.
본 발명은 시료를 유효량의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 과정을 포함하는 생물학적 시료 내의 기능적 핵산의 활성을 선택적으로 억제하는 방법에도 관계한다. 이들 방법들은 많은 용도를 갖는다 기능적 핵산이 플라스미드 또는 DNA 분절과 같은 네이키드(naked) 핵산일 때, 억제는 예를 들어 트랜스펙션에 의해 그 핵산이 도입되는 세포를 형질전환(transformation)시키는 분자의 능력을 감소시키는데 유용하다. 세포-유리 해독 시스템에서, 억제는 RNA의 해독을 감소시키는데 유용하다. 기능적 핵산이 리보자임과 같은 촉매 핵산일 때, 상기 방법은 핵산의 그의 표적에 대한 작용을 억제하는데 유용하다.
기능적 핵산이 감염성 바이러스의 일부인 바이러스 게놈일 때, 상기 방법들은 일정 부위를 살균하고, 전혈, 혈액 제품 또는 세포 배양물 내에 형성된 단백질들과 같은 생물학적 제품들과 같은 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물중의 바이러스들을 불활성화하거나 제거하는데 및 바이러스의 감염력을 바람직한 정도(예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 계산에 의할 때 적어도 약 20로그)로 불활성화하는데 유용하다. 생체고분자물질-함유 조성물은 예를 들어, 전혈로부터 정제된 단백질; 혈액 제품(예컨대, 인자 Ⅷ과 같은 응고 인자, 에리트로포이에틴과 같은 호르몬등); 세포 배양물 제품(예컨대, 세포 추출물, 생물학적 분자(예컨대, 재조합 단백질)들이 풍부한 배양배지; 혈액 제품에 의해 처리된 단백질 함유 조성물(예컨대, 우혈청과 함께 인큐베이션된 조성물); 및 식물 제품 등을 포함할 수 있다. 이들 방법들은 조성물 내의 생물학적 제품의 중요한 생물학적 특징들은 보존한 채로 실험실용 및 치료용으로 이들 제품들의 순도 및 안전성을 확보하는데 유용하다.
본 발명은 혈액 시료를 수집 및/또는 처리하고 그 안의 바이러스들을 불활성화시키는 혈액-수집장치(blood-collection devices)도 제공한다. 본 발명의 혈액-수집장치는 혈액 또는 그의 분획을 담는 용기 및 용기 내에 담긴 혈액 또는 그의 분획 내의 바이러스들을 불활성화하는데 효과적인 양의 본 발명의 선택적 에틸렌이민 불활성화제를 포함한다. 이러한 구현예의 일례는 그 안에 에틸렌이민 올리고머 불활성화제가 담지되는 배큐테이너(vacutainer)와 같은 마개가 되어 있는 진공튜브를 포함한다. 혈액 시료가 튜브 내에 담길 때, 그것은 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉하게 된다. 다른 예는 헌혈을 위해 이용되는 것과 같은 혈액-수용 백(blood-receiving bag)이다. 본 발명의 혈액-수용 백은 백을 채우는 혈액과 접촉하는 에틸렌이민 올리고머 불활성화제를 포함한다.
마찬가지로, 기능적 핵산이 세균 또는 다른 유기체의 게놈의 일부라면, 상기 방법들은 그러한 세균 또는 다른 유기체들을 살균하거나 제거하는데 이용될 것이다.
본 발명의 방법에 의한 바이러스 게놈의 변형은 바이러스의 복제를 방해하여 본 발명의 사균백신의 감염력을 제거한다. 더욱이, 비리온 코트 단백질들은 동일한 정도로 변형되지 않기 때문에, 백신은 상당한 면역원성을 그대로 보유한다. 에틸렌이민 올리고머들은 다른 선택적 불활성화제들에 비해 핵산의 변형에 있어 훨씬 더 선택적이기 때문에, 에틸렌이민 올리고머를 포함하는 본 발명의 조성물들은 현재 이용되고 있는 덜 선택적인 불활성화제들을 능가하는 현저한 이점을 제공한다.
따라서, 본 발명은 바이러스 불활성화 조건하에서 바이러스들을 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 사균백신의 제조방법에도 관계한다. 바이러스 불활성화 조건은 바이러스, 세균 또는 다른 유기체들의 핵산들을 아미노-알킬화 및 불활성화하는 상술한 방법들로부터 선택된다. 일반적으로, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5에서, 약 0.50 M 미만의 이온강도를 갖는 용액 내에서, 약 4℃ 내지 약 40℃에서, 약 107 내지 108 단위/ml의 고역가의 바이러스가 에틸렌이민 올리고머와 함께 인큐베이션된다. 처리 시간(즉, 불활성화의 종점)은 특정 바이러스의 구조 및 조성, 인큐베이션 온도, 이온강도, 및 에틸렌이민 올리고머의 양성자첨가 가능한 기의 수에 의존한다. 그러나, 동력학 연구는 pH 및 불활성화될 바이러스에 의존하여, 인큐베이션 시간은 몇 초간의 짧은 기간이 되거나 약 1시간, 5 시간, 50 시간, 100 시간, 300 시간 또는 500 시간이 될 수 있다는 것을 말해 준다. 바람직하게, 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 삼량체, 직선상 사량체, 또는 분지상 사량체이다. 백신의 제조방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예컨대 Vaccines (Slorein, G. Martance, E. eds) 2nd edition, 1994, Saunders, Harcourt-Brace, Phil, Toronto)를 참고할 수 있다.
백신용의 경우에, 죽은 바이러스는 직접 백신 제형으로 이용되거나 또는 약제학상 허용가능한 담체와의 후속 혼합물을 위해 개개의 도스(dose) 또는 다수 도스 용기 내에 동결건조될 수 있다. 동결건조된 죽은 바이러스들은 대개 4℃로 유지된다.
백신은 아쥬반트로, 즉, 항원과 함께 이용될 때 면역반응을 항진시키는 물질로 투여될 수 있다. 백신은 면역화 도스(immunization dose)로 제공될 수 있다. 면역화 도스는 면역반응을 생성하거나 향상시키는데 필요한 항원 또는 면역원의 양이다. 이러한 양은 다양한 아쥬반트들의 존재 및 효능에 따라 달라질 것이다. 양은 동물, 및 면역원 또는 항원 또는 아쥬반트에 따라 달라지겠지만. 대개 약 100mg/도스 미만일 것이다. 면역화 도스는 통계학 상으로 유효한 숙주동물 면역화 및 공격 연구(challenge studies)를 행하는 것과 같은 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예컨대, Manual of Clinical Immunology, H.R. Rose 및 H. Friedman, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980) 참조.
세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물의 처리방법 또는 사균백신의 제조방법은 이미 에틸렌이민 단량체 및 β-프로피오락톤과 같은 다른 알킬화제에 의해 비가역적으로 불활성화되는 것으로 당업계에 알려진 바이러스들의 불활성화에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 약제들은 그들의 선택성 덕분에 광범위한 용도를 갖는데, 백신 제조를 위한 바이러스의 선정 및 생물학적 제품의 살균시에 개업의사들은 부분적으로 다른 불활성화제들과 관련한 업계의 경험을 참고할 수 있다.
본 발명은 유효한 양의 불활성화된 바이러스들 및 약제학상 허용가능한 담체를 포함하고, 여기서 상기 불활성화된 바이러스들이 감염력을 바람직한 정도(직접 측정시 적어도 약 6 로그 혹은 본원에 개시된 바와 같이 계산에 의한 경우 적어도 약 20 로그)까지 감소시키는데 효과적인 바이러스 불활성화 조건하에서 바이러스들을 처리하는 방법에 의해 제조되는 사균백신에도 관계한다. 본 발명의 사균백신은 동물 및 사람의 질병 예방에 유용하다. 목적하는 정도의 면역성을 부여할 수 있는 본 발명의 백신들은 면역반응을 유발하는데 효과적인 양의 불활성화된 바이러스를 포함할 것이다. 다른 백신에 비해 본 발명의 백신 내에 있는 바이러스 게놈은 핵염기의 내향고리 질소(endocyclic nitrogen)에서 알킬화되지만. 비리온 내의 다른 생체고분자물질에 우선하는 핵산 변형의 상대적인 속도가 다른 선택적인 불활성화제에 의해 달성될 수 있는 것 보다 훨씬 빠르기 때문에 불활성화가 훨씬 더 효과적이라는 점에서 현저한 차이가 있다. 사균 백신 제조에 있어서, 바이러스 시료는 면역원성은 보존한 채로 바이러스를 불활성화하는 양 및 조건하에서 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께 인큐베이션된다.
적당한 약제학적 담체들 및 그들의 제형들은 Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed.(Mack Publishing Co., Easton 1995)에 기술되어 있다. 이러한 조성물들은 일반적으로 대상에 적당하게 투여하기에 적당한 용량(dosage)을 제조하도록 적당량의 담체와 함께 유효량의 화합물을 포함한다.
본 발명은 대상에게 본 발명의 사균백신을 투여함으로써 바이러스에 대해서 대상을 면역화하는 치료방법에도 추가로 관계한다. 대상은 사랑이거나 사람이 아닌 동물일 수 있다. 본 발명의 치료방법의 실시에 있어서, 상술한 유효량의 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 본 발명의 화합물 이외의 다른 화합물과 함께, 당업계에 알려진 유용하고 허용가능한 방법에 의해 투여된다.
본 발명의 치료방법의 실시에 있어서, 대상에게 투여될 백신의 구체적인 용량은 바이러스의 특성, 투여 스케줄, 대상의 연령 및 신체적 특질 등과 같은 여러가지 고려 사항에 의존할 것이다. 적당한 용량은 의학계에 잘 알려진 임상적 접근방법을 이용함으로써 정해질 수 있을 것이다.
이론에 얽매이지 않을 때, 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 핵산에 대한 높은 선택성은 명백히 본 발명의 실시시에 조절될 수 있는 다음과 같은 인자들을 포함한다. 에틸렌이민 단량체 및 에틸렌이민 올리고머들은 하나의 아지리디노기를 포함한다 (도 1). 친전자체로서의 아지리딘의 반응성은 아지리딘 질소의 양성자첨가에 의해 극적으로 증가하지만(Van Etten, R.L. 및 Dolhun,J.J. (1986) J. Org. Chem. 33:3904-3913), 그의 알킬화에 의해서는 단지 약간의 영향만을 받는다 (Earley. J.E, et al., (1958) J. Am. Chem. Soc 80:3458-3462). 따라서, 이들 화합물들의 아지리디노기에 양성자첨가된 형태가 유일한 반응성 형태일 것이다. 아지리딘의 통상의 친전자 반응의 속도는 용액 내의 그들의 양성자첨가된 형태와 농도에 비례할 것이다.
도 1의 화합물 Ⅰ 내지 Ⅴ는 그들의 아지리디노기의 pKa 및 아미노기들의 수, 상호 배열, 및 pKa 면에서 서로 현저하게 다르다. 따라서, 아지리디노기가 양성자첨가된 이들 화합물들의 반응성 형태의 분율과 그들의 총 평균 양전하는 모두 pH에 상당히 의존한다 (표 2)
[표 1]
올리고에틸렌이민들의 양성자첨가 가능한 기들의 pKa 값
*) 두 개의 2차 아미노기들의 평균치
**) 두 개의 1차 아미노기들의 평균치
단백질 및 폴리뉴클레오타이드에 대한 아지리딘의 작용은 아미노산 잔기 및 핵염기 양자에서 친핵성기들의 아미노-알킬화를 초래한다 (Dermer,O.C. 및 Ham, G.E. (1969) Ethyleneimine And Other Aziridines, Acad. Press, NY-London 52:249-285). 다수의 친전자제(electrophilic agent)들과 마찬가지로, 아지리딘은 핵산을 퓨린의 N7, N3, N1에서 우선적으로 변형시키고, 피리미딘의 N3에서 훨씬 낮은 정도로 변형시킨다 (Hemminki, K. 및 Ludlum, D.B, (1981) J. Natl. Cancer Inst. 73:1021-1027; Musser, S.M. et al., (1992) Chem. Res. Toxicol. 5:95-99; Singer, B. 및 Grunberger, D.(1983) Moleculer Biology of Mutagens and Carcinogens, Plenum Press, New York-London; Loveless, A (1966) Genetic and Allied Effects of Alkylating Agents, Butterworths, London; 및 Kochetkov, N.K. 및 Budowsky, E.I. eds (1972) Organic Chemistry of Nucleic Acids. Part B, Plenum Press, London-New York). 주형 합성은 N7 알킬화 퓨린, 주로 구아닌의 이미다졸 고리의 비교적 느린 개환 때문에 알킬화제에 의해 정지된다(O'Connor,T.R. et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:5879-93; Hemminki, K.(1984) Chem.-Biol. Interactions. 48:249-260).예를 들어, 에틸렌이민은 구아노신을 변형시켜 N7-알킬구아노신 보다 훨씬 빠른 속도의 이미다졸 고리 개환을 시현하는 N7(아미노에틸)-구아노신을 만든다 (Hemminki, K (1984) Chem.-Biol. Interactions. 48:249-260; Hemminki, K.(1989) Chem.-Biol. Interactions. 70:289-303).
[표 2]
올리고에틸렌이민의 총 평균 양전하(A) 및 그들의 아지리디노기 양성자첨가 정도(B)
pH 7.5에서 에틸렌이민 단량체(1)로부터 그의 사량체(IV 및 V)로의 전이는 용액 내의 약제의 반응성 형태의 평균 농도에 기초하여 계산된, 파아지 감염력 불활성화의 유효속도상수(k)를 2자리 이상 증가시킨다 (표 3). 이러한 전이는 아지리디노기의 pKa 값을 5 자리 감소시킨다. 따라서, 약제의 반응성 형태의 분획은 이러한 pH에서 4 자리 정도 감소한다 (표 2). 따라서, pH 7.5에서 단량체로부터 사량체로의 전이는 용액 내의 약제의 반응성 형태의 평균 농도에 기초하여 계산된 속도상수(k1)를 약 6자리 정도 증가시킨다.
[표 3]
약제의 반응성 형태의 전체 평균 농도에 기초하여 계산된, 20℃하 0.05 M NaCl내의 올리고에틸렌이민들의 작용에 의한 파아지 MS2 감염력 불활성화의 속도상수 (M-1.nin-1)(괄호안, k1)
* 속도상수는 생존곡선의 초기 부분을 이용하여 계산되었다.
** 직선상 및 분지상 사량체의 등몰 혼합물
올리고양이온으로서, 에틸렌이민 올리고머는 그들의 연합상수(association constant)에 반영된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드에 대해서 높은 친화성을 갖는다. 정전기 상호작용에 의해 영향을 받는 이러한 연합상수는 올리고양이온 및 다음이온 용적 전하밀도(volume charge density)에 비례하여, 올리고양이온의 총 평균 양전하(total average positive charge)에 의해 증가한다. 에틸렌이민 단량체로부터 그의 올리고머로의 전이는 분자의 총 평균 양전하를 현저하게 증가시킨다(표 2). 또한, 에틸렌이민 올리고머에서 양성자첨가 가능한 기들 사이의 거리는 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드간 인산기들 사이의 거리와 동일하다. 따라서 단량체로부터 올리고머로의 전이시에 올리고에틸렌이민의 양성자첨가 가능한 기(protonizable groups)들의 수의 증가는 그들의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 바이러스 RNA와의 연합을 증가시킬 것이다 (Manning, G.S. (1978) Q. Rev. Biophys. 2:179-246; Thomas, T.J. 및 Bloomfield, V.A. (1984) Biopolymers 23:1295-1306; 및 Stevens,L.S. (1967) Biochem.J. 103:811-815).
핵산 변형에 이용된 다수의 알킬화제들은 폴리뉴클레오타이드에 대해서 뚜렷한 친화성을 갖지 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 pH-의존성 및 핵염기들의 pK 값들의 비교는 pH 범위 6.0-8.0에서 알킬화되는 것은 주로 핵염기의 중성 형태라는 것을 입증한다 (Budowsky,E.I. 및 Zalesskaya,M.A. (1991) Vaccine. 9:319-325; Singer, B. 및 Grunberger, D.(1983) Moleculer Biology of Mutagens and Carcinogens, Plenum Press, New York-London; Loveless, A. (1966) Genetic and Allied Effects of Alkylating Agents. Butterworths, London; 및 Kochetkov, N.K. 및 Budowsky, E.I eds (1972) Organic Chemistry of Nucleic Acids, Part B, Plenum Press, London-New York)48, 50, 51). pH의 추가의 증가는 구아노신 및 유리딘의 더욱 반응적인 양성자가 제거된 형태의 분율들을 증가시켜, 파아지 불활성화 속도를 증가시킬 것이다. 그러나, pH 8.5에서 파아지 감염력 불활성화의 속도상수는 pH 7.5에서 보다 작았다 (표 3). 따라서, 적어도 이 pH 범위에서, 불활성화 속도에 대한 약제의 반응성 형태의 분율의 영향은 핵염기에 대한 것 보다 크다. 따라서, pH 범위 6.0-8.5에서 감염력 불활성화 속도상수의 계산시에, 우리는 반응성(무양성자) 형태인 핵염기의 분율이 본질적으로 일정하다고 가정한다. 파아지 MS2의 올리고에틸렌이민 불활성화의 경우에, 불활성화 속도상수의 pH-의존성은 주로 불활성화제의 반응성 형태의 분율 및 총 평균 양전하에 기인한다.
pH가 8.5에서부터 6.5로 감소됨으로써 유효 불활성화 속도상수는 60배 증가한다. 이것은 용액 내의 이들 약제의 반응성 분획의 증가와 관련된다 (표 2 및 3). 그래서 이 경우에 불활성화 속도에 대한 pH의 영향은 주로 용액 내의 반응성 형태의 농도 변화에 의해 결정된다. 그러나, 삼량체 및 사량체들의 총 평균 양전하의 pH-의존성은 에틸렌이민 단량체에 대해서 보다 뚜렷하고(표 1), 단량체 및 이량체에 비해 삼량체 및 사량체에 의한 폴리뉴클레오타이드 변형의 속도 상의 큰 변화를 초래한다는 사실이 강조되어야 한다.
종래의 불활성화제에 의한 비리온 성분들중 임의의 것의 변형의 속도는 보통 약제의 평균용액농도의 함수인 것으로 생각된다. 그러나, 저분자질량 약제가 일부 고분자에 대해 특이적인 친화성을 갖는다면, 이 고분자 주변의 약제의 국부 농도는 약제의 평균용액농도 보다 높고 고분자로부터의 거리가 증가됨에 따라 지수함수적으로 감소한다(Dolar, D. 및 Peterlin, A. (1969) J. Chem. Phys., 50:3011-3015). 바이러스 게놈 불활성화의 선택성은 이들 생체고분자물질 근방의 약제의 국부 농도 상의 차이에 비례할 것이다. 따라서, 게놈 근방의 올리고에틸렌이민 농도의 국부적 증가라도 그의 변형속도를 우선적으로 증가시킬 것이다. 그러나, 위에서 고려된 바와 같이, 에틸렌이민 올리고머들과 폴리뉴클레오타이드 사이의 복합체의 형성은 아지리디노기의 양성자첨가 정도, 및 그 결과로 폴리뉴클레오타이드 변형의 속도상수(k1)를 증가시킬 것이다. 고분자로부터 1-2nm 만큼 거리가 떨어짐에 따른 약제 농도의 지수함수적 감소 때문에, 약제의 국부 농도는 그의 평균용액농도와 본질적으로 동일하다 (Dolar. D. 및 Peterlin, A. (1969) J. Chem. Phys., 50:3011-3015). 분명하게, 이 거리에서 약제 반응성 형태의 분율은 용액 내에서 자유로운 상태(연합되지 않은)일 때와 동일할 것이다. 따라서, 고분자 근방에서의 불활성화제의 농도의 증가는 물론 불활성화제와 폴리뉴클레오타이드 사이의 연합은 캡시드 성분, 특히 비리온 표면에 있는 그들의 항원-포함 부위의 변형 속도에 영향을 미치지 않을 것이다. 바이러스 게놈 불활성화의 선택성은 종래의 불활성화제에 비하여 핵산에 대해 특이적인 친화성을 갖는 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제에 의해 향상된다.
이상의 모든 데이터 및 고찰들은 사람들이 폴리뉴클레오타이드 친화성이 높고 바이러스 게놈 변형의 반응속도 및 선택성이 향상된 에틸렌이민 삼량체 또는 사량체를 선택하게 할 것이다. 전술한 바와 같이, 이러한 전이(transition)는 적어도 6자리의 선택성의 증가를 초래한다. 따라서, 에틸렌이민 단량체의 선택성이 완전한 비리온 사균백신의 제조를 위해 현재 이용되는 다른 약제들의 선택성에 지나지 않아도, 삼량체 및 사량체의 선택성의 현저한 증가는 면역원성, 안정성 및 기타의 비리온 특성에 대한 비리온 성분 변형의 효과를 무시해도 좋을 정도가 되게 한다.
폴리뉴클레오타이드 변형에 대해 선택성을 갖는 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 이용은 안전하고 효율적인 사균 항바이러스 백신을 제조할 수 있는 새로운 가능성을 제공한다. 동일한 접근방법이 공혈자(donor) 혈액 및 혈청은 물론 동물 조직 및 세포 배양물로부터 분리된 의학 및 수의학 조제 내의 가장 해로운 오염균인 바이러스의 선택적 불활성화에도 이용될 수 있다. 동일한 접근방법이 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물을 오염시킬 수 있는, 생물학적 활성(예컨대, 형질전환) DNA 단편의 선택적 불활성화에도 이용될 수 있다.
이하의 실시예들은 설명의 목적만을 위한 것으로, 제한적인 것은 아니다.
실시예 1
박테리오파아지 불활성화
동력학 측정(Kinetic Determination)
박테리오파아지 MS2를 종래의 방법에 따라 준비하였다. 폴리에틸렌글리콜(PEG 6000, Serva) 재침강(resedimentation) 또는 NaCl (0.02-1.0 M, 20 mM Tris HCl, pH 7.4) 선형 경사의 DEAE-세파덱스 A25상의 크로마토그래피에 의해 정제를 행하였다. 정제된 파아지를 0.15M NaCl 용액(2-10 mg/㎖)에 현탁시켜 +4℃에 보관하였다. 바이러스 현탁액의 감염력을 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) CA180을 갖는 고기-펩톤 아가 상에서 종래의 2층 기술(bilayer technique)에 의해 측정하였다.
에틸렌이민(Ⅰ), 그의 삼량체(Ⅲ), 및 직선상(Ⅳ) 및 분지상(Ⅴ) 사량체들을 코스탸노브스키 등((1988) Izv. Akad. Nauk SSSR, 11:2566-2575)의 방법에 따라 준비하였다. PMR 데이터를 통해서 이들 화합물들의 순도가 95% 이상임을 확인하였다. 에틸렌이민의 용액들은 계산된 용적의 화합물(화합물 Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅳ(Ⅴ)의 20℃에서의 비밀도는 각각 0.836, 0.945 및 0.968g.cm-3이었다)을 0.15 M Nacl 용액에 첨가함으로써 사용 직전에 제조하였다.
25℃에서 0.15 M NaCl 수용액 내의 에틸렌이민의 양성자첨가 가능한 기들의 pKa 값은 자동온도조절된 세포 구획(thermostatted cell compartment)들을 가지고 자동적정기 TTT-60(Radiometer)를 이용하여 HCl에 의한 전위차 적정(도 2)의 결과에 기초하여 산출하였다. pKa 값 측정의 정화성은 0.05나 되었다. 약제의 반응성(아지리딘 질소에서 양성자첨가된) 형태의 분출(Q)을 하기 식에 의해 계산하였다:
[수학식 1]
상기 식에서, pKi 값은 각 화합물의 아지리디노기의 pKa 값이다.
분자의 총 평균 양전하(p)는 다음 식을 이용하여 계산되었다:
[수학식 2]
상기 식에서, d(Hn.An+1)는 주어진 pH 값에서 양전하 n을 갖는 약제의 분율이다.
혼합하기 이전에, 파아지-포함 조성물 및 새로 만들어진 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 용액을 20℃에서 보존하고 목적 pH는 희석 NaCl 또는 HCl 용액의 첨가에 의해 조절하였다. 20℃에서 인큐베이션된 반응혼합물들의 분취량들(불활성화제의 최종농도는 도 3 및 도 4의 간단한 설명에 기술되어 있다)을 일정한 시간 간격으로 취하여 곧바로 100배 희석한 후에 감염력(역가)의 측정에 이용하였다. 감염력 불활성화의 유효 속도상수(k)는 다음 식에 따라 계산하였다:
[수학식 3]
상기 식에서, A는 약제의 농도(전체 또는 반응성 분획의)이고; So 및 St는 불활성화 개시 이전 및 t분 후의 현탁액의 감염력(역가)이다.
전위차 적정 곡선(도 2)의 분명한 형태는 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 이온 상태(ionic status) 상의 변화를 반영한다. 단량체의 경우에, 하나의 평탄역(plateau)은 아지리디노기의 양성자첨가에 해당한다. 계산된 pKa 값 (표 1)은 문헌상의 데이터들(O'Rourke, C.E., et al., (1956) J. Am. Chem. Soc. 78:2159-2160)과 잘 일치된다. 다른 화합물의 경우에, 평탄역은 아미노기 및 아지리디노기의 양성자첨가에 해당한다 (표 1). 올리고머 Ⅱ 내지 Ⅴ에 의한 산의 소비는 각각이 pKa 값이 5.15-3.0인 하나의 기를 갖는다는 것을 가리키는데, 이것은 이들 분자 내의 하나의 아지리디노기의 존재에 부합한다. 강염기성인 아미노기들의 많은 수가 분자의 총 양전하를 증가시켜 아지리디노기들의 양성자첨가를 감소시키기 때문에, 분자 Ⅱ 및 Ⅴ는 에틸렌이민에 비해 낮은 아지리디노 pKa를 나타낸다. 분자 Ⅳ와 Ⅴ 사이의 덜 뚜렷한 pKa 차이는 이들 분자 내에서의 아지리디노기와 아미노기들의 상호 배열 상의 차이에 기인할 것이다. 화합물 Ⅱ 내지 Ⅳ의 경우에는 대부분의 염기성 아미노기들의 양성자첨가에 1당량의 산이 요구되는데 반하여, 화합물 Ⅴ의 경우에는 2당량이 요구된다. 이들 데이터들은 처음 3 화합물들의 각각에 있는 하나의 일차 아미노기(primary amino group) 및 화합물 Ⅴ의 두 개의 일차 아미노기들의 존재와 서로 관련된다. 하나 및 두 개의 2차 아미노기(secondary amino groups)들의 존재에 부합하는, 1 및 2 당량의 산(acid)의 소비는 각각 pH 7.35 및 7.05에서 화합물 Ⅲ 및 Ⅳ의 이온 전이(ionic transitions)에 요구된다. pH 6.4에서의 화합물 Ⅴ의 이온 전이에 요구되는 1당량의 산의 소비는 하나의 3차 아미노기(tertiary amino group)의 존재에 부합한다. 이들 화합물들에 있어서, 2차 및 3차 아미노기들과 대비되는 1차 아미노기들의 높은 pKa 값은 폴리아민 분자의 구조는 물론 전자 효과(electronic effect)에 기인할 것이다 (M.D. Bratek-Wiewiorowsak et al., (1986) Bull. Pol. Ac. Sci. Chem. 34:229-249 참조). 이들 데이터들은 화합물 Ⅰ 내지 Ⅴ에 대하여 임의의 pH 값에서의 총 평균 양전하 및 아지리디노기 양성자첨가의 정도를 계산하는데 이용되었다 (표 2).
pH 7.5에서 화합물 Ⅰ 내지 Ⅴ에 의한 파아지 MS2 감염력의 지수함수적인 감소(도 3)는 이들 화합물들의 농도가 채택된 조건하에서 일정하게 유지된다는 것을 가리킨다. 이로 인해 수득된 데이터에 기초하여 감염력 불활성화에 대한 유효속도상수(k)를 계산할 수 있다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 에틸렌이민 단량체로 부터 그의 사량체로의 전이는 이러한 속도상수의 2자리 증가를 초래한다.
8,5로부터 6.5로의 pH의 감소는 에틸렌이민에 의한 파아지 감염력 불활성화의 속도를 60배 증가시킨다 (도 4, 표 3). pH 6.5에서 이 화합물의 이용은 생존곡선 형태를 지수함수적인 것으로부터 상당히 벗어나게 한다(도 4). 이러한 변화는 화합물 Ⅱ 농도의 빠른 감소가 이 pH에서의 그들의 양이온 중합에 기인한다는 것을 가리킨다(Gembitsky, P.A. et al., (1791) Nauka, Moscow 참조). 따라서 pH 6.5에서 화합물 Ⅱ의 불활성화 속도상수는 생존곡선의 처음 부분만을 이용하여서 계산되었다. pH 6.5에서 화합물 Ⅱ 소비의 속도상수는 불활성화 조기(early period)의 속도상수 및 감염력 불활성화의 최종 정도를 이용하여 계산할 때, 약 0.02 min-1이었다 (Budowski, E.I. 및 Zalesskaya, M.A. (1991) Vaccine, 9:319-325 참조).
실시예 2
불활성화 종점의 계산
바이러스-함유 조성물의 감염력 감소의 정도는 시료 용적을 증가시키고(적당한 한계 이내로) 일련의 연속적인 계대(passage)들을 이용하여도 적어도 약 6자리 정도 실험적으로 조절될 수 있다. 그러나, 안전한 사균백신의 제조는 최초 바이러스-함유 조성물의 감염력이 적어도 약 20자리 정도 감소될 것을 필요로 한다. 따라서, 일반적으로, 사균 바이러스 백신의 안전성은 실험에 의해서만 결정될 수 없고 본원에 기술된 방법을 이용하여야 하며 동력학적 접근방법을 이용한 계산에 의해 보다 정확하게 사정될 수 있다. 이것은 본 발명의 선택적 불활성화제의 특징들을 고려한 바이러스에 대한 불활성화 조건의 정확한 동력학적 설명을 필요로 한다. 데이터들은 생존곡선의 초기(실험적으로 조절된) 부분으로부터 수득될 수 있다.
정확한 동력학적 설명은 불활성화 중의 바이러스 현탁액의 감염력의 정확한 측정이 기초가 되어야 한다. 당업자들은 불활성화 속도상수 및 선택적 불활성화제 작용의 최소 작용기간(t1)의 측정을 확실하게 하기 위해 감염력(역가) 측정이 정확함을 보장해야 할 것이다. t1의 신뢰성 있는 값은 상술한 동력학적 접근방법을 이용하여 수득될 수 있는데, 특히, 기술된 정도의 감염력의 감소까지 생존곡선이 양호한 동력학적 설명을 제공할 때 그러하다. 바이러스 게놈의 변형이 생물학적 인자들에 의해 왜곡되지 않는다고 가정할 때(DNA 수선(repair)과 같이) 그리고 첫번 째 불활성화 손상이, 바이러스 핵산내의 그의 위치에 관계없이, 게놈의 완전한 복제를 봉쇄한다고 가정할 때, 본 발명의 선택적 불활성화제의 작용 중에 바이러스 생존곡선은 하기 식을 따를 것이다:
S = S0 exp (-Akt)
상기 식에서, So 및 S는 선택적 불활성화제의 작용 개시 이전 및 t분 이후의 바이러스-함유 조성물의 감염 역가이다. A는 선택적 불활성화제의 농도이고 k는 불활성화, 즉, 게놈당 뉴클레오타이드 잔기의 변형의 속도상수이다.
값 A 및 k가 불활성화 중에 일정하다고 가정할 때, 생존곡선은 지수함수적이다. 이 경우에, 감염력을 일정한 정도까지 감소시키는데 요구되는 불활성화 지속시간은 다음 식에 따라 산출될 수 있다:
t1 = [2.3/(Ak)]log(S/S0)
표 3에 기술된 실시예 1에서 수득된 불활성화의 속도상수를 적용하면, 불활성화의 지속시간은, 에틸렌이민 올리고머의 농도가 10-3 M(사량체의 경우)이고 표 3(pH 7.5)으로 부터 취한 불활성화의 속도상수 k=150이며 log(S/S0)이 목적하는 불활성화 정도, 이 경우에는 적어도 약 20이라고 가정하면, 실시예 1에서 감염력의 감소 시간은 20℃에서 수행된 15.3분이다.
본 발명에 따라, 임의의 바이러스에 대한 불활성화 및 본 발명의 선택적 불활성화제의 종점은 생존곡선의 초기 부분으로부터 수득된 데이터에 기초하여 불활성화 조건하에서 결정될 수 있다.
실시예 3
피코르나바이러스. 단일가닥 RNA, 양성 쇄(positive chain), 단백질 바이러스만을 갖는 캡시드를 포함하는 A형 간염 바이러스(엔테로바이러스 속) 및 구제역 바이러스(아프토바이러스)를 연구하였다. 바이러스들을 정제 및 감염력 및 안정성의 측정을 포함하는 종래의 방법에 따라 준비하였다. 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 상술한 대로 준비하였다. 특정한 염용액 및 특정한 온도에서의 에틸렌이민의 pKa 값들을 측정하였다. 각 바이러스에 대해 표 4에 기술된 것과 같은 조건을 이용하여 바이러스 및 선택된 바이러스 불활성화제, 즉, 에틸렌이민 올리고머를 특정한 pH, 온도 및 농도에서 혼합하였다.
[표 4]
20℃에서 에틸렌이민 사량체의 작용에 의한 일부 동물 바이러스 감염력의 불활성화(15-20자리)를 위한 시간
*) 바이러스의 타입 및 균주, 바이러스 정제 방법 및 반응혼합물의 조성에 의존한다.
적당한 시간 간격으로 취한 반응혼합물의 시료들에 티오설페이트(최종농도 0.1M)를 30분간 보충하여 과량의 불활성화제를 켄칭(quenching)하고, 반응혼합물의 감염력 역가를 상술한 대로 측정하였다. 이러한 바이러스 감염력이 20자리 감소하는데 필요한 시간(t1)은 상기 식을 이용하여 계산하였다. 예를 들어, 약 500인 불활성화 속도상수(당업자들에게 공지되어 있고, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 박테리오파아지 MS2와 비교되는 A형 간염 바이러스의 게놈 길이의 비교에 기초한다)를 적용할 때, 불활성화 지속시간은, 에틸렌이민 올리고머의 농도가 10-4 M(사량체의 경우)이고 불활성화 속도상수 k=500(pH 7.5)이며 log(S/S0)이 목적하는 불활성화 정도, 이 경우에는 적어도 약 20이라고 가정하면, 이 실시예에서 감염력의 감소 시간은 20℃에서 수행된 30분이다.
실시예 4
라브도바이러스. 단일가닥 RNA 바이러스 및 지질-엔벨로프를 갖는 뉴클레오캡시드를 포함하는 소포성 구내염 바이러스(VSV; vesicular stomatitis virus)를 연구하였다.
VSV는 사람 A549 세포내에서 배양된다. 준비된 EMC 스톡들은 마우스 L929 또는 사람 A549 세포들이다. 배양 및 분석방법은 당업자들에게 공지되어 있다. VSV의 감염력은 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM 배양액내의 10-배 연속 희석물에 대해 종점에서 측정하였다. 각 희석물은 96웰 마이크로타이터 플레이트들에 있는 사람 A549 세포들의 8 복제 웰(replicate wells)들을 접종하는데 이용된다. 바이러스 유발 세포병원성(cytopathology)을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션 한 후에 채점하였다. 보고된 바이러스 역가는 공지된 방법을 이용하여 채점된다.
세포-연합(cell-associated) VSV는 150㎠ 조직 배양 플라스크내에서 사람 4549 세포의 컨플루언트 단층(confluent monolayer)을 혈청이 없는 DMEM내의 5ml의 107 ID50/ml VSV와 함께 37℃, 5% CO2 하에서 인큐베이션함으로써 준비한다. 이들 조건하에서의 감염다중성(multiplicity of infection)은 약 2.1 TCID50/세포이다. 불활성화를 평가하기 위해서, 폴리스티렌 튜브 내의 DMEM내의 세포-연합 바이러스에 선택적 에털렌이민 올리고머 불활성화제를 3ml 분취량으로 첨가한다. 반응혼합물들의 분취량들을 일정한 시간 간격으로 취하여 티오설페이트(최종농도 0.1M)를 30분간 공급하여 과량의 선택적 불활성화제를 켄칭한다. 원심분리에 의해 세포들을 제거하고 상청액 및 재분산된 펠렛의 감염력 역가를 평가한다. 이들 바이러스 감염력이 20자리 정도 감소되는 시간 t1을 상술한 식을 이용하여 계산한다.
선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제의 존재 하에서 전혈(5×109 적혈구/ml)에 첨가된 세포 유리(cell free) VSV의 불활성화를 평가한다. 바이러스 감염력은 본원에 기술된 대로 평가한다. 바이러스 감염력이 20자리 정도 감소되는 시간 t1을 상술한 식을 이용하여 계산한다. 적혈구 구조 및 기능을 평가한다.
실시예 5
오르토믹소비리다에. 단일가닥 분절된 RNA, 음성 쇄(negative chain), 지질-엔벨로프 캡시드 바이러스인 인플루엔자 A 바이러스의 불활성화를 연구한다. 바이러스들을 정제 및 감염력 및 안정성의 측정을 포함하는 종래의 방법에 따라 준비한다. 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제는 상술한 대로 준비한다. 특정한 염용액내 및 특정한 온도에서의 에틸렌이민의 pKa 값들을 측정한다. A형 인플루엔자 바이러스 및 선택된 바이러스 불활성화제, 즉, 에틸렌이민 올리고머를 바이러스에 대해 상술한 조건을 이용하여 특정한 pH, 온도 및 농도에서 혼합한다. 바이러스 감염력은 본원에 기술된 대로 평가한다. 이들 바이러스 감염력이 20자리 정도 감소되는 시간 t1을 상술한 식을 이용하여 계산한다.
실시예 6
사람 면역결핍바이러스 (단일가닥 RNA 게놈 2 사본, 자주 캡시드 단백질이 돌연변이됨)를 연구한다. 세포-유리 또는 세포내 형태의 HIV를 시험관 내에서 전혈 또는 적혈구 농축물에 첨가한다. 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제를 가하고 시료의 처리후 HIV 항원 측정을 행한다. 바이러스 감염력은 본원에 기술된 대로 평가한다. 이들 바이러스 감염력이 20자리 정도 감소되는 시간 t1을 상술한 식을 이용하여 계산한다.
전술한 설명으로부터, 본 발명의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제 및 방법들이 병원, 실험실, 키트의 일부가 되는 경우 등 여러 가지 경우에, 세포- 또는 생체고분자물질-함유 조성물 내의 혈액-전염 바이러스, 세균, 또는 기생충을 불활성화하는데 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 세포 조성물들은 여러 가지 단백질들도 포함하기 때문에, 본원의 바이러스 불활성화는 단백질 분획들, 특히, 응고인자(인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ와 같은), 혈청 알부민 및/또는 면역글로불린을 포함하지만. 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 혈장 단백질 분획들 또는 정제된 혈액제품들에도 적용될 수 있다. 바이러스 및 세균 불활성화는 단백질 분획들 또는 정제된 단백질을 본원의 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제로 처리함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 다른 바이러스 불활성화 방법들과 혼용될 수 있다. 예를들어. 의학 제품의 제조에 이용되는 특수한 방법(예컨대, 낮은 pH의 버퍼 내에서의 크로마토그래피 또는 칼슘 킬레이트제를 포함하는 산성 용액 내의 적혈구의 보관)들은 선택된 감수성이 높은 바이러스, 대개 엔벨로프 바이러스들에 대해 부수적인 바이러스 불활성화 특성들을 가질 수 있다. 에틸렌이민의 이용은 이러한 바이러스들을 불활성화하는데 있어 이러한 약제를 보조할 것이다.
실시예 7
주변 단백질 농도로부터의 반응속도의 독립성
파아지 MS2의 불활성화를 최대 3%(30mg/ml) 농도의 단백질의 존재 및 부재하에서 측정하여 배지 내의 높은 단백질 농도가 바이러스 게놈과의 반응속도에 현저한 영향을 미치는지를 확인하였다. 0.15 M NaCl에 현탁된 MS2 파아지를 동일한 용적의 사람 혈청 알부민에 첨가하였다. 올리고에틸렌이민 삼량체 및 사량체를 파아지 현탁액에 최종농도가 각각 0.4 mM 는 0.2mM이 되도록 첨가하여 pH 7.0, 25℃에서 인큐베이션하였다. 주기적으로, 시료를 취하여 잔류 감염력 (파아지 역가)에 대하여 분석하였다. 계산된 속도상수는 표 5에 나타내었다.
[표 5]
사람 혈청 알부민의 존재 하에서의 파아지 MS2의 불활성화 속도상수
바이러스 불활성화 속도에 대해 고농도 단백질은 검출가능한 정도의 영향을 미치지 않았는데, 이는 에틸렌이민과 바이러스 게놈 사이의 반응의 높은 선택성을 뒷받침해 주고 핵산 변형이 고농도의 단백질 또는 다른 생체고분자물질을 함유하는 생물학적 유체(fluids) 또는 기타의 유체에서도 이루어질 수 있다는 것을 확인해 준다.
실시예 8
파아지 감염력의 불활성화(핵산 변형)의 특이성: 에틸렌이민 올리고머들에 의한 단백질의 변형 없음
에틸렌이민 단량체(25 mM), 삼량체(0.4 mM) 및 사량체(0.2 mM)에 의한 MS2 파아지의 불활성화를 0.02M 인산염 버퍼내, PH 7.0-7.2, 25℃하, 0.9%의 사람 혈청 알부민의 존재 하에서 다양한 불활성화 정도로 행하였다. 티오설페이트(0.1 M 최종농도)와의 반응에 의한 불활성화 반응의 완료후, 각 인큐베이션으로부터의 시료들을 12.5% 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 및 등전집중(isoelectric focusing)[pH 범위 3 내지 7]에 의해 비교하였다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 양자에서 80자리 까지의 불활성화 이후에 알부민 상의 차이가 검출되지 않았는데, 이는 단백질의 크기에 대해 불활성화가 유의할 만한 영향을 미치지 않은 것을 가리킨다.
[표 6]
에틸렌이민 올리고머에 의한 단백질 변형의 부재, SDS-PAGE 분석
# 환원 및 비-환원 SDS-PAGE의 경우, 약 5 개의 희미한 고분자량 밴드들과 함께 약 68kDa에서 두드러진 주요 밴드.
* 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에서 변화 없음.
그러나, 표 7에 나타난 바와 같이, 등전집중(IEF)에 의한 알부민 시료의 분석은 에틸렌이민 삼량체 및 사량체는 그렇지 않았지만 에틸렌이민 단량체에 의한 불활성화는 알부민에서 전하 이질성(charge heterogeneity)을 현저하게 향상시켜 그것을 더욱 염기성으로 만들었다는 것을 입증하였다. 이것은 에틸렌이민 단량체는 알부민을 변형시켰고 그의 전하를 변화시켰다는 것을 가리킨다. 이와 대조적으로, 에틸렌이민 삼량체 및 사량체는, 81자리까지의 동일한 정도의 불활성화에서, 알부민 전하에 대해 감지할 수 있는 정도의 영향을 미치지 않았다. 이것은 동일한 조건하에서의 에틸렌이민 단량체에 의한 불활성화 반응이 핵산은 물론 단백질들을 변형시키는 반면에, 에틸렌이민 올리고머에 의한 불활성화 반응은 핵산에 대해 고도로 선택적이라는 젓을 가리킨다.
[표 7]
에틸렌이민 올리고머에 의한 단백질 변형의 부재, 등전집중 분석
# pI 약 5.5에서 하나의 주밴드
* 주밴드의 높은 폭 및 확산, 주로 높은 양전하의 방향으로(보다 염기성)
실시예 9
엔벨로프 동물 바이러스의 불활성화
엔벨로프 동물 바이러스의 불활성화를 알아보기 위해서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VE; Venezuelan Equine Encephalitis virus)를 0.2% 우혈청 알부민을 포함하는 0.02M 인산염 버퍼내에서 22 또는 37℃하에서 24시간까지 에틸렌이민 삼량체(2 mM) 또는 사량체(0.5 mM)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 혼합물로부터 주기적으로 시료를 취하여 잔류 바이러스 농도에 대해 적정하였다. 처음 7시간 동안의 데이터로부터 불활성화 속도상수를 구하였다. 결과는 하기 표 8에 도시하였다:
[표 8]
에틸렌이민 올리고머에 의한 베네수엘라 말 뇌염 바이러스의 불활성화 속도상수
실시예 10
엔벨로프 동물 바이러스의 불활성화 중의 항원 에피톱의 보존
에틸렌이민 올리고머에 의한 불활성화 중의 항원 에피톱의 보존을 입증하기 위해서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스를 37℃에서 2 mM의 에틸렌이민 삼량체에 의해 7시간까지 불활성화하였다. 3시간 및 7시간의 불활성화 이후의 바이러스의 항원성을 3가지 상이한 단클론 항체들을 이용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 종점역가를 측정하여 불활성화 이전의 바이러스의 역가와 비교하였다. 이용된 단클론 항체들은 1A1B-9, 7A1A-1, 및 7A3A-4이었다. 항체 1A1B-9는 타입-특이적인 항원을 인식하는 반면에, 항체 7A1A-1, 및 7A3A-4는 바이러스 캡시드 항원의 펼침(unfolding) 이후에 노출되는 숨은 에피톱을 인식한다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 8자리의 불활성화(3시간 불활성화) 또는 약 18.7자리의 불활성화(7시간 불활성화) 이후에 항원 반응성에는 아무런 변화가 없었다.
[표 9]
에틸렌이민 삼량체(2 mM)에 의한 베네수엘라 말 뇌염 바이러스의 불활상화 중의 항원 에피톱의 보존
실시예 11
에틸렌이민 올리고머의 브롬화물 염에 의한 MS2 파아지 불활성화의 동력학
에틸렌이민 올리고머의 브롬화물 염에 의한 MS2 파아지 불활성화의 동력학을 알아보기 위해서, 파아지를 25℃에서 24시간까지 다양한 시간 동안, pH 7.0의 몇몇 버퍼중 하나에서, 에틸렌이민 삼량체, 에틸렌이민 사량체, 에틸렌이민 삼량체의 히드로브롬화물 염(β-브로모에틸-디에틸렌트리민 트리브로모히드레이트) 또는 에틸렌이민 사량체의 히드로브롬화물 염(2-브로모에틸-트리에틸렌테트라아민 테트라브로모히드레이트)와 함께 인큐베이션하였다. 잔류 감염력을 측정하기 위해서 주기적으로 시료를 취하여, 감염력 불활성화의 속도상수를 구하였다. 표 10에 나타낸 결과는 MS2 파아지가 브롬화물 염과 함께 인큐베이션되었을 때 각각의 에틸렌이민의 삼량체 및 사량체로의 전환에 의해 불활성화되었다는 것을 가리킨다. 대응하는 에틸렌이민 올리고머의 존재 하에서의 불활성화에 비해 브롬화물 염의 불활성화의 다소 느린 속도는 전환이 약 30-40%만 완전했다는 것을 가리킨다. 그럼에도 불구하고, 할로겐 염의 이용은 그들의 높은 안정성 및 편리성 때문에 바람직할 수 있다. 데이터는 인산면 음이온이 반응을 억제한다는 것도 설명해 주는데, 이것은 아마도 에틸렌이민 올리고머와 핵산 사이의 상호작용을 방해하는 그의 높은 음전하에 기초할 것이다.
[표 10]
에틸렌이민 삼량체 및 사량체 및 대응하는 브롬화물 염에 의한 MS2 파아지의 불활성화 속도상수
A : 0.15 M NaCl
B : 0.075 M NaCl, 0.2 M MOPS
C : 0.1 M NaCl, 0.025 M 인산염
D : 0.075 M NaCl, 0.2 M 인산염
이상에서 바이러스와 관련하여 기술하였지만, 본 발명의 방법은 저장된 혈액 또는 혈액제품내에서 발견되는 세균 및 혈액-전염 기생충들을 포함하는 모든 생물학적 오염균들을 불활성화시키는데도 유용하다.
앞서 발명의 이해를 명확하게 하기 위하여 상세하게 기술하였지만, 일정한 변형들이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것이 자명하다.
본원에 언급된 모든 참고문헌 및 특허 문헌들은 전문 그대로 본원에 참고 자료로 첨부된다.
Claims (12)
- 바이러스 불활성화 조건하에서 생물학적 조성물을 선택적 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 생물학적 조성물 내의 감염성 바이러스의 불활성화 방법,
- 제 1항에 있어서, 상기 에틸렌이민 올리고머가 삼량체, 직선상 사량체, 또는 분지상 사량체인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 조성물이 생체고분자물질-함유 조성물인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 조성물이 세포-함유 조성물인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이러스가 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 파포바바이러스, 파르보바이러스, 레오바이러스, 오르비바이러스, 로타바이러스, 알파바이러스, 루비바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 파라믹소바이러스, 모르빌리바이러스, 뉴모바이러스, 베지큘로바이러스, 리사바이러스, 피코르나바이러스, 오르토믹소바이러스, 부냐바이러스, 플레보바이러스, 나이로바이러스, 헤파드나비리다에, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 및 필로비리다에로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 접촉 단계가 생물학적 조성물을 0.0001 M 내지 0.015M 에틸렌이민 올리고머 불활성화제와 함께 pH 6.5 내지 pH 8.5에서 0.1 M 내지 0.2 M의 이온강도를 갖는 용액 내에서 15℃ 내지 30℃에서 1시간 내지 500 시간 동안 인큐베이션하는 과정을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 접촉 단계가 상기 조성물을 0.007 M 에틸렌이민 올리고머와 함께 pH 7.0 내지 pH 8.0에서 0.15 M의 이온강도를 갖는 용액 내에서 인큐베이션하는 과정을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 조성물이 포유동물 전혈, 정제된 또는 부분적으로 정제된 혈액 단백질, 혈구 단백질, 우유, 타액, 혈장, 혈소판-풍부 혈장, 혈장농축물, 상기 혈장의 임의의 분별 침강물, 상기 혈장의 임의의 분별 상청액, 혈청, 저온형침강물, 저온형상청액, 세포용해물, 포유동물 세포 배양물, 태반추출물, 발효생성물, 및 혈구내에 유도된 단백질들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 조성물이 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 백혈구 농축물, 정액, 복수, 포유동물세포 , 비-포유동물 세포 및 포유동물 전혈로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 조성물이 피브리노겐, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 X, 면역글로불린, 프리알부민, 레티놀-결합 단백질, 알부민, 알파-글로불린, 감마-글로불린, 보체 성분, 피브로넥틴, 안티트롬빈 Ⅲ, 헤모글로빈, 인터페론, 성장인자, 플라스미노겐 활성화인자, 성장호르몬, 인슐린 및 에리트로포이에틴으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 방법,
- 제 1항에 있어서, 상기 바이러스가 엔벨로프 바이러스인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이러스가 비-엔벨로프 바이러스인 방법,
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