PL184466B1

PL184466B1 - Zastosowanie estru ditiokarbaminianowego

Info

Publication number: PL184466B1
Application number: PL95342067A
Authority: PL
Inventors: Medford@Russel@M; Alexander@R@Wayne; Parthasarathy@Sampath; Khan@Bobby@V; Offerman@Margaret@K
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-10
Publication date: 2002-11-29
Also published as: WO1995030415A1; US5773209A; EP0759752A4; NO964742D0; CA2189336A1; US5811449A; JP3120091B2; US5750351A; PL180874B1; HUT76728A; MX9605450A; US5807884A; GEP20012409B; BR9507716A; SK136496A3; BG101030A; KR100394157B1; US5773231A; US5846959A; NO964742L

Abstract

1. Zastosowanie estru ditiokarbaminianowego o wzorze A oznacza fizjologicznie odszczepialna grupe opuszczajaca inna niz farmaceutycznie dopuszczalny kation; B oznacza grupe o wzorze NR2 R3 , w którym R2 i R3 niezaleznie od siebie oznaczaja grupe alkilowa, gru- pe o wzorze -(CHOH)n (CH2)nOH, grupe o wzorze -(CH2)„CO2R , w którym n oznacza 1,2,3, 4,5 lub 6; grupe hydroksy (C1 -6)alkilowa; grupe alkenylowa; grupe alkilo (CO2H), alkenylo(C02H ), alkinylo- -(CO2H) lub grupe arylowa, ewentualnie podsta- wiona grupa -NO2, -CH3, t-butylowa, -CO2H, ato- mem chlorowca, lub grupa p-OH; wzglednie R2 i R3 razem tworza mostek o wzorze -(CH2)m -, w którym m oznacza 3, 4,5 lub 6, a R4 oznacza alkil, aryl alkilo- aryl lub aryloalkii; do wytwarzania leku do leczenia choroby sercowo-naczyniowej u gospodarza. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie estru ditiokarbaminianowego do wytwarzania leku do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1, a więc do leczenia choroby sercowo-naczyniowej oraz chorób zapalnych.

Adhezja leukocytów (krwinek białych) do śródbłonka stanowi podstawowe, wczesne zjawisko w wielu różnych stanach zapalnych, do których należy miażdżyca, choroby autoimmunologiczne oraz zakażenia bakteryjne i wirusowe. Rekrutacja leukocytów do śródbłonka zaczyna się wtedy, gdy indukowalne receptory cząsteczki adhezyjnej na powierzchni komórek śródbłonka reagują z odpowiadającymi im przeciwreceptorami na komórkach immunologicznych. O tym, które typy leukocytów (monocyty, limfocyty czy neutrofile) ulegają rekrutacji, decydują komórki śródbłonka naczyniowego przez selektywną ekspresję swoistych cząsteczek adhezyjnych, takich jak cząsteczka adhezji komórkowej naczyń - 1 (VCAM-1), cząsteczka adhezji międzykomórkowej - 1 (ICAM-1) i E-selektyna. Na najwcześniejszym etapie powstawania uszkodzenia miażdżycowego zachodzi miejscowa ekspresja VCAM-1 na śródbłonku i selektywna rekrutacja leukocytów jednojądrzastych wywołujących ekspresję przeciwreceptora integryny VLA-4. Ponieważ selektywna ekspresja VLA-4 zachodzi na monocytach i limfocytach, ale nie na neutrofilach, VCAM-1 odgrywa istotnąrolę w regulowaniu selektywnej adhezji leukocytów jednojądrzastych. W wyniku następczego przejścia leukocytów w piankowate makrofagi, zachodzi synteza różnorodnych cytokin zapalnych, czynników wzrostu i chemicznych czynników przyciągających, które umożliwiają rozprzestrzenienie rekrutacji leukocytów i płytek krwi, namnażanie komórek mięśni gładkich, aktywację komórek śródbłonka i syntezę macierzy pozakomórkowej, charakterystyczne dla dojrzewania blaszki miażdżycowej.

VCAM-1 ulega ekspresji w hodowli ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego po aktywacji lipopolisacharydem (LPS) i cytokinami takimi, jak interleukina 1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworu (TNF-α). Czynniki te nie są selektywne dla aktywacji ekspresji komórkowych cząsteczek adhezyjnych. Schemat I przedstawia proces aktywacji cytokinami genu ekspresji VCAM-1 w komórkach śródbłonka naczyniowego.

184 466

Schemat I

l.Cytokina wiąże się ze swym rpceptorsni .y.y-~~.·.

• w .Aktywowany**i receptor wytw.\. sygnał wewnątrzkomórkowy

3.Aktywacja transkrypcyj nego □iałka regulacyj nego

4.Przemieszczeni do jądra__——----Z-.Wiązanie specyficzny zeiementem wzmacnia] 'DNA na promotorz VCAM-I

Regulacja aktywacji cytokinami genu ekspresji cząsteczki adhezji komórkowej naczyń -1 (VCAM-1) przez czynniki regulacyjne wrażliwe na reakcje utleniania i redukcji (reakcje redox), takie jak - NF- kp, w komórkach śródbłonka naczyniowego (IkB stanowi podjednostkę hamującą; nF- kp stanowi czynnikjądrowy -kB; NH₃ oznacza koniec aminowy białka, a RNA Pol II stanowi polimerazę II RNA).

Analiza cząsteczkowa elementów regulacyjnych na ludzkim genie VCAM-1, kontrolujących jego ekspresję, pozwala sądzić, że istotną rolę we wrażliwej na reakcję redox ekspresji genu VCAM-1 odgrywa czynnikjądrowy - kB (NF- kp), transkrypcyjny czynnik regulacyjny, lub NF- p - podobne białko wiążące. Czynniki transkrypcyjne stanowią białka aktywujące (lub hamujące) ekspresję genu wewnątrz jądra komórki poprzez przyłączanie się do swoistych sekwencji DNA, zwanych „czynnikami wzmacniającymi”, położonymi zwykle obok regionu genu, zwanego „promotorem”, od którego rozpoczyna się synteza RNA. Czynnik jądrowy - kB stanowi powszechnie ulegający ekspresji wielopodjednostkowy czynnik transkrypcyjny, aktywowany w komórkach kilku typów przez szeroką i różnorodną grupę czynników zapalnych, takich jak TNF-α i L-1 p, endotoksyny bakteryjne i wirusy RNA. Odgrywa on kluczowąrolę w mediacji sygnałów zapalnych i innych sygnałów stresowych do jądrowego systemu regulacji. Jakkolwiek nieznane są ścisłe sygnały biochemiczne, aktywujące NF-kB, ten czynnik transkrypcyjny może sprowadzać do jednego szlaku cząsteczkowego liczne czynniki ryzyka i „sprawcze” czynniki miażdżycy, takie jak hiperlipidemia, palenie papierosów, nadciśnienie tętnicze i cukrzyca.

Co ważne, aktywacja NF-kB w komórkach śródbłonka naczyń przez różne sygnały może być swoiście hamowana przez przeciwutleniacze, takie jak N-acetylocysteina i dwutiokar- baminian pirolidynowy (porównaj zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/969 934). Odkrycie tego zjawiska doprowadziło do wysunięcia hipotezy, że rodniki tlenowe odgrywają istotną rolę w aktywacji NF-kB poprzez niesprecyzowany mechanizm redox. Ponieważ element zwiększający NF-kB - podobny reguluje również transkrypcję promotora VCAM- 1 w sposób związany z wrażliwościąna reakcję redox, stres oksydacyjny w uszkodzeniu miażdżycowym może odgrywać rolę w regulacji ekspresji genu VCaM-1 poprzez to transkrypcyjne białko regulujące, wrażliwe na reakcje redox.

184 466

Uważa się, że modyfikacja lipoproteiny o małej gęstości (LDL) do oksydacyjnie zmodyfikowanej LDL (ox-LDL) poprzez reaktywne postacie tlenu stanowi główne zjawisko, powodujące powstawanie i szerzenie się miażdżycy. Steinberg i wsp., N. Engl. J. Med. 1989; 320:915-924. Utleniona LDL stanowi złożoną strukturę, utworzoną z co najmniej kilku chemicznie odrębnych materiałów utlenionych, z których każdy, oddzielnie lub w połączeniu, jest zdolny do modulacji ekspresji genu aktywowanej przez cytokinę cząsteczki adhezyjnej. Wodorotlenki kwasów tłuszczowych, takie jak wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE), wytwarzająsię z wolnych kwasów tłuszczowych wskutek działania lipoksygenaz i stanowią ważny składnik utlenionej LDL.

Twierdzi się, że generacja lipidów utlenionych wytwarza się poprzez działanie układu lipoksygenazy komórkowej i że utlenione lipidy są następnie przenoszone na LDL. Zachodzi zatem reakcja szerzenia się wewnątrz LDL w ośrodku, katalizowana przez metale przejściowe i/lub związki sulfhydrylowe. W uprzednich badaniach wykazano, że modyfikacja kwasów tłuszczowych hodowli komórek śródbłonka może zmieniać ich podatność na uraz oksydacyjny. Dodanie nasyconych lub jednonienasyconych kwasów tłuszczowych do hodowli komórek śródbłonka zmniejsza ich podatność na uraz oksydacyjny, natomiast dodanie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) zwiększa tę podatność na uraz oksydacyjny.

Stosując analizę HPLC z odwróconymi fazami natywnych i' zmydlonych ekstraktów lipidowych LDL, wykazano, że 13-HPODE stanowi dominujący utleniony kwas tłuszczowy w LDL utlenionej przez aktywowane monocyty ludzkie. Przewlekłe narażenie na utlenione LDL stanowi sygnał oksydacyjny dla komórek śródbłonka naczyniowego, prawdopodobnie poprzez swoisty wodorotlenek kwasu tłuszczowego, który wybiórczo zwiększa ekspresję genu indukowanej przez cytokinę VCAM-1.

Poprzez niedokładnie jeszcze zdefiniowany mechanizm, obszary ściany naczyniowej, predysponowane do miażdżycy, preferencyjnie wychwytują krążącą LDL. Poprzez nie w pełni poznany szlak komórki śródbłonka mięśni gładkich i/lub komórki zapalne powodują następnie przejście LDL w ox-LDL. W przeciwieństwie do LDL, wychwytywanej przez receptor LDL, monocyty chciwie wychwytują ox-LDL poprzez receptor „wymiatacza”, którego ekspresja, w przeciwieństwie do ekspresji receptora LDL, nie jest hamowana w miarę wzrostu poziomu lipidów wewnątrzkomórkowych. Tak więc, monocyty nadal wychwytują ox-LDL i przekształcają się w wypełnione lipidami piankowate komórki makrofagowe, wytwarzające pasmo tłuszczowe.

Biorąc pod uwagę, że choroby sercowo-naczyniowe stanowią obecnie główną przyczynę zgonu w Stanach Zjednoczonych, oraz to, że 90% chorób sercowo-naczyniowych rozpoznaje się obecnie jako miażdżycę, istnieje wyraźna potrzeba wynalezienia nowych sposobów i środków farmaceutycznych do leczenia tych chorób. Dla osiągnięcia tego celu ważne jest zidentyfikowanie i manipulacja swoistymi utlenionymi związkami biologicznymi, działającymi jako wybiórcze regulatory ekspresji mediatorów procesu zapalnego, a w szczególności, VCAM-1. Celem bardziej ogólnym jest zidentyfikowanie wybiórczych sposobów hamowania ekspresji genów wrażliwych na reakcje redox lub aktywacji wrażliwych na reakcje redox genów, które ulegają hamowaniu.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie estru ditiokarbaminianowego o wzorze s

ll ΐ A--S-C--B w którym

A oznacza fizjologicznie odszczepialną grupę opuszczającą inną niż farmaceutycznie dopuszczalny kation;

B oznacza grupę o wzorze NR²R³, w którym R² i R³ niezależnie od siebie oznaczają grupę alkilową, grupę o wzorze -(CHOH)n(CH2)nOH, grupę o wzorze -(CH2>nCO2R⁴, w którym n oznacza 12,3,4, 5 lub 6; grupę hydroksy(C1_₆)alkilową; grupę alkenylową; grupę alkilo(CO2H), alkenylo(CO2H), alkinylo(CO2H) lub grupę arylową, ewentualnie podstawioną grupą -NO2, -CH3

184 466 t-butylową, -CO2H, atomem chlorowca, lub grupąp-OH; względnie R² i R³ razem tworzą mostek o wzorze -(CH2)_m., w którym m oznacza 3,4,5 lub 6, a R⁴ oznacza alkil, aryl alkiloaryl lub aryloalkil; do wytwarzania leku do leczenia choroby sercowo-naczyniowej u gospodarza.

Korzystnie, zastosowanie dotyczy estru ditiokarbaminianowego, w którym A oznacza acyl, alkil, grupę fosforanową, grupę siarczanową lub grupę sulfonianową.

Korzystnie, zastosowanie dotyczy estru ditiokarbaminianowego, w którym A oznacza acetyl, propionyl lub butyryl.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby sercowo-naczyniowej, którąjest miażdżyca tętnic.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby sercowo-naczyniowej, którąjest nawrót zwężenia po dokonanej plastyce tętnic.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby sercowo-naczyniowej, którąjest choroba tętnicy wieńcowej.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby sercowo-naczyniowej, którąjest dusznica bolesna.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia ludzi.

Zastosowanie według wynalazku, korzysnie, dotyczy wytwarzania leku, w którym substancja czynna zawarta jest w ilości 0,5 - 500 mg/kg ciężaru ciała.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie estru ditiokarbaminianowego o wzorze

S

U « ^B w którym A-S-C--B

A oznacza fizjologicznie odszczepiamą grupę opuszczającą inną niż farmaceutycznie dopuszczalny kation;

B oznacza grupę o wzorze NR2R3, w którym R2 i R3 niezależnie od siebie oznaczają grupę alkilową, grupę o wzorze -(CHOH)_n(CH2)_nOH, grupę o wzorze - (CH2)nCO2R4, w którym n oznacza 1,2, 3,4, 5 lub 6; grupę hydroksy (C₁.₆)alkilową; grupę alkenylową; grupę alkilo(CO2H), alkenylo(CO₂H), alkinylo(CO2H) lub grupę arylową, ewentualnie podstawioną grupą NO2, -CH3, t-butylową, -CO₂H, atomem chlorowca, lub grupąp-OH; względnie R2 i R3 razem tworzą mostek o wzorze -(CH2)_m-, którym m oznacza 3,4,5 lub 6, a R4 oznacza alkil, aryl alkiloaryl lub aryloalkil; do wytwarzania leku do leczenia choroby zapalnej u gospodarza.

Korzystnie, zastosowanie dotyczy estru ditiokarbaminianowego, w którym A oznacza acyl, alkil grupę fosforanową, grupę siarczanową lub grupę sulfonianową.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby zapalnej, którąjest reumatoidalne zapalenie stawów.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby zapalnej, którąjest gościec zwyradniający.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby zapalnej, którą jest astma.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby zapalnej, którąjest zapalenie skóry.

Zastosowanie według wynalazku, korzystnie, odnosi się do choroby zapalnej, którąjest stwardnienie rozsiane.

184 466

Wytworzony lek wybiórczo hamuje VCAM-1, a więc znajduje zastosowanie do leczenia schorzenia lub zaburzenia, występującego u ludzi, w którego powstawaniu ma udział ekspresja lub hamowanie genu wrażliwego na reakcje redox, a zwłaszcza do leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych.

Stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe (“PUFA”) i ich wodorotlenki (“oxPUFA”), stanowiące ważne składniki oksydatywnie zmodyfikowanych lipoprotein o małej gęstości (LDL), zwiększają ekspresję VCAM-1, lecz nie zwiększają ekspresji wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1) ani E-selektyny w ludzkich komórkach śródbłonka aorty, poprzez mechanizm, którego mediatorem nie sącytokiny ani inne sygnały niecytokinowe. Stanowi to podstawowe odkrycie ważnego i nieznanego uprzednio szlaku biologicznego odpowiedzi immunologicznych, których mediatorem jest VCAM-1.

Nieograniczajace przykłady związków zwiększających ekspresję genu powierzchni komórki VCAM-1, lecz nie ICAM-1 ani E-selektyny, stanowią kwasy linolowy, kwas linolenowy, kwas arachidonowy, wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE) i wodorotlenek arachidonowy (15-HPETE). Nasycone kwasy tłuszczowe (takie jak kwas stearynowy) i jednonienasycone kwasy tłuszczowe (takie jak kwas oleinowy) nie indukują ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny.

Indukcja VCAM-1 poprzez PUFA i ich wodotlenki kwasów tłuszczowych jest hamowana przez przeciwutleniacz ditiokarbaminian pirolidynowy (PDTC). Wskazuje to, że mediatorem indukcji jest utleniona cząsteczka sygnałowa, i że indukcja nie zachodzi, gdy utlenianie tej cząsteczki jest blokowane (to znaczy, utlenienie nie zachodzi), odwracane (to znaczy, cząsteczka sygnałowa ulega redukcji) lub wtedy, gdy uniemożliwia się interakcję tego sygnału, zmodyfikowanego przez reakcje redox, z jego celem regulacyjnym.

Komórki przewlekle narażone na wyższy od prawidłowego poziom wielonienasyconych kwasów tłuszczowych lub ich utlenionych odpowiedników mogą dawać początek nieprawidłowej odpowiedzi immunologicznej, pozostającej w dysproporcji do obecnego zagrożenia, prowadzać do stanu chorobowego. Nadmierne uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego na PUFA i ox-PUFA może przyśpieszać tworzenie się, na przykład, blaszki miażdżycowej.

W oparciu o te odkrycia opracowano sposób leczenia miażdżycy, restenozy po angioplastyce, chorób naczyń wieńcowych, dusznicy bolesnej i innych chorób sercowo-naczyniowych, jak również chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatorem jest VCAM-1, przy czym sposób ten polega na usunięciu, zmniejszeniu stężenia lub zapobieganiu wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takichjak np. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy (C_lg Δ⁹’¹²), linolenowy (C18 Δ⁶’⁹’¹²), arachidonowy (C20 Δ^¹¹·¹⁴) i eikozatrienowy (C20 Δ ⁵·8>^ηΊ⁴). Nieograniczające przykłady chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatoremjest VCAM-1, stanowią reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, dychawica oskrzelowa, zapalenie skóry i stwardnienie rozsiane.

Metoda ta stanowi znaczący postęp w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, ponieważ wybiega poza obecnie stosowane sposoby, skierowane jedynie na hamowanie postępu choroby, i przy właściwym jej stosowaniu zapewnia możliwość zachowawczego „wyleczenia” miażdżycy poprzez zapobieganie tworzeniu się nowych blaszek i powodowanie zaniknięcia blaszek już powstałych.

Sposób hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcję redox lub aktywacji genu hamowanego we wrażliwym na reakcje redox szlaku, polega na podawaniu skutecznej ilości substancji zapobiegającej utlenianiu sygnału, a typowo, utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego. Przykładowe geny wrażliwe na reakcje redox, związane z prezentacją odpowiedzi immunologicznej, stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, geny powodujące ekspresję cytokin biorących udział w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej (np. IL-Ίβ), chemiczne środki przyciągające, ułatwiające migrację komórek zapalnych do miejsca uszkodzenia (np. MCP-1), czynniki wzrostu (np. IL-6 i receptor trombiny) i cząsteczki adhezyjne (np. VCAM-1 i E-selektyna).

184 466

Ocenia się ilościowo poziom krążących lub znajdujących się na powierzchni komórki V CAM-1 lub innego odpowiedniego markera i wpływ na ten poziom podawania odpowiedniego przeciwutleniacza.

Ocenia się uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego gospodarza na wielonienasycone kwasy tłuszczowe lub ich utlenione odpowiedniki. Można to osiągnąć np. wystawiając gospodarza na działanie PUFA lub ox-PUFA i porównując otrzymane stężenie VCAM-1 na powierzchni komórki lub krążącego, lub innego markera zastępczego z normą populacyjną.

Ocenia się modele in vivo miażdżycy lub innych chorób serca lub chorób zapalnych, których mediatorem jest VCAM-1, poprzez podawanie zwierzętom-gospodarzom nadmiernej ilości PUFA lub utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego dla wywołania choroby. Zwierzęta te można stosować w badaniach klinicznych dla dalszego dokładniejszego poznania tych zaburzeń.

Związki ocenia się ze względu na ich zdolność do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, na podstawie ich zdolności do hamowania utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym.

Można to osiągnąć poprzez narażenie gospodarza, na przykład człowieka lub zwierzęcia, np. myszy, na wysoki poziom PUFA lub ox-PUFA i następnie ocenę terapeutycznej skuteczności związku badanego w oparciu o jego zdolność do zmniejszania stężenia VCAM-1 krążących lub osadzonych na powierzchni komórek. Zamiast tego można stosować badanie przesiewowe in vitro, oparte na zdolności związku badanego do zapobiegania utlenianiu PUFA lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym wo becności substancji utleniającej, takiej jak metal, np. miedź, lub enzymu, takiego jak peroksydaza, lipoksygenaza, cyklooksygenaza lub cytochrom P-450.

Komórki śródbłonka naczyniowego wystawia się na działanie TNF-α lub innego materiału indukującego VCAM-1 przez odpowiedni czas, a następnie uszkadza się je odpowiednimi środkami, np. poprzez sonikację lub zamrażanie-rozmrażanie. Izoluje się przedziały cytozolowe i błonowe. Wyznakowane radioaktywnie PUFA dodaje się do określonych ilości przedziałów. Bada się zdolność płynu do przemiany PUFA w ox-PUFA wo becności lub w nieobecności związku badanego. Zamiast układu komórek uszkodzonych można stosować komórki nienaruszone.

Doustne podawanie ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC) w dawce 25-50 mg/kg/dzień dramatycznie hamowało miażdżycorodne tworzenie pasm tłuszczowych, zapalenie monocytowo-makrofagowe tętnic, ekspresję śródblonkowego VCAM-1 i w zasadzie normalizowało zależiąod śródbłonka funkcję relaksacji u królików o indukowanej dietąhipercholesterolemii, u których poziom cholesterolu wynosił powyżej 1000 mg/dl. W tych samych dawkach inne domniemane środki terapeutyczne, takie jak przeciwutleniacze probucol i witamina E, nie wywierały działania na tworzenie blaszek w tym modelu.

W doświadczalnym modelu miażdżycy, zależne od śródbłonka zwiotczenie tętnic przywraca się poprzez podawanie PDTC. W modelu króliczym z hipercholesterolemią indukowaną dietą, doustne podawanie PDTC w dawce 25-50 mg/kg/dzień powodowało powrót zależnej od śródbłonka reaktywności naczyń. Określano to poprzez badania z pierścieniem skurczowym aorty pobranej od zwierząt kontrolnych i zwierząt badanych. U pacjentów z miażdżycą zjawisko to manifestuje się jako normalizacja reaktywności naczyń obwodowych w odpowiedzi na przekrwienie, mierzone nieinwazyjnymi badaniami przepływu metodą Dopplera. Stanowi to wystandaryzowane, powszechnie dostępne i łatwe do wykonania badanie, które można wykorzystać do dobrania dawek doustnych w taki sposób, aby uzyskać skuteczne stężenie leku we krwi. PDTC działa jako lekprzeciwniedokrwienny, szybko normalizując patologiczne zmniejszenie zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń tętniczych charakterystyczne dla chorób sercowo-naczyniowych i miażdżycy. Ta poprawa przepływu krwi w naczyniach widoczna jest jako poprawa w zakresie objawów i ograniczonej przez niedokrwienie zdolności do wysiłku, oraz zapewnia

184 466 nieinwazyjną ocenę ochrony naczyń. Do innych klinicznych objawów zaburzeń zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń należy impotencja.

Cząsteczkowy układ czynników regulacyjnych kontrolujący transkrypcję genu VCAM-1 stanowi nowy układ czynników transkrypcyjnych, utworzony z podjednostekp65 i p50 z rodziny NF-kB/Rel, sprzężony krzyżowo z podjednostkami c-fos i c-jun z rodziny AP-1. Zarówno w badaniach struktury, jak i w badaniach czynności dowiedziono, że te czynniki AP-1 odgrywają ważną rolę w regulacji promotora VCAM-1, co prawdopodobnie ma kluczowe znaczenie w terapeutycznej regulacji ekspresji genu VCAM-1. Po raz pierwszy wykazano zatem rolę czynnościową tego sprzężonego krzyżowo układu transkrypcyjnego w regulacji genu endogennego.

Wynalazek bliżej objaśniono na rysunku, na którym fig. 1 stanowi wykres ekspresji na powierzchni komórki (O.D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty w zależności od liczby godzin narażenia na cytokinę TNF-α (kółko zamalowane); kwas linolowy (trójkąt zamalowany); i wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE, kwadrat zamalowany); oraz przy braku narażenia na te substancje (kontrola, kwadrat niezamalowany). Figura 2 stanowi wykres ekspresji na powierzchni komórki (O.D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na kwas linolowy (trójkąt zamalowany); i wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE, kwadrat zamalowany) w zależności od stężenia kwasu tłuszczowego (pM).

Figura 3 stanowi wykres kolumnowy ekspresji na powierzchni komórki (O.D. 450 nm) VCAM-1, ICAM-1 i E-selektyny w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na cytokinę TNF-α, kwas stearynowy, kwas oleinowy, kwas linolowy, kwas linolenowy i kwas arachidonowy.

Figura 4 stanowi wykres kolumnowy ekspresji na powierzchni komórki (O.D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na kwas linolowy, 13-HPODE, kwas arachidonowy, wodorotlenek kwasu arachidonowego (15-HPETE) z (kolumny zamalowane na czarno) lub bez (kolumny zakreskowane) przeciwutleniaczem ditiokarbaminianem pirolidynowym.

Figura 5 przedstawia autoradiogram wykazujący ostrą indukcję mRNA VCAM-1 przez kwas linolowy il 3-HPODE. HAEC narażano, lub nie, na kwas linolowy (7,5 pM), 13-HPODE (7,5 pM) lub TNF-a (100 U/ml). Wyizolowano RNA całkowite i dokonano podziału na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego ³²P cDNA A) VCAM-1 -swoistego B) β-aktyno - swoistego. Po przepłukaniu, filtry poddano ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny. Identyfikacja pasm: 1) kontrola 2) kwas linolowy (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) 3) kwas linolowy (ekspozycja 48-godzinna) 4) 13-HPODE (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) i 5) TNF-α, (100 U/ml, ekspozycja 4-godzinna).

Figura 6 przedstawia autoradiogram wykazujący, że indukcja mRNA VCAM-1 przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe nie zależy od syntezy białek komórkowych. HAEC poddawano ekspozycji na kwas linolowy (7,5 pM) lub arachidonowy (7,5 pM) wo becności lub w nieobecności cykloheksymidu (10 pg/ml) przez 4 godziny, a następnie poddawano obróbce, tak jak to opisano na fig. 5.

Figura 7 przedstawia autoradiogram wykazujący, że kwas linolowy indukuje aktywację transkrypcyjnąpromotora V CAM-1 poprzez wrażliwy na reakcj e redox czynnik NF-kB - podobny. HAEC rozszczepiono w takim stosunku, aby uzyskać około 60% konfluencję na 100 mm płytkach do hodowli tkankowych. HAEC transfekowano 30 pg plazmidu VCAMCAT p288, VCAMCAT p85 lub pSV2CAT, stosując technikę koprecypitacji fosforanu wapniowego z użyciem standardowych metod. Po 24-godzinnym okresie regeneracji HAEC poddano, lub nie, obróbce wstępnej 50 pM PDTC i po 30 minutach ekspozycji na kwas linolowy (7,5 pM) lub TNF-α (100 U/ml), dodawano bezpośrednio do płytek. Po 18 godzinach wytworzono wyciągi komórkowe przez szybkie zamrażanie-rozmrażanie w 0,25 M Tris, pH 8,0. Białka z poszczególnych wyciągów komórkowych badano pod kątem aktywności acetylotransferazy chloramfenikolu

184 466 (CAT), j ak to opisywano uprzednio (Ausubel, 1989) (Ac, chloramfenikol acetylowany N, nieacetylowany).

Figura 8 przedstawia płytkę z żelem akrylamidowym wykazującą że wielonienasycone kwasy tłuszczowe aktywują aktywność NF-kB -podobnego wiązania DNA, blokowaną przez przeciwutleniacz PDTC. Konfluentne HAEC w pożywce zawierającej 4% FBS (jak to opisano na fig. 1) poddano, lub nie, obróbce wstępnej PDTC (50 μΜ) przez trzydzieści minut, a następnie trzygodzinnej ekspozycji na, odpowiednio, kwas linolowy (7,5 μΜ), kwas oleinowy (7,5 μΜ), lub TNF-a (100 U/ml). Pięć mikrogramów wyciągu jądrowego inkubowano z dwuniciową wtVCAM-l, wyznakowaną ³²P, frakcjonowano ze względu na wielkość na 4% natywnym żelu akrylamidowym, i poddano ekspozycji na kliszę autoradiograficzną w temperaturze -70°C przez 18 godzin. Oznaczono dwa pasma A i C, odpowiadające aktywności NF-kB -podobnej. W komórkach kontrolnych (nie poddanych obróbce) obserwowano słabe pasmo B.

Figury 9A i 9B stanowią wykresy kolumnowe względnie reaktywnych na kwas tiabarbiturowy substancji (O.D. 532 nm) kwasu arachidonowego il 5-HPETE wo becności lub nieobecności PDTC. Próba reaktywności na kwas tiabarbiturowy (TBARS) pozwala zmierzyć zdolność utleniającą materiału w bezkomórkowym, nie zawierającym pożywki, środowisku.

Figura 10 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskany jak to opisano poniżej, hybrydyzowany do wyznakowanego ³²P, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Płytka A), cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Płytka B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Płytka C). Po 30-minutowej obróbce wstępnej 50 pM soli sodowej ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC), komórki HUVE (ludzkie komórki żyły pępkowej) poddano działaniu IL-lb (10 U/ml) w stałej obecności 50 pM PDTC. W oznaczonych punktach czasowych dokonano izolacji całkowitego RNA i frakcjonowania ze względu na wielkość 20 pg materiału poprzez denaturację elektroforezy na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę, hybrydyzację, jak to opisano powyżej, i uwidocznienie przez autoradiografię. Pasmo 1- godzina 0, Pasma 2,4,6,8, - tylko OL-1 przez, odpowiednio, 2,4,8 i 24 godziny. Pasma 3,5,7,9 -IL-1 i PDTC przez, odpowiednio, 2, 4, 8 i 24 godziny.

Figura 11 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskanego według powyższego opisu, hybrydyzowanego do wyznakowanego ³²P, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Kolumna A) , cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Kolumna B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Kolumna C). Komórki HUVE poddano obróbce wstępnej wskazanymi stężeniami PDTC, a następnie działaniu IL-1 b wo becności PDTC przez cztery godziny, i badano pod kątem akumulacji mRNA VCAM-1 metodą hybrydyzacji filtra techniką Northern. Pasmo 1 - kontrola, pasmo 2 - IL-1 (10 u/ml), pasmo 3 - IL-lb + PDTC (0,05 pM),pasmo4-IL-l LB + PDTC (0,5 pM),pasmo5

- IL-lb + PDTC (5,0 pM), pasmo 6 - IL-lb+PDTC (50,0 pM), pasmo 7 - IL-lb + PDTC (100 pM).

Figura 12 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskanego według powyższego opisu, hybrydyzowanego do wyznakowanego ³²P, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Kolumna A), cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Kolumna B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Kolumna C). Komórki HUVE poddano obróbce wstępnej według opisu z fig. 9,50 pM PDTC, poddano czterogodzinnej ekspozycji na niżej wskazane środki, i badano ze względu na akumulacjęmRNAVCAM-l (Kolumna A) i ICAM-1 (Kolumna B). Pasmo 1 -TNFa(100 U/ml),pasmo 2

- TNFa + PDTC, pasmo 3 - lipopolisacharyd (LPS) (100 ng/ml), pasmo 4 - LPS + PDTC/ pasmo 5

- poli(I:C) (100 mg/ml), pasmo 6 - poli(I:C) + PDTC.

Figura 13 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 i ICAM-1 na powierzchni komórki wo becności (kolumny ciemne) lub nieobecności (kolumny jasne) PDTC i wo becności różnego rodzaju bodźców indukujących. Konfluentne HUVE poddano, lub nie, obróbce wstępnej (tylko CTL) przez 30 minut 50 pM PDTC, a następnie eksponowano przez określony czas na określone środki wo becności lub nieobecności (tylko CTL) PDTC. Ekspresję na powierzchni komórek określano poprzez pierwotne wiązanie z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi swoiście przeciwko VCAM-1 (4B9) i ICAM-1 (84H10), a następnie wiązanie wtórne ze znakowanymi peroksydazą chrzanową przeciwciałami kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom mysim (IgG). Ocenę ilościową przeprowadzono, określając konwersję

184 466 kalorymetryczną przy 450 nm- TMB. Figura 13 wskazuje, że wielokrotne sygnały regulacyjne indukują VCAM-1, lecz nie ICAM-1, w ludzkich komórkach śródbłonka naczyniowego poprzez wspólny, wrażliwy na ditiokarbaminian szlak.

Figura 14 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O.D. 595 nm) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, w stosunku do stężenia różnych przeciwutleniaczy. (PDTC stanowi sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego; DETC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy, zwany również dwu- etyloditiokarbaminianem sodowym; NAC stanowi N-acetylocysteina, a DF stanowi desferoksymina).

Figura 15 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O.D. 595 nm) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, wo becności określonej ilości różnych przeciwutleniaczy. (PDTC stanowi sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego; DIDTC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy, SarDTC stanowi N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy; IDADTC stanowi N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, MGDTC stanowi N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy; MeOBGDTC stanowi N-(4-metoksybenzylo)-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy; DEDTC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy; Di-PDTC stanowi N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy, NAC stanowi N-acetylocysteina).

Figura 16 stanowi wykres odsetka komórek Molt-4 wiążących się z komórkami HUVE po stymulacji, lub bez stymulacji, TNFa (100 U/ml) przez sześć godzin wo becności lub w nieobecności PDTC.

Figura 17 ilustruje strukturę chemiczną następujących czynnych ditiokarbaminianów: pirolidyno-N-karboditiolan sodowy, N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy. N,N-dwu (karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy, N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (dwuetyloditiokarbaminian sodowy) i N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy.

Figura 18 stanowi wykres kolumnowy wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych bSa il 3-HPODE, według pomiaru w jednostkach fluorescencyjnych, w stosunku do mikromolowego stężenia PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE inkubowano z 200 mikrogramami BSA wo becności PDTC przez sześć dni. Fluorescencję mierzono w 430-460 nm ze wzbudzeniem w 330-360 nm.

Figura 19 stanowi wykres wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA i ox-PUFA w zależności od długości fali (nm) i stężenia PDTC. W miarę wzrostu PDTC zmniejsza się zawartość fluorescencyjnych związków addycyjnych.

Figura 20 stanowi wykres wpływu PDTC na utlenienie LDL przez peroksydazę chrzanową (HRP), mierzony wzrostem O.D. (234 nm) w zależności od czasu (minuty) dla zmiennego stężenia PDTC. Stwierdzono, że po okresie inkubacji PDTC hamuje utlenianie LDL przez HRP w sposób zależny od stężenia. Figura 21 stanowi wykres wpływu PDTC na indukowane cytokinami tworzenie się ox-PUFA w ludzkich komórkach śródbłonka aorty. Jak to wskazano, zarówno TNF-a, jak i IL-1B powoduje utlenienie kwasu linolowego do kwasu oksylinolowego. PDTC wyraźnie zmniejsza utlenianie.

W opisie stosowano następujące definicje

Określenie „wielonienasycony kwas tłuszczowy” (zwany również „PUFA”) oznacza kwas tłuszczowy (typowo C₈ do C24), posiadający co najmniej dwa wiązania alkenylowe; do grupy tej należą, lecz nie jest ona do nich ograniczona, kwas linolowy (C₁₈ Δ⁹·¹²), linolenowy (C₁₈ A⁶’⁹·¹²), arachidonowy (C20 Δ³’8>^ηΊ4) i eikozatrienowy (C20 Δ8ΠΊ4).

Określenie „utleniony wielonienasycony kwas tłuszczowy” oznacza nienasycony kwas tłuszczowy, w którym co najmniej jedno wiązanie alkenylowe zostało przekształcone w wodorotlenek. Nieograniczające przykłady stanowią:

184 466

ΟΟΗ

Określenie „alkil”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza nasycony węglowodór C, do C_lo, o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym (w przypadku węglowodorów C₅ lub wyższych) (lub niższy alkil, np. C1 do C₅; do grupy tej należy grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, izobutylowa, t-butylowa, pentylowa, cyklopentylowa, izopentylowa, neopentylowa, heksylowa, izoheksylowa, cykloheksylometylowa, 3-metylopentylowa, 2,2-dwumetylobutylowa i 2,3-dwumetylobutylowa). Grupa alkilowa może być ewentualnie podstawiona przy dowolnym z atomów węgla jedną lub więcej resztą dobraną z grupy, do której należy grupa hydroksylowa, aminowa i grupa aminowa z jednym lub dwoma podstawnikami, przy czym podstawnik stanowi niezależnie grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa; arylowa, alkoksylową, aryloksylowa, nitrowa, cyjanowa, kwas sulfonowy, siarczan, kwas fosfoniowy, fosforan, lub fosfonian, niezabezpieczona lub zabezpieczona, jeśli jest to niezbędne, jak jest to wiadome specjalistom, i jak to opisali np. Greene i wsp., „Protective Groups in Organie Synthesis”, John Wiley and Sons, wydanie drugie, 1991.

Określenie „grupa alkenylową”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza węglowodór C2 do C_H), o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym, z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym.

Określenie „grupa alkinylową”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza węglowodór C2 do C_w, o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, z . co najmniej jednym wiązaniem potrójnym.

Określenie „grupa aroalkilowa” oznacza grupę arylową z co najmniej jednym podstawnikiem alkilowym.

Określenie „grupa alkoarylowa” oznacza grupę alkilo wąz co najmniej jednym podstawnikiem arylowym.

Określenie „grupa chlorowcowa” (alkilowa, alkenylową lub alkinylową) oznacza grupę alkilową, alkenylową lub alkinylową, w której co najmniej jeden z atomów wodoru w grupie zastąpiono atomem chlorowca.

Określenie „grupa arylowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza grupę fenylową, bifenylową lub naftylową, korzystnie, grupę fenylową. Grupa arylowa może być ewentualnie podstawionajedną lub więcej resztą dobraną z grupy, do której należy grupa -NO2, -CH₃, t-butylowa, -CO2H, atom chlorowca lub grupa p-OH.

Określenie „grupa alkoksylową”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza cząstkę struktury -O-alkilowej.

Określenie „grupa acylowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza grupę o wzorze C(O)R’, w którym R’ stanowi grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa.

Określenie „grupa heteroarylowa lub heteroaromatyczna”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza cząstkę aromatyczną, zawierającą co najmniej jeden atom siarki, tlenu lub azotu w pierścieniu aromatycznym. Nieograniczające przykłady stanowią grupa fenazynowa, fenotiazynowa, furylowa, pirydylowa, pirymidylowa, tienylowa, izotiazolilowa, imidazolilowa, tetrazolilowa, pirazynylowa, benzofuranylowa, benzotiofenyowa, chinolilowa, izochinolilowa, benzotienylowa, izobenzofurylowa, pirazolilowa, indolilowa, izoindolilowa, benzoimidazolilowa, purynylowa, morfolinylowa, karbozolilowa, oksazolilowa, tiazolilowa, izotiazolilowa, 1,2,4-tiadiazolilowa, izooksazolilowa, pirolilowa, pirazolilowa, chinoazolinylowa, pirydazynylowa, pirazynylowa, cynnolinylowa, ftalazynylowa, chinoksalinylowa, ksantynylowa, hipoksantynylowa, pterydynylowa, 5-azacytydynylowa, 5-azauracylilowa, triazolopirydynylowa, imidazolopirydynylowa, pirolopirymidynylowa,pirazolopirymidynylowa, adeninowa, N6-alkilopurynowa,

184 466

N⁶-acylopurynowa, N⁶-hydroksyalkilopurynowa, N⁶tioalkilopurynowa, tyminowa, cytozynowa, 6-azapirymidynowa, 1-merkaptopyrmidynowa, uracylowa, N’-alkilopirymidynowa, N⁵-benzylopirymidynowa, N5-chlorowcopirymidynowa, N⁵winylopirymidynowa, N5-acetylenopirymidynowa, N5-acylopirymidynowa, N5-hydroksyalkilopurynowa i N6-tioalkilopurynowa, i izoksazolilowa. Grupa heteroaromatyczna może być ewentualnie podstawiona, tak jak to opisano powyżej dla grupy arylowej. Pierścień heteroaromatyczny może być całkowicie lub częściowo uwodorniony, jeśli jest to korzystne. Zamiast pirydyny można stosować np. dihydropirydynę, przy czym przykład ten nie jest ograniczający. Tlenowe i azotowe grupy funkcyjne mogą być zabezpieczone, jeśli jest to konieczne lub korzystne, w czasie sekwencji reakcji. Odpowiednie grupy zabezpieczające są dobrze znane specjalistom, i stanowi je grupa trójmetylosililowa, dwumetyloheksylosililowa, t-butylodwumetylosililowa i t-butylodwufenylosililowa, tritylmetylowa, alkilowa, grupa acylowa, jak np. acetylowa lub propionylowa, metylosulfonylowa i p-toluilosulfonylowa.

Określona „grupa hydroksyalkilowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza grupę alkilową C, do C6, w której co najmniej jeden z atomów wodoru przyłączony do dowolnego atomu węgla został zastąpiony grupą hydroksylową.

Określenie „przeciwutleniacz tiolowy” oznacza zawierający atom siarki związek opóźniający utlenianie.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalna pochodna” oznacza pochodna związku czynnego, która, po podaniu organizmowi, jest zdolna do uwalniania, bezpośrednio lub pośrednio, związku macierzystego, lub która sama wykazuje aktywność.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny kation” oznacza cząstkę organiczną lub nieorganiczną, naładowaną dodatnio, która może być podawana w połączeniu ze środkiem farmaceutycznym, na przykład, jako przeciwkation w soli. Farmaceutycznie dopuszczalne kationy są znane specjalistom, i stanowią je, lecz nie są one do nich ograniczone, jon sodowy, potasowy i aminy czwartorzędowe.

Określenie „fizjologicznie odszczepialna grupa opuszczająca” oznacza cząstkę, która może ulec odszczepieniu in vivo od cząsteczki, do której jest przyłączona, i stanowi, lecz nie jest do nich ograniczona, anion organiczny lub nieorganiczny, grupę acylową (włączając w to, lecz nie jest ona do niej ograniczona, grupę (alkilo)C(O), np. grupę acetylową, propionylowąi butyrylową), grupę alkilową, fosforanową, siarczanową lub sulfonianową.

Określenie „enancjomerycznie wzbogacona kompozycja lub związek” oznacza kompozycję lub związek zawierający co najmniej 95%, korzystnie co najmniej 97,98,99 lub 100% wagowo pojedynczego enancjomeru związku.

Określenie „aminokwas” oznacza syntetyczne i naturalnie występujące aminokwasy, włączając w to, lecz nie są one do nich ograniczone, grupę alanylową, walinylową, leucynylową, izoleucynylową, prolinylową, fenyloalaninylową, tryptofanylową, metioninylową, glicynylową, serynylową, treoninylową, cysteinylową, tyrozynylową, asparaginylową, glutaminylową, aspartoilową, glutaoilową, lizynylową, argininylową i histydynylową.

Określenie „cząstka łącząca” w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza dowolną grapę dwuwartościową, łączącą dwie reszty chemiczne, włączając w to, lecz nie są one do nich ograniczone, grupę alkilową, alkenylową, alkinylową, arylową, polialkilenooksylową (np. - [(CH^O-Jn-), -C1_6calkoksy-C1.1₀alkilo-, C1_6alkilotio-C1_₁₀alkilo-, -NR3-, i - (CHOH) _nCH₂OH, w których n może wynosić niezależnie 0, 12, 3, 4, 5 lub 6.

Identyfikację utlenionych i nieutlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jako bezpośrednich mediatorów ekspresji VCAM-1 prowadzi się w następujący sposób:

Dla ustalenia, czy PUFA lub utlenione PUFA działająjako bezpośredni immunomodulator ekspresji genu komórek śródbłonka, wcześnie pasażowane ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC) hodowano przez osiem godzin w pożywkach i surowicy i eksponowano na kwasy tłuszczowe nasycone (kwas stearynowy), jednonienasycone (kwas oleinowy) i wielonienasycone (kwas linolowy i arachidonowy); jak również na wodorotlenki kwasów tłuszczowych linolowego

184 466 (13-HPODE) lub arachidonowego (15-HPETE). HAEC eksponowano również zamiast tego na działanie cytokiny czynnika martwicy nowotworu-α.

HAEC eksponowano na kwas linolowy lub 13-HPODE przez różne okresy czasu, do 48 godzin, a następnie badano ze względu na ekspresję VCAM-1 na powierzchni komórki testem ELISA. Wyniki porównano z wynikami uzyskanymi przy ekspozycji HAEC na cytokinę TNF-α (100 U/ml) przez takie same okresy czasu. Ekspresja VCAM-1 w HAEC inkubowanych z kwasem linolowym lub 13-HPODE ulega przejściowo zwiększeniu. Ekspresja osiąga wartości szczytowe po około 8-9 godzinach; znaczącą ekspresję stwierdza się po 24 godzinach, po czym maleje ona po upływie 48 godzin. Kinetyka indukcji VCAM-1 przez zarówno kwas linolowy, jak i 13-HPODE jest bardzo podobna do kinetyki TNF-α, a zatem mechanizmy, poprzez które wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukują VCAM-1 wydają się być podobne do mechanizmów TNF-α.

Przeprowadzono również badania zależności odpowiedzi od dawki kwasu linolowego i 13-HPODE na ekspresję genu VCAM-1 po 8 godzinach. Stwierdzono, że 7,5 pM stanowi najniższą dawkę szczytową, przy której kwas linolowy il 3-HPODE znacząco indukują ekspresję genu VCAM-1.

Badano następnie, czy krótkotrwała inkubacja komórek śródbłonka z wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi indukuje również ekspresję ICAM-1 i E-selektyny. Stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe linolowy i arachidonowy indukują ekspresję genu na powierzchni komórki do wartości około 59% indukowanej przez TNF ekspresji genu VCAM-1. Stwierdzono natomiast, że ani ICAM-1, ani E-selektyna nie ulegały indukcji tymi kwasami tłuszczowymi. Przeciwnie, nasycony kwas tłuszczowy - kwas stearynowy - i jednonienasycony kwas tłuszczowy - kwas oleinowy - nie indukowały ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny. Ekspresję genu VCAM-1 obserwowano również po inkubacji HAEC z utlenionymi metabolitami kwasu linolowego (13-HPODE) i kwasu arachidonowego (15-HPETE).

Dla zbadania, czy stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka, spowodowany przez wieionienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity, indukuje VCAM-1 poprzez mechanizm wrażliwy na reakcje redox, HAEC poddano obróbce wstępnej przeciwutleniaczem ditiokarbaminianem pirolidynowym (PDTC, 50 pM) przez 30 minut, a następnie komórki inkubowano niezależnie z kwasem linolowym, kwasem arachidonowym, 13-HPODE il 5-HPETE (po 7,5 pM) przez 8 godzin. Stwierdzono, że PDTC hamował ekspresję genu VCAM-1 indukowaną przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione odpowiedniki. Wskazuje to, że mediatorem indukcji jest utleniona cząsteczka sygnałowa, i że indukcja nie zachodzi, kiedy utlenianie cząsteczki jest blokowane (to znaczy, utlenienie nie zachodzi), odwracane (to znaczy, cząsteczka sygnałowa ulega redukcji) lub wtedy, gdy uniemożliwia się jej interakcję z białkiem docelowym, być może poprzez układ redox.

Dla określenia, czy selektywna indukcja VCAM-1 przez PUFA i ich utlenione metabolity zachodzi na poziomie mRNA, HAEC inkubowano z kwasem linolowym lub 13-HPODE. Kwas linolowy i 13-HPODE indukowały akumulację mRNA VCAM-1, zbliżoną poziomem do indukowanej przez TNF-α. Przeciwnie, nie stwierdzano indukcji ekspresji genu ICAM-1 ani E-selektyny na poziomie mRNA w HAEC inkubowanych z kwasem linolowym lub 13-HPODE. Wyniki te sąpodobne do obserwowanych na poziomie powierzchni komórki. Wskazująone, że pretranskrypcyjne mechanizmy regulacyjne pełnią rolę mediatora indukcji ekspresji genu VCAM-1 przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity.

Niezbędne było również określenie, czy wielonienasycone kwasy tłuszczowe działają jako sygnał pierwotny, czy też poprzez białko regulacyjne wykorzystujące cytokinę IL-4 w indukcji ekspresji genu VcaM-1. W celu zbadania, czy nowo wytworzone białka, takie jak IL-4, biorą udział w wytwarzaniu i ekspresji genu VCAM-1, indukowanej przez PUFA, takie jak kwas linolowy, HAEC inkubowano z 13-HPODE (7,5 pM) i eksponowano na inhibitor syntezy białka, cykloheksymid. Nie stwierdzano hamowania akumulacji mRNA VCAM-1 przez cykloheksymid w HAEC inkubowanych z 13-HPODE. Mierzono również testem ELISA wytwarzanie IL-4 przez HAEC inkubowane z kwasami linolowym lub arachidonowym i ich utlenionymi

184 466 metabolitami. Nie stwierdzano zwiększenia wydzielania IL-4 przez HAEC inkubowane z tymi PUFA lub ich utlenionymi metabolitami.

W uprzednich pracach wykazano, poprzez badania nad delecją i promotorami heterolcgicznymi, że cytokiny i nie-cytokiny aktywująekspresję genu VCAM-1 w komórkach śródbłonka co najmniej częściowo w sposób transkrypcyjny poprzez dwa NF-kB -podobne elementy wiążące DNA. Wykazano również, że PDTC hamuje ekspresję genu VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny. Dla określenia, czy wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukują aktywację transkrypcyjną ludzkiego promotora VCAM-1 w podobnym mechanizmie, dokonano przejściowej transfekcji chimerycznego genu reporterowego p288 YCAMCAT, zawierającego współrzędne -288 do +22 ludzkiego promotora VCAM-1 .Dodanie kwasu linolowego (7,5 pM) zwiększało aktywność promotora VCAM-1, która dwukrotnie przewyższała aktywność kontroli i wynosiła około 60% maksymalnego sygnału indukowanego przez TNF-α. Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu minimalnego indukowalnego cytokinami promotora genu VCAM-1 (p85 VCAM-CAT), zawierającego miejsca -77 i -63 bp - podobne. Ani kwas linolowy, ani TNF-α nie wykazywały żadnego wpływu na aktywność przy zastosowaniu konstytutywnie ulegającej ekspresji sekwencji pSV2 CAT. PDTC hamowało aktywację transkrypcyjną obu sekwencji promotorowych VCAM-1 indukowaną przez kwas linolowy. Dane wskazują, że analogicznie do TNF-α, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas linolowy, indukują aktywację transkrypcyjną VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox mechanizm NF-kB podobny.

Dla określenia, czy wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity regulują aktywność promotora VCAM-1 poprzez NF-kB - podobny transkrypcyjny czynnik regulacyjny, badano wyciągi jądrowe z HAEC ze względu na aktywność wiązania DNA do oligonukleotydu dwuniciowego, zawierającego NF-kB podobne elementy promotorowe VCAM-1, położone w miejscach -77 i -63. Jak to przedstawiono na fig. 7, dwa pasma A i C, ukazujące aktywność NF-kB - podobną, ulegały indukcji w odpowiedzi na trzygodzinną ekspozycję na kwas linolowy (7,5 μΜ) . Podobne wyniki uzyskano po ekspozycji na cytokinę TNF-α (100 U/ml). W komórkach kontrolnych (nie poddawanych obróbce) stwierdzano słabe pasmo B. Nie stwierdzano indukcji wiązania NF-kB podobnego przez jednonienasycony kwas tłuszczowy - kwas oleinowy. Wstępna trzydziestominutowa obróbka komórek PDTC hamowała aktywność wiązania kompleksu A i C DNA po aktywacji kwasem linolowym. Wyniki te są zbliżone do uprzednio publikowanych obserwacji, że PDTC blokuje aktywację ekspresji genu VCAM-1 w HUVEC poprzez hamowanie aktywacji tych NF-kB -podobnych białek wiążących DNA.

Przykład 1

Wpływ utlenionych i nieutlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na kinetykę aktywacji ekspresji genu VCAM-1

Ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC) posiewano na 96-zagłębieniowe płytki i inkubowano z kwasem linolowym (7,5 μM), 13-HPODE(7,5 μΜ) lub TNF-α (100 U/ml) w pięciu różnych punktach czasowych do 48 godzin. HAEC, uzyskane z Clonetics (Boston, MA) hodowano na pożywce Medium 199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), 16 U/ml heparyny, 10 U/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 50 μ/ml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, i 100 μ/ml streptomycyny. Na jeden dzień przed doświadczeniem, komórki umieszczono w pożywce zawierającej 4% FBS. Konfluentne HAEC inkubowano przez okres do 48 godzin z TNF-α (100 U/ml), lub kwasami stearynowym, oleinowym, linolowym linolenowym lub arachidonowym (7,5 μM). Podobne doświadczenie prowadzono z różnymi dawkami kwasu linolowego lub 13-HPODE przez czas 8 godzin (1-60 μM) (fig. 2). Oceny ilościowej dokonano przez oznaczenie konwersji kolorymetrycznej w 450 nm TMB. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=3 dla każdej wartości doświadczalnej). * - wartość różniącą się (p,05) od Kontroli.

Jak to ukazano na fig. 1, zarówno kwas linolowy, jak il 3-HPODE indukowały ekspresję VCAM-1. W dziesięć godzin po ekspozycji, ilość VCAM-1 na powierzchni komórki, indukowana

184 466 przez kwas linolowy i 1 3-HPODE , wynoiiła powyżej połowy wartości indrdcowanej przez cytokinę TNF-a.

Jak to ukazano na fig. 2, indukcja VCAM-1 przez kwas linolowy i i3-HPODE jest zależna od stężenia. Przy stężeniu tych związków wynoszącym od 2 do 10 μΜ, obserwuję się gwałtowny wzrost ilości indukowanej VCAM-1 powierzchni komórki, która następnie utrzymuje się na w przybliżeniu stałym poziomie do stężenia wynoszącego co najmniej 100 μΜ. Należy zauważyć, że stężenie PUFA wskazane na fig. 2 dodaje się do stężenia endogennie stwierdzanego w HAEC.

Przykład 2

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukuj ą ekspresję genu VCAM-1, lecz nie ICAM-1 ani E-selektyny

Testem ELISA mierzono ekspresję VCAM-1, ICAM-1 i E-selektyny na powierzchni komórki HAEC. HAEC, uzyskane z Clonetics (Kalifornia) hodowano w Medium 199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), 16 U/ml heparyny, 10 U/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 50 μg/ml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, i 100 μg/ml streptomycyny. Na jeden dzień przed doświadczeniem, komórki umieszczono w pożywce zawierającej 4% FBS. Konfluentne HAEC inkubowąno, lub nie, przez 8 godzin z TNF-a (100 U/ml), lub jednym z kwasów: stearynowym, oleinowym, linolowym, linolenowym lub arachidonowym (7,5 μM). Ekspresję na powierzchni komórki A)VCAM-1 B) ICAM-1 i C) E-selektyny oznaczono przez wiązanie pierwotne z przeciwciałami mysimi, skierowanymi swoiście przeciwko V CAM-1 /ICAM-1 i E-selektynie, a następnie wtórne wiązanie z ze znakowanymi peroksydazą chrzanową przeciwciałami kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom mysim (IgG).

Ocenę ilościową przeprowadzono, określając konwersję kolorymetryczną przy 450 nm TMB. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=4 dla każdej wartości doświadczalnej).

* - wartość różniąca się (p<0,05) od Kontroli.

Jak to ukazano na fig. 3, kwas linolowy, kwas linolenowy i kwas arachidonowy znacząco indukowały ekspresję VCAM-1, lecz nie indukowały ekspresji na powierzchni komórki ICAM-1 ani E-selektyny. Ani kwas stearynowy, ani kwas oleinowy nie indukowały ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny. TNF-α silnie indukował ekspresje wszystkich trzech cząsteczek powierzchni komórki.

Przykład 3

Przeciwutleniacz PDTC hamuje indukcję VCAM-1 wywoływanąprzez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity

Konfluentne HAEC poddano obróbce wstępnej wo becności lub w nieobecności PDTC (soli sodowej ditiokarbaminianu pirolidynowego, 50 pM) przez trzydzieści minut. Komórki inkubowano następnie przez osiem godzin z TNF-a( 100 U/ml), kwasem linolowym lub arachidonowym (7,5 pM), lub wodorotlenkami kwasów tłuszczowych 13-HPODE (7,5 pM) lub 15-HPETE (7,5 pM). Ekspresję VCAM-1 na powierzchni komórki mierzono testem ELISA, jak to opisano w przykładzie 1. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=4 dla każdej wartości doświadczalnej).

* - wartość różniącą się (pO,05) od Kontroli.

Jak to ukazano na fig. 4, PDTC hamuję indukcję VCAM-1 przez kwas linolowy, 13-HPODE, kwas arach idonowy il 5-HPETE.

Przykład 4

Ostra indukcja mRNA VCAM-1 przez kwas linolowy ii 3-HPODE

HAEC eksponowano na kwas linolowy (7,5 pM) lub 13-HPODE (7,5 pM). Wyizolowano RNA całkowite, dokonano podziału 20 pg na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego 3²P cDNA A) VCAM-1 - swoistego B) β-aktyno -swoistego, i przeprowadzono uwidocznienie przez autoradiografię. Po przepłukaniu, filtry poddano

184 466 ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny. Identyfikacja pasm: 1) kontrola 2) kwas linolowy (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) 3) kwas linolowy (ekspozycja 48-godzinna) 4) 13-HPODE (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) i 5) TNF-α (100 U/ml, ekspozycja 4-godzinna).

Jak to ukazano na fig. 5, zarówno kwas linolowy, jak i 1 3-HPODE indukowały wytwarzanie mRNA dla VCAM-1 przez osiem godzin. Po 48 godzinach, kwas linolowy nie powodował już indukcji mRNA VCAM-1.

Przykład 5

Indukcja mRNA VCAM-1 przez PUFA nie zależy od syntezy białek komórkowych

HAEC eksponowano na kwas linolowy lub arachidonowy (7,5 pM) wo becności lub w nieobecności cykloheksymidu (10 pg/ml) przez okres 4 godzin. Wyizolowano RNA całkowite, dokonano podziału 20 pg na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego 32p cDNA A) VCAM-1 - swoistego B) β-aktyno - swoistego, i przeprowadzono uwidocznienie przez autoradiografię. Po przepłukaniu, filtry poddano ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny.

Jak to ukazano na fig. 6, indukcja VCAM-1 przez kwasy linolowy i arachidonowy nie zależy od syntezy białek komórkowych.

Przykład 6

Kwas linolowy indukuje aktywację transkrypcyjnąpromotora VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB -podobny

HAEC rozszczepiono w takim stosunku, aby uzyskać około 60% konfluencję na 100 mm płytkach do hodowli tkankowych. HAEC transfekowano 30 pg plazmidu VCAMCAT p288, VCAMCAT p85 lub pSV2CAT, stosując technikę koprecypitacji fosforanu wapniowego z użyciem standardowych metod. Po 24-godzinnym okresie regeneracji HAEC poddano obróbce wstępnej 50 pM PDTC i po 30 minutach ekspozycji na kwas linolowy (7,5 pM) lub TNF-α (100 U/ml), dodawane bezpośrednio do płytek. Po 18 godzinach wytworzono wyciągi komórkowe przez szybkie zamrażanie-rozmrażanie w 0,25 M Tris, pH 8,0. Białka z poszczególnych wyciągów komórkowych badano pod kątem aktywności acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) (Ac, chloramfenikol acetylowany, N, nieacetylowany).

Figura 7 ukazuje wyniki tego doświadczenia. Kwas linolowy indukuje aktywację- transkrypcyjną promotora VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny. Wyniki te sąpodobne do obserwowanych przy aktywacji promotora VCAM-1 przez cytokiny, takie jak TNF-α. Sugeruje to, że PUFA działają przez utleniony związek pośredni, który stanowi jednocześnie mediator aktywacji cytokinowej VCAM-1.

Przykład 7

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe aktywują NF-kB - podobną aktywność wiązania DNA, blokowaną przez przeciwutleniacz PDTC

Konfluentne HAEC w pożywce zawierającej 4% FBS (jak to opisano w przykładzie 1) poddano obróbce wstępnej PDTC (50 pM) przez trzydzieści minut, a następnie trzygodzinnej ekspozycji na kwas linolowy lub oleinowy (7,5 pM), lub TNF-α (100 U/ml). Pięć mikrogramów wyciągu jądrowego inkubowano z dwuniciowąwtVCAM-1, wyznakowaną 32p, frakcjonowano ze względu na wielkość na 4% natywnym żelu akrylamidowym, i poddano ekspozycji na kliszę autoradiograficznąw temperaturze -70°C przez 18 godzin. Oznaczono dwa pasma A i C, odpowiadające aktywności NF-kB -podobnej. W komórkach kontrolnych (nie poddanych obróbce) obserwowano słabe pasmo B.

Na fig. 8 ukazano, że kwas linolowy indukuje NF-kB podobną aktywność wiązania do promotora VCAM-1 w sposób wrażliwy na reakcje redox. Jest to analogiczne do cytokiny TNF-α i sugeruje podobny mechanizm działania. TNF-α prawdopodobnie indukuje VCAM-1 poprzez mechanizm, którego mediatorem jest ox-PUFA.

184 466

Przykład 8

Utlenienie w bezkomórkowym, pozbawionym pożywki układzie przez nieutleniony i utleniony (15-HPETE) kwas arachidonowy

Figury 9A i 9B stanowią wykresy kolumnowe względnie reaktywnych na kwas tiabarbiturowy substancji (O.D. 532 nm) kwasu arachidonowego i 15-HPETE wobecności lub nieobecności PDTC. Próba reaktywności na kwas tiabarbiturowy (TBARS) pozwala zmierzyć zdolność utleniającą materiału w bezkomórkowym, nie zawierającym pożywki, środowisku. Jak to ukazano na figurach, zarówno kwas arachidonowy, jak i 15-HpEtE wykazują wyraźną aktywność TBARS, hamowaną przez PDTC.

Wynalazek służy do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1. Stwierdzenie, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity stanowią selektywne, wrażliwe na reakcje redox immunomodulatory, zapewnia podstawę do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1 lub geny wrażliwe na reakcje redox.

Wynalazek zapewnia sposób leczenia miażdżycy, restenozy po angioplastyce, chorób naczyń wieńcowych, dusznicy bolesnej i innych chorób sercowo-naczyniowych, jak również chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatorem jest VCAM-1, przy czym sposób ten polega na usunięciu, zmniejszeniu stężenia lub zapobieganiu wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak np. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy, linolenowy i arachidonowy. W alternatywnym wykonaniu zapewnia się sposób leczenia tych chorób, polegający na zapobieganiu interakcji PUFA lub ox-pUFA z białkiem lub peptydem, stanowiącym mediator ekspresji VCAM-1.

Hamowanie ekspresji VCAM-1 można osiągnąć na różne sposoby, w tym przez podawanie przeciwutleniacza, zapobiegającego utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, przez modyfikację in vivo metabolizmu PUFA do ox-PUFA, jak to szczegółowo opisano poniżej.

Podawanie przeciwutleniaczy

W tym sposobie leczenia można stosować dowolny związek redukujący ox-PUFA lub hamujący utlenianie PUFA, któryjest względnie nietoksyczny i biodostępny, lub który można zmodyfikować dla zapewnienia jego biodostępności. Specjalista łatwo ustali standardowymi sposobami, czy dany związek redukuje ox-PUFA lub hamuje utlenianie PUFA.

Przeciwutleniacze ditiokarboksylanowe

Stwierdzono, że ditiokarboksylany wykazują korzystne działanie w leczeniu miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych. Ditiokarboksylany, w tym ditiokarbaminiany, można stosować do blokowania zdolności komórek, w tym komórek śródbłonka, do ekspresj i V CAM-1 lub do hamowania ekspresj i genu wrażliwego na reakcj e redox lub aktywacj i genu hamowanego na szlaku wrażliwym na reakcje redox.

Co najmniej jeden z tych związków, ditiokarbaminian pirolidynowy (PDTC) hamuje ekspresję genu VCAM-1 w stężeniu mniejszym od 1,0-mikromolowego. Związki te wykazują również korzystną toksyczność wobec nąmnążąjących się lub nieprawidłowo dzielących komórek mięśniówki gładkiej naczyń. Inny ditiokarbaminian, N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy, również hamuje ekspresję VCAM-1, lecz nie wykazuje korzystnej toksyczności wobec nieprawidłowo dzielących się komórek mięśniówki gładkiej naczyń.

Stwierdzono, że ditiokarbaminian pirolidynowy nie hamuje istotnie ekspresji ICAM-1 ani ELAM-1, tak więc leczenie tym związkiem nie wpływa niekorzystnie na aspekty odpowiedzi zapalnej, której mediatorem jest ELAM-1 lub ICAM-1. Tak więc unika się uogólnionej immunosupresji. W ten sposób unika się powikłań ogólnoustrojowych, wynikających z uogólnionego hamowania cząsteczek adhezyjnych w licznych innych komórkach, o których wiadomo, że wykazują ekspresję tych cząsteczek. Inne farmaceutycznie dopuszczalne sole PDTC również stanowią skuteczne środki do leczenia chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych.

Ditiokarbaminiany stanowią chelatory metali przejściowych stosowane w klinice w przypadkach zatrucia metalami ciężkimi. Baselt, R.C., F.W.J. Sunderman i wsp., (1977), „Comparisons od antidotal efficacy of sodium diethyldithiocarbamate, D-penicillamine and triethylenetetramine upon acute toxicity of nickel carbonyl in rats”. Res Commun Chem Pathol

184 466

Pharmacol 18(4); 677-88; Menne, T. iK. Kaaber (1978), „Treatment ofpompholyx due to nickel allergy with chelating agents”. Contact Dermatitis 4(5); 289-90; Sunderman, F.W. (1978), „Clinical response to therapeutic agents in poisoning from mercury vapor” Ann Clin Lab Sci 8(4): 259-69; Sunderman, F.W. (1979), „Efficacy of sodium diethylodithiocarbamate (dithiocarb) in acute nickel carbonyl poisoning”. Ann Clin Lab Sci 9(1): 1-10; Gale, G.R., A.B. Smith i wsp., (1981), „Diethylodithiocarbamate in treatment of acute cadmium poisoning” Ann Clin Lab Sci 11(6); 476-83; Jones, M.M. i M.G.Cherian (1990), „The search for chelate antagonists for chronię cadmium intoxication”, Toxicology 62(1): 1-25; Jones S.G., M.A. Basinger i wsp. (1982), „A comparison of diethylodithiocarbamate and EDTA as antidotes for acute cadmium intoxication”, Res Commun Chem Pathol Pharmacol 38(2): 271-8; Pages, A., J.S. Casas i wsp. (1985), „Dithiocarbamates in heavy metal poisoning: complexes of N,N-di(1-hydroxyethyl)dithiocarbamate withZn(n), Cd.(H),Hg(II), CH₃HgII) i C₆H₅Hg(II).: J. InorgBiochem25(1):35-42; Tandon, S.K., N. S. Hashmi i wsp., (1990), „The lead-chelating effects of substituted dithiocarbamates”. Biomed Environ Sci 3(3): 299-305.

Ditiokarbaminiany stosuje się również jako środek dodatkowy w chemioterapii cisplatyną w celu zapobiegania nefrotoksyczności. Hacker, M.P., W.B. Ershler i wsp (1982), „Effect of disulfiram (tetraethylthiuram disulfide) and diethyldithiocarbamate on the bladder toxicity and antitumor activity of cyclophosphamide in mice”, Cancer Res 42(11); 4490-4. Bodenner, 1986 #733; Saran, M. i Bors, W. (1990) „Radical reactions in vivo - an overview”. Radiat. Environ. Biophys. 29 (4): 249-62.

Ditiokarbaminian stosowany obecnie w leczeniu nadużywania alkoholu stanowi disulfiram, dimer dwuetyloditiokarbaminianu. Disulfiram hamuje dehydrogenazę aldehydową w wątrobie. Inoue, K. i Fukunaga, i wsp., (1982) „Effect of disulfiram and its reduced metabolite, diethyldithiocarbamate on aldehyde dehydrogenase of human erythrocytes”, Life Sci 30(5); 419-24.

Istnieją doniesienia o tym, że ditiokarbaminiany hamują replikację wirusa HIV, jak również przyśpieszają dojrzewanie swoistych subpopulacji komórek T. Odkrycie to dało początek badaniom klinicznym ditiokarbaminianu w populacji chorych na AIDS. Reisinger, E. i wsp., (1990), „Inhibition of HIV progression by dithiocarb”, Lancet 335: 679.

Ditiokarboksylany stanowią związki o wzorze A-SC(S)-B, należące do ogólnej klasy związków znanych jako przeciwutleniacze tiolowe, i zwane są inaczej karboditiolami lub karboditiolanami. Wydaje się, że cząstka -SC(S) ma zasadnicze znaczenie dla aktywności terapeutycznej, i że A i B mogą stanowić dowolną grupę, którą nie wpływa niekorzystnie na skuteczność lub toksyczność związku.

Doboru A i B specjalista dokona tak, aby uzyskać korzystną charakterystykę związku, włączając w to wielkość, ładunek, toksyczność, i stopień stabilności (w tym także stabilność w środowisku kwaśnym, takim jak żołądek, lub zasadowym, takim jak dalsze odcinki przewodu pokarmowego). Dobór A i B ma również istotny wpływ na dystrybucję w tkankach i farmakokinetykę związku. Ogólnie, w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, korzystne jest, aby związek akumulował się, lub lokalizował, w warstwie błony wewnętrznej naczynia, w której znajdują się naczyniowe komórki śródbłonka. Korzystne są związki wydalane z moczem.

Korzystną cechą przy farmaceutycznym podawaniu ditiokarboksylanów jest to, że jak się wydaje, nie ulegają one enzymatycznemu rozszczepieniu in vivo przez tioesterazy, mogą więc wykazywać długi okres półtrwania in vivo.

W korzystnym wykonaniu, A stanowi atom wodoru lub farmaceutycznie dopuszczalny kation, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, atom sodu, potasu, wapnia, magnezu, glinu, cynku, bizmutu, baru, miedzi, kobaltu, niklu, lub kadmu;tworzący solę kwas organiczny, typowo kwas karboksylowy, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas pamoinowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwas naf- talenosulfnowy, kwas naftalenodwusulfonowy, lub kwas poligalakturonowy; lub kation wytworzony z amoniaku lub innej zasady azotowej, jak na przykład, lecz bez ograniczenia

184 466 do nich, azotowa grupa heterocykliczna, lub cząstka o wzorze NR4R5R6R⁷, w którym R4, r5, r6 i R7 stanowią, niezależnie od siebie, atom wodoru, grupa alkilowa C,- linearna, rozgałęziona, lub (w przypadku C4.6) cykliczna, hydroksy (C,^) alkilowa (w której na dowolnym atomie węgla znajduje się jedna lub więcej grup hydroksylowych), lub arylowa, N,N-dwubenzyloetylenodwuamina, D-glukozamina, cholina, tetraetyloamoniak, lub etylenodwuamina.

W innym wykonaniu, A może stanowić fizjologicznie odszczepialną grupę opuszczającą, która może ulegać odszczepieniu in vivo z cząsteczki, do której jest przyłączoną, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, grupy acylowe (włączając w to grupę acetylową, propionylową i butyrylową), alkilowe, fosforanowa, siarczanowa lub sulfoniowa.

W jednym z wykonań, B stanowi grupa alkilowa, alkenylową, alkinylową, alkoarylowa, aroalkilowa, chlorowcoalkilowa, chlorowcoalkenylowa, chlorowcoalkinylowa, arylowa, alkoarylowa, atom wodoru, grupa Cj_₆ alkoksy-C1„1₀alkilowa, C,.6alkilotio-Ci_i0alkilowa, NR2R³, - (CHOH)_nCH2OH, w której wartość n wynosi 0,1,2,3,4,5 lub 6, - (C^n^R, w tym grupa alkiloacetylowa, alkilopropionylowa i alkilobutyrylowa, lub hydroksy (C^alkilo (w której przy dowolnym z atomów węgla znajduje się jedna lub więcej grupa hydroksylowa).

W innym wykonaniu, B stanowi NR2R3, w którym R2 i R3 stanowią niezależnie od siebie grupy alkilowe; - (CHOH)_nCH2OH, w której wartość n wynosi 0,1,2,3,4, 5 lub 6, - (CH2_nCO2Rl -(CH2)_nCO2R4; hydroksyt(C1.6) alkilo-; alkenylową (na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, grupa winylowa, allilowa, i CH^CRCH-CI^CI®) ; alkilo (CC^H), alkenylo (CO2H), alkinylo (CO2H), lub arylowa, w której grupa arylowa może zawierać podstawnik, jak to opisano powyżej, szczególnie, na przykład, NO2, CH3, grupę t-butylową, CO2H, atom chlorowca, lub grupę p-OH; lub R2¹ R³ mogą razem tworzyć mostek taki jak -(CH2)_m-, w którym wartość m wynosi 3,4, 5 lub 6, i w którym R4 stanowi grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa, na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, grupa acetylowa, propionylową i butyrylową.

Wjeszcze innym wykonaniu, B może stanowić grupę heterocykliczną lub alkikloheterocykliczną. Grupa heterocykliczna może być ewentualnie częściowo lub całkowicie uwodorniona. Nieograniczające przykłady stanowiągrupy wymienione powyżej, włączając w to grupę fenazynową, fenotiazynową, pirydynową i dihydropirydynową.

W jeszcze innym wykonaniu, B stanowi pozostałość farmaceutycznie czynnego związku lub leku. Termin „lek”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza dowolną substancję do użytku wewnętrznego lub zewnętrznego jako środek do leczenia lub zapobiegania choroby lub zaburzenia.

Nieograniczające przykłady stanowią leki do leczenia lub zapobiegania chorób sercowo-naczyniowych, takie jak przeciwutleniacze, np. probucol; kwas nikotynowy; środki zapobiegające zlepianiu się płytek krwi, takie jak aspiryna; środki przeciwzakrzepowe, jak kumaryna; blokery kanału wapniowego, jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitory enzymu konwertazy angiotensyny (ACE), jak kaptopryl i enalapryl; (β-blokery, jak propranolol, terbutalol i labetalol; niesterydowe leki przeciwzapalne, jak ibuprofen, indometacyna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy, sulindak, lub kortykosteroidy. Grupa -C(S)SA może być bezpośrednio połączona z lekiem, lub przyłączona poprzez dowolną odpowiednią cząstkę łączącą.

W innym wykonaniu, ditiokarbaminian stanowi pochodna aminokwasu o wzorze AO2C-R9nR^,0-C(S)SA, w którym R⁹ stanowi dwuwartościowa cząstka B, cząstka łącząca, łub reszta wewnętrzna dowolnego z naturalnie występujących aminokwasów (np. CH3CH dla alaniny, CH2 dla glicyny, CH^R^NR dla lizyny, itd.), a R, stanowi atom wodoru lub niższa grupa alkilowa.

B może również stanowić polimer, do którego dołączona jest jedna lub więcej grup ditiokarbaminianowych, bezpośrednio lub poprzez dowolną odpowiednią cząstkę łączącą. Ditiokarbaminian uwalnia się korzystnie z polimeru w warunkach in vivo w czasie odpowiednim dla zapewnienia korzystnego wpływu leczniczego. W korzystnym wykonaniu, sam polimer również ulega degradacji in vivo. Termin „ulegający biodegradacji”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza polimer, który rozpuszcza się lub degraduje w okresie dopuszczalnym w pożądanym

184 466 zastosowaniu (zwykle w terapii in vivo), wynoszącym zwykle poniżej pięciu lat, a korzystnie, mniej niż jeden rok, przy ekspozycji na roztwór fizjologiczny o pH 6-8 w temperaturze pomiędzy 25 a 37°C. W korzystnym wykonaniu, polimer degraduje się w czasie wynoszącym od 1 godziny do kilku tygodni, w zależności od zastosowania.

Znanych jest wiele polimerów ulegających degradacji. Nieograniczające przykłady sta- nowiąpeptydy, białka, nukleoproteiny, lipoproteiny, glikoproteiny, syntetyczne i naturalne polipeptydy i poliaminokwasy, na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, polimery i kopolimery lizyny, argininy, asparaginy, kwasu aspartamowego, cysteiny, cystyny, kwasu glutaminowego, glutaminy, hydroksylizyny, seryny, treoniny, i tyrozyny; poliortoestry, takie jak poli (a-hydroksykwasy), na przykład, kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, poli (laktydoko-glikolid), wielobezwodniki, albumina lub kolagen, polisacharydy zawierające jednostki cukrowe, jak laktoza, i polikaprolakton. Polimer może stanowić kopolimer nieregularny lub blokowy.

B może również stanowić grupę zwiększającą rozpuszczalność ditiokarbaminianu w wodzie, na przykład, -niższy alkilo-O-R⁸, w którym R⁸ stanowi -PO2(OH)M⁺ lub PO3(M⁺)2, w którym M+ stanowi farmaceutycznie dopuszczalny kation; -C (O) (CH2)₂CO₂’M⁺ lub -SO3· M⁺, -niższąalkilowąalkilokarbonylo-niższą; -karboksylo-niższąalkilową; -niższąalkiloamino-niższą alkilową, N,N-dwupod-stawioną amino niższą alkilową, w której podstawniki stanowią niezależnie od siebie grupę niższą alkilową; pirydylo-niższą alkilową, imidazolilo-niższą alkilową, imidazolilo-Y-niższą alkilową, w której Y stanowi grupę tiolową lub aminową; morfolinylo-niższą alkilową, pirolidynylo-niższąalkilową; tiazolinylo-niższą alkilową, piperydynylo-niższą alkilową, morfolinylo-niższąhydroksyalkilową; N-pirylową; piperazynylo-niższą alkilową, N-podstawionąpiperazynylo-niższą alkilową, w której podstawnik stanowi niższa grupa alkilowa; triαrohlo-niżsrą alkilową; tetrazolilo-niższą alkilową, tetrazolilamino-niższą alkilową; lub tiazolilo-niższą alkilową.

W alternatywnym wykonaniu podawać można dimer taki jak B-C(S)S-SC(S)-B.

Nieograniczające przykłady ditiokarbaminianów stanowią związki o wzorze:

1)Substrat alifatyczny

HR

C= S

2)aminokwas

COOH

S

II c

I s*

R- CH₂=CH ch₃-ch=ch

c =s I

S’ poliaminokwas _R-

COOH COOH	Lys-	Lys J	- Lys 1
1- 1	R'N	NR'	NR
r'h ,r'h	1	1	l
	C=S	C=S 1	C=S J
1	1 S’	ł S'	S’

C= S

S*

R

S O h II ,

R-C-S-C-R

184 466

R* Rpodstawniki

N0₂ R'

CH₃ lub grupa t-butylowa

COOH p-OH

S

II

A-S-C-B s s

II II

B-C-S-S-C-B

Na* Tioester

Ca**

NH₄*

Cholina* i aminy czwartorzędowe

Mg**

Al.***

K*

H*

Do leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych należy dobierać ditiokarboksylany wykazujące lipofilność odpowiednią dla lokalizacji miejsca chorobowo zmienionego. Związek nie powinien gromadzić się w przedziałach o niskim obrocie metabolicznym, takich jak tkanka tłuszczowa. W korzystnym wykonaniu do leczenia chorób sercowo-naczyniowych, farmakokinetyka związku nie powinna ulegać istotnym zmianom w przypadku zastoinowej niewydolności serca ani niewydolności nerek.

W celu podawania miejscowego, do leczenia chorób zapalnych skóry, wybrany związek należy wytwarzać w postaci preparatu wchłanianemu przez skórę w ilości wystarczającej dla uzyskania działania terapeutycznego w miejscu chorobowo zmienionym.

Ditiokarboksylan musi być fizjologicznie dopuszczalny. Ogólnie, dopuszczalne są związki o indeksie terapeutycznym wynoszącym co najmniej 2, a korzystnie, co najmniej 5 lub 10. Indeks terapeutyczny definiuje się jako EC50/IC50, gdy EC₅₀ stanowi stężenie związku hamującego ekspresję VCAM-1 o 50%, natomiast IC₅o stanowi takie stężenie związku, które jest toksyczne dla 50% komórek docelowych. Toksyczność komórkową można mierzyć poprzez bezpośrednie zliczanie komórek, metodą wyłączenia błękitu trypanowego, lub różne badania nad aktywnością metaboliczną, np. metodą włączania 3H-tymidyny, jak jest to znane specjalistom. Indeks terapeutyczny PDTC w hodowli komórkowej w komórkach HUVE, mierzony jako iloraz toksyczności komórkowej i zdolności hamowania aktywowanej przez TNFa ekspresji VCAM-1, ma wartość powyżej 100. We wstępnych badaniach nad szybko dzielącymi się komórkami ludzkiego glejaka HT-18 wykazano brak toksyczności w stężeniach 100-krotnie wyższych od stężenia terapeutycznego. Disulfiram, stosowana doustnie postać dwuetyloditiokarbaminianu, stosowana w leczeniu nadużywania alkoholu, nie wykazuje zwykle istotnego klinicznie działania toksycznego przy właściwym stosowaniu.

Znanych jest kilka ditiokarbaminianów o działaniu uszkadzającym geny (genotoksycznym). Związki te nie są objęte zakresem niniejszego wynalazku, który ograniczony jest do podawania materiałów dopuszczalnych fizjologicznie. Przykład ditiokarbaminianu genotoksycznego stanowi środek grzybobójczy dwumetyloditiokarbaminian cynku. Ponadto, właściwości antycholinesterazowe niektórych ditiokarbaminianów mogąprowadzić do działania neurotoksycznego. Miller, D. (1982), Neurotoxicity of the pesticidal carbamates. Neurobehav. Toxicol. Teratol. 4(6); 779-87.

Termin „ditiokarboksylan” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza, lecz nie jest do niego ograniczony, ditiokarbaminiany o wzorach:

R¹ SC(S)NR2r3 l^_ub R.2r3Ń(S)CS-SC(S)NR2r3, w których R1 stanowi atom wodoru lub kation dopuszczalny farmaceutycznie, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, jon sodowy, potasowy, lub nR⁴R⁵R⁶R⁷, w którym R⁴, R⁵, R⁶ i R⁷ stanowią, niezależnie od siebie, atom wodoru, grupę C,_6 alkilową o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym, grupę hydroksy

184 466 (C^) alkilową(w której przy dowolnym atomie węgla znajduje się jedna lub więcej grup hydroksylowych), lub grupę arylową, a

R2 i R³ stanowią, niezależnie od siebie, grupę CM0 alkilową o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym; - (CHOH)n (CH2)nOH, w których n może wynosić 0,1,2,3,4,5 lub 6; -(CH2)nCO2R1, -(CH2)nCO2R4; grupę hydroksy (CJ alkilową, lub R2¹ R razem tworzą wiązanie, na przykład -(CH2)m-, w którym wartość m wynosi 3-6, i w którym R4 stanowi grupę alkilową, arylową, alkoarylową, lub aroalkilową, włączając w to grupę acetylową, propionylową i butyrylową Szczegółowe przykłady korzystnych ditiokarbaminianów, przedstawione na fig. 15, stanowią sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego, N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy, N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy; N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (dwuetyloditiokarbaminian sodowy) i NlN-dwuizopropyl o-N-karboditiolan sodowy. Aktywne ditiokarboksylany, a w szczególności ditiokarbaminiany, są dostępne w handlu lub można je wytworzyć sposobami znanymi ze stanu techniki.

Aktywność biologiczną oznaczano w następujący sposób

Zdolność ditiokarboksylanów do hamowania ekspresji VCAM-1 można mierzyć różnymi sposobami, na przykład sposobami opisanymi szczegółowo poniżej w przykładach 9-15. Dla ułatwienia, w przykładach 9-11 i 14-15 opisano ocenę aktywności biologicznej soli sodowej karboditiolanu N-pirydynylowego (zwanej również PDTC). Celem tych przykładów nie jest ograniczenie zakresu wynalazku, który obejmuje zastosowanie dowolnego z wyżej opisanych związków do leczenia miażdżycy i innych rodzajów chorób zapalnych i sercowo-naczyniowych, których mediatoremjest VCAM-1. Zamiast PDTC można łatwo zastosować dowolny z wyżej opisanych związków i oceniać go w podobny sposób.

W przykładach 12 i 13 podano dane porównawcze dotyczące zdolności niektórych ditiokarbaminianów do hamowania ekspresji genu VCAM-1. W poniższych przykładach wykazano, że ditiokarbaminiany według niniejszego wynalazku swoiście blokują zdolność VC-AM-1 do ekspresji w komórkach śródbłonka naczyniowego w odpowiedzi na wiele sygnałów, o których wiadomo, że wykazują aktywność w miażdżycy i w odpowiedzi zapalnej.

Przeprowadzono następujące procedury doświadczalne

Hodowle komórkowe

Dokonano izolacji z cewnikowanych ludzkich żył pępkowych komórek HUVE, przepłukano je roztworem Hanksa dla usunięcia krwi, a następnie inkubowano z 1% kolagenazą przez 15 minut w temperaturze 37°C. Po usunięciu kolagenazy komórki hodowano w pożywce M199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (HyClonee, 16 pg/ml heparyny (ESI Pharmaceuticals, Cherry Hill, NJ), 50 pg/ml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka (Collaborative Research Incorporates, Bedford MA), 25 mM Hepes Buffer, 2 mM L-glutaminy, 100 gg/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny, w temperaturze 37°C na płytkach do hodowli tkankowej, pokrytych 0,1%) żelatyną. Dokonano pasażowania komórek w konfluencji poprzez rozszczepienie 1:4. Komórki stosowano w pierwszych 8 pasażach.

Inkubacja z cytokinami i innymi odczynnikami

Konfluentne komórki HUVE przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, po czym umieszczono w świeżej pożywce. 30 minut przed dodaniem cytokin dodano wskazane stężenia PDTC. Do pożywki bezpośrednio dodano cytokiny i inne induktory, w punktach czasowych i w stężeniu wskazanych dla każdego doświadczenia. Ludzka rekombinacyjna IL-1b stanowiła dar Upjohn Company (Kalamazoo, Michigan). TNFa uzyskano z firmy Boehringer Ingelheim. Lipopolisacharyd bakteryjny (LPS), kwas poliinozynowy: kwas policytydylowy (Poly I: C) i ditiokarbaminian pirolidynowy (PDTC) uzyskano z firmy Sigma Chemical (St. Louis, MO). Wszystkie inne odczynniki stosowano w stopniu odczynnika.

Izolacja RNA

Dokonano izolacji całkowitego RNA komórkowego poprzez pojedynczą ekstrakcję z zastosowaniem kwaśnej mieszaniny tiocyjanianu-fenolu-chloroformu. Komórki przepłukano solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanem, a następnie dokonano ich lizy 2 ml izotiocyjanianu

184 466 guanidynowego. Roztwór zakwaszono 0,2 ml octanu sodowego (pH 4,0), a następnie ekstrahowano 2 ml fenolu i 0,4 ml mieszaniny chloroformu : alkoholu izoamylowego (24:1). Przeprowadzono dwukrotnie strącenia RNA etanolem przed zastosowaniem go do analizy metodą Northern blot.

Analiza metodą Northern blot

Wyizolowano RNA całkowite (20 pg) i dokonano podziału na frakcje zależnie od wielkości z zastosowaniem 1% żelu agarozowo-formaldehydowego wo becności 1 ug/ml bromku etydowego. RNA przeniesiono na filtr nitrocelulozowy i połączono kowalencyjnie promienio- waniem ultrafioletowym z zastosowaniem urządzenia do wiązania poprzecznego Stratlinker UV (Stratagene, La Jolla, CA). Hybrydyzację prowadzono w temperaturze 42°C przez 18 godzin w 5X SSC (1X=150 mM NaCl, 15 mM cytrynianu Na), 1% soli sodowej siarczanu dodecylowego, 5X roztworze Denhardta, 50% formamidzie, 10% siarczanie dekstranowym i 100 ug/ml pociętego zdenatuworanego DNA spermy łososiowej. Zastosowano około 1-2X 10⁶ cpm/ml wyznakowanej sondy (aktywność sw-oistal 08 cpm/ug DNA) na hybrydyzację. Po hybrydyzacji filtry przepłukano na koniec 0,2X SSC w temperaturze 55°C. Przed rehybrydyzacją z innymi sondami nitrocelulozę usunięto przegotowaną wodą. Przeprowadzono autoradiografię z ekranem intensyfikującym w temperaturze -70°C.

³2Sondy

Sondy DNA, wyznakowane ³2p, wytworzono sposobem losowego doboru primera oligonukleotydu. Sondę ICAM-1 stanowił fragment EcoRI ludzkiego cDNA. Sondę ELAM-1 stanowił 1/85 kb fragment Hind III ludzkiego cDNA. Sondę VCAM-1 stanowił fragment Hind III -Xho I ludzkiego cDNA, utworzony z nukleotydów 132-1814.

Enzymatyczny Test Immunosorpcyjny (ELISA)

Komórki HUVE posiewano na 96-zagłębieniowe płytki 48-72 godzin przed przeprowadzeniem testu. Do każdego z zagłębień dodano przeciwciała pierwotne w M199 z 5% FBS i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. Komórki następnie przepłukano i inkubowano przez jedną godzinę ze znakowanymi perok^^^<da^iąlgG kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom nysim (Bio Rad), rozcieńczonymi 1/500 w M199 z 5% FBS. Następnie przepłukano zagłębienia i prowadzono wykrywanie wiązania przeciwciał, dodając 100 pl 10 mg/ml 3,3,5,5'-tetrametylobenzydyny (Sigma) z dodatkiem 0,003% H2O2. Reakcję przerwano, dodając 25 pl 8N kwasu siarkowego. Płytki odczytano w urządzeniu do odczytu eLiSa (Bio Rad) w OD 450 nm po zaślepieniu na rzędach zabarwionych tylko przeciwciałem drugiego etapu. Dane stanowią średnią z trzech powtórzeń.

Przeciwciała

Przeciwciało monoklonalne (MAb) 4B9, rozpoznające cząsteczkę adhezji komórkowej naczyń -1 (VCAM-1) były darem Dr Johna Harlana (University ofWashington). MAb rozpoznające cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka (ELAM-1) były darem Dr Swerlick (Emory University). Hybrydomą wytwarzające MAb 84H10, rozpoznające wewnątrzkomórkową cząsteczkę adhezyjną (ICAM-1) wyhodowano rutynowymi sposobami w naszym laboratorium i przeciwciało zastosowano jako supernatant hodowli komórkowej.

Przykład 9

PDTC blokuje indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 HUVEC, której mediatorem jest IL-1B, lecz nie blokuje indukcji ICAM-1 ani ELAM-1

Dla określenia, czy stan oksydacyjny komórki śródbłonka może zmieniać podstawową lub indukowaną ekspresję genu cząsteczki adhezji komórkowej, dokonano ekspozycji ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego na działanie cytokiny indukującej, IL-1b (10 U/ml) w obecności lub w nieobecności tiolowanego przeciwutleniacza chelatującego metal, ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC, 50 pM) przez czas do 24 godzin. Jak to ukazano na fig. 10, sama IL-1b (pasma 2,4,6,8) indukuje oczekiwaną szybką i przejściowąindukcję akumulacji mRNA VCAM-1 (Płytka -A), E-selektyny (ELAM-1, Płytka B) i ICAM-1 (Płytka C), z których wszystkie osiągają wartości szczytowe po czterech godzinach. Jednakże, w obecności PDTC, indukcja akumulacji mRNA VCAM-I przez IL- 1b jest gwałtownie hamowana o ponad 90% (Płytka A, pasma 3,5,7 i 9).

184 466

W przeciwieństwie do tego, jakkolwiek indukcja ELAM-1, której mediatorem jest IL-1b, ulega niewielkiemu hamowaniu po 2 i 24 godzinach (por. pasma 2 i 3), 8 i 9, Płytka B), PDTC nie hamuje indukcji po 4 i 8 godzinach (pasma 5 i 7, Płytka B). Indukcja akumulacji mRNA ICAM-1, której mediatorem jest IL-1b, nie jest zaburzona (Płytka B, pasma 3,5,7 i 9). Istotnie, spostrzega się niewielki wzrost indukcji przez IL-lb akumulacji mRNA ICAM-1 (~30%) (por. pasma 4 i 5, Płytka B). Jednakową ilość przeniesionego na nitrocelulozę RNA na pasmo potwierdzono poprzez barwienie bromkiem etydowym i uwidocznienie.

Przeprowadzono analizę zależności odpowiedzi od dawki dla określenia, czy PDTC hamuje indukcję ekspresji genu VQAM-1 przez IL-1b w sposób zależny od dawki. Jak to ukazano na fig. 11, PDTC hamuje indukcję ekspresji genu VCAM-1, której mediatorem jest IL-lb, stromą krzywą zależności odpowiedzi od dawki (fig. 11, Płytka A) z obliczonym EC50 wynoszącym około 10 pM, natomiast PDTC nie hamuje indukcji ekspresji ELAM-1, której mediatorem jest IL- 1b, w tych stężeniach (fig. 11, Płytka B). Indukcja akumulacji mRNA ELAM-1, której mediatorem jest IL-1b, jest zwiększana przez PDTC w stężeniu powyżej 0,5 pM (fig. 2, por. pasmo 2 i pasma 4-7, Płytka C).

Dane te wykazują, że IL-1b wykorzystuje etap wrażliwy na ditiokarboksylan, a w szczególności na ditiokarbaminian, jako część swego mechanizmu sygnalizacyjnego przy indukcji ekspresji genu VCAM-1. Dane wydają się również wskazywać, że ten etap wrażliwy na ditiokarbaminian nie odgrywa istotnej roli w indukcji ekspresji genu ELAM-1 ani ICAM-1, której mediatorem jest IL-1b.

Przykład 10

PDTC blokuje indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 HUVEC poprzez różnorodne bodźce

W celu stwierdzenia, czy inne znane z piśmiennictwa aktywatory ekspresji genu VCAM-1 również wykorzystują etap wrażliwy na PDTC, przebadano trzy odrębne klasy aktywatorów: inny klasyczny czynnik indukujący, którego mediatorem jest receptor (TNFa), induktor, którego mediatorem nie jest receptor (lipopolisacha-ryd - LPS), i opisany niedawno nowy induktor (dwuniciowy RNA, poli (I:C). We wszystkich trzech przypadkach, PDTC znacznie hamował indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 HUVEC po czterech godzinach (fig. 12, mRNA VCAM- Płytka A). Jakkolwiek ekspresja genu ELAM-1, której mediatoremjest TNFa, ulega w pewnym stopniu zahamowaniu (fig. 12 pasmo 1 i 2, Płytka B), akumulacja mRNA ELAM-1, której mediatorem jest LPS i poli(I:C) nie ulega zmianie (fig. 12 pasma 3-6, Płytka B). Dane te wskazują, że strukturalnie różne czynniki indukujące, działające poprzez odrębne szlaki, mają wspólny etap regulacyjny swoisty dla indukcji ekspresji genu VCAM-1.

Przykład 11

PDTC blokuje ekspresję VCAM-1 na powierzchni komórki HUVE, indukowaną przez różne bodźce

W celu określenia, czy indukcja ekspresji białka powierzchni komórek śródbłonka V CAM-1, podobnie jak jego mRNA, ulega hamowaniu przez PDT C, przeprowadzono test ELISA z użyciem przeciwciał monoklonalnych dla ilościowej oceny indukcji VCAM-1 i ICAM-1 powierzchni komórki hodowli komórek HUVE. Jak to ukazano na fig. 13, wiele klas czynników aktywujących, w nieobecności PDTC (-PDTC), indukuje szybką i przejściową akumulację VCAM-1 (górna płytka po lewej stronie) w momencie szczytu na powierzchni komórki po sześciu godzinach. W obecności PDTC (+PDTC, górna płytka po prawej stronie), indukcja przez wszystkie badane czynniki ekspresji VCAM-1 na powierzchni komórki wyraźnie zmniejsza się (80-90%). W przeciwieństwie do tego, indukowana ekspresja ICAM-1 na powierzchni komórki w tych samych warunkach nie zmienia się (dolne płytki po lewej i prawej stronie).

Dane te wskazują, że ekspresją VCAM-1 na powierzchni komórki, podobnie jak akumulacja jej mRNA, ulega wybiórczemu hamowaniu przez ditiokarbaminiany i że wiele klas czynników aktywujących wykorzystuje podobny, wrażliwy na ditiokarbaminiany mechanizm w celu indukowania ekspresji genu VCAM-1.

184 466

Przykład 12

Porównanie skuteczności przeciwutleniaczy w blokowaniu indukcji VCAM-1 przez TNFa

W celu określenia, czy strukturalnie podobne, lub niepodobne, przeciwutleniacze mogą również hamować ekspresję genu VCAM-1, i z jakim natężeniem, komórki HUVE eksponowano na sześć godzin na TNFa wo becności lub w nieobecności czterech różnych przeciwutleniaczy w różnym stężeniu. Jak to ukazano na fig. 14, zarówno dwuetyloditiokarbaminian (DETC), jak i N-acetylocysteina (NAC) hamowały ekspresję VCAM-1 w stężeniu, odpowiednio, 5 pM i 30 pM. W przeciwieństwie do tego, PDTC (PDTC) wykazywał skuteczność w stężeniu od 5 do 50 pM. Chelator metali (żelaza), desferoksamina, nie wykazywał działania w badanych stężeniach.

Przykład 13

PDTC hamuje indukcję przez TNF adhezji, której mediatorem jest VCAM-1/VLA-4

Sposobami opisanymi w przykładzie 12 badano zdolność rozmaitych przeciwutleniaczy do hamowania indukcji TNF-α VCAM-1 w komórkach HUVE. Figura 15 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O.D. 595 nm) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, w zależności od stężenia PDTC (sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego), DIDTC (NN-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy), SarDTC (N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy), IDADTC (N,N-dwu(kar-boksymetyio)-N-karboditioian trójsodowy), MGDTC (N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy), MeOBGDTC (N-(4-metoksyben-zylo)-D-giukamino-N-karboditiolan sodowy), DEDTC (N,N-dwu-etylo-N-karboditiolan sodowy), Di-PDTC (N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy) i NAC (N-acetylocysteina).

Przykład 13a

PDTC hamuje indukcję przez TNF adhezji, której mediatorem jest VCAM-1/VLA-4

W celu ustalenia, czy hamowanie przez PDTC regulacji VCAM-1 wiąże się z konsekwencjami czynnościowymi, badano przyłączanie się komórek Molt-4 do komórek HUVEC, stymulowanych, lub nie, TNFa (100 U/ml) przez sześć godzin wo becności lub nieobecności PDTC. Uprzednio wykazano, że komórki Molt-4 przyłączają się do aktywowanych komórek HUVEC poprzez mechanizm zależny od VCAM-1. Jak to ukazano na fig. 16, odsetek komórek Molt-4 przyłączających się do komórek HUVEC zmniejszał się przy obecności w pożywce PDTC.

Przykład 14

PDTC hamuje wiązanie monocytów w aorcie piersiowej u królików, którym podawano cholesterol

Przeprowadzono doświadczenie w celu określenia, czy przeciwutleniacz tiolowy PDTC będzie skuteczny w blokowaniu pierwszej składowej miażdżycy, wiązania monocytów, w doświadczalnym modelu zwierzęcym. Jeden dojrzały biały królik szczepu New Zealand (3,5 kg) otrzymywał dożylnie PDTC (20 mg/kg, co odpowiada stężeniu 20 mg/ml w PBS) jeden raz dziennie przez 5 dni. Wstrzyknięcia podawano przez rurkę do żyły bocznej usznej, której drożność utrzymywano przez płukanie heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej. PDTC roztwór wytwarzano codziennie lub co drugi dzień (przechowywano w ciemnym miejscu w temperaturze 4°C), i filtrowano (filtr o porach 0,45 mm) bezpośrednio przed użyciem. Po pierwszym wstrzyknięciu, po umieszczeniu rurki, lek podawano przytomnemu królikowi bez wyraźnego dyskomfortu ani innych działań niepożądanych. Drugiego dnia wstrzyknięć, królikowi podano karmę zawierającą 15 (wagowo) cholesterolu, którą podawano następnie przez pozostały czas doświadczenia. W piątym dniu zwierzę uśmiercano, dokonywano wycięcia i utrwalenia aorty piersiowej. Po odpowiednim przygotowaniu próbkę oglądano na niższym etapie skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w emiter LaB. Stosując obrazowanie dwuekranowe i przezroczystą siatkę na ekranie CRT, oceniano 64 sąsiednie pola w powiększeniu 62ox, co odpowiada powierzchni ~1,3 mm². W każdym polu zliczano liczbę przylegających leukocytów (WBC) i erytrocytów (RBC).

Dane z próbki łuku aorty były następujące: 5 WBC i ~25 RBC na pole o powierzchni 1,3 mm². Ten poziom adhezji WBC jest podobny do obserwowanego u zwierząt kontrolnych,

184 466 którym podawano zwykłą karmę (około 7 na pole obserwowano w próbkach z łuku i odcinka piersiowego aorty w dwóch doświadczeniach „kontroli ujemnej”). U królików z „kontroli dodatniej”, otrzymujących przez 4 dni 1% cholesterolu i nie otrzymujących przeciwutleniacza, stwierdzano około pięciokrotny wzrost adhezji, do wartości 38 WBC/1,3 miF. Przy próbkach z łuku aorty obserwowano znaczną ilość szczątków o rozmiarach komórek. Nie jest jasne, czy materiał ten stanowi artefakt powstały przy wytwarzaniu preparatu, czy też był obecny in vivo, a jeśli tak, to czy jest on związany z podawaniem PDTC. Badania te sugerują, że wstrzyknięcia PDTC mogą skutecznie blokować początkową adhezję monocytów do śródbłonka aorty.

Przykład 15

Hamowanie związków addycyjnych BSA 13-HPODE za pomocą PDTC

Figura 18 stanowi wykres kolumnowy wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych bSa il 3-HPODE, według pomiaru w jednostkach fluorescencyjnych, w stosunku do mikromolowego stężenia PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE inkubowano z 200 mikrogramami BSA wo becności PDTC przez sześć dni. Fluorescencję mierzono w 430-460 nm ze wzbudzeniem w 330-360 nm. Szczegóły testu, por. Freebis, J., Parthasarathy, S., Steinberg, D., Proceedings ofthe National Academy of Sciences 89,10588-10592,1992. W typowej reakcji 100 nmol LOOH (wytworzonego poprzez katalizowane przez lipooksygenazę utlenienie kwasu linolowego) inkubuje się ze 100 pg bydlęcej albuminy surowicy przez 48-72 godzin i po wytworzeniu się produktów fluorescencyjnych mierzy się spektrum fluorescencyjne ze wzbudzeniem w 360 nm i emisję pomiędzy 390 a 500 nm. Jak to ukazano, PDTC zmniejsza stężenie fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA il 3-HPODE.

Przykład 16

Wpływ PDTC na utlenianie LDL przez peroksydazę chrzanową

Figura 20 stanowi wykres wpływu PDTC na utlenienie LDL przez peroksydazę chrzanową (HRP), mierzony w zależności od czasu (minuty) dla zmiennego stężenia PDTC. Po utlenieniu LDL mierzono utlenienie składowych kwasów tłuszczowych LDL, określane poprzez wzrost gęstości optycznej w 234 nm. Gdy wielonienasycony kwas tłuszczowy utlenia się, zachodzi przemieszczenie wiązań podwójnych, w wyniku czego powstają sprzężone dieny absorbujące przy 234 nm. Uważa się, że odcinek krzywej rozpoczęcia i rozprzestrzeniania (okres latencji) jest miarą zdolności LDL do utlenienia. Typowo, 100 pg ludzkiego LDL inkubuje się z 5 pM H2 O2 i obserwuje się następnie wzrost absorpcji w 234 nm.

Stwierdzono, że po okresie inkubacji PDTC hamuje utlenianie LDL przez HRP w sposób zależny od stężenia.

Przykład 17

Wpływ PDTC na indukowane cytokinami wytwarzanie ox-PUFA

Figura 21 stanowi wykres wpływu PDTC na indukowane cytokinami tworzenie się ox-PUFA w ludzkich komórkach śródbłonka aorty. Jak to wskazano, zarówno TNF-α, jak i IL-1B powoduje utlenienie kwasu linolowego do kwasu oksylinolowego. PDTC wyraźnie zmniejsza utlenianie.

Modyfikacja syntezy i metabolizmu PUFA i ox-PUFA

Poprzez modyfikację przemiany PUFA do ox-PUFA można uzyskać hamowanie ekspresji VCAM-1. Na przykład, znanych jest wiele enzymów utleniających związki nienasycone, takich jakperoksydazy, lipoksygenazy, cyklooksygenazy lub cytochrom P-450. Hamowanie tych enzymów może zapobiegać utlenianiu PUFA in vivo. PUFA mogą również ulegać utlenieniu przez zależne od metali substancje nieenzymatyczne.

Sposób modyfikacji ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox

W alternatywnym wykonaniu zapewnia się sposób hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego we wrażliwym na reakcje redox szlaku, polegający na podawaniu skutecznej ilości substancji zapobiegającej utlenianiu sygnału, a typowo,

184 466 utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego. Przykładowe geny wrażliwe na reakcje redox, związane z prezentacją odpowiedzi immunologicznej, stanowią lecz nie sądo nich ograniczone, geny powodujące ekspresję cytokin biorących udział w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej (np. IL-Ιβ) , chemiczne środki przyciągające, ułatwiające migrację komórek zapalnych do miejsca uszkodzenia (np. MCP-1), czynniki wzrostu (np. IL-6 i receptor trombiny) i cząsteczki adhezyjne (np. VCAM-1 i E-selektyna). Uwzględniając powyższe, specjalista będzie mógł dokonać przesiewowego badania rozmaitych przeciwutleniaczy pod kątem ich zdolności do hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego w szlaku wrażliwym na reakcje redox. Wszystkie takie wykonania są objęte zakresem niniejszego wynalazku.

Na podstawie wyników takich badań przesiewowych można zidentyfikować cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające 5'-końcowe sekwencje regulacyjne genów wrażliwych na reakcje redox, do regulacji lub hamowania ekspresji genów in vivo. Do ekspresji konkretnej rekombinacyjnej sekwencji genowej regionu bocznego 5' w komórkach można stosować wektory, włączając w to zarówno plazmidy, jak i eukariotyczne wektory wirusowe, w zależności od preferencji i oceny specjalisty (por. np. Sambrook i wsp., rozdział 16). Ponadto, trwają prace nad pewną liczbą wektorów wirusowych i niewirusowych, umożliwiających włączenie sekwencji kwasów nukleinowych in vivo (por. np. Mulligan, 1993, Science, 260, 926-932; Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 980 286; Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 868 116, włączone do niniejszego opisu przez przywołanie). Ostatnio opracowano układ transportowy, w którym kwas nukleinowy zamyka się w liposomach kationowych, które można wstrzykiwać dożylnie do organizmu ssaka. Układ ten stosuje się do wprowadzania DNA do komórek różnych tkanek dorosłych myszy, w tym do śródbłonka i szpiku kostnego (por. np. Zhu i wsp., 1993 Science, 261, 209-211, włączone do niniejszego opisu przez przywołanie).

Sekwencje boczne 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować w celu hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox. Na przykład, antysensowny RNA całego lub części regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować do hamowania ekspresji genu in vivo. Są już znane ze stanu techniki wektory ekspresyjne (np. retrowirusowe wektory ekspresyjne), które można stosować do wytwarzania antysensownego RNA wybranej sekwencji DNA, ulegającej ekspresji w komórce (porównaj opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4868116 i nr 4 980 286).

Zgodnie z powyższym, można dokonać wprowadzenia DNA zawierającego całość lub część sekwencji regionu bocznego 5' genu do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tak że po przejściu do komórki w wyniku transkrypcji wprowadzonego DNA wytwarza się antysensowne RNA, komplementarne do produktu transkrypcji mRNA genu normalnie znajdującego się w komórce. Ten produkt transkrypcji antysensownego RNA wprowadzonego DNA może następnie dobrać się parami zasad z prawidłowym produktem transkrypcji mRNA znajdującym się w komórce i w ten sposób zapobiec translacji mRNA. Jest oczywiście niezbędne dobranie sekwencji regionu bocznego 5' w kierunku końca 3' od miejsc początku transkrypcji dla genu wrażliwego na reakcje redox dla zapewnienia, że antysensowne RNA zawiera sekwencje komplementarne obecne na mRNA. Antysensowne mRNA można wytwarzać również in vitro, i następnie wprowadzać do komórek. Oligonukleotydy można wytwarzać w automatycznym urządzeniu do syntezy (np. automatyczne urządzenie do syntezy Model 8700 firmy Milligen-Biosearch, Burlington, MA, lub ABI, Model 380 B). Udowodniono również, że dezoksyoligonukleotydy antysensowne skutecznie hamują transkrypcję genu i replikację wirusową (por. np. Zamecnik i wsp., 1978, Proc.Natl. Acad. Sci USA 75, 280-284; Zamecnik i wsp., 1986, Proc.Natl. Acad. Ści. 83, 4143-4146; Wickstrom i wsp., 1988 Proc.Natl. Acad. Sci USA 85,1028-1032; Crooke 1993 FASEB J. 7,533-539. Ponadto, w niedawnych badaniach wykazano, że możliwejest ulepszenie hamowania ekspresji genu przez oligonukleotydy antysensowne, jeżeli oligonukleotydy antysensowne zawierają zmodyfikowane nukleotydy (por. np. Offensperger i wsp., 1993 EMBO J. 12,1257-1262 (hamowanie in vivo replikacji wirusa wirusowego zapalenia wątroby typu B u kaczek i ekspresji jego genu przez antysensowne oligonukleotydy fosforotiolanowe); Rosenberg

184 466 i wsp., PCT WO 93/01286 (wytwarzanie oligonukleotydów siarczanotiolowych); Agrawal i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (wytwarzanie antysensownych fosforoamidanów i fosforotiolanów oligonukleozydowych w celu hamowania replikacji ludzkiego wirusa braku odporności - 1); Sarin i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7794 (wytwarzanie antysensownych oligonukleotydów metylofosfonianowych); Shaw i wsp., 1991 Nucleic Acid Res. 19,747-750 (wytwarzanie oligonukleotydów opornych na 3'-egzonukIeazę, zawierających modyfikacje fosforoamidanu 3'-końcowego); powyższe publikacje włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.

Sekwencje regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować także w terapii potrójnej helisy (triplex). Udowodniono, że oligonukleotydy komplementarne do genowych sekwencji promotorowych na jednej z nici DNA wiążą się z promotorem i sekwencjami regulatorowymi, tworząc miejscowo potrójne helisy kwasu nukleinowego, blokujące transkrypcję genu (por. np. 1989 Maher i wsp., Science 245, 725-730; Orson i wsp., 1991 Nucl. Acids Res. 19, 3435-3441; Postal i wsp., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8227-8231; Cooney i wsp., 1988 Science 241, 456-459; Young i wsp., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10023-10026; Duval-Valentin i wsp., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,504-508; 1992 Blume i wsp., Nuci. Acids Res. 20,1777-1784; 1992 Grigoriev i wsp., J. Biol. Chem. 267,3389-3395.

Ostatnio przedstawiano obliczenia teoretyczne i odkrycia empiryczne, ułatwiające zaprojektowanie oligonukleotydów do zastosowania w kierowanym oligonukleotydarni wytwarzaniu potrójnej helisy w celu hamowania ekspresji genu. Na przykład, oligonukleotydy powinny na ogół mieć długość powyżej 14 nukleotydów dla zapewnienia swoistości sekwencji docelowej (por. np. Maher i wsp., (1989); Grigoriev i wsp., (1992)). Ponadto, wiele komórek chciwie wychwytuje oligonukleotydy o długości poniżej 50 nukleotydów (por. np. Orson i wsp., (1991); Holt i wsp., 1988 Mol. Cell. Biol. 8, 963-973; Wickstrom i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1028-1032). W celu zmniejszenia podatności na degradację wewnątrzkomórkową, np. przez 3'-egzonukleazy, do 3'-końcowej grupy hydroksylowej oligonukleotydów można wprowadzić wolną aminę, bez utraty swoistości wiązania sekwencji (Orson i wsp., 1991). Ponadto, stabilność tripleksów zwiększa się przy metylacji cytokin obecnych w oligonukleotydzie, jak również wtedy, gdy czynnik rozdzielający, jak np. pochodna akrydynowa, jest kowalencyjnie przyłączony do fosforanu 5'-końcowego (np. przez mostek pentametylenowy); znów, bez utraty swoistości wiązania sekwencji (Maher i wsp., (1989); Grigoriev i wsp., (1992).

Sposoby wytwarzania oligonukleotydów są dobrze znane specjalistom. Sposoby takie są rozmaite, od standardowego trawienia enzymatycznego i następnie izolowania fragmentu nukleotydu (por. np. Sambrook i wsp., rozdziały 5 i 6) aż do sposobów czysto syntetycznych, np. poprzez metodę fosfoamidynu cyjanoetylowego z zastosowaniem urządzenia do syntezy DNA Milligen lub Beckman System 1Plus (por. również Ikuta i wsp., Ann. Rev. Biochem., 1984 53,323-356 (metoda fosfotrójestrowa i fosforynotrójestrowa); Narang i wsp., Methods Enzymol, 65, 610-620 (1980) (metoda fosfotrójestrowa). W związku z powyższym, sekwencje DNA regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox, opisanego powyżej, można stosować do projektowania i wytwarzania oligonukleotydów zawierających sekwencje DNA utworzone w zasadzie z co najmniej 15 kolejnych nukleotydów, z (lub bez) modyfikacji zasad, z (lub bez) rozdzielających pochodnych czynników, do zastosowania w wytwarzaniu potrójnych helis, szczególnie w regionie bocznym 5' genu wrażliwego na reakcje redox w celu hamowania ekspresji tego genu.

W niektórych przypadkach może być korzystne wprowadzenie do układu ekspresyjnego czynników wzmacniających lub wielokrotnych kopii sekwencji regulatorowych w celu ułatwienia przesiewowego badania sposobów i odczynników służących do manipulacji ekspresją.

Modele i sposoby badania przesiewowego

Przeprowadzono badania przesiewe do wykrywania zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, lub gen wrażliwy na reakcje redox, które polegają na ilościowym oznaczeniu zastępczych markerów choroby.

W jednym z wykonań ocenia się poziom utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub innych odpowiednich markerów, w tkance lub we krwi, na przykład, gospodarza, jako

184 466 środek oceny „środowiska oksydacyjnego” gospodarza i wrażliwości gospodarza na choroby, których mediatorem jest gen wrażliwy na reakcje redox lub VCAM-1.

Oceniono uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego gospodarza na wielonienasycone kwasy tłuszczowe lub ich utlenione odpowiedniki. Można to osiągnąć np. wystawiając gospodarza na działanie PUFA lub ox-PUFA i porównując otrzymane stężenie VCAM-1 na powierzchni komórki lub krążącego, lub innego markera zastępczego z normą populacyjną.

Wykonano modele in vivo miażdżycy lub innych chorób serca lub chorób zapalnych, których mediatorem jest VCAM-1, poprzez podawanie zwierzętom-gospodarzom nadmiernej ilości PUFA lub utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego dla wywołania choroby. Zwierzęta te można stosować w badaniach klinicznych dla dalszego dokładniejszego poznania tych zaburzeń.

Oceniano związki ze względu na ich zdolność do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, na podstawie ich zdolności do hamowania utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym.

W innym wykonaniu, komórki śródbłonka naczyniowego wystawia się na działanie TNF-a lub innego materiału indukującego VCAM-1 przez odpowiedni czas, a następnie uszkadza się je odpowiednimi środkami, np. poprzez sonikację lub zamrażanie-rozmrażanie. Izoluje się przedziały cytozolowe i błonowe. Wyznakowane radioaktywnie PUFA dodaje się do określonych ilości przedziałów. Bada się zdolność płynu do przemiany PUFA w ox-PUFA wo becności lub w nieobecności związku badanego. Zamiast układu komórek uszkodzonych można stosować komórki nienaruszone.

Środki farmaceutyczne

Możliwe jest leczenie ludzi, koni, psów, bydła i innych zwierząt, w szczególności ssaków, cierpiących na choroby sercowo-naczyniowe, i inne choroby zapalne, których mediatorem jest VCAM-1 lub gen wrażliwy na reakcje redox, poprzez podawanie pacjentowi związku powodującego usunięcie, zmniejszenie stężenia lub zapobieganie wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak np. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy (C₁₈ Δ⁹Ί²), linolenowy (C^ Δ691²), arachidonowy (C2₀ Δ^5,8,1 'Ί4) i eikozatrienowy (C^ Δ^8,ΠΊ4); innych sygnałów oksydacyjnych; lub innego związku czynnego, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej pochodnej lub soli w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozpuszczalniku. Substancje czynne można podawać dowolną korzystną drogą, np. doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo.

W rozumieniu niniejszego opisu, określenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole lub kompleksy” oznacza sole lub kompleksy zachowujące korzystną aktywność biologiczną wyżej wymienionych związków i wykazujące minimalne niepożądane działania toksyczne. Nieograniczające przykłady takich soli stanowią: (a) kwasowe sole addycyjne, wytworzone z kwasów nieorganicznych (np. kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas azotowy, itp.), i sole wytworzone z kwasów organicznych takich jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas pamoinowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas naftalenodwusulfonowy, lub kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne, wytworzone z wielowartościowego kationu metalu takiego, jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas itp., lub z kationu organicznego, wytworzonego

184 466 z N,N-dwubenzyloetylenodwuaminy, D-glukozaminy, amoniaku, tetraetyloamoniaku, lub etylenodwuaminy lub (c) kombinacje (a) i (b), np. taninian cynku itp.

Związek czynny lub mieszaninę związków podaje się w dowolny odpowiedni sposób, na przykład, lecz bez ograniczenia do tych sposobów, doustnie i dożylnie. Ogólny zakres dawkowania w wymienionych powyżej zaburzeniach będzie wynosił od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, podawanych z częstością od jeden raz na dwa dni do kilku razy dziennie. Korzystne są dawki dzienne od około 1 do 3000 mg/pacjenta/dzień/bardziej korzystne, od około 5 do 500 mg/pacjenta/dzień, i najkorzystniejsze, od około 25 do 500 mg/pacjenta/dzień.

Składnik czynny należy podawać w taki sposób, aby uzyskiwać szczytowe stężenie związku czynnego w osoczu wynoszące około 0,1-100 EmuM, korzystnie, około 1-10 pM. Można to osiągnąć np. poprzez wstrzyknięcie dożylne roztworu lub preparatu składnika czynnego, ewentualnie w soli fizjologicznej, lub w środowisku wodnym, lub poprzez podanie bolusu składnika czynnego.

Związki podawać można również bezpośrednio do ściany naczyniowej, stosując cewniki perfuzyjne z balonikiem, po lub zamiast angioplastyki naczyń wieńcowych lub innych naczyń tętniczych. Na przykład, podaje się 2-5 ml fizjologicznie dopuszczalnego roztworu zawierającego około 1-500 pM związku lub mieszaniny związków, pod ciśnieniem 1-5 atmosfer. Następnie, w ciągu następnych sześciu miesięcy, w okresie największego ryzyka restenozy, związki czynne podaje się odpowiednimi drogami w odpowiednim schemacie dawkowania.

W celu spowodowania „obkurczania się” zmian chorobowych tętnic wieńcowych, których nie można leczyć angioplastyką ani zabiegiem operacyjnym, stosuje się względnie krótkotrwałe leczenie związkiem czynnym. Nieograniczający przykład krótkotrwałego leczenia stanowi podawanie związku przez okres od dwóch do sześciu miesięcy w dawce od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, z częstością od raz na dwa dni do trzy razy dziennie.

W celu zapobiegania rozwojowi zmian zaawansowanych u pacjentów wysokiego ryzyka można stosować leczenie długoterminowe. Leczenie długoterminowe może trwać wiele lat, w dawkach od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, z częstością od raz na dwa dni do trzy razy dziennie.

Związki czynne można również podawać w okresach bezpośrednio przed i po angioplastyce naczyń wieńcowych w celu zmniejszenia lub wyeliminowania nieprawidłowej odpowiedzi proliferacyjnej i zapalnej, która obecnie prowadzi do istotnej klinicznie restenozy.

Związki czynne można podawać wraz z innymi lekami stosowanymi w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, włączając w to środki obniżające poziom lipidów, takie jak probucol i kwas nikotynowy; środki hamujące agregację płytek krwi, takie jak aspiryna; środki przeciwzakrzepowe, jak kumaryna; blokery kanału wapniowego, jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitory enzymu konwertazy angiotensyny (ACE), jak kaptopryl i enalapryl i β-blokery, jak propranolol, terbutalol i labetalol. Związki można również podawać wraz z niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi, jak ibuprofen, indometacyna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy, sulindak. Związek możną również podawać wraz z kortykosteroidami.

Stężenie związku czynnego w preparacie będzie zależeć od stopnia wchłaniania, dystrybucji, inaktywacji i wydalania leku, jak również od innych czynników znanych specjalistom. Należy zaznaczyć, że dawkowanie będzie również zależało od ciężkości schorzenia. Należy rozumieć, że sposób dawkowania należy dobierać odpowiednio dla danego pacjenta w danym okresie, w zależności od indywidualnego zapotrzebowania i profesjonalnej oceny osoby podającej lub nadzorującej podawanie preparatów, oraz że zakres stężenia, podany w niniejszym opisie, majedynie charakter przykładowy i nie ogranicza zakresu niniejszego wynalazku. Składnik czynny można stosować w jednej dawce lub w dawkach podzielonych, podawanych w różnych odstępach czasowych. Preparaty doustne zawierać będą zwykle obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogąone być zamknięte w kapsułkach żelatynowych lub prasowane w tabletki. Związek czynny przeznaczony do leczniczego podawania doustnego można łączyć z zarobkami i stosować w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. W skład preparatu mogą także wchodzić farmaceutycznie odpowiednie środki wiążące, i/lub substancje dodatkowe.

184 466

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki itp. mogą zawierać dowolny z następujących składników, lub związków o podobnej naturze: środek wiążący, jak celuloza mikrokrystaliczna, tragakantca lub żelatyna; zaróbka, jak skrobia lub laktoza, środek rozsadzający, jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; środek zwilżający, jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, jak koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, jak sacharoza lub sacharyna; środek smakowy, jak mięta pieprzowa, salicylan metylowy, lub aromat pomarańczowy. W przypadku kapsułek, mogą one zawierać, oprócz substancji omówionych powyżej, ciekły nośnik, np. olej. Ponadto, poszczególne rodzaje preparatów mogą zawierać rozmaite inne substancje, modyfikujące fizyczną postać preparatu, np. powłoki cukrowe, szelakowe lub inne powłoki dojelitowe.

Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub pochodnąmożna podawać jako składnik eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia itp. Syrop może oprócz związków czynnych zawierać sacharozę, jako środek słodzący, i niektóre środki konserwujące, barwniki i środki smakowe.

Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne lub sole można również podawać z innymi substancjami czynnymi, nie zaburzającymi korzystnego działania, lub z substancjami uzupełniającymi korzystne działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, lub przeciwwirusowe.

Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskórnego, podskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki; jałowy rozcieńczalnik, jak woda do wstrzyknięć, roztwór soli fizjologicznej, oleje roślinne, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki przeciwbakteryjne, jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przeciwutleniacze, jak kwas askorbinowy lub bisiarczyn sodowy; środki chelatujące, takie jak kwas etylenodwuaminoczterooctowy; bufory, jak octany, cytryniany lub fosforany i środki izotonizujące, jak chlorek sodowy lub dekstroza. Preparat do podawania doustnego można wytwarzać w postaci ampułek, strzykawekjednorazowych lub szklanych lub plastykowych fiolek wielodawkowych.

Znane są odpowiednie nośniki do zastosowań miejscowych, należą do nich płyny do zmywania (lotio), zawiesiny, maści, kremy, żele, nalewki, aerozole, pudry, pasty, plastry przezskórne o przedłużonym uwalnianiu, aerozole dooskrzelowe, i czopki do stosowania doodbytniczego, dopochwowego i na śluzówkę nosa lub jamy ustnej.

Do wytwarzania preparatów do podawania miejscowego można stosować środki zagęszczające, zmiękczające i stabilizujące. Przykłady środków zagęszczających stanowią wazelina, wosk pszczeli, żywica ksantanowa i glikol polietylenowy, środki pochłaniające wilgoć, jak sorbit, środki zmiękczające, jak oleje mineralne, lanolina i jej pochodne, lub skwalen. W handlu dostępne są liczne roztwory i maści.

W celu poprawienia smaku preparatów miejscowych do podawania na śluzówki można stosować naturalne lub syntetyczne środki smakowe lub słodzące. Można dodawać obojętne barwniki, w szczególności w przypadku preparatów przeznaczonych do stosowania na powierzchnię śluzówki jamy ustnej.

Związki czynne można łączyć z nośnikami, chroniącymi związek przed szybkim uwalnianiem się, np. w postaci preparatów o przedłużonym uwalnianiu, włączając w to wszczepy i mikrokapsułkowe układy uwalniania. Można stosować odpowiednie biologicznie i ulegające degradacji biologicznej polimery, takie jak octan etylenowo-winylowy, wielobezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry, i kwas polimlekowy. Opatentowano wiele sposobów wytwarzania takich preparatów, które są ogólnie znane specjalistom.

Przy podawaniu dożylnym, korzystne nośniki stanowią sól fizjologiczna lub sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS).

Związek czynny można również podawać w plastrze przezskórnym. Sposoby wytwarzania plastrów przezskórnych są znane specjalistom. Por. np. Brown, L.i Ląnge^R., Transdermal Delivery of Drugs, Annual Review of Medicine, 39:221-229 (1988), które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.

184 466

W innym wykonaniu, składniki czynne łączy się z nośnikami zabezpieczającymi związek przed szybkim usunięciem z organizmu, w postaci np. preparatów o przedłużonym uwalnianiu, włączając w to wszczepy i mikrokapsułkowe układy uwalniania. Można stosować odpowiednie biologicznie i ulegające degradacji biologicznej polimery, takie jak octan etylenowo-winylowy, wielobezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry, i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich preparatów są oczywiste dla specjalistów. Materiały można również nabyć wAlza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.

Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą również stanowić zawiesiny liposomalne. Można je wytwarzać sposobami znanymi specjalistom, opisanymi np. w opisie patentowym Stany Zjednoczone Ameryki nr 4522811. Na przykład, preparaty liposomowe można wytwarzać, rozpuszczając odpowiedni lipid (lipidy) (takie jak stearoilofosfatydyloetanolamina, stearoilofosfatydylocholina, arachidoilofosfatydylocholina i cholesterol) w rozpuszczalniku nieorganicznym, który następnie odparowuje się, pozostawiając cienką warstwę wysuszonego lipidu na powierzchni naczynia.

Następnie do naczynia wprowadza się wodny roztwór związku czynnego lub jego pochodnej monofosforanowej, dwufosforanowej i/lub trój fosforanowej. Naczynie wiruje się następnie ręcznie dla uwolnienia substancji lipidowych z boków naczynia i dla rozproszenia płynnych agregatów, wytwarzając w ten sposób zawiesinę liposomalną.

Przykład 18

Środek farmaceutyczny w postaci tabletki

Środek farmaceutyczny w postaci tabletki wytworzono przez granulowanie na mokro składników (a) do (c) z roztworem poliwinylopirolidonu, dodano stearynian magnezowy i sprasowano. Skład kompozycji:

(a) Składnik czynny	mg/tabletkę 250	mg/tabletkę 220
(b) Laktoza	210	26
(c) Skrobia kukurydziana	20	12
(d) Poliwinylopirolidon	m	9
(e) Stearynian magnezowy	5	3
Razem:	500	300

184 466

Wpływ kwasu linolowego i 13-HPODE (zależność odpowiedzi nd dawki) na ekspresję genu VCAM-1

Fig. 2

184 466

Ekspresja na powierzchni'komórki (O.D. 450nm)

arachidonowy

184 466

0.4

Ekspresja na powierzchni kcmórki. (O.D.)

OJ

0.2

0.1

0.0

	M O §	£ o G
nJ		1	O
rd	£	r>	Ό
o	o		•H
	rd
-P	V) O		tn u

Fig *4

15-HPSIZ

184 466

Fię.5

184 466

184 466 p85VCAMCAT p288VCAMCAT pSV,CAT

CON.» KONTROLA

L.Λ. = KWAS

LINOLOWY

CON L.A TNF L.A »

POIĆ

CON L.A. INF L.A.

POIĆ

CON L.A. TNF L.A.

POIĆ pfl5VCAMCAT p288VCAMCAT pSV,CAT

Ac

CON L.A. INF L.A.

«

POIĆ

CON L.A. INF L.A.

POIĆ

CON L.A INF L.A.

»

POIĆ

184 466

C T L T L

PDTC: - - - 4- +

C T L T L

PDTC: - - - + ₊

2 3 4 5

C: KONTROLA

T: TNFa (100 U/ml)

L: KWAS LINOLOWY (7.5 gM)

C.‘ KONTROLA

T: TNFa (100 U/ml) L:kwas linolowy (7.5 pM)

184 466

* - wartość różna (p<i0,05) od kontroli # - wartość różna (p<0,05) od wartości dla odpowiedniego kwasu tłuszczowego bez obróbki PDTC

184 466 <*** §

r« m

«η

Względna aktywność TBARS

wartość różna (p<0,05) od kontroli wartość różna (p<0,05) od wartości dla odpowiedniego kwasu tłuszczowego bez obróbki PDTC

Fig . 9b

184 466

Fig·. 10a

CZAS (GODZINY)

Fig-10b

Fig· .00c

CZAS (GODZINY)

VCAM-1

ECZAS (GODZINY)

234 56789

ICAM-1

P07C (μΜ) O O 0.050.5 5 50 100

Fig\ Ha

VCAM-1

3 4 5 6 7

184 466

Fig·, .llb

ΡΟΤθ(μΜ) o O 0.05 0.5 5 50 100 IL28 S

18S + + + + + 4- +

2 3 4 5 6 7

E- SELEKTYNA

Fig .lic

PDTC (μΜ) O O 0.0005 5 50 100

2 3 4 5 6 7

ICAM 1

TNF LPS PIC

TNF LPS PIC PDTC _ ₊ _ ₊ _ ₊

TNF LPS PIC

28S18S Fig.l2c

ICAM- 1

184 466

Względna Względna akumulacja ICAM-1 akumulacja VCAM0.140η

0.1200.1000.0800.0600.040 0.020

0.000------0.2500.200·

0,150«

0.100«,

0.050 H

0.000

Eł £k

ESI

Fig- . 13

184 466

Względna ekspresja VCAM-1 na powierzchni komórki

0.4

0.3-

Fig·. 14

184 466 % wiązanie MOLT-4 Wzglądna ekspresja VCAM0.07-/

0.060.050.040.030.020.01n-ć

Ll tt tt

4=71

2Z71

ΖΣΖ £·£ £ £ £ £ p t ¢2 Z 2.z 22 h-H-H > ί^§<->§ί2§ί^§ί2^ερερεο £ > §^085§qS^ =5 LL>_n >^>_n ^>^^>O>L!j>5r Q

2 □	2	2	2	ω	2	Q
o.	□	3-	3	2	2	2
o	o	o	O	3	3	3
tn	to	o	o	O	O	O
		to	10	o	o	o
				to	to	to

O

O to

Fig.15

La |e§ I ^ε£2»ε £

Η

SZ2 __£~ «— □

o o

tO

O o

to o

<

z

E tO

TNF TNF TNF »P0iC >mA8D3C4

184 466 c-SNa

Sól sodowa karboditiolanu N-pirolidynowego

CH₃-N-CS₂Nq

CH₂C0CH

N-metylo-N-karboksymetylo-Nkarboditiolan sodowy (zwany też sarkozynodwutiokarbaminianem. sodowym)

NaOOCCHj-N-CSgNa

CH₂C00Na

N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy (zwany też solą· trój sodową ditiokarbaminianu kwasu.iminodwuoctowego)

Mo — N (CHCH)₄CH^H

CSpNa

N-metylo-D-glukamin.o-N-karboditiolan sodowy

CH,CH,-N- CS,Na

Ί

CHjCHj

N- (4-metoksy-benzylo) -D-glukamino-N-karboditiolan sodowy

N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (zwany też dwuetyloditio karbaminianem sodowym) (CH₃)₂CH-N-CS₂Na

CHICHĄ

N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy (zwany też dwuizopropylodwukarbaminianem sodowym)

184 466

WPŁYW PDTC NA WYTWARZANIE SIE FLUORESCENCYJNYCH ZWIĄZKÓW ADDYCYJNYCH (1 mikromol 13-HPODE inkubowano z 200 mikrogramami BSA w obecności PDTC przez 6 dni Pluorescencję mierzono w 430-460 nm przy wzbudzeniu 330-360 nm)

JEDNOSTKI PLUORSSCENCJI

400 -

χ»Ζ»χ*χκ*χ·3

··*«*·*·*«*********·£ β™ λ·??··»···;·»'··»'

Μ·Σ·Μ···Μ··ν5 ••ίώίώί&ίώί»

Μ*ί·ί·!·Ι·Σ·Σ·Μ·5 wWwjww ·:Λ“Λν·ν··ν

2.5 ••♦♦•♦•WWiW !·ί·ί»Μ»ί·.«Μ«.»Ι<

PDTC (MIKROMOLE) Fig.18

184 466

Wpływ PDTC na wytwarzanie się fluorescencyjnych związków addycyjnych z DSA i LOOH

JEDNOSTKI FLUORESCENCJI

Długość fali Fig. 19 (nm)

184 466

WPŁYW PDTC NA UTLENIANIE LDL PRZEZ HRP

WZROST W OD 234 nm

Czas (minuty)

PAsr .20

184 466

Fig 2.1

184 466

WPŁYW KWASU LINOLOWEGO I 13-HPODE NA KINETYKĘ EKSPRESJI GENU VCAM-1

Ekspresja na powierzchni‘komórki (O.D. 450)

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie estru ditiokart

A-S-C-»B

A-S-C--B

A oznacza fizjologicznie odszczepialną grupę opuszczającą inną niż farmaceutycznie dopuszczalny kation;

B oznacza grupę o wzorze NR²R³, w którym R² i R³ niezależnie od siebie oznaczajągrupę alkilową grupę o wzorze -(CHOH)n (CH2)nOH, grupę o wzorze -(CH2)nCO2R⁴, w którym n oznacza 1, 2, 3, 4, 5 lub 6; grupę hydroksy (C,_6)alkilową grupę alkenylową; grupę alkilo (CO2H), alkenylo(CO2H), alkinylo(CO2H) lub grupę arylową, ewentualnie podstawioną grupą -NO2, -CH3, t-butylową, -CO2H, atomem chlorowca, lub grupąp-OH; względnie R2 i R3 razem tworzą mostek o wzorze -(CH2)_m-, w którym m oznacza 3,4,5 lub 6, a R4 oznacza alkil, aryl alkiloaryl lub aryloalkii; do wytwarzania leku do leczenia choroby sercowo-naczyniowej u gospodarza.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że substancją aktywnąjest ester ditiokarbaminianowy, w którym A oznacza acyl, alkil, grupę fosforanową, grupę siarczanową lub grupę sulfonianową.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że substancjąaktywnąjest ester ditiokarbaminianowy, w którym A oznacza acetyl, propionyl lub butyryl.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą sercowo-naczyniowajest miażdżyca tętnic.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą sercowo-naczyniowajest nawrót zwężenia po dokonanej plastyce tętnic.
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą sercowo-nac^^^i^K^-^^^ąjest choroba tętnicy wieńcowej.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą sercowo-naczyniowąjest dusznica bolesna.
8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia ludzi.
9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wytworzonym leku substancja czynna zawarta jest w ilości 0,5 - 500 mg/kg ciężaru ciała.
10. Zastosowanie estru ditiokarbaminianowego o wzorze s

II

A-S-C--B w którym

A oznacza fizjologicznie odszczepialną grupę opuszczającą inną niż farmaceutycznie dopuszczalny kation;

B oznacza grupę o wzorze NR2R³, w którym R2 i R3 niezależnie od siebie oznaczają grupę alkilową, grupę o wzorze -(CHOH)_n(CH2)nOH, grupę o wzorze -(CH2)nCO2R4 w którym n oznacza 1, 2, 3, 4, 5 lub 6; grupę hydroksy (C^alkilową grupę alkenylową; grupę alkilo (CO2H), alkenylo(CO2H), alkinylo(CO2H) lub grupę arylową, ewentualnie podstawioną grupą-NO2, -CH3, t-butylową, -CO2H, atomem chlorowca, lub grupą j-OH; względnie R2 i R3 razem tworząmostek o wzorze -(CH2)_m-, w którym m oznacza 3,4,5 lub 6,

184 466 a R⁴ oznacza alkil, aryl alkiloaryl lub aryloalkil; do wytwarzania leku do leczenia choroby zapalnej u gospodarza.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że substancją aktywną jest ester ditiokarbaminianowy, w którym A oznacza acyl, alkil grupę fosforanową, grupę siarczanową lub grupę sulfonianową.
12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że substancją aktywną jest ester ditiokarbaminianowy, w którym A oznacza acetyl, propionyl lub butyryl.
13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że chorobązapalnąjest reumatoidalne zapalenie stawów.
14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że chorobą zapalnąjest gościec zwyradniający.
15. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że chorobą zapalnąjest astma.
16. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że chorobą zapalnąjest zapalenie skóry.
17. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że chorobą zapalnąjest stwardnienie rozsiane.
18. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że leczonym gospodarzem jest człowiek.
19. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że w wytworzonym leku substancja czynna zawarta jest w ilości 0,5 - 500 mg/kg ciężaru ciała.