CZ330896A3 - Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenasycené mastné kyseliny a způsoby s tímto použitím spojené - Google Patents

Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenasycené mastné kyseliny a způsoby s tímto použitím spojené Download PDF

Info

Publication number
CZ330896A3
CZ330896A3 CZ963308A CZ330896A CZ330896A3 CZ 330896 A3 CZ330896 A3 CZ 330896A3 CZ 963308 A CZ963308 A CZ 963308A CZ 330896 A CZ330896 A CZ 330896A CZ 330896 A3 CZ330896 A3 CZ 330896A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vcam
acid
polyunsaturated fatty
fatty acid
expression
Prior art date
Application number
CZ963308A
Other languages
English (en)
Inventor
Russell M. Medford
Wayne R. Alexander
Sampath Parthasarathy
Bobby V. Khan
Margaret K. Offermann
Original Assignee
Emory University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emory University filed Critical Emory University
Publication of CZ330896A3 publication Critical patent/CZ330896A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C07D295/20—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms by radicals derived from carbonic acid, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C07D295/21—Radicals derived from sulfur analogues of carbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/265—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbonic, thiocarbonic, or thiocarboxylic acids, e.g. thioacetic acid, xanthogenic acid, trithiocarbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/325—Carbamic acids; Thiocarbamic acids; Anhydrides or salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/02—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/04—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof having nitrogen atoms of thiocarbamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/02—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/08—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof having nitrogen atoms of thiocarbamic groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/14—Dithiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/16—Salts of dithiocarbamic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/7056—Selectin superfamily, e.g. LAM-1, GlyCAM, ELAM-1, PADGEM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
    • Y10T436/201666—Carboxylic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

Oblast techniky
-f-Anč-M-ivýcli cliurub # r t tL· AIOINíSVIA
Tato přihláška se týká metod a kompozic pro léčlou | aterosklerosy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob. 1 „ λ ς Β 8 9 0 0
Dosavadní stav techniky
Adhese leukocytú na endotel representuje základní, časnou událost v širokém rozsahu zánětlivých stavů, včetně aterosklerosy, autoimunitních chorob a bakteriálních a virových infekcí. Nahromadění leukocytú na endoteliu je započato tehdy, jestliže indukující adhesivní molekuly receptorů na povrchu buněk endotelu reagují s opačnými receptory na imunitních buňkách. Vaskulární endoteliální buňky determinují, jaký typ leukocytú (monocyty, lymfocyty nebo neutrofily) je povolán, a to selektivní expresí specifických adhesních molekul, jako je vaskulární buněčná adhesní molekula 1 (VCAM-1), intracelulární adhesní molekula -1 (ICAM-1) a E-selektin. V raných stadiích aterosklerotických lézí je lokalizovaná endoteliální exprese VCAM-1 a selektivní hromadění mononukleárních leukocytú, které exprivují integrinový protireceptor VLA-4. Vzhledem k selektivní expresi VLA-4 na monocytech a lymfocytech, ale ne na neutrofilech, je VCAM-1 důležitá ve sprostředkování selektivní adheze mononukleárních leukocytú. Následná konverze leukocytú na pěnité makrofágy vede k syntézee velké šíře zánětlivých cytokinů, růstových faktorů a chemoatraktantů, které pomáhají rozšiřovat hromadění leukocytú a destiček, pomáhají proiiferaci buněk hladkého svalu, aktivaci endoteliálních buněk a syntéze extracelulární matrice charakteristické pro zrající aterosklerotický plát.
VCAM-1 je exprivována v kultivovaných lidských vaskulárních endoteliálních buňkách po aktivaci 1ipopolysacharidem (LPS) a cytokiny jako je interleukin -1 (IL-1) a tumor nekrosis faktor (TNF-a). Tyto faktory nejsou selektivní pro aktivaci exprese buněčných adhezních molekul Schéma 1 ilustruje proces cytokinové aktivace VCAM-1 genové exprese ve vaskulárních endoteliálních buňkách.
Regulační schéma pro cytokinovou aktivaci genovou expresi vaskulární buněčné adhezní molekuly - 1 (VCAM-1), přes redox sensitivní regulační faktory jako je NF-kP, vé vaskulárních endoteliálních buňkách (IkB je inhibiční podjednotka, NF-kB je nukleární faktor - kB, NH3 r3 označuje aminokonec proteinu a RNA Pol II je RNA polymerasa II)
Molekulární analýza regulačních elementů na lidském VCAM-1 genu, který kontroluje jeho expresi naznačuje důležitou úlohu nukleárního faktoru -kB (NF-kB), transkripčního regulačního faktoru, nebo NF-kB podobného vazebného proteinu v oxidačně-redukční sensitivni regulaci VCAM-1 genové exprese. Transkripční faktory jsou proteiny, které aktivují (nebo reprivují) genovou expresi uvnitř buněčného jádra vazbou na specifické DNA sekvence nazývané enhancer elementy, které jsou obyčejně blízko regionu genu nazívaného promotor, ze kterého je iniciována syntéza RNA. Nukleární faktor - kB je uhikvitně exprivovaný multipodjednotkový transkripční faktor aktivovaný v mnoha buněčných typech širokou a různorodou skupinou inflamatorních agens jako je TNF-a, IL-Ιβ, bakteriální endotoxin, a RNA viry Hraje klíčovou roli ve zprostředkování zánětlivých a jiných stresových signálů jadernému regulačnímu aparátu. Ačkoliv přesné biochemické signály, které aktivují NF-kB nejsou známé, může být transkripční faktor integrován do společné molekulární dráhy mnoha rizikových faktorů a kausativních signálů aterosklerosy, jako je hyper1ipidemie, kouření, hypertenze a diabetes mellitus.
Důležité je, že aktivace NF-kB ve vaskulárních endoteliálních buňkách různými signály může být inhibována antioxidanty jako je N-acetylcystein a pyrrolidin dithiokarbamát (viz U.S.S.N. 07/969,934, nyní dostupný). To vedlo k hypotéze, že kyslíkové radikály hrají důležitou roli v aktivaci NF-kB nedefinovaným oxidačně-redukčním mechanismem. Protože NF-kB podobný enhancer element také reguluje transkripci VCAM-1 promotoru oxidačnš-redukčním sensitivním způsobem, může oxidační stres v aterosklerotické lézi hrát roli v regulaci VCAM-1 genové exprese cestou tohoto oxidoredukčně sensitivnlho transkripčního regulačního proteinu.
Bylo vyvozenmo, že modifikace lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) do oxidativně modifikovaných LDL (ox-LDL) reaktivními druhy kyslíku je centrální událostí, která iniciuje a propaguje aterosklerosu. Steinberg et al., N. Engl. J. Med. 1989,320:915-924. Oxidovaný LDL je komplexní struktura, sestávající z alespoň několika odlišných oxidovaných materiálů, ze kterých každý, ať sám nebo v kombinaci, může modulovat cytokiny modulovanou genovou expresi adhesních molekul. Hydroperoxidy mastných kyselin jako je linoleyl hydroperoxid (13-HPODE) jsou produkovány z volných mastných kyselin 1ipooxygenásami a jsou důležitými komponentami oxidovaných LDL.
Bylo předpokládáno, že generování oxidovaných lipidů je prováděno akcí buněčného 1ipooxygenásového systému a že oxidované lipidy jsou dále transferovány do LDL. Tam je potom propagační reakce uvnitř LDL v mediu katalyzovaném přechodovými kovy a /nebo sulfhydryl sloučeninami. Dřívější výzkumníci demonstrovali, že modifikace mastných kyselin kultivovaných endoteliálních buněk může změnit jejich náchylnost k oxidativnímu poškození. Suplementace nasycených nebo mononenasycených mastných kyselin u kultivovaných endoteliálních buněk redukuje jejich vnímavost k oxidativnímu poškození, zatímco suplementace polynenasycenými mastnými kyselinami (PUFA) zvyšuje vnímavost k oxidačnímu poškozeni.
Užitím HPLC analýzy s reverzní fází nativních a saponifikovaných lipidových extraktů LDL bylo demonstrováno, že 13-HPODE je predominantní oxidovaná mastná kyselina v LDL oxidovaná aktivovanými lidskými monocyty. Chronická expozice oxidovanému LDL poskytuje oxidativní signál vaskulárním endoteliálním buňkám, možná cestou specifického hydroperoxidu mastné kyseliny, který selektivně zvyšuje cytokiny indukovanou VCAM-1 genovou expresi.
Díky mechanismům, které nejsou dobře definovány, sekvestrují oblasti cévní stěny predisponované k aterosklerose preferenčně cirkulující LDL. Prostřednictvím špatně popsané metabolické dráhy pak endotelie, hladké svaly a/nebo zánětlivé buňky konvertují LDL na οχ-LDL. Oproti LDL, který je vychytáván díky LDL receptorů,vychytávají monocyty dychtivě οχ-LDL díky scavenger receptorů,jehož exprese,narozdí1 od LDL receptorů, neinhibuje nárůst obsahu intracelulárních lipidů. Tak monocyt pokračuje ve vychytávání οχ-LDL a stává se 1ipid-přeplněné pěnitým makrofágem, který formuje tukový pruh.
Kardiovaskulární choroby jsou nyní vedoucí příčinou úmrtí ve Spojených státech a devadesát procent kardiovaskulárních chorob je nyní diagnostikováno jako aterosklerosa, a proto je zde silná potřeba identifikovat nové metody a farmaceutická agens pro její léčbu. Vzhledem k tomuto cíli je důležitá identifikace a manipulace specifických oxidovaných biologických sloučenin, které účinkuji jako selektivní regulátory exprese mediátorů zánětlivých procesů a zejména VCAM-1. Obecnějším cílem je identifikace selektivních metod pro supresi exprese na redukci sensitivních genů nebo aktivace na redukci sensitivních genů, které jsou suprivovány.
Poskytnutí léčby pro aterosklerosu a jiné kardiovaskulární a zánětlivé choroby je tudíž předmětem předkládaného vynálezu.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí metod pro selektivní inhibici VCAM-1.
Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí metod pro léčbu chorob nebo poruch, které jsou zprostředkovány expresí nebo supresí na redukci sensitivních genů.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutických kompozic pro léčbu aterosklerosy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob.
Podstata vynálezu
Bylo objeveno, že polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) a jejich hydroperoxidy (ox-PUFA), které jsou důležitou komponentou oxdativně modifikovaných lipoproteinů s nízkou densitou (LDL) indukují expresi VCAM-1, ale ne intracelulární adhezní molekuly - 1 (ICAM-1) nebo E-selektinu v lidských aortálních endoteliálních buňkách díky mechanismu, který není zprostředkován cytokiny nebo jinými necytokinovými signály. To je základním objevem v důležité a dříve neznámé biologické metabolické dráze ve VCAM-1 zprostředkované imunitní odpovědi.
Jako nelimitující příklady, kyselina linoleová, kyselina linolenová, kyselina arachidonová, hydroperoxid kyseliny linoleové (13-HPODE) a hydroperoxid kyseliny arachidonové indukují genovou expresi VCAM-1 na povrchu buněk, ale ne expresi ICAM-1 a E-selektinu. Nasycené mastné kyseliny (jako je kyselina stearová) a mononenasycené mastné kyseliny (jako je kyselina oleová) neindukují expresi VCAM-1, ICAM-1 ani E selektinu.
Indukce VCAM-1 PUFA a jejich hydroperoxidy mastných kyselin je suprivována antioxidačním pyrrolidin d i th i oka rhamat em (PI)TC) . Toto inikuje, že indukce je mediována oxidující signální molekulou, a že indukci je zabráněno, je-li. blokována oxidace molekuly (t.j- oxidace se nevyskytne), je-li revertována (t.j. signální molekula je redukována), nebo je-li redukčně modifikovanému signálu jinak zabráněno v interakci s jeho regulačním cílem.
Buňky, které jsou chronicky exponovány vyšším než normálním hladinám polynenasycených mastných kyselin nebo jejich oxidovaným protějškům, mohou iniciovat imunitní odpověď která není normální a která je nepoměrná vzhledem k přítomnému ohrožení a která vede k chorobnému stavu. Nadměrná senzitivita vaskulárnich endoteliálních buněk k PUFAS a ox-PUFAS může akceleroval formování, například, aterosklerotického plátu.
Na základě těchto objevů jc poskytnuta metoda pro léčbu a t e vosk 1 o rosy, pos tang i op 1. as t i ckých res 1, cnos, ko ronární arteriální choroby, anginy a jiných kardiovaskulárních chorob, jako i nekardiovasulárníoh zánětlivých chorob, které jsou mediovány VCAM-1, která zahrnuje odstranění, snížení koncentrací, nebo prevenci vytváření oxidovaných polynenasycených mastných kyselin včetně, ale ne pouze, oxidované linoleové (Ci8A9,12) , linolenové (CiβA6·9·12), arachidonové (C2o~5·8·11»14), a eikosatrienové (C20c8>11»14) kyseliny.
Neomezujícími příklady nekardiovaskulárních zánětlivých chorob, které jsou mediovány VCAM-1 zahrnují revmatoidní artritis a osteoartritis, astma, dermatitis, a roztroušenou sklerosu.
Tato metoda representuje signifikantní výhodu v léčbě kardiovaskulárních chorob, ve které jde dále než nynější terapie, která pouze inhibuje progresi choroby, a je-li použita vhodně, tak poskytuje možnost proléčby aterosklerosy zabráněním vývoje nových lézí a způsobením regrese již vzniklých lézí.
V alternativním provedení je poskytnuta metoda pro supresi exprese genů senzitivních na redukci nebo aktivaci genů, které suprivují redox senzitivní dráhu, která zahrnuje podání efektivního množství substance, která zabraňuje oxidaci oxidačního signálu, typicky oxidaci polynenasycených mastných kyselin.
Representativní geny senzitivní na redukci, které jsou zahrnuty do imunitní odpovědi, jsou (bez omezení) ty, které exprivují cytokiny působící v iniciaci imunitní odpovědi (t.j. IL-Ιβ), chemoatraktanty, které způsobují migraci zánětlivých buněk na místo poškození (t.j.MCP-1), růstové faktory (t.j. IL-6 a trombinový receptor), a adhezní molekuly (t.j. VCAM-1 a E-selektin).
Vyšetření chorob mediovaných VCAM-1 nebo geny sensitivními na redukci jsou také poskytnuta a zahrnují kvantifikaci přítomných markérů choroby. V jednom provedení je hodnocena hladina oxidovaných polynenasycených mastných kyselin, nebo jiných vhodných markérů, například ve tkáních nebo krvi hostitele jako prostředek k odhadu oxidativního prostředí hostitele a hostitelovi vnímavosti k VCAM-1 a geny senzitivními na redukci zprostředkovaným chorobám.
V jiném provedení je kvantifikována hladina cirkulujících
VCAM-1 a VCAM-1 na povrchu buněk , nebo jiného vhodného markéru a efekt podání vhodného antioxidantu na tuto hladinu.
V ještě další zkoušce je hodnocena senzitivita vaskulárních endotelových buněk hostitele k polynenasyceným mastným kyselinám nebo jejich oxidovaným protějškům. Toto může být provedeno například vystavením hostitele PUFA nebo ox-PUFA a srovnáním výsledných koncentrací na povrchu buněk nebo cirkulujícího VCAM-1 nebo jiného přítomného markéru k populační normě.
V dalším provedení, in vivo modely aterosklerosy nebo jiných srdečních nebo zánětlivých chorob, které jsou mediovány VCAM-1, mohou být poskytnuty podáním nadměrného množství PUFA nebo oxidovaných polynenasycených mastných kyselin hostitelským zvířatům k vyvolání choroby. Tato zvířata mohou být užita v klinických výzkumech k dalšímu pochopení těchto chorob. V ještě dalším provedení vynálezu mohou být sloučeniny zkoušeny na schopnost léčby chorob zprostředkovaných VCAM-1 na základě jejich schopnosti inhibovat oxidaci polynenasycených mastných kyselin nebo interakce PUFA nebo ox-PUFA s proteinovým cílem.
Toto může být provedeno vystavením hostitele, například člověka nebo zvířete jako je myš, vysokým hladinám PUFA nebo ox-PUFA a pak určením terapeutické účinnosti testované sloučeniny založené na její schopnosti snižovat koncentrace cirkulujícího nebo povrchového VCAM-1. Alternativně, může být použit in vitro průzkum na základě schopnosti testované sloučeniny zabránit oxidaci PUFA nebo ox-PUFA, nebo interakci PUFA nebo ox-PUFA s proteinovým cílem za přítomnosti oxidující substance jako je kov, například měd, nebo enzymů jako je peroxidasa, 1ipooxygenasa, cyklooxygenasa, nebo cytochrom
P450.
V jiném provedení jsou vaskulárni endotelové buňky vystaveny TNF-alfa nebo jinému VCAM-1 indukujícímu materiálu po vhodnou dobu a pak odebrány vhodnými prostředky, například sonikací nebo zmrazením-roztátlm. Je izolován cytosolový a membránový kompartment.Radioznačená PUFA je přidána k definovanému množství kompartmentů. Schopnost roztoku konvertovat PUFA na ox-PUFA v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny je zkoumána. Intaktní buňky mohou být použity na místě rozrušeného buněčného systému.
Pyrrolidin dithiokarbamát (PDTC), orálně podaný v dávce 25-50 mg/kg/den dramaticky inhibuje formování aterogeních mastných pruhů, arteriální monocyt-makrofágový zánět, endoteliální VCAM-1 expresi a esenciálně normalizuje na endotelu dependentní relaxační funkci u dietou indukované hypercholesterolemie u králíků se sérovou hladinou cholesterolu nad 1000 mg/dl. Ve stejných dávkách nemají jiná terapeutická agens jako jsou antioxidanty probucol a vitamin E žádný efekt na tvorbu lézí v tomto modelu.
Na endotelu dependentní arteriální relaxace je nastolena u experimentální aterosklerozy podáním PDTC. U dietou indukované hypercholesterolemie u králičího modelu orálně podaný PDTC (25-50 mg/kg/den) restauruje na endotelu dependentní vasoreaktivitu. Toto bylo stanoveno studiemi kontraktivity kroužků excidovaných aort od kontrolních a testovaných zvířat. U pacientů s aterosklerosou se toto manifestuje samo jako normalizace periferní vaskulárni reaktivity v odpovědi na hyperemii měřenou neinvazivní Dopplerovou průtokovou studií. Toto je standartizovaný, obecně vhodný a snadno proveditelný test, který může být užit k titraci funkční hladiny léku při orálním podání. PDTC působí v antiischemické terapii rapidní normalizaci patologicky ztracené na endotelu závislé arteriální vasodilatace charakteristické pro kardiovaskulární choroby a aterosklerozu. Zlepšení vaskulárního průtoku krve je manifestováno jako zlepšení symtomů a ischemií omezených výkonostních funkcí a poskytuje neinvazivní hodnocení vaskulární protekce. Jiné klinické indikace abnormalit v endotel-odvozené vasorelaxaci zahrnují impotenci.
Molekulární genetický faktor, který kontroluje VCAM-1 genovou transkripci, je nový komplex transkripčních faktorů sestávající se z p65 a p50 podjednotek NF-kB/Rel rodiny párované k c-fos a c-jun podjednotkám AP-1 rodiny. Podle strukturálních a funkčních studií bylo stanoveno, že tyto AP-1 faktory hrají důležitou roli v regulaci VCAM-1 promotorů, které jsou pravděpodobně centrální v terapeutické regulaci VCAM-1 genové exprese. Toto je první demonstrace funkční role tohoto křížem-párováného transkripčního komplexu v regulaci endogeních genů.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 je graf exprese VCAM-1 na povrchu buněk (O.D. 450 nm) jako funkce času v lidských aortálních endoteliálních buňkách při expozici cytokinu TNF-alfa (plné kroužky), kyselině linoleové (plné trojúhelníky), a linoleovému hydroperoxidu (13-HPODE, plné čtverečky), a v nepřítomnosti těchto substanci (kontrola, prázdné čtverečky).
Obrázek 2 je graf exprese VCAM-1 na povrchu buněk (O.D. 450 nm) exprese VCAM-1 na povrchu buněk (O.D. 450 nm) v lidských aortálních endoteliálních buňkách při exposici linoleové kyselině (plný trojúhelník) a linoleovému hydroperoxidu (13-HPODE, plný čtvereček) jako funkce koncentrace mastných kyselin (μΜ).
Obrázek 3 je graf exprese (O.D. 450 nm) VCAM-1,ICAM-1, a E selektinu na povrchu buněk lidských aortálních endoteliálních buněk při expozici cytokinu TNF-alfa, kyselině stearové, kyselině linolenové, a kyselině arachidonové.
Obrázek 4 je graf exprese (O.D. 450 nm) VCAM-1 na povrchu lidských aortálních endoteliálních buněk při exposici kyselině linolenové, 13-HPODE, kyselině arachidonové, a hydroperoxidu kyseliny arachidonové (15-HPETE), s (plná čára) nebo bez (přerušovaná čára) antioxidantem pyrrolidin dithiokarbamátem.
Obrázek 5 je ilustrací autoradiogramu indikujícího akutní indukci VCAM-1 mRNA linoleovou kyselinou a 13-HPODE. HAEC byly nebo nebyly vystaveny kyselině linoleové (7.5 μΜ), 13-HPODE (7.5 μΜ), nebo TNF alfa (100 U/ml). Celková RNA byla izolována a 20 μg bylo frakciováno podle velikosti denaturační 1% agarosa-formaldehyd gelovou elektroforesou, transferováno do nitrocelulosy, a hybridizováno do 32P-značené lidské bud A) VCAM-1 specifické nebo B) β-aktin specifické cDNA. Po promytí byly filtry exponovány na rentgenovém filmu při -70 °C s jedním intenzifikovaným promítnutím po 24 hodin. Identifikace linií: 1) kontrola, 2) kyselina linoleová (akutní, 8 hodinová expozice), 3) kyselina linoleová (48 hodinová expozice), 4) 13-HPODE (akutní, 8 hodinová expozice), 5) TNF-alfa (100 U/ml, 4 hodinová expozice).
Obrázek 6 je ilustraci autoradiogramu, který indikuje, že indukce VCAM-1 mRNA polynenasycenými mastnými kyselinami je nezávislá na buněčné proteinové syntéze. HAEC byly vystaveny bud linoleové (7.5 uM) nebo arachidonové (7.5 μΜ) kyselině za přítomnosti nebo nepřítomnosti cykloheimidu (10 pg/ml) po 4 hodinovou periodu, a pak ošetřeny jak popisuje obrázek 5.
Obrázek 7 je ilustrací autoradiogramu, který indikuje,že linoleová kyselina indukuje transkripční aktivaci VCAM-1 promotoru prostřednictvím na redukci senzitivního NF-kB podobného faktoru. HAEC byly rozděleny v takovém poměru, aby dal přibližně 60% konfluenci ve 100-mm plotnách tkáňových kultur. HEAC byly transfektovány s 30 ug bud p288 VCAMCAT, nebo p85 VCAMCAT, nebo PSV2CAT plasmidem koprecipitační technikou fosforečnanem vápenatým za použití standardní techniky.
Po 24 hodinové zotavovací periodě byly, nebo nebyly HAEC ošetřeny 50 μΜ PDTC a po 30 minutách byly exponovány kyselině linoleové (7.5 μΜ) nebo TNF - alfa (100 U/ml) přímo přidaným do ploten. Po 18 hodinách byl buněčný extrakt připraven rychlým zmrazením-táním v 0.25 Tris, pH 8.0. Proteiny každého buněčného extraktu byly zkoušeny na chloramfenikol acetyl transferasovou (CAT) aktivitu, jak bylo dříve popsáno (Ausube1,1989) (Ac, acetylovaný, N, neacetylovaný chloramfenikol).
Obrázek 8 je ilustrací akrylamidových gelových řezů, které indikují, že polynenasycené mastné kyseliny aktivují vazebné aktivity NF-kB-podohné DNA, které jsou blokovány antioxidanty PDTC. Konfluentní HAEC v mediu obsahujícím 4 % FBS (jak popisuje obrázek 1) byl nebo nebyl ošetřen PDTC (50 μΜ) po třicet minut a pak vystaven na 3 hodiny kyselině linoleové (7.5 μΜ), kyselině oleové (7.5 μΜ) nebo TNF-alfa (100 U/ml), respektive. 5 mikrogramů nukleárního extraktu bylo inkubováno s dvouřetězcovou 32P-značenou wtVCAM, frakcionováno podle cDNA (Panel C). HUVE buňky byly předošetřeny určenou koncentrací PDTC a pak vystaveny IL-lb za přítomnosti PDTC po 4 hodiny a zkoušeny na VCAM-1 mRNA akumulaci Northern filter hybridizační analýzou. Dráha 1 - kontrola, dráha 2 - IL-1 (10 μΜ/ml), dráha 3 - IL-lb + PDTC (0.05 μΜ), dráha 4 - IL-lb LB + PDTC (0.5 μΜ), dráha 5 - IL-lb + PDTC (5.0 uM), dráha 6 - IL-lb + PDTC (50 μΜ), dráha 7 - IL-lb + PDTC (100 μΜ).
Obrázek 12 ilustruje autoradiogram mRNA, získaný jak je popsáno dále, hybridizované na 32P-značenou bud VCAM-1 specifickou cDNA (Panel A),nebo na E-selektin (ELAM-1)spécifickou cDNA (Panel B),nebo na ICAM-1 specifickou cDNA (Panel C). HUVE buňky byly předošetřeny jak popisuje obrázek 9 50uM PDTC, vystaveny agens popsanými níže a zkoušeny na VCAM-1 (Panel A), a ICAM-1 (Panel B) mRNA akumulaci. Dráha 1 - TNFa (100 U/ml), dráha 2 - TNFA + PDTC, dráha 3 - 1ipopolysacharid (LPS) (100 ng/ml), dráha 4 - LPS + PDTC, dráha 5 - póly (I:C) (100 mg/ml), dráha 6 - póly (I;C) + PDTC.
Obrázek 13 je grafem relativní povrchové exprese VCAM-1 a ICAM-1 za přítomnosti (tmavé proužky), nebo nepřítomnosti (světlé proužky) PDTC a v přítomnosti mnohých typů indukujících stimulů. Rozpuštěné HUVEC byly, nebo nebyly (pouze CTL) předošetřeny po 30 minut 50 μΜ PDTC a pak vystaveny po určitou dobu určitému agens za přítomnosti nebo nepřítomnosti (CTL pouze) PDTC. Exprese na buněčném povrchu byla determinována primární vazbou VCAM-1 specifických (4B9) a ICAM-1 specifických (84H10) myších monoklonálních protilátek následovanou sekundární vazbou kozí anti-myší (IgG) protilátkou s připojenou křenovou peroxidasou. Kvantifikace byla provedena určením kalorimetrické konverze při 450 nm TBM.
Obrázek 13 indikuje, že mnohotné regulační signály indukují VCAM-1, ale ne ICAM-1 přes společnou dithiokarbamát - senzitivní dráhu v lidských vaskulárních endoteliálních buňkách.
Obrázek 14 je grafem relativní VCAM-1 povrchové exprese (O.D.S9S nM) v lidských buňkách z umbilikální vény, aktivované TNFa, versus koncentrace různých antioxidantů.
(PDTC je N-pyrrolidin-dithiokarbamát sodný; DETC je N,N-diethyl-N-karhothiolát sodný, také nazývaný jako diethyldithiokarbamát sodný; NAC je N-acetylcystein; a DF je desf erroximin).
Obrázek 15 je grafem relativní povrchové VCAM-1 exprese (O.D. 595 nM) v lidských endoteliálních buňkách umbilikální žíly, aktivované TNF-alfa, v přítomnosti specifického množství antioxidantů. (PDTC je N-pyrrolidindithiokarbamát sodný; DIDTC je N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný; SarDTC je
N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát sodný;. IDACTC je N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát trojsodný; MGDTC je N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát sodný; MeOBGDTC je N-(4-methoxybenzyl)-D-glukamin-N-karbodithioát sodný; DETC je N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný; Di-PDTC je
N,N-diisopropyl-N-karbodithioát sodný; NAC je
N-acetylcystein).
Obrázek 16 je procentuálním grafem Molt-4 buněk navázaných na HUVE buňky stimulované nebo néstimulované TNF alfa (100 U/ml) po šest hodin za přítomnosti nebo nepřítomnosti PDTC.
Obrázek 17 ilustruje chemickou strukturu následujících aktivních dithiokarhamátů: pyrrolidin-N-karhodithioát sodný, N-methy1-N-karboxymethy1-N-karbodi thioát sodný,
N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát troj sodný,
N-methy1-D-g1ukamin-N-karbodithioát sodný,
N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný (diethyldithiokarbamát sodný) a N,N-diisopropy1-N-karbodithioát sodný.
Obrázek 18 je sloupcový graf efektu PDTC na formování fluorescentních aduktů BSA a 13-HPODE, jak je měřeno ve fluorescentnich jednotkách versus mikromolární koncentrace PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE byl inkubován s 200 mikrogramy BSA za přítomnosti PDTC po šest dní. Fluorescence byla měřena při 430-460 nm s excitací při 330-360nm.
Obrázek 19 je grafem vlivu PDTC na formování fluorescentních aduktů BSA a ox-PUFA jako funkce vlnové délky (nm) a koncentrace PDTC. Se zvyšováním koncentrace PDTC se kvantita fluorescentních aduktů snižuje.
Obrázek 20 je grafem vlivu PDTC na oxidaci LDL křenovou peroxidasou (HRP), jak je měřeno zvýšením O.D. (234 nm ) versus čas (minuty) pro různé koncentrace PDTC. Je pozorováno, že po inkubační periodě PDTC inhibuje oxidaci LDL HRP způsobem, který je závislý na koncentraci.
Obrázek 21 je diagramem vlivu PDTC na cytokiny indukované formování ox-PUFA v lidských aortálních endoteliálních buňkách. Jak je naznačeno, jak TNF a, tak IL-Ιβ způsobují oxidaci linoleové kyseliny na ox-1inoleovou kyselinu. Oxidaci je signifikantně zabráněno PDTC.
Podrobný popis vynálezu
I. Definice
Tak, jak je zde použit, označuje výraz polynenasycené mastné kyseliny (zde také uváděné jako PUFA), mastné kyseliny (typicky od Ce do C24) , které mají alespoň dvě alkenyl vazby, a zahrnují, ale nejsou tímto omezeny, linoleovou (Cie*9·12), linolenovou (Cis*6*9·12), arachidonovou (C2005·8·11·14) a eicosatrienovou (C20*8·11·14) kyselinu.
Výraz oxidované polynenasycené mastná kyselina označuje nenasycenou mastnou kyselinu, ve které alespoň jedna z alkenylových vazeb byla konvertována na hydroperoxid. nelimitujícími příklady jsou:
13-HPODE
15-HPETE
Výraz alkyl jak je zde použit, zahrnuje, pokud není uvedeno jinak, nasycený přímý, rozvětvený nebo cyklický (v případě C5 nebo většího) uhlovodík o Ci až C10 (nebo nižší alkyl , tj. Ci až C5) , ,^ίΙ,νΚ Hb/ , propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, terč.butyl, pentyl, cyklopentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyk, cyklohexyl, cyklohexylmethyl, 3-methylpenty1,
2,2-dimethylbutyl a 2,3-dimethylbutyl. Alkylová skupina může být popřípadě substituována na kterémkoliv z uhlíku jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny, zahrnující hydroxy1, amino nebo mono- nebo disubstituovaný amino, kde substituentová skupina je nezávisle alkyl, aryl, alkaryl nebo aralkyl; aryl, alkoxy, aryloxy, nitro, kyano, sulfonová kyselina, sulfát, fosfonová kyselina, fosfát nebo fosfonát, bud nechráněný nebo chráněný podle potřeby, jak je známo odborníkům v oboru, jak uvádí Greene a spol., Protectife Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, druhé vydání, 1991.
Výraz alkenyl, jak je zde uveden a pokud není uvedeno jinak, označuje přímý, rozvětvený nebo cyklický uhlovodík o C2 až Cio s alespoň jednou dvojnou vazbou.
Výraz alkinyl, jak je zde uveden a pokud není uvedeno jinak, označuje přímý, rozvětvený nebo cyklický uhlovodík o C2 až Cto s alespoň jednou trojnou vazbou.
Výraz aralkyl označuje arylovou skupinu s alespoň jedním alkylsubsti tuentem.
Výraz alkaryl označuje alkylovou skupinu, která má alespoň jeden arylový substituent.
Výraz halogen(alky1, alkenyl nebo alkinyl) označuje alkylovou, alkenylovou nebo alkinylovou skupinu, ve které alespoň jeden z vodíků ve skupině byl nahrazen atomem halogenu.
Výraz aryl jak je zde použit a pokud není uvedeno jinak, označuje fenyl, bifenyl nebo naftyl a výhodně fenyl. Arylová skupina může být popřípadě substituována jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny, zahrnující alkyl, hydroxyl, amino, alkylamino, arylamino, alkoxy, aryloxy, nitro, kyano, kyselinu sulfonovou, sulfát, kyselinu fosfonovou, fosfát nebo fosfonát, CO2H nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl,
CO2(alkyl, aryl, alkaryl nebo aralkyl), nebo glukamin, bud nechráněný nebo chráněný podle potřeby jak je to známo odborníkům v oboru, například jak uvádí Greene a spol., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, druhé vydání, 1991.
Výraz alkoxy jak je zde použit a pokud není uvedeno jinak, označuje skupinu vzorce -O-alkyl.
Výraz acyl jak je zde použit, označuje skupinu vzorce C(O)R', kde R' je alkyl, aryl, alkaryl nebo aralkylskupina.
Výraz heteroaryl nebo heteroaromatický, jak je zde použit, zahrnuje aromatickou skupinu, terá obsahuje alespoň jednu síru, kyslík nebo dusík v aromatickém kruhu. Neomezující příklady jsou fenazin, fenothiazin, furyl, pyridyl, pyrimidyl, pyrimidyl, thienyl, isothiazolyl, imidazolyl, tetrazolyl, pyrazinyl, benzofuranyl, benzothiofenyl, chinolyl, isochinolyl, benzothienyl, isobenzofuryl, pyrazolyl, indolyl, isoindolyl, benzimidazolyl, purinyl, morfolinyl, karbozolyl, oxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, isooxazolyl, pyrrolyl, pyrazolyl, chinazoliny1, pyridaznyl, pyrazinyl, cinnolinyl, ftalazinyl, chinoxalinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, pteridinyl, 5-azacytidinyl, 5-azauracily1, triazolopyridiny1, imidazopyridiny1, pyrrolopyrimidiny1, pyrazolopyrimidinyl, adenin, N6-alkylpuriny, N6benzylpurin, N6-halogenpurin, N6-vinylpurin, N6-acetylenický purin,
N6-acylpurin, N6-hydroxyalkylpurin, N6-thioalkylpurin, thymin, cytosin, 6-azapyrimidin, 2-merkaptopyrimidin, uráčil, N6-alkylpyrimidiny, N6-benzylpyrimidiny, N6-halogenpyrimidiny, N6-vinylpyrimidin, N6-acetylenický pyrimidin,
N6-acylpyrimidin, N6-hydroxyalkylpurin a N6-thioalkylpurin a isoxazolyl. Heteroaromatická skupina může být popřípadě substituovaná jak je popsáno výše pro aryl. Heteroaromatická skupina může být částčně nebo úplně hydrogenována podle potřeby. Jako neomezující příklad je možno použit dihydropyridin místo pyridinu. Funkční kyslíkové a dusíkové skupiny na heterocyklické bázi mohou být chráněny podle potřeby nebo požadavků během reakčního sledu. Vhodné chránící skupiny jsou dobře známé odborníkům v oboru a zahrnují trimethylsilyl, dimethylhexylsilyl, terc.butyldimethylsilyl a terč.butyldifeny1sily1, tritylmethyl, alkylskupiny, acylskupiny jako je acetyl a propionyl, methylsulfonyl a p-toluylsulfonyl.
Výraz hydroxyalkyl jak je zde použit označuje Cl až C6 alkylskupinu, ve které je alespoň jeden z vodíků připojených ke kterémukoliv z atomů uhlíku nahrazen hydroxyskupinou.
Výraz thiolový antioxidant označuje sloučeninu, obsahující síru, která zpomaluje oxidaci.
Výraz farmaceuticky přijatelný derivát označuje derivát aktivní sloučeniny, který po podání příjemci, je schopný poskytnout přímo nebo nepřímo, původní sloučeninu nebo sám vykazuje její aktivitu.
Výraz farmaceuticky přijatelný kationt označuje organickou nebo anorganickou skupinu, která nese pozitivní náboj a která může být podána ve spojení s farmaceutickým činidlem, například jako protikationt v soli. Farmaceuticky přijatelné kationty jsou známy odborníkům v oboru a zahrnují, ale nejsou tak omezeny, sodík, draslík, a kvarterní aminy.
Výraz fyziologicky odštěpitelná skupina označuje skupinu, která může být odštěpena in vivo z molekuly, ke které je připojena a zahrnuje, ale není tak omezen, organický nebo anorganický aniont, farmaceuticky přijatelný kationt, acyl (zahrnující ale bez omezení (alkyl)C(O), zahrnující acetyl, propionyl a butyryl), alkyl, fosfát, sulfát a sulfonát.
Výraz enantiomerně obohacená kompozice nebo sloučenina označuje kompozici nebo sloučeninu, která obsahuje alespoň 95 % a výhodně alespoň 97, 98, 99 nebo 100 % hmotn. jediného enantiomerů sloučeniny.
Výraz aminokyselina zahrnuje syntetické a přirozeně se vyskytující aminokyseliny, zahrnující, ale neomezující se tak, alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, prolinyl, fenylalaninyl, tryptofanyl, methioninyl, glycinyl, serinyl, threoninyl, cysteinyl, tyrosinyl, asparaginyl, glutaminyl, aspartoyl, glutaoyl, lysinyl, argininyl a histidinyl.
Výraz spojovací skupina jak je zde použit, je jakákoliv dvojvazná skupina, která spojuje dva chemické zbytky, zahrnují, ale bez omezení, alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, polyalkylenoxy (například -[(CH2)ηθ-]η-),
-Ci-ealkoxy-Ci-ioalkyl-, -Ci-6alkylthio-Ci-1oalkyl-, -NR3- a -(CHOH)nCH2OH, kde n je nezávisle 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6.
II. Identifikace oxidovaných a neoxidovaných polynenasycených mastných kyselin jako přímých mediátorů VCAM-1 exprese.
Ke stanovení, jestli PUFA nebo oxidované PUFA hrají roli jako přímé imunomodulátory genové exprese endotheliálních buněk byly raně pasážované lidské aortální endotheliálni buňky (HAEC) kultivovány po osm hodin v mediu a seru a vystaveny nasyceným (stearové), mononenasyceným (oleové), a polynenasyceným (linoleová a arachidonová) kyselinám; stejně jako hydroperoxidům mastných kyselin linoleové (13-HPODE) nebo arachidonové (15-HPETE). HAEC byly také alternativně exponovány cytokinovému tumor nekrotizujíčímu faktoru-a.
HAEC byly vystaveny linoleové kyselině nebo 13-HPODE po různou dobu více až do 48 hodin a pak zkoušeny na buněčnou povrchovou expresi VCAM-1 ELISA zkouškou. Výsledky byly srovnány s HAEC vystavenými cytokinu TNF-alfa (100 U/ml) po stejné časové periody. VCAM-1 exprese v HAEC inkubovanými s bud linoleovou kyselinou nebo 13-HPODE je přechodně indukovaná. Exprese narůstá přibližně při 8 až 9 hodinách se signifikantní expresí při 24 hodinách a snižuje se při 48 hodinách. Kinetiky VCAM-1 indukce jak kyselinou linoleovou, tak 13-HPODE odráží kinetiku TNF-alfa, a tak se mechanismus, kterým polynenasycené mastné kyseliny indukují VCAM-1 jeví být stejným jako u TNF-alfa.
Studie odpovědi závislosti dávky linoleové kyseliny a 13-HPODE na VCAM-1 genové expresi při 8 hodinách byly také provedeny. Bylo pozorováno, že 7.5 μΜ je nejnižší vrcholová dávka, při které linoleová kyselina a 13-HPODE indukují signifikantní VCAM-1 genovou expresi.
Pak bylo zkoumáno, zda krátkodobá inkubace endoteliálních buněk s polynenasycenými mastnými kyselinami indukuje také ICAM-1 a E-selektin expresi. Bylo zjištěno, že polynenasycené mastné kyseliny linoleová a arachidonová indukují povrchovou genovou expresi přibližně 59% k TNF indukované genové expresi VCAM-1 . Ρι.ι/oruhodné je, že ani ICAM-1 ani E-selektin nebyly indukovány těmito mastnými kyselinami. Naopak, nasycená mastná kyselina - kyselina stearová a mononenasycená mastná kyselina - kyselina oleová neindukovaly expresi VCAM-1, ICAM-1 nebo E-selektinu. VCAM-1 genová exprese byla také pozorována při inkubaci HAEC s oxidovanými metabolity kyseliny linoleové (13-HPODE a kyseliny arachidonové (15-HPETE).
Ke zjištění, zda oxidační stres v endotheliálních buňkách způsobený polynenasycenými mastnými kyselinami a jejich oxidovanými metabolity indukuje VCAM-1 mechanismem senzitivním na redukci byly HAEC předem vystaveny antioxidantu pyrrolidindithiokarbamátu (PDTC.50 μΜ) po 30 minut a pak byly buňky nezávisle inkubovány s kyselinou linoleovou,kyselinou arachidonovou, 13-HPODE a 15-HPETE (vše 15 μΜ) po 8 hodin.Bylo zjištěno, že PDTC suprivuje genovou expresi VCAM-1 indukovanou polynenasycenými mastnými kyselinami a jejich oxidovanými protějšky. Toto ukazuje na to, že indukce je zprostředkována oxidovanou signální molekulou a že indukci je zabráněno, je-li oxidace molekuly blokována (t.j. k oxidaci nedojde), revertována (t.j. signální molekula je redukována), nebo je zabráněno její interakci s cílovým proteinem, snad díky redox komplexu.
K určení toho, zda selektivní indukce VCAM-1 PUFA a jejich oxidovanými metabolity je pozorovatelná na mRNA úrovni byly HAEC inkubovány s kyselinou linoleovou,nebo 13-HPODE. Kyselina linoleová a 13-HPODE indukovaly VCAM-1 mRNA akumulaci, která byla podobná hladině indukované TNF-alfa. Naproti tomu zde nebyla žádná indukce ICAM-1 nebo E-selektin genové exprese při hladině mRNA v HAEC inkubovanou s kyselinou linoleovou nebo 13-HPODE. Tato zjištění jsou podobná těm, která byla nalezena na úrovni buněčného povrchu.
Tyto výsledky naznačují, že pretranslační regulační mechanismus zprostředkuje indukci VCAM-1 genové exprese polynenasycenými mastnými kyselinami a jejich oxidovanými metaboli ty.
Bylo také žádoucí určit, zda polynenasycené mastné kyseliny účinkují jako primární signál nebo operují přes regulační protein, který užívá cytokin IL-4 v indukci VCAM-1 genové exprese. K výzkumu, zda nově syntetizované proteiny jako je IL-4 jsou užity v syntese genové exprese VCAM-1 indukované PUFA jako je kyselina linoleová, byly HAEC inkubovány s 13-HPODE (7.5 μΜ) a vystaveny inhibitoru proteinové syntézy, cykloheximidu. Nebyla zde žádná inhibice mRNA akumulace VCAM-1 cykloheximidem v HAEC inkubovaných s 13-HPODE. Produkce IL-4 HAEC inkubovaných s kyselinou linoleovou nebo kyselinou arachidonovou a jejich oxidovanými metabolity, stanovená pomocí ELISA, byla také měřena.Nebylo zde žádné zvýšení v IL-4 produkci HAEC inkubovanými s těmito PUFA nebo jejich oxidovanými metabolity.
Předešlé výzkumy demonstrovaly díky studiím delecí a heterologních promotorů, že cytokiny a non-cytokiny aktivovaná VCAM-1 genová exprese v endotheliálních buňkách je alespoň částečně transkribována díky dvěma NF-kB -podobným DNA vazebným elementům. Bylo také demonstrováno, že PDTC inhibuje VCAM-1 genovou expresi přes redox-senzitivní NF-kB podobný faktor. K určení, zda polynenasycené mastné kyseliny indukují transkripční aktivaci lidského VCAM-1 promotoru cestou stejného mechanismu, byl chimérický reportér gen p288
VCAM-CAT, obsahující koordináty -288 až +22 lidského VCAM-1 promotoru, přechodně transfektován do HAEC. Přidání kyseliny linoleové (7.5 μΜ) indukovalo VCAM-1 promotor. Přidání kyseliny linoleové (7.5 μΜ) indukovalo VCAM-1 promotorovou aktivitu, která byla více než dvojnásobná než kontrolní a asi 60% k maximálnímu signálu produkovanému TNF-alfa. Podobné výsledky byly získány s minimálním- cytokiny indukovatelným promotorem VCAM-1 genu (p85 VCAM-CAT), obsahujícím -77 a -63bp NF-kB-podobných míst. Ani kyselina linoleová, ani TNF-alfa neměly žádný vliv na aktivitu za užití konstitutivně exprivovaného PSV2CAT konstruktu. PDTC inhiboval transkripční aktivaci obou VCAM-1 promotorových konstruktů indukovaných kyselinou linoleovou. Data ukazují, že analogicky k TNF-alfa polynenasycené mastné kyseliny jako je kyselina linoleová indukují transkripční aktivaci VCAM-1 přes NF-kB-podobný redox-senzitivní mechanismus.
K určení, zda polynenasycené mastné kyseliny a jejich oxidované metabolity regulují aktivitu VCAM-1 promotoru přes NF-kB-podobný transkripční regulační faktor, byly nukleární extrakty z HAEC zkoušeny na DNA vazebnou aktivitu k dvouřetězcovému oligonukleotidu obsahujícímu VCAM-1
NF-kb-podobné promotorové elementy umístěné v polohách -77 a -63. Jak je ukázáno na obrázku 7, dva proužky A a C, reprezentující NF-kB-podobnou aktivitu, byly indukovány v odpovědi na tříhodinovou expozici kyselině linoleové (7.5 μΜ). Podobná zjištění byla pozorována při exposici cytokinů TNF-alfa (100 ϋ/ml). Široký proužek B byl pozorován pro kontrolu (neošetřené buňky). Žádná indukce NF-kB-podobné vazby nebyla zjištěna pro mononenasycenou mastnou kyselinu, kyselinu oleovou. Před ošetření buněk s PDTC po třicet minut inhibovalo komplexní A a C DNA vazebnou aktivitu po aktivaci kyselinou linoleovou. Tato zjištění jsou v souladu se dříve popsanými nálezy, že PDTC blokuje aktivaci VCAM-1 genové exprese v HUVEC inhibicí aktivace těchto Nf-kB-podohných DNA vazebných proteinů.
Příklad 1
Vliv oxidovaných a neoxidovaných polynenasycených mastných kyselin na kinetiku aktivace VCAM-1 genové exprese
Lidské aortální endoteliální buňky (HAEC) byly umístěny v 96 jamkových plotnách a inkubovány s kyselinou linoleovou (7.5 μΜ, 13-HPODE (7,5 μΜ), nebo TNF-alfa (100 U/ml) po pět různých časových období až do 48 hodin. HAEC, získané od Clonetics (Boston, MA), byly kultivovány v Medium 199 suplementovaném fetálním hovězím sérem (FBS), 16 U/ml heparinu, 10 U/ml epidermálního růstového faktoru, 50 pg/ml růstového suplementu epidermálních buněk, 2mM L-glutaminu,
100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Jeden den před experimentem byly buňky umístěny do media, obsahujícího 4 %
FBS. Konfluentní HAEC byly inkubovány až do 48 hodin s TNF-alfa (100 U/ml) nebo stearovou, oleovou, linoleovou, linolenovou nebo arachidonovou kyselinou (7.5 μΜ). Podobné studie byly provedeny s odlišnými dávkami kyseliny linoleové nebo 13-HPODE po 8-hodinovou periodu (1-60 μΜ) (obrázek 2). Kvantifikace byla provedena stanovením kalorimetrické konverze při 450 nm TMB. Studie byly provedeny trojnásobně (n=4 pro každou experimentální hodnotu).
* - hodnoty se odlišovaly (p<0.05) od kontroly.
Jak ukazuje obrázek 1, jak linoleová kyselina tak 13-HPODE indukovaly expresi VCAM-1. Deset hodin po expozici bylo množství VCAM-1 na buněčném povrchu indukované kyselinou linoleovou a 13-HPODE vyšší než poloviční vzhledem k množství indukovanému TNF-alfa.
Jak je ukázáno na obrázku 2, je indukce VCAM-1 kyselinou linoleovou a 13-HPODE senzitivní na koncentraci. Při koncentraci těchto sloučenin mezi 2 a 10 μΜ je zde ostré zvýšení množství indukovaného VCAM-1 na povrchu buněk, které přetrvává přibližně konstantně do koncentrace alespoň 100 μΜ. Mělo by být pozorováno, že PUFA koncentrace naznačená na obrázku 2 je ve spojení s koncentrací nacházenou endogenně v HAEC.
Příklad 2
Polynenasycené mastné kyseliny indukují genovou expresi VCAM-1, ale ne ICAM-1 a E-selektinu
Exprese VCAM-1, ICAM-1 a E-selektinu na povrchu buněk v HAEC byla měřena pomocí ELISA. HAEC, získané od Clonetics (California), byly kultivovány v Medium 199 suplementovaném 20% fetálním hovězím sérem (FBS), 16 U/ml heparinu, 10 U/ml epidermálního růstového faktoru, 50 pg/ml růstového suplementů epidermálních buněk, 2mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Jeden den před experimentem byly buňky umístěny do media obsahujícího 4 % FBS. Konfluentní HAEC byly nebo nebyly inkubovány po 8 hodin s TNF-alfa (100 U/ml) nebo stearovou, oleovou, linoleovou, linolenovou nebo arachidonovou kyselinou (7.5 μΜ). Povrchová exprese A) VCAM-1 , B) ICAM-1 a C) E-selektinu byla určena primární vazbou VCAM-1 specifických, ICAM-1 specifických, a E-selektin specifických myších protilátek následovanou sekundárním navázáním kozích anti myších (IgG) protilátek s navázanou křenovou peroxidasou. Kvantifikace byla provedena stanovením kalorimetrické konverze při 450 nm TMB. Studie byly provedeny i
trojnásobně (n=4 pro každou experimentální hodnotu). *
- hodnoty se odlišovaly (p<0.05) od kontroly.
Jak je ukázáno na obrázku 3, kyselina linoleová, kyselina linolenová, a kyselina arachidonová signifikantně indukují expresi VCAM-1, ale neindukují buněčnou povrchovou expresi ICAM-1 a E-selektinu. Ani kyselina stearová, ani kyselina oleová neindukovaly expresi VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektinu. TNF-alfa silně indukoval expresi všech tří molekul buněčného povrchu.
Příklad 3
Antioxidant PDTC suprivuje VCAM-1 indukci polynenasycenými mastnými kyselinami a jejich oxidovanými metabolity
Konfluentní HAEC byly předošetřeny za přítomnosti nebo nepřítomnosti PDTC (pyrrolidindithiokarbamátu sodného, μΜ) po třicet minut. Buňky byly pak inkubovány po osm hodin s TNF-alfa (100 U/ml), linoleovou nebo arachidonovou kyselinou (7.5 μΜ), nebo hydroperoxidy mastných kyselin 13-HPODE (7.5 μΜ) nebo 15-HPETE (7.5 μΜ). Exprese VCAM-1 na povrchu buněk v HAEC byla měřena ELISA, jak popisuje Příklad 1. Studie byly provedeny trojnásobně (n=4 pro každou experimentální hodnotu).
* - hodnoty se odlišovaly (p<0.05) od kontroly.
Jak ukazuje obrázek 4, PDTC suprivuje indukci VCAM-1 kyselinou linoleovou, 13-HPODE, kyselinou arachidonovou, a 15-HPETE.
Přiklad 4
Akutní indukce VCAM-1 mRNA kyselinou linoleovou a 13-HPODE
HAEC byly vystaveny kyselině linoleové (7.5 uM) nebo
13-HPODE (7.5 μΜ). Celková RNA byla izolována a 20 pg bylo frakcionováno podle velikosti denaturační 1% agarosa-formaldehyd gelovou elektroforesou, transferováno do nitrocelulosy a hybridizováno do 32P-značené bud A) VCAM-1 specifické, B) β-aktin specifické cDNA a vizualizováno autoradiografií. Po promytí byly filtry vystaveny rentgenovému filmu při -70 °C s jedním intenzifikovaným screenem po dobu 24 hodin. Identifikace drah: 1) kontrola, 2) kyselina linoleová (akutní, 8 hodinová expozice, 3) linoleová (48-hodinová expozice), 4) 13-HPODE (akutní, 8-hodinová expozice), 5) TNF-alfa (100 U/ml, 4-hodinová expozice).
Jak je ukázáno na obrázku 5, jak kyselina linoleová, tak 13-HPODE indukují produkci mRNA pro VCAM-1 v 8 hodinách. Po 48 hodinách kyselina linoleová dále neindukuje VCAM-1 mRNA.
Příklad 5
Indukce VCAM-1 mRNA PUFA je nezávislá na buněčné syntese proteinů.
HAEC byly exponovány bud linoleové, nebo arachidonové kyselině (7.5 μΜ) za přítomnosti nebo nepřítomnosti cykloheximidu (10 pg/ml) po dobu 4 hodin. Celková RNA byla izolována a 20 pg bylo frakcionováno podle velikosti denaturační 1% agarosa-formaldehyd gelovou elektroforesou, transferováno do nitrocelulosy a hybridizováno do A) 32P-značené lidské VCAM-1 nebo B) β-aktin specifické cDNA a pak vizualizováno autoradiografií. Po promytí byly filtry vystaveny rentgenovému filmu při -70 °C s jedním intenzifikovaným screenem po dobu 24 hodin.
Jak ukazuje obrázek 6, indukce VCAM-1 linoleovou a arachidonovou kyselinou je nezávislá na buněčné syntéze proteinů.
Příklad 6
Kyselina linoleová indukuje transkripční aktivaci VCAM-1 promotoru prostřednictvím NF-kB podobného faktoru sensitivního na redukci.
HAEC byly rozděleny v takovém poměru, aby dal přibližně 60% konfuenci ve 100-mm plotnách tkáňových kultur. HEAC byly transfektovány s 30 pg bud p288 VCAMCAT, nebo p85 VCAMCAT, nebo PSV2CAT plasmidem, koprecipitační technikou fosforečnanem vápenatým za užití standartní techniky. Po 24 hodinové zotavovací periodě byly, nebo nebyly, HAEC byly předem ošetřeny 50 μΜ PDTC a po 30 minutách byly exponovány kyselině linoleové (7.5 μΜ) nebo TNF-alfa (100 U/ml) přímo přidaným do ploten. Po 18 hodinách byl buněčný extrakt připraven rychlým zmrazením-táním v 0.25 Tris, pH 8.0. Proteiny každého buněčného extraktu byly zkoušeny na chloramfenikol acetyl transferasovou (CAT) aktivitu, (Ac, acetylovaný, N, neacetylovaný chloramfenikol).
Obrázek 7 ilustruje výsledky tohoto experimentu.
Kyselina linoleová indukuje transkripční aktivaci VCAM-1 promotoru prostřednictvím NF-kB podobného faktoru sensitivního na redukci. Tyto výsledky jsou podobné těm, které jsou pozorovány u aktivace VCAM-1 promotoru cytokiny jako je TNF-alfa. To naznačuje, že PUFA účinkují přes oxidovaný meziprodukt, který také zprostředkuje cytokinovou aktivaci VCAM-1.
Příklad 7
Polynenasycené mastné kyseliny aktivují NF-kB podobné DNA vazebné aktivity, které jsou blokovány antioxidantem PDTC.
Konfluentní HAEC v mediu, obsahujícím 4 % FBS (jak popisuje obrázek 1) byl ošetřen PDTC (50 μΜ) po třicet minut a pak vystaven na 3 hodiny kyselině linoleové (7.5 μΜ), kyselině oleové (7.5 μΜ) nebo TNF-alfa (100 U/ml). 5 mikrogramů nukleárního extraktu bylo inkubováno s dvouřetězcovou 32P-značenou wtVCAM, frakcionováno podle velikosti na 4% nativním akrylamidovém gelu a exponováno na autoradiografickém filmu při -70 °C po 18 hodin. Dva proužky A a C, representující NF-kB podobnou vazebnou aktivitu, jsou označeny.Široký proužek B byl pozorován v kontrolních (neošetřených) buňkách.
Obrázek 8 ilustruje, že kyselina linoleová indukuje NF-kP vazebnou aktivitu k VCAM-1 promotoru způsobem senzitivním na redukci. Toto je analické k cytokinů TNF-alfa a naznačuje to podobný mechanismus akce. TNF-alfa pravděpodobně indukuje VCAM-1 mechanismem, který je zprostředkovaný ox-PUFA.
Přiklad 8
Oxidace v buněk prostém, media prostém provedení jak neoxidovanou, tak oxidovanou (15-HPETE) arachidonovou kyselinou
Obrázky 9A a 9B jsou sloupcové grafy poměrů reaktivních substancí kyseliny thiabarbiturové (O.D.532 nm) kyseliny arachidonové a 15-HPETE za přítomnosti nebo nepřítomnosti PDTC. Zkouška reaktivity kyseliny thiobarbiturové (TBARS) měří oxidační schopnost materiálu v buněk prostém, media prostém prostředí. Jak ukazují obrázky, jak kyselina arachidonová, tak 15-HPETE vykazují signifikantní TBARS aktivitu, která je inhibována PDTC.
Příklad 9
Metody pro léčbu VCAM-1 zprostředkovaných chorob
Objev, že polynenasycené mastné kyseliny a jejich oxidované metabolity jsou selektivními, na redukci senzitivními modulátory poskytuje základ pro terapii chorob, které jsou zprostředkovány VCAM-1 nebo geny senzitivními na redukci. Je poskytnuta metoda pro léčbu aterosklerosy, post-angioplastické restenosy, koronární arteriální choroby, a jiných kardiovaskulárních chorob, jakož i nekardiovaskulárních zánětlivých chorob, které jsou zprostředkovány VCAM-1 a zahrnuje odstranění, snížení koncentrace nebo zabránění tvorbě oxidovaných polynenasycených mastných kyselin, včetně, ale ne pouze oxidované linoleové, linolenové a arachidonové kyselině.
V alternativním provedení je poskytnuta metoda pro léčbu těchto chorob, která zahrnuje prevenci interakce PUFA nebo ox-PUFA s proteinem nebo peptidem, který mediuje VCAM-1 expresi.
Inhibice exprese VCAM-1 může být provedena množstvím způsobů, včetně podání antioxidantů, který zabrání oxidaci polynenasycených mastných kyselin in vivo modifikací metabolismu PUFA na ox-PUFA, jak je detailně popsáno dále.
1. Podání antioxidantů
Jakákoliv sloučenina, která redukuje ox-PUFA nebo která oxiduje PUFA, a která je relativně netoxická a biologicky dostupná nebo která může být modifikována k dosažení biologické dostupnosti, může být použita v této terapii. Odborníci snadno určí, zda sloučenina redukuje ox-PUFA nebo inhibuje oxidaci PUFA užitím standardních technik.
Dithiokarboxylátové antioxidanty
Bylo objeveno, že dithiokarboxyláty jsou užitečné v léčbě aterosklerosy a jiných kardiovaskulárních a zánětlivých chorob. Dithiokarboxyláty, včetně dithiokarbamátů, mohou být využity k blokování schopnosti buněk, včetně buněk endothelu, exprivovat VCAM-1 nebo suprivovat expresi genů senzitivních na redukci nebo aktivovat geny, které jsou suprivovány přes redox senzitivní dráhu.
Alespoň jedna ze sloučenin, pyrrolidindithiokarbamát (PDTC), inhibuje VCAM-l genovou expresi v koncentracích menších než 1,0 mikromolárních. Tato sloučenina také vykazuje preferenční toxicitu k proliferujícím nebo abnormálně se dělícím buňkám hladkého svalu cév. Jiný dithiokarbamát, N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát sodný, také inhibuje expresi VCAM-1 bez signifikantního vlivu na ICAM-1, ale nevykazuje preferenční toxicitu k abnormálně se dělícím buňkám hladkého svalu cév. Jiný dithiokarbamát,
N-methy1-N-karboxymethy1-N-karbodithioát sodný, také inhibuje expresi VCAM-1 bez signifikantního vlivu na ICAM-1, ale nevykazuje preferenční toxicitu k abnormálně se dělícím buňkám hladkého svalu cév.
Bylo objeveno, že pyrrolidindithiokarbamát neblokuje signifikantně ELAM-1 nebo ICAM-1 expresi, a proto léčba těmito sloučeninami neovlivňuje nepříznivě aspekty zánětlivé odpovědi mediované ELAM-1 nebo ICAM-1. Tak je zabráněno generál isované imunosupresi. To umožňuje vyhnout se systémovým komplikacím z generál isované inhibice adhezních molekul v mnoha jiných typech buněk, o nichž je známo, že tyto exprivují. Jiné farmaceuticky akceptovatelné soli PDTC jsou také účinnými agens v léčbě kardiovaskulárních a zánětlivých chorob.
Dithiokarbamáty jsou chelátory přechodových kovů klinicky používané při intoxikaci těžkými kovy. Baselt,
R.C., F.W.J.Sunderman, et al. , (1977), Comparisons of antidotal efficacy of sodium diethyldithiocarbamate,
D-penici1 lamině and triethylenetetramin upon acute toxicity of nickel carbonyl in rats Res Commun Chem Pathol Pharmacol 18(4) : 677-88; Menne T. and K. Kaaber (1978), Treatment of pompholyx due to nickel allergy with chelating agens. Contact Dermatitis 4(5): 289-90, Sunderman, F.W. (1978), Clinical response to therapeutic agens in poisoning from mercury vapor Ann Clin LAB Sci 8(4): 259-69, Sunderman, F.W. (1979), Efficacy of sodium diethyldithiocarbamate (dithiocarb) in acute nickel carbonyl poisoning. Ann Clin Lab Sci 9(1):
1-10, Gale, G.R., A.B. Smith, et al., (1981),
Diethyldithiocarbamate in treatment of acute cadmium poisoning. Ann Clin Lab Sci 11(6): 476-83, Jones ,M.M. a M.G. Cherian (1990), The search for chelate antagonists for chronic cadmium intoxication, Toxicology 62(1): 1-25, Jones ,S.G., M.A. Basinger, et al., (1982), A comparison of diethyldithiocarbamate and EDTA as antidotes for acute cadmium intoxication. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 38(2): 271-8, Pages ,A., J.S. Casas, et al.,(1985), Dithiocarbamates in heavy metal poisoning: complexes of
N,N-di(l-hydroxyethyl)dithiocarbamate with Zn(II), Cd(II), Hg(II), CH3Hg(II), a C6H5Hg(II). J.Inorg Biochem 25(1): 35-42 ,Tandon,S.K..N.S.Hashmi et al. (1990) The lead-chelating effects of substituted dithiocarbamates. Biomed Environ Sci 3(3): 299-305.
Dithiokarbamáty byly také užity adjuvantně k chemoterapii cis-platinou k prevenci nefrotoxicity. Hacker, M.P., W.B.
Ershler, et al. (1982). Effects of disulfiram (tetraethylthiuram disulfide) and diethyldithiocarbamate on the bladder toxicity and antitumor activity of cyclophosphamide in mice. Cancer Res 42(11): 4490-4.
Bodenner, 1986 #733, Saran, M. a Bors, W. (1990). Radical reactions in vivo—an overview. Radiat. Environ. Biophys 29(4):249-62.
Dithiokarbamátem nyni užívaným k léčbě abusu alkoholu je disulfiram, dimer diethyldithiokarbamátu. Disulfiram inhibuje jaterní aldehyd dehydrogenasu. Inoue, K., a Fukunaga et al., (1982), Effects of disulfiram and its reduced metabolite, diethyldithiocarbamate on aldehyde dehydrogenase of human erythrocytes. Life Sci 30(5): 419-24.
Bylo popsáno, že dithiocarbamaty inhibují replikaci HIV viru, a také zvyšují maturaci specifických subpopulací T buněk To vedlo ke klinickým studiím diethyldithiokarbamátu u populace pacientů s AIDS. Reisinger Ε., et al., (1990). Inhibition of HIV progression by dithiocarb. Lancet 335:679
Dithiokarboxyláty jsou sloučeniny struktury A-SC(S)-B, které jsou členy obecné skupiny sloučenin známých jako thiolové antioxidanty, a jsou alternativně označovány jako karbodithioly nebo karbodithioláty. Zdá se, že -SC(S)-skupina je podstatná pro terapeutickou aktivitu, a že A a B může být jakákoliv skupina, která nemá nepříznivý vliv na účinost nebo toxicitu sloučeniny.
V alternativním provedení je nahrazen jeden nebo oba atomy síry v dithiokarbamátu atomy selenu. Substituce selenu za síru může v jistých případech snižovat toxicitu molekuly, a tak může být lépe tolerována pacientem.
A a B může být vybrán odborníkem k udělení požadovaných charakteristik sloučenině, včetně velikosti, náboje, toxicity a stupně stability, (včetně stability v kyselém prostředí jako je žaludek, nebo zásaditém prostředí jako je střevní trakt). Selekce A a B může být také důležitá pro efekt distribuce ve tkáních a farmakokinetiku sloučeniny. Obecně, pro léčbu kardiovaskulárních chorob je žádoucí, aby se sloučenina akumulovala, nebo lokalizovala, ve vrstvě arteriální intimy, obsahující buňky cévního endothelu. Sloučeniny jsou preferovaně eliminovány renální exkrecí.
Výhodou farmaceutického podání dithiokarboxylátu je to, že se nezdá být enzymaticky štěpen in vivo thioesterasami a tak může vykazovat prodloužený poločas in vivo.
V preferovaném provedení je A vodík nebo farmaceuticky přijatelný kationt, zahrnující, ale neomezený na, sodík, draslík, vápník, hořčík, hliník, zinek, vismut, baryum, měd, kobalt, nikl nebo kadmium; solitvornou organickou kyselinu, typicky karboxýlovou kyselinu, zahrnující, ale neomezující se na, kyselinu octovou, kyselinu šťavelovou, kyselinu vinnou, kyselinu jantarovou, kyselinu jablečnou, kyselinu askorbovou, kyselinu benzoovou, tanin, kyselinu pamoovou, kyselinu alginovou, kyselinu polyglutamovou, kyselinu naftalensulfonovou, kyselinu naftalendisulfonovou nebo kyselinu polygalakturonovou; nebo kationt vytvořený z amoniaku nebo jiné dusíkaté báze, zahrnující, ale neomezující se na, dusíkaté heterocykly, nebo skupinu vzorce NR4R5R6R7, kde R4,
R5, R6 a R7 jsou nezávisle vodík, Ci-elineární, rozvětvený nebo (v případě C4-6) cyklický alkyl, hydroxy(Ci-6)alkyl (kde jedna nebo více hydroxy1 skupin je umístěno na kterémkoliv z atomů uhlíku), nebo aryl, N,N-dibenzylethylendiamin, D-glukosamin, cholin, tetraethylamonium nebo ethylendiamin.
V dalším provedení může být A fyziologicky odštěpitelná skupina, která může být odštěpena in vivo z molekuly, ke které je připojena a zahrnuje, ale není tak omezena, acyl (zahrnující acetyl, propionyl a hutyryl), alkyl, fosfát, sulfát nebo sulfonát.
V jednom provedení je B alkyl, alkenyl, alkinyl, alkaryl, aralkyl, halogenalkyl, halogenalkenyl, halogenalkinyl, aryl, alkaryl, vodík, Ci-ealkoxy-Ci-1oalkyl,
Ci-ealkylthio-Ci-1oalkyl, NR2R3, -(CHOH)nCH2OH, kde n je 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, -(CH2)nCOaR1, zahrnující alkylacetyl, alkylpropionyl a alkylbutyry1, nebo hydroxy(Ci-e)alkyl- (kde jeden nebo více hydroxylových skupin je umístěno na kterémkoliv z atomů uhlíku).
V dalším provedení je B NR2R3, kde R2 a R3 jsou nezávisle alkyl; -(CHOH)n(CH2)„OH, kde n je 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6; -(CH2)nCOaR1,-(CH2)nCO2R4; hydroxy(Ci-4)alkyl-; alkenyl (zahrnující, ale neomezený na, vinyl, allyl a
CH3CH=CH-CH2CH2); alkyl(CO2H), alkenyl(CO2H), alkinyl(CO2H) nebo aryl, kde arylová skupina může být substituována jak je popsáno výše a to například s NO2, CH3, terč.butylem, CO2H, halogenem nebo p-OH skupinou; nebo R2 a R3 spolu mohou tvořit můstek jako je -(CH2)«~, kde m je 3, 4, 5 nebo 6, a kde r4 je alkyl, aryl, alkaryl ebo aralkyl, zahrnující acetyl, propionyl a butyryl.
V ještě dalším provedení může být B heterocyklická nebo alkylheterocyklická skupina. Heterocyklus může být popřípadě částečně nebo plně hydrogenován. Neomezující příklady jsou ty, které jsou uvedeny výše a zahrnují fenazin, fenothiazin, pyridin a dihydropyridin.
'
V ještě dalším provedení je B zbytek farmaceuticky aktivní sloučeniny nebo léčiva. Výraz léčivo, jak je zde použit, označuje jakoukoliv substanci používanou vnitřně nebo z vnějšku jako medicíny pro léčbu, ošetřováni nebo prevenci choroby nebo poruchy.
Neomezující příklady jsou léčiva pro léčení nebo prevenci kardiovaskulárních chorob, zahrnující antioxidanty jako je probucol; kyselinu nikotinovou; činidla, která brání shlukování destiček jako je aspirin; antitrombotická činidla jako je coumadin; blokátory vápníkových kanálků jako je varapamil, diltiazem a nifedipin; inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu (ACE) jako je captopril a enalopril, β-blokátory jako je propanalol, terbutanol a labetalol, nesteroidní protizánětlivá činidla jako je ibuprofen, indomethacin, fenoprofen, kyselina mefenamová, kyselina flufenamová, sulindac nebo kortikosteroidy. Skupina -C(S)SA může být přímo připojena k léčivu nebo být připojena přes jakoukoliv vhodnou spojovací
V jiném provedení je dithiokarbamát derivát kyseliny vzorce ACUC-R^-NR1o-C(S)SA, kde R9 je dvojvazná B skupina, spojovací skupina nebo vnitřní zbytek jakékoliv z přirozeně se vyskytujících aminokyselin (například CH3CH pro alanin, CH2 pro glycin, CH(CH2)«NH2 pro lysin atd.) a R10 je vodík nebo nižší alkyl.
B může také být polymer, ke kterému jsou připojeny jedna nebo více dithiokarbamátových skupin, bud přímo nebo přes jakoukoliv vhodnou spojovací skupinu. Dithiokarbamát je výhodně uvolňován z polymeru za in vivo podmínek během vhodného časového období za poskytnutí terapeutického přínosu. V preferovaném provedení je polymer samotný také degradabilní in vivo. Výraz biodegradabilni nebo bioerodibilni jak je zde použit, označuje polymer, který se rozpustí nebo degraduje po dobu, která je přijatelná při požadované aplikaci (obvykle terapie in vivo), obvykle méně než pět let a výhodně méně než jeden rok, při vystavení fyziologickému roztoku o pH 6 až 8, majícímu teplotu mezi 25 a 37 °C. Ve výhodném provedení polymer degraduje během doby mezi jednou hodinou a několika týdny, podle aplikace.
Je známo mnoho degradabilnich polymerů. Neomezující příklady jsou peptidy, proteiny, nukleoproteiny, 1ipoproteiny, glykoproteiny, syntetické a přírodní polypeptidy a polyamiokyseliny, zahrnující, ale neomezující se tak, polymery a kopolymery lysinu, argininu, asparaginu, kyseliny aspartové, cysteinu, kyseliny glutamové, glutaminu, hydroxylysinu, šeřinu, threoninu a tyrosinu; polyorthoestery, zahrnující póly(α-hydroxykyseliny), například polymléčnou kyselinu, polyglykolovou kyselinu, póly(laktid-ko-glykolid), polyanhydridy, albumin nebo kolagen, polysacharidy, obsahující cukrové jednotky jako je laktoza a polykaprolakton. Polymer může být náhodný nebo blokový kopolymer.
B může být také skupina, která zvyšuje rozpustnost dithiokrbamátu ve vodě, například -nižší alkyl-O-R8, kde R8 je -PO2(OH)“M+ nebo PO3(M+)2, kde M+ je farmaceuticky přijatelný kationt; -C(O)(CH2)2CO2M*, nebo -SO3M+; - nižší alkylkarbonyl-nižší alkyl; -kárboxy-nižší alkyl; -nižší alkylamino-nižší alkyl; N,N-di substituovaný amino-nižší alkyl-, kde substituenty nezávisle na sobě každý znamenají nižší alkyl; pyridyl-nižší alkyl-; imidazolyl-nižšf alkyl-; imidazolyl-Y-nižší alkyl, kde Y je thio nebo amino; morfolinyl-nižší alkyl; pyrrolidinyl-nižší alkyl; thiazolinyl-nižší alkyl-; piperidinyl-nižší alkyl;
morfolinyl-nižší hydroxyalkyl; N-pyrryl; piperazinyl-nižší alkyl; N-substituovaný piperazinyl-nižši alkyl, kde substituent je nižší alkyl; triazolyl-nižší alkyl; tetrazolyl-nižší alkyl; tetrazolylamino-nižší alkyl; nebo thiazolyl-nižší alkyl.
V alternativním provedení může být podáván dimer jako je B-C(S)S-SC(S)B.
Neomezující příklady dithiokrbamátů mají vzorec:
1) alifatický substrát R\
N
I
C=s
Rch,=ch
CHj-CřfeCH
2) aminokyselina
Polyaminokyselina
COOH COOH Lys— 1
1 , R'H R'H -Lys-Lys 1 i
I R'N 1 c=s 1 NR' I NR
1 . C=S c=s 1 S- 1 C=s 1 S'
1 s· S*
R' subs t i tuenty R- Na* S . 0 o 11 » R—C—S—C-R
NO2 R* terc.butyl Ca** thioester
CHj nebo NH4*
COOH cholin* a kvarterní aminy
P-OH Mg**
A—S
S
II c—B
S n 11
B—C—s
S
II
C—0
Dithiokarboxyláty mohou být zvoleny pro léčbu aterosklerosy a jiných kardiovaskulárních chorob a zánětlivých chorob proto, že mají správnou lipofi litu k umístění v poškózeném místě. Sloučenina by se neměla kompartmentalisovat v regionech s nízkým obratem jako jsou tuková depozita.
V preferovaném provedeni pro léčbu kardiovaskulárních chorob by neměla být farmakokinetika sloučeniny dramaticky narušena městnavým srdečním selháním nebo renální insuficiencí.
Pro místní aplikaci pro léčbu zánětlivých kožních chorob by měla být vybraná sloučenina formulována tak, aby byla absorbována kůží v dostatečném množství k dosažení terapeutického efektu v postiženém místě.
Dithiokarboxyláty musí být fyziologicky přijatelné.
Obecně, sloučeniny s terapeutickým indexem alespoň 2, a preferovaně 5 nebo 10, jsou akceptovatelné. Terapeutický index je definován jako EC50/IC50, kde EC50 je koncentrace sloučeniny, která inhibuje expresi VCAM-1 z 50% a IC50 je koncentrace sloučeniny, která je toxická pro 50% cílových buněk. Buněčná toxicita může být měřena přímým počítáním buněk, vyloučením trypan blue, nebo různými studiemi metabolické aktivity, jako je inkorporace 3H-tymidinu odborníkům dobře známá. Terapeutický index PDTC ve tkáňové kultuře je větší než 100 při měření buněčné toxicity rozdělené podle schopnosti inhibovat VCAM-1 expresi aktivovanou TNF-α v HUVE buňkách. Iniciální studie na rychle se dělících buňkách typu HT-18 lidského gliomu nevykazovala žádnou toxicitu při koncentracích lOOkrát vyšších než jsou terapeutické koncentrace. Disulfiram, orálně podávaná forma dietyldithiokarbamátu, užívaná v léčbě abusu alkoholu, nevykazuje žádnou významnou klinickou toxicitu, je-li vhodně podán.
Je několik dithiokarhamátů, o kterých je známo, že jsou genotoxické. Tyto sloučeniny nespadají do rozsahu tohoto vynálezu, který je limitován na podání fyziologicky akceptovatelého materiálu. Příkladem genotoxického dithiokarhamátů je fungicid dimethyldithiokrbamát zinku. Dále anticholinesterasové vlastnosti některých dithiokarbamátů mohou vést k neurotoxickým efektům. Miller, D. (1982). Neurotoxicity of pesticidal carbamates. Neurobehav.
Toxicol.Teratol.4(6): 779-87.
Termín dithiokarboxyláty, jak je zde použit specificky zahrnuje, ale není omezen dithiokarbamáty vzorců:
RiSC(S)NR2R3 nebo R2R3N(S)CS-SC(S)NR2R3 kde R1 je H nebo farmaceuticky přijatelný kationt, zahrnující ale neomezující se na, sodík, draslík nebo NR4R5R6R7, kde R4, R5, R6 a R7 jsou nezávisle vodík, Ci-β lineární, rozvětvený nebo cyklický alkyl, hydroxy(Ci-6)alkyl (kde jedna nebo více hydroxylových skupin je umístěno na kterémkoliv z uhlíkových atomů), nebo aryl a
R2 a R3 jsou nezávisle Ci-io lineární, rozvětvený nebo cyklický alkyl; -(CHOH)n(CH2)nOH, kde n je 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6; -(CH2)nCO2R1, -(CH2)nCO2R4; hydroxy(Ci-6)alkyl-, nebo R2 a R3 spolu tvoří můstek jako je -(CH2)·-, kde m je 3 až 6 a kde R4 je alkyl, aryl, alkaryl nebo aralkyl, zahrnující acetyl, propionyl a butyryl.
Specifické příklady vhodných dithiokarbamátů ilustrovaných na obr. 15 zahrnují pyrrolidin-N-karbodithioát sodný, N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát sodný,
N,N-di(karboxymethyl)-N-karbodithioát trojsodný,
N-me thyl-D-g1ukami n-N-karbod i thioát s odný,
N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný (diethyldithiokarbamát sodný) a N,N-diisopropyl-N-karbodithioát sodný.
Aktivní dithiokarboxyláty a zejména dithiokarbamáty jsou bud obchodně dostupné nebo mohou být připraveny za použití známých metod.
II. Biologická aktivita
Schopnost dithiokarboxylátů inhibovat expresi VCAM-1 může být měřena množstvím způsobů, včetně metod detailně popsaných v Příkladech 9 až 15. Příklady 9-11 a 14-15 popisují hodnocení biologické aktivity pyrrolidin-N-karbodithioátu sodného (také označovaný jako PDTC). Tyto příklady nemají omezovat rozsah vynálezu, který specificky zahrnuje užití jakékoliv z výše uvedených kompozic k léčbě aterosklerosy, a jiných typů zánětů a kardiovaskulárních chorob mediovaných VCAM-1. Jakákoliv ze sloučenin popsaných výše může být snadno nahrazena za PDTC a hodnocena stejným způsobem.
Příklady 12 a 13 poskytují srovnávací data na schopnosti množství dithiokarbamátů inhibovat genovou expresi VCAM-1. Příklady níže uvedené určují, že chráněné dithiokarbamáty specificky blokují schopnost VCAM-1 být exprivována vaskulárními endotheliálními buňkami v odpovědi na mnohé signály, o kterých je známo, že jsou aktivní v aterosklerose a v zánětlivé odpovědi.
Experimentální postupy
Buněčné kultury: HUVE buňky byly izolovány z lidské umbilikální vény, která byla kanylována, perfundovány Hankovým roztokem k odstranění krve, a pak inkubovány s 1% kolagenasou po 15 minut při 37 °C. Po odstranění kolagenasy byly buňky kultivovány v M199 mediu suplementovaném 20% fetálním bovinním sérem (HyClone), 16 pg/ml heparinu (ESI Pharmaceuticals, Cherry Hill, NJ), 50 pg/ml suplementu růstu endoteliálních buněk (Collaborative Research Incorporated, Bedfor MA), 25 mM Hepes pufru, 2 mM L-glutaminu, 100 pg/ml penicillinu a 100 pg/ml streptomycinu a kultivovány při 37 <>C na kultivačních plotnách potažených 0.1% želatinou. Buňky byly pasážovány při konfluenci rozdělením 1:4. Buňky byly užity během prvních 8 pasáží.
Inkubace s cytokiny a jinými činidly
Konfluentní HUVE buňky byly promyty salinickým roztokem fosfátového pufru a pak přechovávány v čerstvém mediu. Určená koncentrace PDTC byla přidána jako předošetření 30 minut před přidáním cytokinů. Cytokiny a další induktory byly přidány přímo do media v době a v koncentraci určené pro každý experiment. Lidský rekombinantní IL-lb byl velkodušným darem od Upjohn Company (Kalamazoo, Michigen). TNFa byl získán od Bohringer Engelheim. Bakteriální 1ipopolysacharid (LPS), kyselina pólyinosinová: kyselina polytidilová ( Póly I:C), a pyrrolidindithiokarbamát (PDTC) byly získány od Sigma Chemical (St. Louis, MO). Všechny ostatní reagens byly čistoty pro reakci.
RNA izolace
Celková buněčná RNA byla izolována jedinou extrakcí užitím kyselou směsí guanidinumthiokyanát - fenol - chloroform. Buňky byly propláchnuty salinickým roztokem fosfátového pufru a pak lyžovány 2 ml guanidiumisokyanátu. Roztok byl okyselen 0.2 ml octanu sodného (pH 4.0) a pak extrahován 2 ml fenolu a 0.4 ml chloroform:isoamylalkoholu (24:1). RNA byla podrobena dvěma ethanolovým precipitacím před použitím pro Northern blot analýzu.
Northern blot analýza
Celková buněčná RNA (20 ug) byla frakcionována podle velikosti na 1% agarosa formaldehydových gelech za přítomnosti 1 pg/ml ethidiumbromidu. RNA byla transferována do nitrocelulosového filtru a kovalentně navázána ultrafialovým zářením za použití Stratlinker UV crosslinkeru (Stratagene, La Jolla, CA). Hybridizace byla provedena při 42 °C po 18 hodin v 5X SSC (1X= 150 mM NaCl, 15 mM Na citrátu), 1 % dodecylsulfátu sodného, 5X Denhartova roztoku, 50 % formamidu, 10 % dextransulfátu, a 100 ug/ml střihem denaturované DNA lososových spermií. Přibližně 1-2X 106 cpm/ml značené proby (specifická aktivita >108 cpm/pg DNA) bylo užito pro hybridizací. Po hybridizací byly filtry promyty s konečnou přesností 0.2 SSC při 55 °C. Nitroceluloza byla odstraněna horkou vodou před rehybridizací jinými próbami.
Autoradiografie byla provedena intensifikovanou expozicí při -70 °C.
3 2Proby 32P značené DNA proby byly vyrobeny metodou náhodného primer oligonukleotidu. ICAM-1 proba byla Eco Rl fragmentem lidské cDNA. ELAM-1 proba byla 1.85 kb Hind III fragmentem lidské cDNA. VCAM-1 proba byla Hind III- Xho I fragmentem lidské cDNA sestávajícím se z nukleotidů 132-1814.
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
HUVE buňky byly umístěny do 96-jamkových ploten tkáňových kultur 48 až 72 hodin před zkouškou. Primární protilátky v M199 s 5 % FBS byly přidány do každé jamky a inkubovány 1 hodinu při 37 °C. Buňky byly pak promyty a inkubovány jednu hodinu s kozí anti myší IgG konjugovaným s peroxidasou (Bio Rad) ředěnou 1/500 v M199 s 5 % FBS. Jamky byly pak promyty a vazba protilátky byla detegována přidáním 100 μΐ 10 mg/ml 3,3,5,5|- tetramety1-benzidinu (Sigma) s 0.003 % H2O2. Pak byla reakce zastavena přidáním 25 μΐ 8N kyseliny sírové. Plotny byly čteny na ELISA readeru (Bio Rad) při 450 nm po zatemnění na řadách vybarvených pouze s protilátkou z druhého kroku, údaje jsou průměry z trojitých pokusů.
Protilátky
Monoklonální protilátky (MAb) 4B9 rozpoznávající adhezní molekulu 1 cévních buněk (VCAM-1) daroval Dr. John Harlan (University of Washington). MAb E9A1F1 rozpoznávající adhezní molekulu endotheliálních buněk (ELAM-1) daroval Dr. Swerlick (Emory University). Hybridní produkty mAb 84H10 rozpoznávající intercelulární adhezní molekulu 1 (ICAM-1) jsou rutině vyráběny v našich laboratořích a protilátka byla použita jako supernatant tkáňové kultury.
Příklad 9
PDTC blokuje IL-lb zprostředkovanou indukci
HUVEC VCAM-1, ale ne ICAM-1 nebo ELAM-1, mRNA akumulaci.
K určení, jestli oxidační stav endotheliální buňky může alterovat základ, nebo indukovat expresi genů buněčných adhezních molekul byly kultivované lidské vaskulární endotheliální buňky vystaveny indukujícím cytokinům IL-lb (10 U/ml), za přítomnosti nebo nepřítomnosti thiolatovaného kov chelatujícího antioxidantů, pyrrolidindithiokarbamátu (PDTC, μιη) po více než 24 hodin. Jak je ukázáno na obrázku 10, IL-lb sám (dráhy 2, 4, 6, 8) indukuje rychlou a přechodnou indukci VCAM-1 (Panel A), E-selektinu (ELAM-1,Panel Β), a ICAM-1 (Panel C) mRNA akumulace, která má u všech maximum ve 4 hodinách. Nicméně, za přítomnosti PDTC je IL-lb indukce VCAM-1 mRNA akumulace dramaticky inhibována o více než 90 % (Panel A, dráhy 3, 5, 7, 9). Oproti tomu, ačkoliv IL-lb zprostředkovaná indukce ELAM-1 je lehce inhibována ve 2 a 24 hodinách (srovnej dráhy 2 a 3, 8 a 9 Panelu Β), PDTC neinhibuje indukci ve 4 a 8 hodinách (dráhy 5 a 7, Panel B). IL-lb zprostředkovaná indukce ICAM-1 mRNA akumulace není ovlivněna (panel B, dráhy 3, 5, 7, 9). Samozřejmě, je pozorováno mírné zvýšení IL-lb indukce ICAM-1 mRNA akumulace (~30 %) (srovnej dráhy 4 a 5, panel B). Ekvivalentní množství do nitrocelulozy transferované RNA na dráhu bylo potvrzeno barvením ethidiumbromidem a vizualizací.
Analýza odpovědi na dávku byla provedena k určení, zda PDTC inhibuje indukci VCAM-1 genové exprese IL-lb na dávce závislým způsobem. Jak ukazuje obrázek 11, PDTC inhibuje IL-lb zprostředkovanou indukci VCAM-1 genové exprese podle strmé křivky odpovědi na dávku (obrázek 11, Panel A) s kalkulovanou ECso přibližně 10 μΜ, zatímco PDTC neinhibuje IL-lb zprostředkovanou indukci ELAM-1 exprese těmito koncentracemi (Obr.11, panel B). IL-lb zprostředkovaná indukce ICAM-1 mRNA akumulace je zvýšena PDTC s koncentrací vyšší než 0.5 uM (Obr.2, srovnej dráhu 2 a dráhu 4-7, panel C).
Tato data demonstrují, že IL-lb využívá dithiokarboxylát, a zejména dithiokarbamát sensitivní krok jako součást jeho signálního mechanismu v indukci VCAM-1 genové exprese. Tato data také naznačují, že tento dithiokarbamát senzitivní krok nehraje signifikantní roli v indukci ELAM-1 nebo ICAM-1 genové
SO expres i.
Příklad 10
PDTC blokuje indukci HUVEC VCAM-1 mRNA akumulace mnohými stimuly
K určení, zda jiné dobře popsané aktivátory VCAM 1 genové exprese také využívají PDTC senzitivních kroků byly testovány tři odlišné třídy aktivátorů: jiné klasické receptorem zprostředkované indukující agens (TNFa), non-receptor zprostředkovaný induktor (1ipopolysacharid (LPS)) a nedávno popsaný nový induktor (dvojřetězcová RNA, póly (I:C)). Ve všech třech případech PDTC dramaticky inhiboval indukci VCAM-1 mRNA akumulace v HUVEC po čtyřech hodinách (obrázek 12, Panel A). Ačkoliv TNFa zprostředkovaná ELAM-1 genová exprese je suprivovaná ve stejném rozsahu (obr. 12 linie 1 a 2, panel Β), LPS a póly (I:C) zprostředkovaná ELAM-1 mRNA akumulace byla neovlivněna (obr. 12 linie 3-6, panel B). Indukce ICAM-1 mRNA akumulace byla neovlivněna (Obr.12, panel C). Tato data indikují, že strukturálně odlišná indukující agens, působící přes různé dráhy, sdílejí společné regulační kroky specifické pro indukci VCAM-1 genové exprese.
Příklad 11
PDTC blokuje HUVE buněčnou povrchovou expresi VCAM-1 indukovanou více stimuly
Pro stanovení, zda, podobně jako jeho mRNA, by indukce exprese endotheliálního buněčného povrchového proteinu VCAM-1 mohla také být inhibována PDTC, byly monoklonální protilátky použity v ELISA eseji pro kvantifikaci indukce buněčného povrchového VCAM-1 a ICAM-1 v kultivovaných HUVE buňkách. Jak je uvedeno na obr. 13, indukuje mnoho tříd aktivačních činidel, za nepřítomnosti PDTC (-PDTC) rychlou a přechodnou akumulaci VCAM-1 (horní levý panel) při buněčném povrchovém vrcholu za šest hodin. Za přítomnosti PDTC (+PDTC, horní pravý panel), indukce buněčné povrchové exprese VCAM-1 všemi testovanými činidly je dramaticky inhibována (80 až 90 X). Naopak indukovaná exprese buněčného povrchového ICAM-1 není ovlivněna za stejných podmínek (horní levé a pravé panely).
Tyto údaje demonstrují, že podobně jako jeho mRNA akumulace, jsou buněčné povrchové VCAM-1 exprese selektivně inhibovány dithiokrbamáty a že mnoho tříd aktovačních činidel využívá podobný, dithiokrbamát senzitivní mechanismus pro indukci VCAM-1 genové exprese.
Příklad 12
Srovnávací účinnosti antioxidantů při blokování TNFa indukce VCAM-1
Pro stanovení, zda strukturně podobné nebo odlišné antioxidanty by také mohly inhibovat VCAM-1 genovou expresi a s jakou potencí, byly HUVE buňky vystaveny TNFa na šest hodin za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentracích čtyř různých antioxidantů. Jak je uvedeno na obrázku 14, jak diethyldithiokarbamát (DETC) tak N-acetylcystein (NAC) inhibují VCAM-1 expresi v koncentracích 5 μΜ a 30 μΜ. Naopak PDCT (PDCT) byl účinný mezi 5 a 50 μΜ. Chelátor kovového železa, desferroximin, neměl žádný vliv při testovaných koncentracích.
Příklad 13
PDTC inhibuje TNF indukci VCAM-l/VLA-4 zprostředkovanou adhezi
Schopnost různých antioxidantů inhiovat TNF-α indukci
VCAM-1 v HUVE buňkách byla hodnocena metodou podle příkladu 12. Obr.15 je graf relativní VCAM-1 buněčné povrchové exprese (O.D. 595 nM) v TNF-α aktivovaných HUVE buňkách proti koncentracím PTDC (N-pyrrolidindithiokarbamát sodný), DIDTC (N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný), SarDTC (N-methyl-N-karboxymethyl-N-karbodithioát sodný), IDADTC (N,N-di(karboxymethy1)-N-karbodithioát troj sodný), MGDTC (N-methyl-D-glukamin-N-karbodithioát sodný), MeOBGDTC (N-(4-methoxybenzy1)-D-glukamin-N-karbodithioát sodný), DEDTC (N,N-diethyl-N-karbodithioát sodný), Di-PDTC (N,N-diisopropyl-N-karbodithioát sodný) a NAC je (N-acetylcystein).
Příklad 13
PDTC inhibuje TNF indukci VCAM-l/VLA-4 zprostředkovanou adhezi
Za účelem definovat, zda PDTC inhibice VCAM-1 regulace je spojena s funkčními konsekvencemi, vazba Molt-4 buněk k HUVEC bňkám bud nestimulovaná nebo stimulovaná s TNFa (100 U/ml) byla hodnocena šest hodin za přítomnosti nebo nepřítomnosti PDTC. Molt-4 buňky byly předem zjištěny jako vázající se k aktivovaným HUVEC přes VCAM-1 záislý mechanismus. Jak je uvedeno na obr. 16, procenta Molt-4 vazby k HUVEC buňkám se zvyšují za přítomnosti PDTC v mediu.
Příklad 14
PDTC inhibuje monocytovou vazbu ke thorakální aortě cholesterolem krmených králíků
Byl proveden pokus pro stanovení, zda by thiolový antioxidant PDTC mohl být účinný při blokování první monocytové vazebné složky atherosklerozy v experimentálním zvířecím modelu. Jeden dospělý Novozélandský bílý králík (3,5 kg) dostal intravenozní injekci PDTC (20 mg/kg, jako koncentraci 20 mg/ml v PBS) jednou denně po 5 dnů. Injekce byly podávány po delši dobu zavedenou kanylou do marginální ušní vény, která byla udržována průchodnou heparinizovaným salinickým roztokem. PDTC roztok byl míšen denně jako čerstvý nebo na několik dnů (uchováván chráněný před světlem při 4 ° C) a filtrován (filtr o 0,45 mm pórech) právě před použitím. Po první injekci, kdyžbyla umístěna kanyla, bylo léčivo podáno králíkovi v bdělém stavu bez zjevného nepohodlí nebo jiného škodlivého vlivu. Druhý den injekcí byla králíkovi podána potrava, obsahující 1 % hmotn. cholesterolu a po zbytek pokusu bylo pokračováno v této potravě. Pátý den bylo zvíře usmrceno a thorakální aorta byla vyříznuta a fixována. Po příslušné preparaci byl vzorek zobrazen na nižším stupni ISI DS-130 skanovacího elektronového mikroskopu opatřeného LaB emitérem. Za použití zobrazení dual-screen a transparentní mřížky na CRT screenu, bylo hodnoceno 64 sousedních polí při 620x zvětšení, pro pokrytí plochy asi 1,3 mm2. V každém poli byl spočten a zaznamenán počet adherentních leukocytů (WBC) a erythrocytů (RBC).
Data z obloukových vzorků jsou následující: 5 WBC a asi 25 RBC na 1,3 mm2 pole. Tato úroveň WBC adheze je podobná jako u kontrolních zvířat krmených pravidelnou potravou (asi 7 na pole bylo možno vidět v obloukových a thorakálních vzorcích od 2 'negativních kontrolních' pokusů). 'Pozitivní kontrolní' králíci krmení 1 % cholesterolu po 4 dny ale bez podání antioxidantu vykazují asi 5-násobné zvýšení adheze, na 38 WBC/1,3 mm2. Značné množství většinou buněčných zlomků bylo pozorováno adherovaných ke každému oblokovému vzorku, není jasné, zda tento materiál je artifaktem přípravy nebo byl přítomen in vivo, a zda je tedy vztažen k PDTC podání. Tyto studie naznačují, že PDTC infuze mohou účinně blokovat počáteční monocytovou adhezi k aortovému endothelu.
Příklad 15
Inhibice BSA 13-HPODE aduktů s PDTC
Obrázek 18 je sloupcový graf vlivu PTDC na tvorbu fluorescentních aduktů BSA a 13-HPOD měřeno ve fluorescenčních jednotkách proti mikromolární koncentraci PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE byl inkubován se 200 mikrogramy BSA za přítomnosti PDTC po šest dnů. Fluorescence byla měřena při 430 až 460 nm s excitací při 330 až 360 nm. Podrobně viz Freebis J.,
Parthasarathy S., Steinberg D. Proceedings of National Academy of Sciences 89, 10588-10592, 1992. V typické reakci 100 nmol LOOH (generován 1ipoxygenasou katalyzovanou oxidací kyseliny linoleové) inkubovaných se 100 pg hovězího sérového albuminu po 48 až 72 hodin a tvorbou fluorescentních produktů jsou následovány měřením fluorescentního spektra s excitací při 360 nm a emisí mezi 390 a 500 nm.
Jak je zjištěno, PDTC snižuje koncentraci fluorescentních aduktů BSA a 13-HPODE.
Obrázek 13 je graf vlivu PTDC na tvorbu fluorescentních aduktů BSA a ox-PUFA jako funkce vlnové délky (nm) a koncentrace PDTC. Jak koncentrace PDTC stoupá, klesá množství fluorescentních aduktů.
Příklad 16
Vliv PDTC na oxidaci LDL křenovou peroxidasou
Obrázek 20 je graf vlivu PDTC na oxidaci LDL křenovou peroxidasou (HRP), měřený proti času (minuty) pro měnící se koncentrace PDTC. Oxidace LDL byla následována měřením oxidace složek mastné kyseliny LDL jak je stanoveno zvýšením optické hustoty při 234 nm. Když se polynenasycené mastná kyselina oxiduje, je zde posun dvojné vazby vedoucí ke tvorbě konjugovaných dienů, které absorbují při 234 nm. úsek iniciační a propagační křivky (lag fáze) je považován za měření oxidovatelnosti LDL. Nad lag fází je LDL odolnější k oxidaci. Typicky se 100 pg lidského LDL inkubuje s 5 μΜ H2O2 a následuje zvýšení absorpce 234 nm.
Po inkubační periodě je pozorováno, že PDTC inhibuje oxidaci LDL u HRP způsobem, který je závislý na koncentraci.
Příklad 17
Vliv PDTC na cytokinem indukovánu tvorbu ox-PUFA
Obrázek 21 e graf vlivu PDTC na cytokinem indukovanou tvorbu ox-PUFA v lidských endotheliálních buňkách aorty. Jak je uvedeno, jak TNF-α tak IL-1B působí oxidaci linoleové kyseliny na ox-1inoleovou kyselinu. Oxidace je významně bráněno u PDTC.
2. Modifikace syntézy a metabolismu PUFA a ox-PUFA
Inhibice exprese VCAM-1 může být provedena přes modifikaci metabolismu PUFA na ox-PUFA. Například je známo mnoho enzymů, které oxidují nenansycené materiály, zahrnujících peroxidasy, 1ipoxygenasy, cyklooxygenasy a cytochrom P450. Inhibice těchto enzymů může být prevencí oxidace PUFA in vivo. PUFA mohou také být oxidovány na kovu závislými neenzymatickými materiály.
IV. Způsob modifikace exprese redox-senzitivních genů
V alternativním provedení je poskytnut způsob suprese exprese redox-senzitivních genů nebo aktivace genu, který je suprivován redox-senzitivní drahou, který zahrnuje podání účinného množství substance, která brání oxidaci oxidovaného signálu a typicky oxidaci polynenansycené mastné kyseliny. Reprezentativní redox-senzitivní geny, které jsou zahrnuty v prezentaci imunitní odpovědi zahrnují, ale nejsou tak omezeny, ty, které eprimují cytokiny zahrnuté v iniciaci imunitní odpovědi (např. IL-Ιβ), chemoatraktanty, které promotují migraci zánětlivých buněk do bodu poškození (např. MCP-1), růstové faktory (IL-6, trombin-receptor) a adhezní molekuly (např. VCAM-1 a E-selektin).
Podle tohoto popisu bude odborník v oboru schopen prohledat velké množství antioxidantů na jejich schopnost potlačit expresi redox-senzitivních genů nebo aktivovat gen, který je suprivován redox-senzitivní drahou. Všechna tato provedení jsou míněna jako spadající do rozsahu předloženého vynálezu.
Na základě výsledků tohoto screeningu mohou být identifikovány molekuly nukleové kyseliny, obsahující 5' regulační sekvence redox-senzitivních genů, které mohou být použity pro regulaci a inhibici genové exprese in vivo. Vektory, zahrnující jak plasmidové tak eukaryotické virální vektory, mohou být použity pro expresi určitého rekombinantního 5' přiléhajícího region-genového konstruktu v buňkách podle preferencí a hodnocení odborníkem v oboru (viz např. Sambrook a spol, kapitola 16). Dále bylo vyvinuto mnoho virálních a nevirálních vektorů, které umožňují zavedení nukleokyselinových sekvencí in vivo (viz např. Mulligan, 1993,
Science, 260, 926-932; US patent č. 4980286, US patent č. 4868116; zahrnuté zde jako odkaz. V poslední době byl vyvinut dodávací systém, ve kterém je nukleová kyselina enkapsulována v kationtových liposomech, která může být injektována intravenózně do savce. Tento systém byl použit pro zavedení DNA do buněk více tkání v dospělé myši, zahrnujících entothel a kostní dřeň )viz např. Zhu a spol., 1993 Science 261, 209-211; zahrnuto zde jako odkaz).
5' přiléhající sekvence redox-senzitivních genů mohou být použity pro inhibici exprese redox-senzitivních genů.
Například antisense RNA celé nebo části 5' přiléhající oblasti redox-senzitivního genu může být použita pro inhibici exprese genu in vivo. Expresní vektory, které mohou být použity ke generování antisense RNA vybrané DNA sekvence, která je exprimována v buňce (např. retrovirální expresní vektory) jsou již v oboru dostupné (viz např. US patent č. 4868116; US patent č. 4980286). V souladu s tím může být DNA, obsahující celou nebo část sekvence 5' přiléhající oblasti genu inzertována do vhodného expresního vektoru tak, že po pasážování do buňky transkripce inzertované DNA poskytne antisense RNA, která je komplementární k mRNA transkriptu genu normálně se nalézajícího v buňce.Tento antisense RNA transkript inzertované DNA může pak tvořit bázový pár s normálním mRNA transkriptem nacházejícím se v buňce a tím bránit mRNA aby byla translatována. Je samozřejmě nezbytné vybrat sekvence 5' přiéhající oblasti, které jsou po směru od míst transkripčního startu pro redox-senzitivní gen pro zajištěni toho, že antisense RNA obsahuje komplementární sekvence přítomné na mRNA. Antisense RNA může být generována také in vitro a pak být inzertována do buněk. Oligonukleotidy mohou být syntetizovány na automatickém syntetizátoru (např. MOdel 8700 automatizovaný syntetizátor Mi 11igen-Biosearch,
Burlington, MA nebo ABI Model 380B). Navíc antisense deoxyoligonukleotidy byly zjištěny jako účinné při inhibici genové transkripce a virální replikace (viz např. Zamecnik a spol., 1978, Proč. Nati.Acad.Sci. USA 75, 280-284; Zamecnik a spol., 1986 Proč.Nati. Acad.Sci., 83, 4143-4146; Wickstrom a spol., 1988, Proč. Nati. Acad.Sci. USA 85, 1028-1032; Crooke 1993 FASEB J., 7, 533-539. Navíc práce z poslední doby ukázaly, že zlepšení inhibice exprese genu antisense oligonukleotidy je možné, jestliže antisense oligonukleotidy obsahují modifikované nukleotidy (viz např. Offensperger aspol., 1993 EMBO J., 12, 1257-1262 (in vivo inhibice virální replikace kachní hepetitidy B a genové exprese antisense fosforothioát oligonukleotidy); Rosenberg a spol., PCT WO 93/01286 (syntéza sulfurothioátových oligonukleotidů); Agrawal a spol., 1988 Proč. Nati. Acad.Sci. USA 85, 7079-7083 (syntéza antisense oligonukleosidových fosforoamidátů a fosforothioátů pro inhibici replikace viru-1 lidské imunodeficience); Sarin a spol., 1989 Proč. Nat1.Acad.Sci. USA 85, 7448-7794 (syntéza antisense methylfosfonátových oligonukleotidů); Shaw a spol., 1991 Nucleic Acids Res 19, 747-750 (syntéza 3' exonukleasa-rezistentních oligonukleotidů, obsahujících 3' terminální fosforoamidátové modifikace); zahrnuté zde jako odkaz).
Sekvence 5' přiléhající oblasti redoc-senzitivního genu mohou být také použity v genové terapii trojným helixem (triplexem). Oligonukleotidy komplementární ke genovým promotorovým sekvencím jednoho z řetězců DNA byly zjištěny jako vázající promotor a regulátorové sekvence pro tvorbu lokálních trojných nukleokyselinových helixú, které blokují transkripci genu (viz např. 1989 Maher a spol., Science 245, 725-730; Orson a spol., 1991 Nucl.Acids Res. 19, 3435-3441; Postál a spol., 1991 Proč.Nati.Acad.Sci. USA 88, 8227-8231;
Cooney a spol., 1988 Science 241, 456-459; Young a spol., 1991 Proč.Nati.Acad Sci. USA 88, 10023-10026; Duval-Valentin a spol., 1992 Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 504-508; 1992 Blume a spol., Nucl.Acids Res. 20, 1777-1784; 1992 Grigoriev a spol., J.Biol.Chem. 267, 3389-3395.
V poslední době byly uvedeny jak teoretické výpočty tak empirické nálezy, které poskytují návod pro dezén oligonukleotidů pro použití ve tvorbě oligonukleotidově řízeného trojného helixu pro inhibicí genové exprese.
Například by oligonukleotidy měly být větší než 14 nukleotidů délky pro zajištění specifity cílové sekvence (viz např. Maher a spol., (1989); Grigiriev a spol., (1992). Také mnoho buněk lačně přijímá oligonukleotidy, které jsou menší než 50 nukleotidů v délce (viz např. Orson a spol., (1991); Holt a spol., 1988 Mol.Cel 1.Biol. 8, 963 - 973; Wickstrom a spol., 1988 Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 1028-1032). Pro snížení náchylnosti k intracelulární degradaci, například 3' exonukleasami, může být volný amin zaveden ke 3' terminální hydroxylové skupině oligonukleotidů bez ztráty sekvenční vazebné specifity (Orson a spol., 1991). Navíc se stabilnější triplexy jestliže jakékoliv cytosiny, které mohou být přítomny v oligonukelotidu jsou methylovány a také když je interkalační činidlo jako je akridin, kovalentně připojeno k 5' terminálnímu fosfátu (např. přes pentamethylenový můstek); opět bez ztráty sekvenční specifity (Maher a spol., (1989); Grigoriev a spol. (1992).
Metody pro produkci nebo syntézu oligonukleotidů jsou v oboru dobře známé. Takové metody mohou zahrnovat metody od strandardního enzymatického štěpení, následovaného izolací nukleotidového fragmentu (viz např. Sambrook a spol., kapitola 5, 6) ke spíše syntetickým metodám, například metodu kyanoethylfosforamiditovou za použití Milligen nebo Beckman System lPlus DNA syntetizátoru (viz také Ikuta a spol. v Ann. Rev. Biochem. 1984 53, 323-356 (fosforotriesterová a fosfit-triesterová metoda); Narang a spol., v Methods Enzymol., 65, 610-620 (1980) (fosfortriesterová metoda). Podle toho DNA serkvence 5' přiléhající oblasti redox-senzitivního genu zde popsaného mohou být použity k vytvoření a konstruktu oligonukleotidů, zahrnujícíh DNA sekvenci, obsahující alespoň 15 po sobě jdoucích nukleotidů, s nebo bez bázových modifikací nebo derivátů interkalačnich činidel, pro použití ve tvorbě trojných helixů specificky v 5' přiléhající oblasti redox-senzitivního genu za účelem inhibice exprese genu.
V některých případech může být výhodné inzertovat enhancery nebo násobné kopie reglačních sekvencí do expresního systému pro usnadnění screeningu metod a činidel pro manipulaci a expresi.
V. Modely a vyšetření
Jsou také poskytnuta vyšetřeni chorob zprostředkovaných VCAM-1 nebo redox-senzitivnimi geny, která zahrnují kvantifikaci zástupců markerůchoroby. V jednom provedení se hodnotí hladina oxidovaných polynenasycených mastných kyselin nebo jiných vhodných markérů, ve tkání nebo v krvi, například se hostitel hodnotí pomocí hodnocení oxidačního prostředí v hostiteli a hostitelovy náchylnosti k VCAM-1 nebo redox-senzitivním genem zprostředkované choroby.
V jiném provedení se kvantifikuje hladina cirkulujícího nebo buněčně-povrchového VCAM-1 nebo jiného vhodného markéru a vliv podání vhodného antioxidantů na hladinu.
V ještě další eseji se hodnotí citlivost hostitelových endotheliálních buněk k polynenasyceným mastným kyselinám nebo jiným oxidovaným protějškům. Toto může být například provedeno podnícením hostitele s PUFA nebo ox-PUFA a porovnáním výsledné koncentrace buněčně povrchového nebo cirkulujícího VCAM-1 nebo jiných zástupců markérů k populační normě.
V jiném provedení mohou být poskytnuty in vivo modely atherosklerozy nebo jiné srdeční nebo zánětlivé choroby, která je zprostředkována VCAM-1 podáním hostitelskému živočichovi účinného množství PUFA nebo oxidované polynenasycené mastné kyseliny pro vyvolání choroby. Tito živočiši mohou být použity ve klinickém výzkumu pro další pochopení chorob.
V ještě dalším provedení vynálezu mohou být sloučeniny hodnoceny na svoji schopnost léčit choroby zprostředkované VCAM-1 na bázi jejich schopnosti inhibovat oxidaci polynenasycené mastné kyseliny nebo interakce PUFA nebo ox-PUFA s proteinovým cílem.
Toto může být například uskutečněno podnícením hostitele, například člověka nebo zvířete jako je myš, k vyšší hladině PUFA ebo ox-PUFA a pak stanovením terapeutické účinnosti testované sloučeniny založené na její schopnosti snižovat koncentraci cirkulujícího nebo buněčně povrchového VCAM-1. Alternativně in vitro vyšetření může být použito, které je založeno na schopnosti testované sloučeniny bránit oxidaci PUFA, nebo interakci PUFA nebo ox-PUFA s proteinovým cílem za přítomnosti oxidační substance jako je kov, například měd, nebo enzymu jako je peroxidasa, 1ipoxygenasa, cyklooxygenasy nebo cytochrom P450.
V dalším provedení jsou vaskulární endotheliální buňky vystaveny TNF-α nebo VCAM-1 indukujícímu materiálu po správnou dobu a pak rozbity jakýmikoliv vhodnými prostředky, například sonifikací nebo mrazením-táním. Cytosolické a membránové kompartmenty se izolují. Radioaktivně značená PUFA se přidá k definovaným množstvím kompartmentů. Hodnotí se schopnost kapaliny konvertovat PUFA na ox-PUFA za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny. Intaktní buňky mohou být použity místo buněčných zlomků.
III. Farmaceutické kompozice
Lidé, koně, psi, hovězí dobytek a jiná zvířata a zejména savci, postižení kardiovaskulárními chorobami a jinými zánětlivými stavy zprostředkovanými VCAM-1 nebo redox-senzitivními geny mohou být léčeni podáním účinného množství sloučeniny pacientovi, které způsobí odstranění, snížení koncentrace nebo prevenci tvorby oxidovaných polynenasycených mastných sloučenin, zahrnujících, ale neomezujících se na kyselinu linoleovou (Cie delta9·12), linolenovou (Cie delta6·9·12), arachidonovou (C20 delta5·8·11·14) a eikosatrienovou (C20 delta8·11·14); jiný oxidační signál; nebo jinou aktivní sloučeninu nebo jejich farmaceuticky přijatelné deriváty nebo soli ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle. Aktivní materiály mohou být podávány jakýmkoliv vhodným způsobem, například orálně, parenterálně, intravenozně, intradermálně, subkutánně nebo topicky.
Jak je zde použito výraz farmaceuticky přijatelné soli nebo komplexy označuje soli nebo komplexy, které si zachovávají požadovanou biologickou aktivitu výše uvedených sloučenin a vykazují minimálně nežádoucí toxikologické účinky. Neomezující příklady takových solí jsou (a) adiční sole s kyselinami vytvořené s anorganickými kyselinami (například kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou dusičnou a podobně) a soli vytvořené s organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina jantarová, kyselina jablečná, kyselina askorbová, kyselina benzoová, tannin, kyselina pamoová, kyselina alginová, kyselina polyglutamová, kyselina naftalensulfonová, kyselina naftalendisulfonová a kyselina polygalakturonová; (b) adiční sole s bázemi vytvořené s polyvalentními kovovými kationty jako je zinek, vápník, vismut, baryum, hořčík, hliník, měd, kobalt, nikl, kadmium, sodík, draslík a podobně, nebo s organickým kationtem vytvořeným s
Ν,Ν-dibenzylethylen-diaminem, G-glukosaminem, amoniem, tetraethylamoniem nebo ethylendiaminem; nebo (c) kombinace (a) a (b); např.tanátová sůl zinku a podobně.
Aktivní sloučenina nebo směs sloučenin jsou podávány jakýmkoliv vhodným způsobem, zahrnujícím, ale neomezujícím se na, orální a intravenózní. Obecné rozmezí dávky pro jakýkoliv z výše uvedených stavů bude od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti s dávkovým programem v rozmezí jednou denně až několikrát denně. Preferované denní dávky jsou mezi přibližně 1 a 3000 mg/pacienta/den, výhodněji mezi přibližně 5 a 500 mg/pacienta/den a ještě výhodněji mezi přibližně 25 a 500 mg/pacient/den.
Aktivní složka by měla být podávána pro dosažení píkových plasmových koncentrací aktivní sloučeniny asi 0,1 až 100 μΜ, výhodně asi 1 až 10 μΜ. Toho může být dosaženo například při intravenózní injekci roztoku nebo formulace aktivní složky, popřípadě v salinickém nebo vodném mediu nebo podání jako bolusu aktivní složky.
Sloučeniny mohou být také podány přímo do vaskulárni stěny za použití perfuzního balónkového katetru nebo in lieu koronární nebo jinou arteriální angiopatií. Jako příklad, podávají se 2 až 5 ml fyziologicky přijatelného roztoku, který obsahuje přibližně 1 až 500 μΜ sloučeniny nebo směsi sloučenin při tlaku 1 až 5 atmosfér. Potom, během průběhu dalších šesti měsíců během periody maximaálního rizika restenozy, jsou aktivní sloučeniny podávány jinými vhodnými cestami a dávkovými režimy.
Relativně krátkodobé ošetření s aktivními sloučeninami se používá k vyvolání smrštění chorobných lézí koronární arterie, která nemůže být léčena ani angioplastií ani chirurgicky. Neomezující příklad krátkodobého léčení je dva až šest měsíců dávkování v rozmezí od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti podávaných v periodách od jednou denně každý další den až třikrát denně.
Dlouhodobější léčení může být použito pro prevenci vývoje lézí u vysocerizikových pacientů. Dlouhodobé léčení můža zahrnovat několik let s dávkovým rozmezím od 0,5 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti podávaných v intervalech od jednou denně každý další den do třikrát denně.
Aktivní sloučeniny mohou být také podávány po periodu bezprostředně před a pokoronární angioplastií jako prostředek pro redukci nebo odstraněni abnormální proliferativní a zánětlivé odezvy, která často vede ke klinicky významným restenozám.
Aktivní sloučeniny mohou být podávány ve spojení s jinými léčivy používanými při léčení kardiovaskulární choroby, zahrnujících lipidy snižující činidla jako je probucol a kyselina nikotinová; inhibitory agregace destiček jako je aspirin; antitrombotická činidla jako je coumadin; blokátory vápníkových kanálků jako je varapamil, diltiazem a nifedipin; inhibitory angiotenzin konvertujicího enzymu (ACE) jako je captopril a enalopril, β-blokátory jako je propanalol, terbutanol a labetalol, nesteroidní proti zánět 1 ivá činidla jako je ibuprofen, indomethacin, fenoprofen, kyselina mefenamová, kyselina flufenamová, sulindac nebo kortikosteroidy.
Koncentrace aktivní sloučeniny v léčivé kompozici bude záviswet na absorpčních, distribučních, inaktivačních a sekrečních rychlostech léčiva jakož i jiných faktorech známých odborníkům v oboru. Je třeba uvést, že se hodnoty dávek také mohou měnit podle obtížnosti stavu, který je zmírňován. Toto je třeby chápat tak, že pro jakýkoliv jednotlivý subjekt by mohl být upraven specifický dávkový režim v průběhu doby podle individuální potřeby a profesionálního hodnocení odborníka pro podávání kompozic a že koncentrační rozmezí zde uváděná jsou pouhými příklady a nejsou míněna jako omezení praktického provedení nárokované kompozice, účinná složka může být podána jednou nebo může být rozdělena do více menších dávek pro podání v měnících se časových intervalech.
Orální kompozice bude obvykle zahrnovat inertní ředidlo nebo poživatelný nosič. Může být uzavřena v želatinových kapslích nebo stlačena do tablet. Pro účel orálního terapeutického podání může být aktivní sloučenina inkorporována s přísadami a použita ve formě tablet, trochejů nebo kapslí. Farmaceuticky přijatelná pojivová činidla a/nebo pomocné látky mohou tvořit část kompozice.
Tablety, pilule, kapsle, tricheje a podobně mohou obsahovat jakoukoliv z následujících přísad nebo sloučenin podobného charakteru: pojivo jako je mikrokrystalická celulóza, guma tragant nebo želatina; přísadu jako je škrob nebo laktóza, dezintegrační činidlo jako je alginová kyselina, Primogel, nebo kukuřičný škrob; lubrikant jako je stearát hořečnatý nebo Sterotes; kluzné činidlo jako je koloidní oxid křemičitý; sladící činidlo jako je sacharóza nebo sacharin nebo ochucovací činidlo jako je peprmint, methylsalicylát nebo pomerančová příchuť. Jestliže je dávkovou jednotkovou formou kapsle, může tato obsahovat, navíc k materiálu výše uvedeného typu, kapalný nosič jako je mastný olej. Navíc mohou dávkové jednotkové formy obsahovat různé jiné materiály, které modifikují fyzickou formu dávkové jednoty, například cukrové, šelakové potahy, nebo jiná enterická činidla.
Aktivní sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo derivát mohou být podávány jako složka elixíru, suspenze, sirupu, oblatky, žvýkací gumy nebo podobně. Sirup může obsahovat navíc k účinným látkám, sacharozu jako sladící činidlo a určité ochranné látky, barviva a barvy a příchutě.
Aktivní sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo derivát mohou být také podávány s jinými aktivními materiály, které nezhoršují požadované působení, jako jsou antibiotika, antifungální, protizánětlivé nebo antivirální sloučeniny.
Roztoky nebo suspenze použité v parenterálním, intradermálním, subkutánním nebo topickém podání mohou zahrnovat následující složky: sterilní ředidlo jako je voda pro injekce, salinický roztok, ztužené oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla; antibakteriální činidla jako je benzylalkohol nebo methylparabeny; antioxidanty jako je kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelatační činidla jako je kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro úpravu tonicity jako je chlorid sodný nebo dextroza. Parenterální přípravek může být uzavřen v ampulích, jednorázových stříkačkách nebo vícedávkových lahvičkách vyrobených ze skla nebo plastů.
Vhodná vehikula pro topickou aplikaci jsou známá a zahrnují lotiony, suspenze, masti, krémy, gely, tinktury, spreje, prášky, pasty, pomalu uvolňující transdermální náplasti, aerosoly pro astma a čípky pro aplikaci na rektální, vaginální, nasální nebo orální mukozu.
Zahušťovací činidla, změkčovadla a stabilizátory mohou být použity pro přípravu topických kompozic. Příklady zahušťovacích činidel zahrnuji petrolátum, včelí vosk, xanthanovou gumu nebo polyethylenglykol, zvlhčovadla jako je sorbitol, změkčovadla jako je minerální olej, lanolin a jeho deriváty, nebo squalen. Mnoho roztoků a mastí je komerčně dostupných.
Přírodní nebo umělé příchutě nebo sladidla mohou být přidány pro zvýšení chutě topických přípravků, aplikovaných pro lokální účinek na mukosální povrchy. Inetrní barvy nebo barviva mohou být přidány, zejména v případě přípravků formulovaných pro aplikaci na orální mukosální povrchy.
Aktivní sloučeniny mohou být připraveny s nosiči, které chrání sloučeninu proti rychlému uvolnění, jako jsou formulace s řízeným uvolňováním, zahrnující implanty a mikroenkapsulované dodávací systémy. Biodegradabilni polymery mohou být použity jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Mnoho metod pro přípravu takových formulací je patentováno nebo obecně známo odborníkům v oboru.
Při intravenozním podání jsou preferované nosiče fyziologický salický roztok a fosfátem pufrovaný sdinický roztok (PBS).
Aktivní sloučenina může být také podávána transdermální náplastí. Metody přípravy transdermálních náplastí jsou známy odborníkům v oboru. Viz například Brown L. a Langer R. , Transdermal Delivery of Drugs, Annual Review of Medicine, 39:221-229 (1988), zahrnuto zde jako odkaz.
V jiném provedení jsou aktivní sloučeniny připraveny s nosiči, které budou chránit sloučeninu proti rychlému uvolnění z těla, jako jsou formulace s řízeným uvolňováním, zahrnující implanty a mikroenkapsulované dodávací systémy. Mohou být použity biodegradabilni, biokompatibilni polymery jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselinu polyglykolovou, kolagen, polyorthoestery a kyselinu polymléčnou. Způsoby přípravy takových formulací budou zřejmé odborníkům v oboru. Materiály mohou být také získány komerčně od Alza Corporation a Nova Pharmaceuticals, lne.
Liposomální suspenze mohou také být farmaceuticky přijatelnými nosiči. Tyto mohou být připraveny metodami známými odborníkům v oboru, například jak jsou popsány v US patentu č. 4522811 (který je zde zahrnut jako odkaz v celém svém rozsahu). Například mohou být připraveny liposomové formulace rozpuštěním vhodného lipidu(ů) (jako je stearoylfosfatidy1ethanolamin, stearoylfosfátidylcholin, arachadoylfosfatidylcholin a cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se pak odpaří, a zanechá tenký film sušeného lipidu na povrchu kontejnerz. Vodný roztok aktivní sloučeniny nebo jejího monofosfátového, difosfátového a/rtebo trifosfátového derivátu se pak zavede do kontejneru. Kontejner se pak zamne v ruce pro uvolnění lipidového materiálu ze stran kontejneru a dispergaci lipidových agregátů, čímž se vytvoří liposomální suspenze.
Modifikace a variace předloženého vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru z předchozího podrobného popisu vynálezu. Takové modifikace a variace jsou považovány za spadající do rozsahu připojených nároků.

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenansycené mastné kyseliny při výrobě léčiva k potlačování exprese VCAM-1.
  2. 2. Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenansycené mastné kyseliny při výrobě léčiva pro potlačování exprese redox-senzitivního genu.
  3. 3. Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenansycené mastné kyseliny při výrobě léčiva pro aktivaci genu, který je potlačován oxidací polynenasycené mastné kyseliny.
  4. 4. Použití látky, která brání interakci mezi nenasycenou mastnou kyselinou a proteinem při výrobě léčiva, které zprostředkuje expresi VCAM-1 pro potlačení exprese VCAM-1.
  5. 5. Použití látky podle nároku 2 nebo 3, kde gen je vybrán ze skupiny, zahrnující ty, které exprimuji cytokiny působící iniciaci imunitní odpovědi, chemoatraktanty, které způsobují migraci zánětlivých buněk k místu poranění, růstové faktory a adhezní molekuly.
  6. 6. Použití látky podle nároku 2 nebo 3, při kterém gen je vybrán ze skupiny sestávající z MCP-I, IL-6 a receptoru thrombinu.
  7. 7. Použití látky podle nároků 1 až 6, při kterém polynenasycená kyselina je vybrána ze skupiny, zahrnující oxidovanou linoleovou, linolenovou, arachidonovou a eicosatrienovou kyselinu.
    ·· ·»··
  8. 8. Použití látky podle nároků 1 až 7 nároků 1 až 4, přičemž látkou je sloučenina vzorce
    ASC(S)B v němž A je vodík nebo farmaceuticky přijatelný kationt a
    B je NR2R3, kde R2 a R3 jsou nezávisle -(CHOH)nCH2OH, kde n je 0, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, -(CH2)nCO2A, -(CH2)nCO2R4 kde R4 je alkyl, alkenyl, alkinyl, alkaryl, aralkyl, hydroxy(C-L.g)alkyl, a dále R2 a R3 mohou být C1_10alkyl, nebo spolu tvořit můstek vzorce “(CH2)m- v kterém m je 3 až 6.
  9. 9. Použití látky podle nároků 1 až 7, kde látkou je pyrrolidindithiokarbamát nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
  10. 10. Způsob in vitro předpovězení nebo hodnocení poruch zprostředkovaných VCAM-1 in vivo, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kvantifikaci hladiny oxidované polynenasycené mastné kyseliny ve tkáni nebo v krvi s použitím zkoušky in vitro.
  11. 11. Způsob in vitro předpovězení nebo hodnocení chorob, zprostředkovaných redox-senzitivním genem in vivo, vyznačující se tím, že zahrnuje kvantifikaci hladiny oxidované polynenasycené mastné kyseliny ve tkáni nebo krvi s použitím zkoušky in vitro.
  12. 12. Způsob in vitro předpovězení nebo hodnocení poruch zprostředkovaných VCAM-1 in vivo, vyznačuj ící se t í m , že zahrnuje kvantifikaci veličiny, vyjadřující hladinu oxidované polynenasycené mastné kyseliny ve tkáni nebo krvi s použitím zkoušky in vitro.
  13. 13. Způsob in vitro předpovězení nebo hodnocení • 9 ·· ···· • · * • ♦ • · • · · ···· *·
    99 ·· • · · ·
    9 9 9·
    99 9 9 ·
    9 9 9
    99 99 chorob, zprostředkovaných redox-senzitivním genem in vivo, vyznačující se tím, že zahrnuje kvantifikaci buněčného znaku, vyjadřujícího hladinu oxidované polynenasycené mastné kyseliny ve tkáni nebo krvi s použitím zkoušky in vitro.
  14. 14. Způsob in vitro hodnocení citlivosti hostitelových vaskulárních endotheliálních buněk vůči polynenasyceným mastným kyselinám nebo jejich oxidovaným protějškům, vyznačující se tím, že zahrnuje provedení imunologického testu hostitele s PUFA nebo ox-PUFA a porovnání výsledné koncentrace buněčně povrchového nebo oběhového VCAM-1 nebo jiného příslušného buněčného znaku s populační normou.
  15. 15. Způsob podle nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že příslušným buněčným znakem je oběhový nebo buněčně povrchový VCAM-1.
  16. 16. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že příslušným buněčným znakem je znak vabraný ze skupiny sestávající z IL-Ιβ, MCP-1 a IL-6.
  17. 17. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že příslušným znakem je cytokinin, který vyvolává imunitní odpověď.
  18. 18. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že příslušným znakem je chemoatraktant, který způsobují migraci zánětlivých buněk k místu poranění.
  19. 19. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že příslušným znakem je růstový faktor.
    ·· ···· «
    ··♦* ·· ·· • · « « • · ·· ··· · <
    • * 1 ·· ··
    20. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznaču- jící s e tím, že příslušným znakem je adhezní molekula. 21. Způsob podle nároků 10 až 12, vyznaču-
    jící se tím, že příslušným znakem je thrombinový receptor.
  20. 22. Způsob in vitro vyhledávání sloučenin, které jsou schopné léčit choroby zprostředkované VCAM-1, vyznačující se tím, že zahrnuje hodnocení schopnosti sloučenina inhibovat oxidaci polynenasycené mastné kyseliny.
  21. 23. Způsob in vitro vyhledávání sloučenin, které jsou schopné léčit choroby zprostředkované VCAM-1, vyznačující se tím, že zahrnuje hodnocení schopnosti sloučenina inhibovat oxidaci interakci polynenasycené mastné kyseliny nebo oxidované polynenasycené mastné kyseliny s proteinovým cílem.
CZ963308A 1994-05-10 1995-05-10 Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenasycené mastné kyseliny a způsoby s tímto použitím spojené CZ330896A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24085894A 1994-05-10 1994-05-10
US08/317,399 US5807884A (en) 1992-10-30 1994-10-04 Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ330896A3 true CZ330896A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=26933783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ963308A CZ330896A3 (cs) 1994-05-10 1995-05-10 Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenasycené mastné kyseliny a způsoby s tímto použitím spojené

Country Status (17)

Country Link
US (6) US5807884A (cs)
EP (1) EP0759752A4 (cs)
JP (1) JP3120091B2 (cs)
KR (1) KR100394157B1 (cs)
CN (1) CN1152869A (cs)
BG (1) BG101030A (cs)
BR (1) BR9507716A (cs)
CA (1) CA2189336A1 (cs)
CZ (1) CZ330896A3 (cs)
GE (1) GEP20012409B (cs)
HU (1) HUT76728A (cs)
MX (1) MX9605450A (cs)
NO (1) NO964742D0 (cs)
NZ (1) NZ287214A (cs)
PL (2) PL184466B1 (cs)
SK (1) SK136496A3 (cs)
WO (1) WO1995030415A1 (cs)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5807884A (en) * 1992-10-30 1998-09-15 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5380747A (en) * 1992-10-30 1995-01-10 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5821260A (en) * 1992-10-30 1998-10-13 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
AUPM906594A0 (en) * 1994-10-26 1994-11-17 Peptide Technology Limited Synthetic polyunsaturated fatty acid analogues
US5571523A (en) * 1995-03-09 1996-11-05 President And Fellows Of Harvard College Antioxidant-induced apoptosis in vascular smooth muscle cells
US5741815A (en) * 1995-06-02 1998-04-21 Lai; Ching-San Methods for in vivo reduction of nitric oxide levels and compositions useful therefor
US5792787A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
JP2000500879A (ja) * 1996-09-20 2000-01-25 アセロジエニクス・インコーポレイテツド 炎症性疾患の診断及びメディエータ
JP2001505906A (ja) * 1996-12-10 2001-05-08 ハダジット メディカル リサーチ サービシズ アンド ディベラップメント カンパニー リミテッド 細胞の分化を誘導する血清由来因子およびその医薬的使用
GB2321455A (en) 1997-01-24 1998-07-29 Norsk Hydro As Lipophilic derivatives of biologically active compounds
US6670398B2 (en) * 1997-05-14 2003-12-30 Atherogenics, Inc. Compounds and methods for treating transplant rejection
EA009987B1 (ru) * 1997-05-14 2008-04-28 Атеродженикс, Инк. Производные пробукола для лечения заболеваний, опосредованных vcam-1
US6852878B2 (en) 1998-05-14 2005-02-08 Atherogenics, Inc. Thioketals and thioethers for inhibiting the expression of VCAM-1
EP1695959A1 (en) * 1997-05-14 2006-08-30 Atherogenics, Inc. Compouds and methods for the inhibition of the expression of VCAM-1
EA200000087A1 (ru) * 1997-07-01 2000-08-28 Атеродженикс, Инк. Повышение эффективности терапии гиперпролиферативных состояний с помощью антиоксиданта
US6989435B2 (en) 1997-09-11 2006-01-24 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US7067117B1 (en) 1997-09-11 2006-06-27 Cambridge University Technical Services, Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
IL122891A0 (en) 1998-01-11 1998-08-16 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising a thiocarbamate
IL122892A0 (en) * 1998-01-11 1998-08-16 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising a thiocarbamate
CA2658200A1 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Mgi Gp, Inc. Naaladase inhibitors useful as pharmaceutical compounds and compositions
DE69927502T2 (de) * 1998-07-06 2006-07-06 Mgi Gp, Inc. (N.D.Ges.D. Staates Delaware) Naaladase-hemmer anwendbar als pharmazeutische verbindungen und zusammensetzungen
US6706759B1 (en) 1998-09-08 2004-03-16 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using dithiocarbamate derivatives
US7816403B2 (en) 1998-09-08 2010-10-19 University Of Utah Research Foundation Method of inhibiting ATF/CREB and cancer cell growth and pharmaceutical compositions for same
US6548540B2 (en) 1998-09-08 2003-04-15 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using dithiocarbamate derivatives
US6589987B2 (en) 1998-09-08 2003-07-08 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using tetraethyl thiuram disulfide
US20050197283A1 (en) * 1998-10-04 2005-09-08 Vascular Biogenics Ltd. Compositions containing beta 2-glycoprotein I for the prevention and/or treatment of vascular disease
IL126447A (en) * 1998-10-04 2004-09-27 Vascular Biogenics Ltd An immune preparation that confers tolerance in oral administration and its use in the prevention and / or treatment of atherosclerosis
US6887712B1 (en) 1998-11-09 2005-05-03 Atherogenics, Inc. Methods and compositions to lower plasma cholesterol levels
US6372187B1 (en) 1998-12-07 2002-04-16 Mcdermott Technology, Inc. Alkaline sorbent injection for mercury control
US7238711B1 (en) * 1999-03-17 2007-07-03 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
EP1153010A1 (en) 1999-02-08 2001-11-14 Checkpoint Genetics, Inc. $i(N)-SUBSTITUTED AMINO ACIDS, ANTIOXIDANT PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND METHODS USING SAME
US6284199B1 (en) * 1999-03-31 2001-09-04 Mcdermott Technology, Inc. Apparatus for control of mercury
US6855859B2 (en) * 1999-03-31 2005-02-15 The Babcock & Wilcox Company Method for controlling elemental mercury emissions
US6734192B1 (en) 1999-08-23 2004-05-11 Mp-1 Inc. Treatment of viral infections
US6710086B1 (en) 2000-02-25 2004-03-23 Medinox, Inc. Protected forms of pharmacologically active agents and uses therefor
US6747061B2 (en) 2000-03-21 2004-06-08 Atherogenics, Inc. N-substituted dithiocarbamates for the treatment of biological disorders
WO2001077072A2 (en) 2000-04-11 2001-10-18 Atherogenics, Inc. Compounds and methods to increase plasma hdl cholesterol levels and improve hdl functionality
JP2003531149A (ja) * 2000-04-13 2003-10-21 ザ・ロツクフエラー・ユニバーシテイ 抗体由来の免疫応答の増強
US6545007B2 (en) 2000-11-17 2003-04-08 Idenix (Cayman) Limited Methods for inhibiting the transmission of HIV using topically applied substituted 6-benzyl-4-oxopyrimidines
PL366009A1 (en) * 2000-10-02 2005-01-24 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of inflammatory diseases
CA2429817C (en) 2000-11-24 2013-02-12 Vascular Biogenics Ltd. Methods employing and compositions containing defined oxidized phospholipids for prevention and treatment of atherosclerosis
NO20006008L (no) * 2000-11-28 2002-05-29 Thia Medica As Fettsyreanaloger for behandling av inflammatoriske og autoimmune sykdommer
HUP0600450A2 (en) * 2000-12-29 2006-09-28 Reddy Us Therapeutics Detection of compounds that modulate inflammatory responses
AU2002249893B2 (en) 2001-01-02 2007-05-24 The Cleveland Clinic Foundation Myeloperoxidase, a risk indicator for cardiovascular disease
US6596708B1 (en) 2001-09-07 2003-07-22 Advanced Medical Instruments Composition for the treatment and prevention of endothelial dysfunction
US20040116350A1 (en) * 2001-09-17 2004-06-17 Paul Wentworth Jr Methods and compositions relating to hydrogen peroxide and superoxide production by antibodies
US20040157280A1 (en) * 2001-09-17 2004-08-12 Paul Wentworth Antibody mediated ozone generation
US20050129680A1 (en) * 2001-09-17 2005-06-16 Paul Wentworth Antimicrobial activity of antibodies
WO2003053368A2 (en) 2001-12-19 2003-07-03 Atherogenics, Inc. Chalcone derivatives and their use to treat diseases
US20030147958A1 (en) * 2002-01-29 2003-08-07 Cheol-Hee Ahn Biodegradable multi-block copolymers of poly(amino acid)s and poly(ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
CA2505923A1 (en) * 2002-11-14 2004-05-27 Novartis Ag Antibody-or neutrophil-mediated ozone generation
US8017651B2 (en) * 2002-11-22 2011-09-13 Bionexus, Ltd. Compositions and methods for the treatment of HIV-associated fat maldistribution and hyperlipidemia
US20040181075A1 (en) * 2002-12-19 2004-09-16 Weingarten M. David Process of making chalcone derivatives
US20040265323A1 (en) * 2003-05-16 2004-12-30 Mccormick Beth A. Compositions comprising pathogen elicited epithelial chemoattractant (eicosanoid hepoxilin A3), inhibitors thereof and methods of use thereof
WO2004108094A2 (en) * 2003-06-06 2004-12-16 Atherogenics, Inc. Sulfonamide-substituted chalcone derivatives and their use to treat diseases
US20060025481A1 (en) * 2004-02-09 2006-02-02 Strange Matthew L Process for preparation of probucol derivatives and polymorphic forms thereof
US7294736B2 (en) * 2004-04-09 2007-11-13 Cambrex Charles City, Inc. Process for preparation of probucol derivatives
WO2005112914A2 (en) 2004-04-20 2005-12-01 Atherogenics, Inc. Phenolic antioxidants for the treatment of disorders including arthritis, asthma and coronary artery disease
US20060063828A1 (en) * 2004-06-28 2006-03-23 Weingarten M D 1,2-Bis-(substituted-phenyl)-2-propen-1-ones and pharmaceutical compositions thereof
JP2008520969A (ja) * 2004-11-15 2008-06-19 クアントミックス・リミテッド 代謝疾患の分析のための装置及び方法
US7345191B2 (en) * 2005-02-26 2008-03-18 Cambrex Charles City, Inc. Process for preparation of probucol derivatives
US8071545B2 (en) * 2005-03-15 2011-12-06 Lewis S. Coleman, Md, Inc. Therapies and compositions for controlling the stress mechanism and for stabilizing hemostasis in an organism
US7767710B2 (en) * 2005-05-25 2010-08-03 Calosyn Pharma, Inc. Method for treating osteoarthritis
US20060269579A1 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Musculoskeletal Research Llc Compositions for treating osteoarthritis
KR100823533B1 (ko) 2007-02-27 2008-04-30 바이오스펙트럼 주식회사 알파 비사볼올을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용조성물
US8252840B2 (en) * 2007-03-26 2012-08-28 Salutria Pharmaceuticals Llc Methods of derivatives of probucol for the treatment of type II diabetes
US20080280985A1 (en) * 2007-03-27 2008-11-13 Scott Robert A D Methods and Compositions Using Certain Phenolic Derivatives for the Treatment of Diabetes
US20090163440A1 (en) * 2007-09-26 2009-06-25 Waddell David D Ion-Channel Regulator Compositions and Methods of Using Same
US8709391B2 (en) * 2008-11-26 2014-04-29 Board Of Regents Of The University Of Texas System Family of pain producing substances and methods to produce novel analgesic drugs
CN102250045A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 复旦大学附属华山医院 抗结核分支杆菌的化合物及其应用
WO2012040656A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers to track response to scv-07
US9029342B2 (en) 2012-09-17 2015-05-12 Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions of matter that reduce pain, shock, and inflammation by blocking linoleic acid metabolites and uses thereof
EP4300103A3 (en) 2013-08-07 2024-02-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Atypical hemolytic uremic syndrome (ahus) biomarker proteins
WO2015071766A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Dignity Sciences Limited Pharmaceutically acceptable salts of polyunsaturated hydroxy fatty acids
US10905062B2 (en) * 2015-10-19 2021-02-02 General Mills, Inc. High protein oat species
RU2662316C1 (ru) * 2017-08-31 2018-07-25 Сергей Владимирович Кунгурцев Жидкофазная композиция с повышенным содержанием природных устойчивых к окислению омега-3 полинепредельных жирных кислот
US20210315851A1 (en) 2020-04-03 2021-10-14 Afimmune Limited Compositions comprising 15-hepe and methods of treating or preventing hematologic disorders, and/or related diseases

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3875170A (en) * 1971-05-25 1975-04-01 Banyu Pharma Co Ltd Pyridine bis (dithiocarbamate) derivatives
US4025527A (en) * 1973-07-13 1977-05-24 Smith Kline & French Laboratories Limited Certain thiazoles and oxazoles
GB1542840A (en) * 1975-02-03 1979-03-28 Smith Kline French Lab Heterocyclic dithiocarbamates and isothioureas
US4670471A (en) * 1981-11-03 1987-06-02 Clark Lealand L Treatment for inflammatory skin disease
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8421039D0 (en) * 1984-08-17 1984-09-19 Wyeth John & Brother Ltd Heterocyclic compounds
US4980286A (en) * 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
EP0228458B2 (en) * 1985-07-05 1997-10-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
EP0284879A3 (en) * 1987-03-17 1990-10-17 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting interleukin-1 release
US4870101A (en) * 1987-03-17 1989-09-26 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting interleukin-1 release
US5035878A (en) * 1988-09-12 1991-07-30 University Of Rochester Use of dithiocarbamates to counteract myelosuppression
US5166133A (en) * 1991-04-17 1992-11-24 Cetus Corporation Method for inhibing adhesion of white blood cells to endothelial cells
JPH07501204A (ja) * 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
FR2679452B1 (fr) * 1991-07-22 1993-11-12 Cis Bio International Produit radiopharmaceutique ayant notamment un tropisme cerebral, comportant un complexe nitruro d'un metal de transition, et son procede de preparation.
US5206264A (en) * 1991-11-04 1993-04-27 Cypros Pharmaceutical Corporation Use of disulfiram to prevent cardiovascular damage
US5306724A (en) * 1992-08-17 1994-04-26 Clintec Nutrition Company Method for preventing and treating atherosclerosis
US5807884A (en) * 1992-10-30 1998-09-15 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5380747A (en) * 1992-10-30 1995-01-10 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5792787A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases

Also Published As

Publication number Publication date
BG101030A (en) 1997-09-30
EP0759752A4 (en) 2001-08-08
NO964742L (no) 1996-11-08
HU9603041D0 (en) 1997-01-28
KR100394157B1 (ko) 2004-02-11
US5811449A (en) 1998-09-22
JP3120091B2 (ja) 2000-12-25
PL180874B1 (pl) 2001-04-30
US5846959A (en) 1998-12-08
NO964742D0 (no) 1996-11-08
US5773209A (en) 1998-06-30
PL184466B1 (pl) 2002-11-29
BR9507716A (pt) 1997-09-23
JPH10500111A (ja) 1998-01-06
WO1995030415A1 (en) 1995-11-16
CA2189336A1 (en) 1995-11-16
SK136496A3 (en) 1999-01-11
PL317193A1 (en) 1997-03-17
EP0759752A1 (en) 1997-03-05
US5773231A (en) 1998-06-30
CN1152869A (zh) 1997-06-25
US5807884A (en) 1998-09-15
US5750351A (en) 1998-05-12
HUT76728A (en) 1997-11-28
NZ287214A (en) 2001-05-25
MX9605450A (es) 1997-12-31
GEP20012409B (en) 2001-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ330896A3 (cs) Použití látky, která brání nebo minimalizuje oxidaci polynenasycené mastné kyseliny a způsoby s tímto použitím spojené
AU692426B2 (en) Dithiocarbamates for the treatment of atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5783596A (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
CA2294247C (en) Antioxidant enhancement of therapy for hyperproliferative conditions
US20180064688A1 (en) Compositions and methods for treatment of prostate cancer
Nakamura et al. Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, M62812, suppresses endothelial cell and leukocyte activation and prevents lethal septic shock in mice
EA027810B1 (ru) Гетероциклические карбоксамиды для лечения вирусных заболеваний
RU2235541C2 (ru) Лечение атеросклероза и других сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний
AU709939B2 (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
AU733198B2 (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
CN115917324A (zh) 治疗癌症的方法
EP4051257A1 (en) Combination therapy having antioxydant properties