PL184114B1 - Środek farmaceutyczny do inhibicji aktywności czynnika tkankowego - Google Patents

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny do inhibicji aktywnosci czynnika tkankowego, inhibicji odkladania plytek, inhibicji naczyniowego nawrotu zwezenia, leczenia ostrego zamykania naczynia wiencowego, zawierajacy czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nos- nik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera zmodyfikowany czynnik VII o obni- zonej zdolnosci do aktywacji X lub IX czynnika osocza, w którym co najmniej jeden aminokwas lezacy w centrum katalitycznym okreslanym przez Ser 344, Asp 242, His 193, zostal zmodyfikowany, przy czym czynnik aktywny zawarty jest w ilosci dawkowej od 50 µ g do 500 mg. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny do inhibicji aktywności czynnika tkankowego, inhibicji odkładania płytek, inhibicji naczyniowego nawrotu zwężenia, leczenia ostrego zamykania naczynia wieńcowego, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera zmodyfikowany czynnik VII o obniżonej zdolności do aktywacji X lub IX czynnika osocza, w którym co najmniej jeden aminokwas leżący w centrum katalitycznym określanym przez Ser 344, Asp 242, His 193, został zmodyfikowany, przy czym czynnik aktywny zawarty jest w ilości dawkowej od 50 pg do 500 mg.

Środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zmodyfikowany aminokwas jest derywatyzowany inhibitorem proteazy serynowej będącym związkiem fosforoorganicznym, fluorkiem sulfonylu, chlorowcometyloketonem peptydu luz azapeptydem, korzystnie wybranym spośród dansylo-Phe-Pro-Arg chlorometyloketonu, dansylo-Glu-Gly-Arg chlorometyloketonu, dansylo-Phe-Phe-Arg chlorometyloketonu i Phe-Phe-Arg chlorometyloketonu.

Środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, ze centrum katalityczne określane przez Ser 344, Asp 242, His 193, zawiera substancję, insercję, lub delecję co najmniej jednego aminokwasu.

Kompozycje obejmują zmodyfikowany czynnik VII, mające antykoagulacyjne właściwości. Zmodyfikowane kompozycje czynnika VII inhibitują także czynnik tkankowy. Sekwencja czynnika VII zawiera co najmniej jedną modyfikację aminokwasową, gdzie modyfikację dobiera się tak, aby znacząco zredukować zdolność aktywowanego czynnika VII do katalizy aktywacji czynników X lub IX osocza, a więc jest zdolny do inhibicji aktywności krzepnięcia. Nowy czynnik VII ma aktywne miejsce zmodyfikowane przez co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe, i w zmodyfikowanej formie jest w stanie wiązać czynnik tkankowy. Zmodyfikowane kompozycje czynnika VII są typowe w zasadniczo czystej postaci.

Kompozycje takie są szczególnie przydatne w sposobach leczenia pacjentów w postaci kompozycji farmaceutycznych, gdy można je podawać osobnikom cierpiącym na różne stany chorobowe w celu leczenia stanów związanych z koagulacją: Takie zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII, zdolne do wiązania czynnika tkankowego, lecz mające znacząco zmniejszoną zdolność katalitycznej aktywacji innych czynników w kaskadzie krzepnięcia, mogą mieć dłuższy czas półtrwania w osoczu, a więc odpowiednio dłuższy okres antykoagulacyjne j aktywności w porównaniu z innymi antykoagulantami. Pośród wskazań medycznych dla tych kompozycji są stany traktowane antykoagulantami, takie jak, np., głęboka żyłowa zakrzepica, zator tętnicy płucnej, udar, rozsiana wewnątrznaczyniowa koagulacja (DIC), odkładanie fibryny w płucach i nerkach związane z gram-ujemną endotoksemią, i zawał mięśnia sercowego. Kompozycje można stosować do inhibicji naczyniowego nawrotu zwężenia zachodzącego po mechanicznych naczyniowych uszkodzeniach, takich jak uszkodzenia spowodowane powietrzną angioplastyką, endarterektomią, redukującą aterektomią, umieszczeniem rurki, laserową terapią lub rotablacją, lub takich jak po naczyniowych przeszczepach, rurkach, wszczepach przepływów omijających lub transplantacjach organów. Kompozycje można więc

184 114 stosować do inhibicji odkładania płytek i związanych zaburzeń. Tak więc sposób inhibicji koagulacji, naczyniowego nawrotu zwężenia lub odkładania płytek, np., obejmuje podawanie pacjentowi kompozycji zawierającej zmodyfikowany czynnik VII, takiej jak kompozycja mająca co najmniej jedno aminokwasowe podstawienie w katalitycznej triadzie Ser^, Asp242 i His₁₉₃, w ilości dostatecznej do skutecznej inhibicji koagulacji, naczyniowego nawrotu zwężenia lub odkładania płytek. Sposoby znajdujące także zastosowanie w leczeniu ostrego zamknięcia naczynia wieńcowego u osobnika obejmują podawanie zmodyfikowanego czynnika VII, zawierającego DEGR-czynnik VII, w połączeniu z aktywatorem plazminogenu tkanki lub streptokinazą, i mogą przyspieszać indukowaną tPA trombolizę.

Typowo, do podawania ludziom, kompozycje farmaceutyczne będą obejmować zmodyfikowane ludzkie białko czynnika VII i farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i bufory.

W korzystnej odmianie ludzkiego i bydlęcego czynnika VII reszta z aktywnego miejsca Ser₃₄₄ jest zmodyfikowana, zastąpiona Gly, Met, Thr, lub korzystniej, Ala. Takiego podstawienia można dokonać oddzielnie lub w kombinacji z podstawieniami na innych miejscach w katalitycznej triadzie, która obejmuje His₁₉₃ i Asp242.

Polinukleotydowa cząsteczka zawiera dwa operatywnie związane regiony sekwencji kodujących, odpowiednio, peptyd pre-pro i a domenę gla białka osocza zależnego od witaminy K, i pozbawione domeny gla białko czynnika VII, w której przy ekspresji polinukleotyd koduje zmodyfikowaną cząsteczkę czynnika VII, który nie aktywuje znacząco czynników X lub IX osocza, i jest zdolna do wiązania czynnika tkankowego. Zmodyfikowana cząsteczka czynnika VII z ekspresji tego polinukleotydu jest biologicznie aktywnym antykoagulantem, tzn. że, jest zdolna do inhibicji kaskady koagulacji, a więc tworzenia depozytu fibryny lub sprzepu. W celu ekspresji zmodyfikowanego czynnika VII cząsteczkę polinukleotydu transfekuje się w linie komórek ssaków, takie jak, np., linie BHK, BHK 570 lub 293.

Figura 1 ilustruje konstrukcję wektora ekspresji dla zmodyfikowanej sekwencji DNA Ser344 —-Ala czynnika VII. Użyte symbole obejmują 0-1, 0-1 mapowaną jednostkową sekwencję z adenowirusa 5; E, sekwencję polepszającą SV40; MLP, główny późny promotor adenowirusa 2; SS, zestaw miejsca cięcia; i pA, sygnał poliadenylacji z SV40 w późnej orientacji.

Figura 2 pokazuje wpływ zatrzasku DEGR-czynnika VIIa na tworzenia skrzepu (odkładanie płytek) w endarterektomizowanych aortach pawiana w porównaniu z potraktowanymi solanką próbami kontrolnymi. Pomiaru w arteriach dokonywano w czasie 60 minut. DEGR-czynnik VIIa znacząco inhibituje rozwój bogatych w płytki skrzepów w tym modelu z naczelnymi ostrego uszkodzenia naczynia.

Figura 3 pokazuje wyniki otrzymane wtedy, gdy komórki mięśni gładkich pawiana inkubowano z rosnącymi stężeniami FVIIa (otwarty kwadrat), lub DEGR-FVIIa wo becności stałej ilości FVIIa (5 nM) (pełny kwadrat). Poziom aktywacji FX określono następnie stosując chromogeniczny substrat S-2222. Dane przedstawiono jako amidolityczną aktywność będącą procentem aktywności wykazywanej wo becności tylko 5 nM FVIIa.

Figura 4 ilustruje rozmiar obszaru błony wewnętrznej naczynia u pawianów po endarterektomii arterii szyjnej i leczeniu DEGR-czynnikiem VIIa przez 7 lub 30 dni, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Figura 5 ilustruje stosunek rozmiaru obszaru błony wewnętrznej naczynia do rozmiaru obszaru błony wewnętrznej naczynia + średni obszar arterii udowej pawiana po powietrznym uszkodzeniu i leczeniu DEGR-czynnikiem VIIa, gdzie grupa kontrolna obejmowała 5 naczyń, po 7 dniach leczenia zbadane 11 naczyń, i po 30 dniach leczenia zbadane 2 naczynia (n= liczba zbadanych naczyń).

Wynalazek ujawnia nowy zmodyfikowany czynnik VII wykazujący antykoagulacyjną aktywność. Zmodyfikowany czynnik VII może być w formie zymogenu (to jest, jednołańcuchowej cząsteczki) lub może być rozcinany w jego miejscu aktywacji. Tak więc, „zmodyfikowany czynnik VII” ma obejmować zmodyfikowane cząsteczki czynnik VII i zmodyfikowany czynnik VIIa wiążące czynnik tkankowy i inhibitujące aktywację czynnika IX do IXa i czynnika

184 114

X do Xa. Kompozycje zmodyfikowanego czynnika VII są przydatne do podawania różnym ssakom, szczególnie ludziom, do inhibicji kaskady koagulacji. Zmodyfikowany czynnik VII można podawać pacjentowi w połączeniu lub w miejsce innych związków antykoagulacyjnych.

Czynnik VII gra ważną rolę w kaskadzie koagulacji, szczególnie obejmującej zewnętrzną ścieżkę. Obecny w cyrkulującym osoczu jako nieaktywne jednołańcuchowe białko zymogenu, po aktywacji czynnik VIIa, w połączeniu z czynnikiem tkankowym i jonami wapnia, aktywuje czynnik X do Xa i aktywuje czynnik IX do IXa, z ostatecznym tworzeniem fibrynowego skrzepu.

Przedmiot niniejszego wynalazku ma zdolność do inhibicji tej sekwencji zdarzeń w kaskadzie koagulacji przez zapobieganie lub inną inhibicję aktywacji czynników X i IX przez czynnik VIIa. Czynnik VII białka wykorzystany w wynalazku zawiera katalityczne miejsce zmodyfikowane w celu zmniejszenia katalitycznej aktywności czynnika VIIa, podczas gdy cząsteczka zachowuje zdolność wiązania czynnika tkankowego. Zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII współzawodniczą z rodzimym czynnikiem VII i/lub VIIa o wiązanie czynnika tkankowego. W wyniku tego ulega inhibicji aktywacja czynników X i IX.

W jednym aspekcie niniejszego wynalazku katalityczną aktywność czynnika VIIa jest inhibitowana przez chemiczną derywatyzację centrum katalitycznego, lub triady.

Derywatyzację można prowadzić na przykład przez poddanie czynnika VII reakcji z nieodwracalnym inhibitorem takim jak związek fosforoorganiczny, fluorek sulfonylu, chlorowcometyloketon peptydowy lub azapeptyd, lub przez acylowanie. Korzystne peptydowe chlorowcometyloketony obejmują PPACK (D-Phe-Pro-Arg chlorometyloketon; patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4318904, dołączany jako odnośnik), D-Phe-Phe-Arg i Phe-Phe-Arg chlorometyloketon; i DEGRck (dansylo-Glu-Gly-Arg chlorometyloketon).

W innym aspekcie katalityczną aktywność czynnika VIIa można także inhibitować dzięki podstawieniu, wstawieniu lub delecji aminokwasów. W korzystnych odmianach aminokwasowe podstawienia dokonuje się w aminokwasowej sekwencji katalitycznej triady czynnika VII, zdefiniowanej tu jako regiony zawierające aminokwasy, które dają wkład do katalitycznego miejsca czynnika VIIa. Podstawienia, wstawienia lub delecje w katalitycznej triadzie są ogólnie w miejscu lub w pobliżu aminokwasów, które tworzą miejsce katalityczne. W ludzkim i bydlęcym białku czynniku VII aminokwasy tworzące katalityczne „triadę” to Se^, i His₁₉₃ (indeks wskazuje pozycję w sekwencji). Katalityczne miejsca w czynniku VII innych ssaków można określić stosując obecnie dostępne techniki obejmujące, między innymi, wydzielanie białka i analizę sekwencji aminokwasów. Katalityczne miejsca można także określić porównując sekwencję z sekwencją innych serynowych proteaz, szczególnie chymotrypsyny, której aktywne miejsce określono wcześniej (Sigler i in., J. Mol. Biol., 35:143-164 (1968), dołączony jako odnośnik), i stąd określając analogiczne reszty aktywnego miejsca.

Podstawienia, wstawienia lub delecje aminokwasowe wykonuje się w celu zapobiegania lub inhibicji aktywacji przez czynnik VIIa czynników X i/lub IX. Czynnik VII tak zmodyfikowany powinien jednak zachować także zdolność do współzawodniczenia z autentycznym czynnikiem VII i/lub czynnik VIIa o wiązanie z czynnikiem tkankowym w kaskadzie koagulacji. Takie współzawodnictwo można łatwo określić dzięki, np., próbie krzepnięcia opisanej tutaj, lub próbie współzawodnictwa wiązania stosując, np., linię komórek mającą czynnik tkankowy na powierzchni komórki, taką jak linię komórek ludzkiego raka pęcherza J82 (Sakai i in. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989), dołączony jako odnośnik).

Aminokwasy tworzące katalityczne miejsce w czynniku VII, takie jak Sei'344 Asp₂₄₂ i His,93 w ludzkim i bydlęcym czynniku VII, mogą być podstawione lub wycięte. W niniejszym wynalazku jest korzystnie zmienić tylko pojedynczy aminokwas, minimalizując możliwość zwiększenia antygenności cząsteczki lub inhibitując jej zdolność do wiązania czynnika tkankowego, jednakże można dokonać dwu lub więcej zmian aminokwasów (podstawień, addycji lub delecji), a także kombinacji podstawień, addycji i delecji. W korzystnej odmianie ludzkiego i bydlęcego czynnika VII, Se^ jest korzystnie podstawiona Ala, lecz może być także podstawiona Gly, Met, Thr lub innymi aminokwasami. Korzystnie jest zastąpić Asp przez Glu i zastąpić His przez Lys lub Arg. Ogólnie, podstawienia dobiera się tak, aby zerwać trzeciorzędową strukturę białka w jak najmniejszym stopniu. Model Dayhoffa i in. (w Atlas of Protein Structure 1978, Nafl Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), dołączany jako odnośnik, można stosować jako przewodnik do doboru innych podstawień aminokwasowych. Można zmieniać reszty jak opisano powyżej w katalitycznym miejscu właściwej sekwencji czynnika VII rodzaju ludzkiego, bydlęcego lub innego i badać powstałe białko na żądanym poziomie inhibicji katalitycznej aktywności i wynikowej antykoagulacyjnej aktywności opisanej tutaj. Dla zmodyfikowanego czynnika VII katalityczna aktywność będzie znacząco inhibitowana, ogólnie mniejsza niż około 5% katalitycznej aktywności dzikiego typu czynnika VII odpowiedniego rodzaju, korzystniej mniejsza niż około 1%o.

Białka według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez zastosowanie technik rekombinacji DNA. Ogólnie, klonowaną sekwencję DNA dzikiego typu czynnika VII modyfikuje się, aby kodowała żądane białko. Tę zmodyfikowaną sekwencję wstawia się następnie do wektora ekspresji, poddawanego z kolei transformacji lub transfekcji do komórek gospodarza. Wyższe eukariotyczne komórki, w szczególności hodowane komórki ssaka, stanowią korzystne komórki gospodarza. Kompletne nukleotydowe i aminokwasowe sekwencje ludzkiego czynnika VII są znane. Patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4784950, dołączony jako odnośnik, gdzie opisano klonowanie i ekspresję rekombinacyjnego ludzkiego czynnika VII. Sekwencję bydlęcego czynnika VII opisano u Takeya i in., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988), dołączanego jako odnośnik.

Zmian sekwencji aminokwasowej można dokonać różnymi technikami. Modyfikacja sekwencji DNA może polegać na mutagenezie specyficznej co do miejsca. Techniki mutagenezy specyficznej co do miejsca są dobrze znane i opisane przez, np., Zollera i Smitha (DNA 3:479-488, 1984). Tak więc stosując nukleotydowe i aminokwasowe sekwencje czynnika VII, można wprowadzić wybrane zmiany.

Czynnik VII zmodyfikowany według niniejszego wynalazku obejmuje białka, które mają amino-terminalną część (domenę gla) podstawioną domeną gla jednego z zaleznych od witaminy K białek osocza, czynnika IX, czynnika X, protrombiny, białka C, białka S lub białka Z. Domeny gla zależnych od witaminy K białek osocza charakteryzują się obecnością reszty kwasu γ-karboksyglutamowego i mają ogólnie od około 30 do około 40 aminokwasów długości z końcem C odpowiadającym pozycjom granic egzon-intron w odpowiednich genach. Sposoby wytwarzania czynnika VII z heterologiczną domeną gla ujawnia opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4784950, dołączany jako odnośnik.

Sekwencje DNA do stosowania w niniejszym, wynalazku będą typowo kodowały peptyd pre-pro na końcu aminowym białko czynnika VII w celu właściwego post-translacyjnego przetwarzania (np. γ-karboksylowania reszty kwasu glutamowego) i sekrecji z komórki gospodarza. Peptyd pre-pro może pochodzić z czynnika VII lub innego białka osocza zależnego od witaminy K, takiego jak czynnik IX, czynnik X, protrombina, białko C lub białko S. Jak zauważą specjaliści, dodatkowych modyfikacji można dokonać w sekwencji zmodyfikowanego czynnika VII tam, gdzie te modyfikacje nie uszkadzają znacząco zdolności białka do działania jako antykoagulant. Np., czynnik VII zmodyfikowany na katalitycznej triadzie można także zmodyfikować w miejscu rozcięcia aktywującego w celu inhibicji konwersji zymogenu czynnika VII w jego aktywowaną dwułańcuchową formę, jak ogólnie opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5288629, dołączonym jako odnośnik.

Wektory ekspresji do stosowania w niniejszym wynalazku będą obejmowały promotor zdolny do kierowania transkrypcją klonowanego genu lub cDNA. Korzystne promotory do stosowania w hodowanych komórkach ssaka obejmują wirusowe promotory i komórkowe promotory. Wirusowe promotory obejmują promotor SV40 (Subramani i in., Mol. Celi Biol. 1:854-864, 1981) i promotor CMV (Boshart i in., Cell 41:521-530, 1985). Szczególnie korzystnym wirusowym promotorem jest główny późny promotor z adenowirusa 2 (Kaufman i Sharp, Mol. Cell Biol. 2:1304-1319, 1982). Komórkowe promotory obejmują promotor mysiego genu k (Hergman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) i mysi promotor V_H

184 114 (Loh i in., Cell. 33:85-93, 1983). Szczególnie korzystnym komórkowym promotorem jest mysi promotor metalotioneina-I (Palmiter i in., Science 222:809-814, 1983). Wektory ekspresji mogą także zawierać zestaw miejsc cięcia RNA umieszczony w dół od promotora i w górę od miejsca insercji dla samej sekwencji czynnika VII. Korzystne miejsca cięcia RNA można otrzymać z genów adenowirusa i/lub immunoglobuliny. W wektorach ekspresji znajduje się też sygnał poliadenylacji umieszczony w dół od miejsca insercji. Szczególnie korzystne sygnały poliadenylacji obejmują wczesny lub późny sygnał poliadenylacji z SV40 (Kaufman i Sharp, ibid.), sygnał poliadenylacji z regionu Elb adenowirusa 5, terminator ludzkiego genu hormonu wzrostu (De Noto i in. Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) lub sygnał poliadenylacji z ludzkiego genu czynnika VII lub bydlęcego genu czynnika VII. Wektory ekspresji mogą także obejmować niekodującą wirusową sekwencję liderową, taką jak trójdzielny lider adenowirusa 2, umieszczony pomiędzy promotorem i miejsca cięcia RNA; i sekwencję polepszającą sekwencje, takąjak sekwencja polepszająca SV40.

Klonowane sekwencje DNA wprowadza się do hodowanych komórek ssaka metodą, np., mediowanej fosforanem wapnia transfekcji (Wigier i in., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) lub elektroporacji (Neumann i in., EMBO J. 1:841-845, 1982). W celu identyfikacji i wyboru komórek dających ekspresję egzogennego DNA, ogólnie wprowadza się gen nadający wybieralny fenotyp (wybieralny marker) do komórek wraz z interesującym genem lub cDNA. Korzystne wybieralne markery obejmują geny nadające oporność na leki takie jak neomycyna, higromycyna i metotreksat. Wybieralny marker może być wzmacnialnym wybieralnym markerem. Korzystnym wzmacnialnym wybieralnym markerem jest sekwencja dihydrofolanowej reduktazy (DHFR). Wybieralne markery przegląda Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, dołączany jako odnośnik). Dobór wybieralnych markerów jest czynnością zwykłą dla specjalisty.

Wybieralne markery można wprowadzać do komórki na odrębnym plazmidzie jednocześnie z interesującym genem, lub można wprowadzać na ten sam plazmid. Na tym samym plazmidzie, wybieralny marker i interesujący gen może być pod kontrolą różnych promotorów lub tego samego promotora, przy czym ten ostatni układ daje sygnał dicistronowy. Konstrukty tego typu są znane specjalistom (np., Levinson i Simonsen, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4713339). Może być także korzystne dodawanie dodatkowego DNA, znanego jako „nośnikowy DNA”, do mieszaniny wprowadzanej do komórek.

Po pobraniu DNA przez komórki, hoduje się je we właściwej pożywce wzrostowej, typowo 1-2 dni, do rozpoczęcia ekspresji interesującego genu. W niniejszym opisie termin „właściwa pożywka wzrostowa” oznacza pożywkę zawierającą środki odżywcze i inne składniki wymagane dla wzrostu komórek i ekspresji zmodyfikowanego genu czynnika VII. Pożywki ogólnie obejmują źródło węgla, źródło azotu, zasadnicze aminokwasy, zasadnicze cukry, witaminy, sole fosfolipidy, białka i czynniki wzrostu. Do wytwarzania γ -karboksylowanego zmodyfikowanego czynnika VII, pożywka będzie zawierała witaminę K, korzystnie w stężeniu około 0,1 pg/ml do około 5 pg/ml. Stosuje się następnie selekcję lekiem w celu wybrania do wzrostu komórek dających ekspresję wybieralnego markera i trwały sposób. Dla komórek transfekowanych wzmacnianym wybieralnym markerem stężenie leku może wzrastać w celu selekcji zwiększonej liczby kopii klonowanej sekwencji, zwiększając tak poziomy ekspresji. Klony trwale transfekowanych komórek są następnie przesiewane na ekspresję zmodyfikowanego czynnika VII.

Korzystne linie komórek ssaków do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują linie komórek COS-1 (ATCC CRL 1650), nerkę młodego chomika (BHK) i 293 (ATCC CRL 1573; Graham i in., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Korzystną linią komórek BHK jest linia komórek tk' ts13 BHK (Waechter i Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, dołączany jako odnośnik), dalej nazywany komórkami BHK 570. Linię komórek BHK 570 złożono w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, pod numerem dostępu ATCC CRL 10314. Linia komórek tk- ts13 BHK jest także dostępna

184 114 z ATCC pod numerem dostępu CRL 1632. Ponadto można stosować wiele innych linii komórek ujawnionych w niniejszym wynalazku, w tym komórki Rat Hep I (wątrobiak szczura; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (wątrobiak szczura; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Ludzkie płuco (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9,1), CHO (ATCC CCL 61) i DUKX (Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980).

Według niniejszego wynalazku, można wykorzystać technikę transgenicznych zwierząt w celu wytworzenia zmodyfikowanego czynnika VII. Korzystne jest wytwarzać białka w gruczołach mlecznych dojrzałej samicy ssaka. Ekspresja w gruczołach mlecznych i dalsza sekrecja interesującego białka w mleku pozwala przezwyciężyć wiele trudności napotykanych przy wydzielaniu białka z innych źródeł. Mleko jest łatwo zebrać, jest dostępne w dużych ilościach, i jest dobrze zbadane biochemicznie. Ponadto główne białka mleka są obecne w mleku w wysokich stężeniach (typowo od około 1 do 15 g/l). Z handlowego punktu widzenia jest oczywiście korzystne stosowanie jako gospodarza gatunku o dużej wydajności mleka. Chociaż można stosować mniejsze zwierzęta, takie jak myszy i szczury (i są one korzystne na etapie uzasadniania), według niniejszego wynalazku jest korzystnie stosować zwierzęta hodowlane, w tym między innymi, świnie, kozy, owce i bydło. Owce są szczególnie korzystne dzięki takim czynnikom jak dotychczasowa historia transgenezy u tego gatunku, wydajność mleka, koszt i łatwa osiągalność sprzętu do zbierania owczego mleka. Patrz publikacja WIPO WO 88/00239 dla porównania czynników wpływających na wybór gatunku gospodarza. Ogólnie jest pożądane wybranie rasy gospodarza hodowanej dla potrzeb mleczarskich, takie jak owce East Friesland, lub wprowadzenie rasy mlecznej przez dalszą hodowlę linii transgenicznej w późniejszym okresie. W każdym przypadku powinno się stosować zwierzęta o znanym, dobrym zdrowiu.

W celu uzyskania ekspresji w gruczole mlecznym stosuje się promotor transkrypcji z genu białka mleka. Geny białka mleka obejmują geny kodujące kazeiny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5304489, dołączony jako odnośnik), β-laktoglobuliny, α-laktalbuminy i białko kwasu mlekowego. Korzystny jest promotor β-laktoglobuliny (BLG). W przypadku owczego genu β-laktoglobuliny będzie się ogólnie stosować region co najmniej najbliższych 406 par zasad flankującej sekwencji 5' genu, chociaż korzystne są większe części flankującej sekwencji 5', do około 5 tys. par zasad, takie jak segment DNA 4,25 tys. par zasad obejmujący flankujący promotor 5' i niekodującą część genu β-laktoglobuliny. Patrz Whitelaw i in., Biochem. J. 286: 31-39 (1992). Podobne fragmenty DNA promotora innych gatunków są także przydatne.

W konstrukty można także włączać inne regiony genu β-laktoglobuliny, jak też genomowe regiony genu poddawanego ekspresji. Ogólnie wiadomo, że konstrukty bez intronów, np., dają słabą ekspresję w porównaniu z zawierającymi takie sekwencje DNA (patrz Brinster i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw i in., Transagnic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343 i WO 91/02318, każde dołączane jako odnośnik). Z tego względu jest ogólnie korzystne, gdzie to możliwe, stosować genomowe sekwencje zawierające wszystkie lub pewne rodzime introny genu kodującego interesujące białko lub polipeptyd, tak więc dalej korzystne jest włączenie co najmniej pewnych intromów z np. genu β-laktoglobuliny. Jeden taki region jest segmentem DNA pozwalającym na rozszczepienie intronu i poliadenylację RNA z niekodującego regionu 3' owczego genu β-laktoglobuliny. Po podstawieniu za naturalną niekodującą sekwencję 3' genu, owczy segment β-laktoglobuliny może polepszyć i stabilizować poziomy ekspresji interesującego białka lub polipeptydu. W innych odmianach region otaczający inicjacyjne ATG sekwencji zmodyfikowanego czynnika VII zastępuje się odpowiednimi sekwencjami z genu białka mleka. Takie zastąpienie daje domniemane specyficzne wobec tkanki początkowe środowisko polepszające ekspresję. Dogodnie jest zastąpić cały zmodyfikowany czynnik VII pre-pro i niekodujące sekwencje 5' tymi z, np., genu HLG, chociaż można zastępować mniejsze regiony.

184 114

W celu ekspresji zmodyfikowanego czynnika VII u transgenicznych zwierząt, segment DNA kodujący zmodyfikowany czynnik VII łączy się operatywnie z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi dla jego ekspresji otrzymując jednostki ekspresji. Takie dodatkowe segmenty obejmują wspomniany wyżej promotor, jak też sekwencje dające terminację transkrypcji i poliadenylację mRNA. Jednostki ekspresji obejmą następnie segment DNA kodujący sekwencję sygnału sekrecji operatywnie związany z segmentem kodującym zmodyfikowany czynnik VII. Sekwencja sygnału sekrecji może być rodzimą sekwencją sygnału sekrecji czynnika VII lub może być sekwencją innego białka, takiego jak białko mleka. Patrz, np., von Heinje, Nuc. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986); i Meade i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873316, dołączane jako odnośniki.

Konstrukcję jednostek ekspresji do stosowania u transgenicznych zwierząt dogodnie prowadzi się wprowadzając zmodyfikowaną sekwencję czynnika VII do plazmidu lub wektor fagowy zawierający dodatkowe segmenty DNA, chociaż jednostkę ekspresji można skonstruować z zasadniczo dowolnej sekwencji ligacji. Szczególnie dogodne jest wytwarzanie wektora zawierającego segment DNA kodujący białka mleka i zastępowanie sekwencji kodującej białka mleka sekwencją zmodyfikowanego polipeptydu czynnika VII, tworząc gen fuzyjny obejmujący kontrolne sekwencje ekspresji genu białka mleka. W każdym przypadku, klonowanie jednostek ekspresji w plazmidach lub innych wektorach ułatwia wzmocnienie sekwencji zmodyfikowanego czynnika VII.

Wzmacnianie dogodnie prowadzi się w bakteryjnych (np. E. coli) komórkach gospodarza, tak więc wektory będą typowo obejmowały początek replikacji i wybieralny marker działający w bakteryjnych komórkach gospodarza.

Jednostkę ekspresji wprowadza się następnie w zapłodnione jaja (w tym embriony we wczesnym etapie) wybranych gatunków gospodarzy. Wprowadzenie heterologicznego DNA można prowadzić jedną z kilku dróg, w tym mikroiniekcji (np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873191), retrowirusowej infekcji (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) lub skierowanej na miejsce integracji z użyciem embrionalnych komórek macierzystych (ES) (przegląd Bradleya i in., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Jaja implantuje się następnie w jajowody lub macicę pseudociężarnych samic i pozwala rozwijać do porodu. Potomstwo niosące wprowadzony DNA w linii zarodkowej może przekazywać DNA swojemu potomstwu w normalny, Mendlowski sposób, pozwalając na rozwój transgenicznych stad.

Ogólne procedury wytwarzania transgenicznych zwierząt są znane. Patrz, np., Hogan i in., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons i in., Bio/Technology 6. 179-183 (1988); Wall i in., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler i in., Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert i in., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort i in., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall i in., J. Cell Biochem, 49: 113-120 (1992); opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873191 i 4873316; publikacje WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; i GB 87/00458, dołączane jako odnośniki. Techniki wprowadzania obcych sekwencji DNA u ssaków i ich komórek rozrodczych opracowano oryginalnie u myszy. Patrz, np., Gordon i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon i Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter i Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4438-4442 (1985); i Hogan i in., (ibid.). Te techniki adaptowano następnie do stosowania dla większych zwierząt, w tym gatunków hodowlanych (patrz np. publikacje WIPO WO 88/00239, WO 90/05188 I WO 92/11757; oraz Simons i in., Bio/Technology 6: 179-183 (1988). Podsumowując, w najbardziej skutecznym sposobie używanym do dziś do wytwarzania transgenicznych myszy lub zwierząt hodowlanych, kilkaset liniowych cząsteczek interesującego DNA wstrzykuje się w jedno z pierwocin jąder zapłodnionego jaja zgodnie z ustaloną techniką. Można także wykorzystać zastrzyk DNA w cytoplazmę zygoty. Można także wykorzystać wytwarzanie w transgenicznych roślinach. Ekspresja może być ogólna lub skierowana do konkretnego organu, takiego jak bulwa. Patrz Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum i in., J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons i in., Bio/Technology 8:217-221 (1990); i publikacja europejskiego Urzędu Patentowego EP 255378.

Zmodyfikowany czynnik VII wytwarzany według niniejszego wynalazku można oczyszczać przez chromatografię powinowactwa na kolumnie z przeciwciałem anty-czynnik VII. Zastosowanie zależnych od wapnia monoklonalnych przeciwciał, jak opisuje Wakabayashi i in., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) i Thim i in., Biochem. 27: 7785-7793, (1988), dołączane jako odnośniki, jest szczególnie korzystne. Dodatkowe oczyszczanie można uzyskać konwencjonalnymi środkami chemicznymi, takimi jak wysokowydajna cieczowa chromatografia. Inne sposoby oczyszczania, w tym strącanie z cytrynianem baru, są znane, i mogą być stosowane do oczyszczania nowego zmodyfikowanego czynnika VII opisanego tutaj (patrz ogólnie Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Korzystny jest zasadniczo czysty zmodyfikowany czynnik VII o co najmniej około 90 do 95% jednorodności, i najkorzystniejszy o 98 do 99% lub większej jednorodności, do celów farmaceutycznych. Po oczyszczeniu częściowo lub do jednorodności w miarę żądania, zmodyfikowany czynnik VII można następnie stosować leczniczo.

Według jednej odmiany wynalazku zmodyfikowany czynnik VII przecina się w jego miejscu aktywacji w celu przekształcenia go w jego dwułańcuchową formę. Aktywację można prowadzić według znanych procedur, takie jak opisane przez Osteruda, i in., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4456591; Hedner i Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); lub Kisiel i Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983), dołączane jako odnośniki. Powstałe cząsteczki można następnie skomponować i podawać jak opisano poniżej.

Zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII według niniejszego wynalazku i jego kompozycje farmaceutyczne są szczególnie przydatne do podawania ludziom do leczenia różnych stanów związanych z wewnątrznaczyniową koagulacją. Np., chociaż głęboką żyłową zakrzepicę i zator tętnicy płucnej można potraktować konwencjonalnymi antykoagulantami, zmodyfikowany czynnik VII opisany tutaj można stosować do zapobiegania występowaniu tromboembolicznych komplikacji u zidentyfikowanych pacjentów o wysokim ryzyku, takich jak pacjenci przechodzący chirurgię lub z zastoinową niewydolnością serca. Ponadto, zmodyfikowany czynnik VII może działać jako antagonista dla czynnika mediowanej tkankowo indukcji koagulacji, blokując wytwarzanie trombiny i dalsze odkładanie fibryny. Jako taki, zmodyfikowany czynnik VII może być przydatny do inhibicji aktywności czynnika tkankowego, dającej, np., inhibicję koagulacji krwi, zakrzepicy lub odkładania płytek.

Zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII według niniejszego wynalazku mogą być szczególnie przydatne do leczenia rozrostu błony wewnętrznej naczynia lub nawrót zwężenia wskutek uszkodzeń naczyń. Ostrymi uszkodzeniami naczyń są uszkodzenia zachodzące nagle (to jest w ciągu dni do miesięcy), w odróżnieniu od chronicznych uszkodzeń naczyń (np. miażdżycy tętnic), które rozwijają się w czasie życia. Ostre uszkodzenia naczyń często wynikają z działań chirurgicznych takich jak rekonstrukcja naczyń, w których wykorzystuje się techniki angioplastyki, endarterektomii, aterektomii, naczyniowych przeszczepów lub tym podobne. Przerost może także powstać jako opóźniona odpowiedź na, np., umieszczenie przeszczepu lub transplantację organu. Ponieważ zmodyfikowany czynnik VII jest bardziej selektywny niż heparyna, wiążąc ogólnie tylko czynnik tkankowy pojawiający się w miejscach uszkodzeń, i ponieważ zmodyfikowany czynnik VII nie niszczy innych białek koagulacyjnych, będzie bardziej skuteczny i mniej prawdopodobnie spowoduje komplikacji krwawienia niż heparyna, gdy użyje się go profilaktycznie do zapobiegania głębokiej żyłowej zakrzepicy. Dawka zmodyfikowanego czynnika VII do zapobiegania głębokiej żyłowej zakrzepicy mieści się w zakresie od około 50 pg do 500 mg dziennie, bardziej typowo 1 mg do 200 mg dziennie, i korzystniej 10 do około 175 mg dziennie dla pacjenta 70 kg, a podawania powinno się zacząć co najmniej około 6 godzin przed operacją i kontynuować co najmniej do stanu samodzielnego poruszania się pacjenta. Dawka zmodyfikowanego czynnika VII do leczenia nawrotu zwężenia będzie wahać się z pacjentem, ale ogólnie będzie mieściła się w zakresach sugerowanych powyżej.

18-4114

Ostatnie postępy w leczeniu choroby wieńcowej obejmują zastosowanie mechanicznej interwencji w celu usunięcia lub przemieszczenia przeszkadzających płytek dla wznowienia dostatecznego przepływu krwi przez tętnice wieńcowe. Pomimo zastosowania wielu form mechanicznej interwencji, w tym powietrznej angioplastyki, redukcyjnej aterektomii, umieszczania naczyniowych rurek, terapii laserowej, lub rotoblatora, skuteczność tych technik pozostaje ograniczona do w przybliżeniu 40% nawrotów zwężenia podczas 6 miesięcy po leczeniu.

Nawrót zwężenia uważa się za wynik złożonego oddziaływania biologicznych procesów, w tym odkładania płytek i tworzenia skrzepu, uwalniania czynników chemotaktycznych i mitogenicznych, oraz migracji i namnażania komórek naczyniowych mięśni gładkich na błonie wewnętrznej naczynia rozszerzonego segmentu arterii.

Inhibicja akumulacji płytek w miejscach mechanicznych uszkodzeń może limitować szybkość nawrotu zwężenia u ludzi. Lecznicze zastosowanie monoklonalnego przeciwciała wobec płytek GpIIb/IIIa jest w stanie ograniczyć poziom nawrotu zwężenia u ludzi (Califf i in., N. Engl. J. Med., 330:956-961 (1994)). Przeciwciało może wiązać receptor GpIIb/IIIa na powierzchniach płytek i tak inhibitować gromadzenie płytek. Dane te sugerują, że inhibicja gromadzenia płytek w miejscu mechanicznego uszkodzenia w ludzkich naczyniach wieńcowych jest korzystna dla zachodzącej końcowej odpowiedzi. Chociaż gromadzenie płytek zachodzi w miejscach ostrych naczyniowych uszkodzeń, wytwarzanie trombiny w tych miejscach może być odpowiedzialne za aktywację płytek i ich dalszą akumulację.

W poniższych przykładach pokazano, że zmodyfikowany czynnik VII według niniejszego wynalazku jest w stanie wiązać czynnik tkankowy powierzchni komórki. Np., DEGR-czynnik VIIa wiąże czynnik tkankowy powierzchni komórki z równoważnym łub wyższym powinowactwem niż dzikiego typu czynnik VIIa. DEGR-czynnik VIIa, jednakże, nie ma enzymatycznej aktywności, jednak wiąże się z czynnikiem tkankowym i działa jako współzawodniczący antagonista dla dzikiego typu czynnika VIIa, inhibitując następne etapy w zewnętrznej ścieżce koagulacji prowadzącej do wytwarzania trombiny.

Zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII według niniejszego wynalazku, wiążące czynnik tkankowy, inhibitują akumulację płytek w miejscu naczyniowych uszkodzeń przez blokadę wytwarzania trombiny i dalszego odkładania fibryny.

Dzięki zdolności DEGR-czynnika VII do blokady wytwarzania trombiny i ograniczenia odkładania płytek w miejscach ostrych naczyniowych uszkodzeń, zmodyfikowane cząsteczki czynnika VII zachowujące aktywność wiązania czynnika tkankowego, lecz pozbawione enzymatycznej aktywności czynnika VIIa można stosować do inhibicji naczyniowych nawrotów zwężenia.

Tak więc kompozycje i sposoby według niniejszego wynalazku mają wiele zastosowań. Np., są one przydatne do zapobiegania lub inhibicji nawrotu zwężenia po interwencji, typowo mechanicznej interwencji, aby usuwać lub przemieszczać przeszkadzający materiał płytkowy w leczeniu choroby naczyń wieńcowych lub obwodowych, tak jak w połączeniu z i/lub po powierzchni angioplastyce, redukcyjnej aterektomii, umieszczaniu naczyniowych rurek, laserowej terapii, rotoblacji, i tym podobnych. Związki będą typowo podawane w ciągu około 24 godzin przed dokonaniem interwencji, i przez co najmniej 7 dni lub więcej po niej. Podawania można dokonywać różnymi drogami, jak opisano poniżej. Związki według niniejszego wynalazku można także podawać systemowo lub lokalnie przy umieszczaniu przeszczepów naczyniowych (np., przez powlekanie syntetycznych lub zmodyfikowanych naturalnych wszczepów arterialnych), w miejscach anastomozy, chirurgicznej endarterektomii (typowo endarterektomii arterii szyjnej), wszczepach przepływów omijających, i tym podobnych. Zmodyfikowany czynnik VII i VIIa także znajduje zastosowanie w inhibicji przerostu błony wewnętrznej naczynia, przyspieszonej miażdżycy tętnic i choroby okluzyjnej żył związanej z transplantacją organów, np., transplantacją szpiku kostnego.

W leczeniu ustalonej głębokiej żyłowej zakrzepicy i/lub zatoru tętnicy płucnej, dawka zmodyfikowanego czynnika VII waha się od około 50 pg do 500 mg dziennie, bardziej typowo 1 mg do 200 mg dziennie, i korzystniej 10 mg do około 175 mg dziennie dla pacjenta 70 kg jako dawkę uderzeniową i podtrzymującą, w zależności od wagi pacjenta i ostrości stanu. Ze względu na małe prawdopodobieństwo komplikacji krwawienia wskutek infuzji zmodyfikowanego czynnika VII zmodyfikowany czynnik VII może zastąpić lub obniżyć dawkę heparyny podczas lub po operacji w połączeniu z trombektomiami lub embolektomiami.

Zmodyfikowane kompozycje czynnika VII według niniejszego wynalazku będą także miały istotną przydatność w zapobieganiu kardiogennych czopów zatorowych i w leczeniu udarów trombotycznych. Ze względu na jego niski potencjał powodowania komplikacji krwawienia i jego selektywność, zmodyfikowany czynnik VII można podawać pacjentom po udarach i może on zapobiegać rozszerzania okluzji arteryjnego skrzepu. Ilość zmodyfikowanego podawanego czynnika VII będzie wahać się przy każdym pacjencie w zależności od natury i ostrości udaru, ale dawki będą ogólnie mieścić się w zakresie sugerowanym poniżej.

Kompozycje farmaceutyczne zmodyfikowanego czynnika VII, który obejmuje DEGR czynnik VII przedstawione tutaj będą przydatne w leczeniu ostrego zawału mięśnia sercowego, ze względu na zdolność zmodyfikowanego czynnika VII do inhibicji koagulacji in vivo. Zmodyfikowany czynnik VII można podawać jako adiuwant z aktywatorem plazminogenu tkanki lub streptokinazą podczas ostrych faz zawału mięśnia sercowego, i może on przyspieszać indukowaną TPA trombolizę. Przy ostrym zawale mięśnia sercowego pacjent otrzymuje dawkę udarową co najmniej około 50 pg do 500 mg dziennie, bardziej typowo 1 mg do 200 mg dziennie, i korzystniej 10 mg do około 175 mg dziennie dla pacjenta 70 kg jako dawki uderzeniowe i podtrzymujące. Zmodyfikowany czynnik VII podaje się przed, w połączeniu z, lub krótko po podawaniu środka trombolitycznego, takiego jak aktywator plazminogenu tkanki.

Zmodyfikowany czynnik VII według niniejszego wynalazku jest przydatny w leczeniu rozsianej wewnątrznaczyniowej koagulacji (DIC) i innych stanów związanych z gram-ujemną bakteriemią. Pacjenci z DIC mają charakterystycznie rozrzucone mikrokrążeniowe skrzepy i często problemy z ostrym krwawieniem, powstające ze zużycia zasadniczych czynników krzepnięcia. Ze względu na jego selektywność, zmodyfikowany czynnik VII nie będzie wzmagał problemów krwawienia związanych z DIC, jak to czynią konwencjonalne antykoagulanty, lecz będzie opóźniał lub inhibitował tworzenie dodatkowych mikronaczyniowych depozytów fibryny. Tak więc zmodyfikowany czynnik VII według wynalazku, w tym DEGR-czynnik VII i DEGR-VIIa, jest przydatny do inhibicji odkładania fibryny związanej z endotoksemią i Szokiem endotoksynowym, a więc także łagodzi skutki gram-ujemnej bakteriemii. DEGR-czynnik VIIa u królików wykazuje działanie zależne od dawki przy blokowaniu odkładania fibryny w nerkach i płucach, i u pawianów zwiększa przeżywalność potraktowanych zwierząt. W przypadkach ostrej bakteriemii, endotoksemii lub DIC, pacjent otrzymuje dawkę udarową co najmniej około 50 pg do 500 mg dziennie, bardziej typowo 1 mg do 200 mg dziennie, i korzystniej 10 mg do około 175 mg dziennie dla pacjenta 70 kg, z dawkami podtrzymującymi w zakresie 50 pg do 500 mg dziennie, typowo 1 mg do 200 mg dziennie dla pacjenta 70 kg.

Kompozycje farmaceutyczne są przeznaczone do pozajelitowego, miejscowego lub lokalnego podawania do celów profilaktyki i/lub leczenia. Korzystnie kompozycje farmaceutyczne podaje się pozajelitowo, to jest dożylnie, podskórnie, lub domięśniowo. Tak więc wynalazek ujawnia kompozycje do pozajelitowego podawania obejmujące roztwór cząsteczek zmodyfikowanego czynnika VII rozpuszczone w dopuszczalnym nośniku, korzystnie wodnym nośniku. Można stosować różne wodne nośniki, np., wodę, buforowaną wodę, 0,4% solanki, 0,3% glicyny i tym podobne. Cząsteczki zmodyfikowanego czynnika VII można także komponować w liposomowe preparaty do dostarczania lub kierowania do miejsc uszkodzeń. Liposomowe preparaty ogólnie opisano w, np., opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4837028, 4501728 i 4975282, dołączanym jako odnośnik. Komozycje można sterylizować konwencjonalnymi, dobrze znanymi sposobami. Powstałe roztwory wodne można opakować do stosowania lub przesączyć w aseptycznych warunkach i liofilizować. Liofilizowany preparat łączy się ze sterylnym roztworem wodnym przed podawaniem. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne pomocnicze substancje konieczne do osiągnięcia fizjologicznych warunków, takie jak środki ustawiania i buforowania pH, ustawiania toniczności i tym podobne, np., octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, itd. Stężenie zmodyfikowanego czynnika VII w tych preparatach może się wahać szeroko, to jest, od mniejszego niż około 0,5%, zwykle od co najmniej około 1% do 15 lub 20% wagowych i będzie dobrane głównie do objętości płynów, lepkości, itd., zgodnie z danym trybem podawania.

Tak więc typowa kompozycja farmaceutyczna do dożylnej infuzji może zawierać 250 ml sterylnego roztworu Ringera, i 10 mg zmodyfikowanego czynnika VII. Rzeczywiste sposoby wytwarzania pozajelitowo podawanych związków będą znane lub oczywiste dla specjalistów i opisane bardziej szczegółowo w np., Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 16, Mack Publishing Company, Easton, PA (1982), dołączanym jako odnośnik.

Kompozycje zawierające cząsteczki zmodyfikowanego czynnika VII można podawać profilaktycznie i/lub leczniczo. W leczniczych zastosowaniach, kompozycje podaje się pacjentowi już cierpiącemu na choroby opisane powyżej, w ilości dostatecznej do leczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania choroby i jej komplikacji. Ilość odpowiednią do dokonania tego definiuje się jako „leczniczo skuteczną dawkę”. Ilości skuteczne w tych zastosowaniach będą zależały od ostrości choroby lub uszkodzenia oraz wagi i ogólnego stanu pacjenta, ale ogólnie wahają się od około 0,05 mg do około 500 mg zmodyfikowanego czynnika VII dziennie dla pacjenta 70 kg, częściej z dawkowaniem od około 1,0 mg do około 200 mg zmodyfikowanego czynnika VII dziennie. Należy pamiętać, że materiały według niniejszego wynalazku można ogólnie wykorzystywać w stanach poważnych chorób lub uszkodzeń, to jest, sytuacjach zagrożenia życia lub możliwego zagrożenia życia. W takich przypadkach, ze względu na minimalizację obcych substancji i ogólny brak immunogenności zmodyfikowanego ludzkiego czynnika VII u ludzi, jest możliwa i może być pożądana decyzja lekarza o podawaniu znaczącego nadmiaru kompozycji tego zmodyfikowanego czynnika VII.

W profilaktycznych zastosowaniach, kompozycje zawierające zmodyfikowany czynnik VII podaje się pacjentowi podatnemu lub zagrożonemu stanem chorobowym lub uszkodzeniem dla polepszenia własnych antykoagulacyjnych możliwości pacjenta. Taka ilość jest zdefiniowana jako „profilaktycznie skuteczna dawka”. W tym zastosowaniu, dokładne ilości ponownie zależą od stanu zdrowia i wagi pacjenta, ale ogólnie wahają się od około 0,05 mg do około 500 mg na pacjenta 70 kg, częściej od około 1,0 mg do około 200 mg na pacjenta 70 kg.

Pojedyncze lub wielokrotne podawanie kompozycji można prowadzić przy dawkowaniu i sposobie podawania dobranym przez lekarza. Dla chodzących pacjentów wymagających dziennych dawek podtrzymujących, zmodyfikowany czynnik VII można podawać przez ciągłą infuzję np. przenośnym układem pompującym.

Lokalne dostarczanie zmodyfikowanego czynnika VII można prowadzić, np., metodą perfuzji, podwójnych powietrznych kateterów, rurek, wprowadzać do naczyniowych wszczepów lub rurek, hydrożeli stosowanych do powlekania powietrznych kateterów, lub innymi dobrze znanymi sposobami. W każdym przypadku, farmaceutyczne kompozycje powinny podawać ilość zmodyfikowanego czynnika VII według wynalazku dostateczną do skutecznego leczenia pacjenta.

Poniższe przykłady podane są ilustracyjnie i nie mają charakteru ograniczającego.

Przykład I

Ekspresja Se^-—AU344 czynnik VII

Dla wytworzenia mutanta miejsca aktywnego Se^—>Ala344 czynnika VII, plazmid FVII(565+2463)/pDX (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4784950 dołączany jako odnośnik; złożone w American Type Culture Collection pod numerem dostępu 40205) trawiono XbaI iK pnI, i odzyskano powstały fragment 0,6 tys. par zasad, zawierający region kodujący serynę 344. Fragment klonowano w trawiony XbaI, KpnI M13mp19, jak pokazano na rysunku. Tę manipulację i następne etapy opisane poniżej ogólnie przeprowadzono według standardowych protokołów (jak opisuje, np., Maniatis i in., Molecular Cloning,

184 114

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

(1982) dołączany jako odnośnik).

Mutagenezę prowadzono na wzorcu M13 zgodnie ze sposobami Zollera i Smitha, supra, stosując mutagenny oligionukleotyd ZC1656 (5' TGG GCC TCC GGC GTC CCC CTT 3') i „uniwersalny” drugi starter ZC87 (5' TCC cAg TCA CGA CGT 3'). Produkty reakcji przesiano stosując kinazowany ZC1656. Pozytywne płytki pobrano, wytworzono wzorcowy DNA i sekwencjonowano od miejsca PstI przy 1077 do miejsca KpnI przy 1213. Analiza sekwencji potwierdziła obecność żądanej mutacji. Klon mutanta oznaczono 1656.

Następnie skonstruowano wektor ekspresji stosując klon 1656. Zmutowaną sekwencję oddzielono od wektora M13 jako fragment ~0,14 tys. par zasad PstI-KpnI. Ten fragment poddano ligacji z fragmentem 1,7 tys. par zasad HindIII-XbaI z FVII(565+2463)/pDX, fragmentem 0,5 tys. par zasad XbaI-PstI z FVII(565+2463)/pDX, i fragmentem 4,3 tys. par zasad KpnI-HindIII z FVII(565+2463)/pDX, jak pokazano na rysunku. Obecność żądanej zmutowanej sekwencji potwierdzono trawiąc mutant i dzikiego typu klony PstI, a zmutowany insert czynnika VII w M13 KpnI i XbaI, wykonując próbę Southerna trawionego DNA, i testując plamy radioznaczonym ZC1656.

Linię komórek nerki młodego chomika BHK 570 (złożoną w American Type Culture Collection pod numerem dostępu 10314 transfekowano dwoma izolatami (oznaczonymi #544 i #545) wektora ekspresji 1656. Komórki wytworzono rozcieńczając zlewającą się 10 cm płytkę komórek BHK 570 1:10 na pięć 10 cm płytek w nieselektywnej pożywce (zmodyfikowana pożywka Eagle Dulbecco [DMEM] zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% mieszanki antybiotykowej PSN [GIBCO Life Technologies, Gaithersburg, Md)). Po 24 godzinach, gdy komórki osiągnęły 20-30% zlewania, kotransfekowano je jednym izolatem wektora ekspresji kodującego mutację 1656, plazmidem p486 (zawierającym ori adenowirusa 5, sekwencję polepszającą SV40, główny późny promotor adenowirusa 2, trójdzielny lider adenowirusa 2, miejsca rozszczepienia 5' i 3', cDNA DHFRr i sygnał poliadenylacji SV40 w pML-1 (Lusky i Botchan, Nature 293: 79-81, (1981)) i 10 pg nośnika DNA (sonikowane DNA spermy łososia), jak pokazano w tabeli 1. DNA dodano do 15 ml probówki, następnie dodano 0,5 ml 2X Hepes (25 g Hepes, 40 g NaCl, 1,8 g KCl, 0,75 g Na₃HPO4 · 2H₂O, 5 g glukozy rozcieńczone do 2,5 l wodą destylowaną i ustawione na pH 6,95-7,0) i probówki mieszano. DNA w każdej probówce strącono dodatkiem 0,5 ml 0,25 M CaCĘ z barbotowaniem powietrza przez roztwór DNA/Hepes przez pipetę Pasteura. Probówki odwrócono, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, i odwrócono ponownie. Mieszaniny DNA dodano następnie kroplami pipetką na płytki komórek. Płytki poruszono i inkubowano w temperaturze 37°C przez 4-6 godzin. Po inkubacji dodano do każdej płytki 2 ml 20% gliceryny rozcieńczonej w Tris-solance (0,375 g KCl, 0,71 g Na2HPO4, 8,1 g NaCl, 3,0 g Tris-HCl, 0,5 g sacharozy, rozcieńczone łącznie w 1 1 i ustawione na pH 7,9). Płytki poruszono i pozostawiono w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Pożywkę usunięto następnie z płytek i zastąpiono 2 ml Tris-solanki. Płytki pozostawiono w temperaturze pokojowej na 2 minuty, następnie Tris-solankę usunięto i zastąpiono 10 ml nieselektywnej pożywki. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez dwa dni.

Tabela 1 Transfekcja*

	544	545	544 Kontrolna	545 Kontrolna
Nazwa plazmidu
Klon 544	15 pl	—	15 pl
Klon 545	—	30 pl	—	30 pl
p486	1,5 pl	1,5 pl	—
Nośnikowe DNA	1,6 pl	1,6 pl	1,6 pl	1,6 pl

* użyte stężenia DNA: klon 544,0,7 pg/pl; klon 545, 0,3 pg/pl; p486, 1,49 pg/pl.

184 114

Po dwudniowej inkubacji, komórki rozcieńczono w pożywce selekcyjnej (DMEM zawierająca 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 1% mieszanki antybiotykowej PSN i 150 nM metotreksatu) i umieszczono na wielkich płytkach w rozcieńczeniach 1:100, 1:250 i 1:500. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez tydzień. Po tygodniu, pożywkę zmieniono i zastąpiono pożywką selekcyjną, a płytki zbadano na tworzenie kolonii.

Po 8 dniach, po utworzeniu kolonii, 12 kolonii wybrano przypadkowo z płytki rozcieńczenia 1:500 płytki transfekcji #544 i #545. Każdy klon umieszczono na płytkach w jednej studzience 6-studzienkowej płytki i hodowano w pożywce selekcyjnej. Po 7 dniach, płytki zlały się, i klony rozdzielono na płytki 10 cm w pożywce selekcyjnej.

Klony opisane powyżej i kontrolne komórki transfekowane w celu ekspresji dzikiego typu czynnika VII znakowano metabolicznie ³⁵S-Metionine-Cysteine Protein Labeling Mix (NEN DuPont Biotechnology Systems, Wilmington, DE). Klony hodowano i przygotowano do eksperymentu znakowania pulsacyjnego w selektywnej pożywce. Komórki przepłukano solanką buforowaną fosforanem (Sigma, St Louis, MO) i napromieniowano przez 4 godziny w 20 pCi/ml 35S-Cys-35S-Met. Po 4 godzinach supematanty i komórki zebrano. Komórki lizowano zgodnie z opisem Lenka i Penmana (Celi 16: 289-302 (1979)) i 400 pl każdego lizatu i oczyszczono wstępnie 50 pl staph A (Sigma, St. Louis, MO).

Próbki metabolicznie znakowanych komórek poddano radioimmunostrącaniu (RIP) najpierw inkubując próbki z 6 pl poliklonalnej antysurowicy anty-czynnik VII przez 4 godziny. 60 pl przemytego gronkowcowego białka A dodano do każdej próbki, i próbki kołysano przez

1,5 godzin w temperaturze 4°C. Próbki odwirowano i supernatant usunięto. Granulki przemyto dwukrotnie w buforze 0,7 M RIPA (10 mM Tris, pH 7,4, 1% kwasu deoksycholowego [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1% Triton Χ-100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 0,7 M NaCl) i raz 0,15 M buforze RIPA (10 mM Tris, pH 7,4 1% kwas deoksycholowego [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1% Triton Χ-100, 0,1 SdS, 5 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Do każdej próbki dodano 100 pl 1x barwnika SDS (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM ditiotrieitolu, 2% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego, 10% gliceryny), i próbki gotowano przez 5 minut, następnie odwirowano dla usunięcia białka A. 50pl każdej próbki puszczono na 10% żel poliakrylamidowy. Wyniki pokazały, że 9 z 10 klonów wydzielało zmodyfikowany czynnik VII.

Przykład II

Aktywność antykoagulacyjna zmodyfikowanego czynnika VII

Zdolność białka zmodyfikowanego czynnika VII do inhibicji krzepnięcia zmierzono w jednoetapowej próbie krzepnięcia stosując dzikiego typu czynnik VII jako kontrolny. Rekombinacyjne białko wytworzono zgodnie z opisem powyżej z komórek hodowanych w pożywkach zawierających 5 pg/ml witaminy K. Zmienne ilości zmodyfikowanego czynnika VII (z klonu 544) lub rekombinacyjnego dzikiego typu czynnika VII rozcieńczono w 50 mM Tris pH 7,5, 0,1% BSA do 100 pl. Mieszaniny unkubowano ze 100 pl osocza bez czynnika VII (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KS) i 200 pl tromboplastyny C (Dade, Miami, FL; zawiera tromboplastynę mózgu królika i 11,8 mM Ca++). Próbę krzepnięcia przeprowadzono w timerze automatycznej koagulacji (MLA Electra 800, Medical Laboratory Automation Inc., Pleasantville, NY), i czasy krzepnięcia przekształcono w jednostki aktywności czynnika VII stosując standardową krzywą skonstruowaną z rozcieńczeń 1:5 do 1:640 normalnego połączonego ludzkiego osocza (z założenia zawierającego jedną jednostkę na ml aktywności czynnika VII; wytworzonego przez połączenie cytrynianowanego osocza od zdrowych dawców). W tej próbie preparaty zmodyfikowanego czynnika VII nie wykazywały wykrywalnej aktywności koagulanta. Tabela 2 pokazuje wyniki próby w kategoriach czasów krzepnięcia dla kontrolnej (nietransfekowanej) pożywki kondycjonowanej komórki BHK (+/witamina K), dzikiego typu czynnika VII i dwu izolatów komórek wydzielających zmodyfikowany czynnik VII. Aktywność czynnika VII jest widziana jako redukcję czasu krzepnięcia w porównaniu z próbką kontrolną.

184 114

Tabela 2

Próbka	Rozcieńczenia	Czas krzepnięcia (s)
Kontrolna +K	1:5	33,1
1:10	33,4
Kontrolna -K	1:5	34,3
1:10	33,2
Dzikiego typu	1:20	19,0
Czynnik VII	1:40	21,5
1:80	23,3
Zmodyfikowany czynnik VII (#6)	1:1	33,5
Zmodyfikowany czynnik VII (#10)	1:1	32,5

W celu określenia wpływu zmodyfikowanego czynnika VII na substraty czynnika osocza, preparaty zmodyfikowanego czynnika VII i rekombinacyjnego dzikiego typu lub rodzimego czynnika VII inkubuje się z czynnikiem X lub czynnikiem IX i jego aktywację monitoruje metodą próby krzepnięcia lub elektroforezy na żelu poliakryloamidowym.

Przykład III

Zdolność zmodyfikowanego czynnika VII do wiązania czynnika tkankowego

Zdolność zmodyfikowanego czynnik VII do współzawodniczenia z dzikiego typu czynnikiem VII o czynnik tkankowy i inhibicji jego aktywności krzepnięcia testowano w jednoetapowej próbie krzepnięcia wo bccności ograniczającej ilości czynnika tkankowego (tromboplastyny).

Czas krzepnięcia określono w jednoetapowej próbie podobnej do opisanej w przykładzie II. Ograniczoną ilość czynnika tkankowego, stałą ilość dzikiego typu czynnika VII, rosnące ilości wariantu czynnika VII użyto w eksperymentach mieszania. Inhibicję prokoagulacyjnej aktywności czynnika VII/VIIa będzie widać jako wzrost czasów krzepnięcia w próbach stosujących rosnące ilości wariantu czynnika VII.

Aktywność czynnika VII w testowanej próbce obliczono jako procent standardowej krzywej mierzącej aktywność czynnika VII w normalnie zbieranym osoczu. Standardową krzywą dla aktywności czynnika VII utworzono stosując seryjne rozcieńczenia normalnie zbieranego osocza w roztworze buforowanym fosforanem (PBS) wahające się od 1:5 do 1:640. Do tego celu zauważono, że normalne osocze zawiera w przybliżeniu 500 ng/ml czynnika VII i przyjęto to za jedną jednostkę aktywności. Mieszaniny 100 pi osocze bez czynnika VII, 100 pl rozcieńczenia osocza i 200 pl tromboplastyny-C (Dade, Miami, FL.) użyto do mierzenia czasu krzepnięcia na automatycznym timerze MLA Electra 800. W celu ustalenia standardowej krzywej, wyniki wykreślono jako procent aktywności (1:5 = 100% aktywności) w funkcji czasu krzepnięcia w sekundach.

Próba wymaga, aby pożywka zawierająca dzikiego typu czynnik VII i wariant czynnika VII zawierała mniej niż 1%o surowicy. Rozcieńczenia wykonanego PBS, aby czasy krzepnięcia wypadały wzdłuż standardowej krzywej. Minimalne rozcieńczenie 1:2 było typowe. Końcowa objętość wynosiła 100 pl. W eksperymentach testowano dwa różne warianty Ser^——Ala ludzkich czynników VII, oznaczone jako klony „#10” i „#6”. Wyniki, umieszczone w tabeli poniżej, pokazują, że ze wzrostem ilości wariantu czynnika VII procent aktywności czynnika VIIa spada.

Tabela 3

Wyniki próby mieszania z wariantami Ser₃44-—Ala (pożywkę B4A1 (dziki typ) użyto jak 100% aktywności dla 10 pl mieszaniny reakcyjnej)

Ser344 —— Ala klon nr	Ilość pożywki wariantu	Ilość pożywki B4A1	Kontrolna BHK.’	Procent aktywności FVIIa
#10	10 pl	10 pl	0	70
#10	20 pl	10 pl	0	51
#10	30 pl	10 pl	0	43
#10	40 pl	10 pl	0	34
#10	50 pl	10 pl	0	28
#10(-K)D	20 pl	10 pl	0	78
#6	10 pl	10 pl	0	74
#6	20 pl	10 pl	0	56
#6	30 pl	10 pl	0	46
#6	40 pl	10 pl	0	41
#6	50 pl	10 pl	0	32
#6 (-K)	20 pl	10 pl	0	85
BHK kontrolna	0	10 pl	20 pl	91
BHK kontrolna (-K)	0	10 pl	20 pl	107

* Nietransferowana kondycjonowana pożywka s

Dla ekspresji wariantu czynnika VII, komórki hodowano w obecności witaminy K, poza oznaczonymi „(-K)”

Eksperymenty wykazały, że warianty czynnika VII mające podstawienie Ser₂^ —> Ala współzawodniczyły z rodzimym czynnikiem VII w sposób zależny od dawki i inhibitowały prokoagulacyjną aktywność rodzimego czynnika VII/VIIa. Można więc wnioskować, że wariant Serj44 —> Ala ludzkiego czynnika VII współzawodniczy z rodzimym czynnikiem VIIa i w konsekwencji inhibituje aktywację czynnika X i/lub IX w ludzkim osoczu.

Przykład IV

Reakcja czynnika VII z PPACK

Rekombinacyjny czynnik VII wytwarzano w transfekowanych komórkach nerek młodego chomika. Białko oczyszczono i aktywowano zgodnie z opisami Thima i in. (Biochemistry 27: 7785-7793, 1988), Brinkousa i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1382-1386, 1989) i Bjoerna i Thima (Res. Disci. No. 269, 564, 1986), dołączanymi jako odnośniki. Pożywkę hodowli komórkowej odzyskano, przesączono i rozcieńczono w celu zmniejszenia stężenia soli. Rozcieńczoną pożywkę frakcjonowano następnie metodą anionowymiennej chromatografii stosując bufor elucji zawierający CaCl₂. Frakcję czynnika VII odzyskano i oczyszczono metodą immunochromatografii stosując zależne od wapnia monoklonalne przeciwciało anty-czynnik VII. Dodatkowe oczyszczanie prowadzono stosując dwa etapy anionowymiennej chromatografii, w których czynnik VII eluowano stosując odpowiednio CaCl₂ i NaCl. Czynnik VIIa odzyskano w końcowym eluacie.

Rekombinacyjny czynnik VIIa (1 pM) w 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7,4 inkubowano z 20 pM Ppack (D-fenyloalanilo-prolilo-arginylochlorometyloketon; Calbichem, La Jolla, CA) przez 5, 20 i 60 minut. Następnie bufor zawierający chromogeniczny substrat S2288 (p-nitroanilid H-D-izoleucyno-L-prolilo-L-argininu; Kabi Vitrum AB, Molndal, Szwecja) z wytworzeniem 2,5-krotnego rozcieńczenia i końcowego stężenia 0,3 mM S2288.

184 114

Wytwarzanie p-nitroaniliny zmierzono i porównano z wynikami uzyskanymi przy stosowaniu nietraktowanego czynnika VIIa jako kontrolnego. Wyniki wskazują, że czynnik VIIa jest w pełni dezaktywowany po około 60 minutach w tych warunkach reakcji.

Przykład V

Wytwarzanie DEGR-czynnika VIIa

Rekombinacyjny ludzki czynnik VIIa wytworzono jak w przykładzie IV. Rekombinacyjny ludzki czynnik VIIa, w 10 mM glicynowego bufora, pH 8,0, 10 mM CaCl₂, 50 mM NaCl, rozcieńczono do stężenia 1,5 mg/ml. Dodano do czynnika VIIa 10-krotny molowy nadmiar dansylo-L-Glu-Gly-Arg-chlorometyloketonu, DEGRck, (Calbiochem, La Jolla, CA 92037), który rozpuszczono w destylowanej H₂O. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C dodano drugi 10-krotny molowy nadmiar DEGRck do mieszaniny i inkubowano przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 37°C. Dodano trzeci 10-krotny molowy nadmiar DEGRck do czynnika VIIa i inkubowano przez w przybliżeniu 16 godzin w temperaturze 4°C. Następnie próbki DEGR-czynnik VIIa intensywnie dializowano w temperaturze 4°C wobec solanki buforowanej Tris (0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,5) w celu usunięcia wszelkiego wolnego DEGRck.

Końcową mieszaninę DEGR-czynnik VIIa testowano na obecność wolnego DEGRck w próbie chromogenicznego substratu czynnika Xa. Mieszaninę DEGR-czynnik VIIa dodano do oczyszczonego ludzkiego czynnika Xa wraz z chromogenicznym substratem S-2222. Substrat jest rozcinany specyficznie czynnikiem Xa, a nie czynnikiem VIIa. Niezwiązany DEGRck w mieszaninie może wiązać czynnik Xa i w ten sposób inhibitować chromogeniczną aktywność czynnika Xa. Wprowadzanie wolnego DEGRck w mieszaninę czynnika Xa generowało standardową krzywą mierzącą poziom wolnego DEGRck w roztworze w funkcji inhibicji chromogenicznej aktywności czynnika Xa. Analiza mieszaniny DEGR-czynnik VIIa pokazała, że stosunek wolny DEGRck:DEGR-czynnik VIIa był mniejszy niż 0,5% po intensywnej dializie, upewniając, że inhibicja obserwowana dla DEGR-czynnika VIIa w różnych układach prób opisanych poniżej nie była spowodowana obecnością wolnego DEGRck.

Przykład VI

Wytwarzanie czynnika Xa w komórkach mięśni gładkich szczura

Komórki naczyniowych mięśni gładkich zanalizowano na obecność czynnika tkankowego powierzchni komórki mierząc zdolność komórek do stymulacji konwersji czynnika X w czynnik Xa przy stosowaniu chromogenicznego substratu specyficznego dla czynnika Xa.

Komórki naczyniowych mięśni gładkich szczura (Clowes i in., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)) umieszczono na płytkach w 96-studzienkowych naczyniach do kultur (American Scientific Products, Chicago, II.) w ilości 8000 komórek na studzienkę w pożywce wzrostowej (tabela 4).

Tabela 4

500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle Dulbecco (DMEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, M D.)

10%o płodowej surowicy cielęcej (Hyclone, Logan, UT.) mM pirogronianu sodu (Irvine, Santa Ana, CA.)

0,29 mg/ml L-glutaminy (Hazelton, Lenexa, KS.)

1x PSN; (100X oznacza 5 mg/ml penicyliny, 5 mg/ml streptomycyny, 10 mg/ml neomycyny) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.)

Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C pożywkę zmieniono na pożywkę bez surowicy (tabela 5).

184 114

Tabela 5

250 ml zmodyfikowana pożywka Eagle Dulbecco (DMEM)

250 ml pożywka Ham F-12 (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) 1m M pirogronianu sodu

0,29 mg/ml L-glutaminy pM transferyny (JRH, Lenexa, KS.) pM insuliny (GIBCO-BRL) ng selenu (Aldrich, Milwaukee, WI.) mg/ml albumin surowicy bydlęcej (Sigma, St. Louis, MO)

Komórki inkubowano 72 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji, dodano PDGF-BB (10 ng/ml) lub 10% płodowej surowicy cielęcej do komórek w celu stymulowania ekspresji czynnika tkankowego (Taubman i in., J. Clin. Invest. 91:547-552, 1993). Równoległy zestaw komórek nie otrzymał PDGF i serum, aby móc ocenić wewnętrzną aktywność niestymułowanych komórek. Po 6 godzinach inkubacji, dodano do komórek rekombinacyjny ludzki czynnik VIIa w końcowym stężeniu 10 mM. Jeden zestaw komórek nie zawierał dodanego czynnika VIIa jako negatywna próba kontrolna. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C i przemyto buforem HEPES (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM CaCf, 11 mM glukozy, 0,1% BSA). Po przemyciu komórki inkubowano przez 5 minut 50 pl na studzienkę 200 nM ludzkiego czynnika X z osocza w solance buforowanej Tris uzupełnionej 5 mM CaCĘ. Do każdej studzienki dodano 25 pl 0,5 M EDTA i 25 pl 800 pM roztworu chromogenicznego substratu S-2222 (Kabi Pharmacia, Franklin, OH). Płytki inkubowano przez 40 minut w temperaturze pokojowej, następnie analizowano przy 405 nm stosując mikropłytkowy czytnik THERMOMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Tabela 6 pokazuje wzrost absorbancji dla studzienek potraktowanych czynnikiem VIIa w porównaniu z kontrolnymi studzienkami (bez dodanego czynnika VIIa). Wzrost absorbancji jest bezpośrednią miarą poziomu czynnika Xa generowanego w studzienkach i jego następnego rozcinaniem chromogenicznego substratu, uwalniającego chromofor. Dane wykazują także, że poziom chromogenicznej aktywności w komórkach wstępnie potraktowanych PDGF-88 lub 10% płodowej surowicy cielęcej był wyższy niż u niestymulowanych komórek.

Tabela 6

Próbka testowana	OD405
Kontrolna	0,043
Wewnętrzna	0,247
PDGF-BB	0,360
10% FCS	0,342

Wyniki wyraźnie pokazują, że istnieje zależna od czynnika VIIa aktywacja czynnik X do czynnika Xa na powierzchni komórek naczyniowych mięśni gładkich szczura.

Przykład VII

Inhibicja powierzchniowej aktywności chromogenicznej komórki przez DEGR-czynnik VIIa Komórki naczyniowych mięśni gładkich szczura umieszczono na płytkach w 96-studzienkowych naczyniach do kultur, jak opisano powyżej. Komórki hodowano przez 72 godziny w pożywce bez surowicy, jak opisano powyżej, i potraktowano dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej przez 6 godzin w celu stymulowania ekspresji czynnika tkankowego. Po stymulacji, sam bufor (kontrolnie), 10 nM czynnika VIIa, lub 10 nM czynnika VIIa + 100 nM

184 114

DEGR-czynnika VIIa dodano do każdej studzienki. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, następnie przemyto buforem HEPES. Po przemyciu, komórki inkubowano przez 5 minut 50 pi na studzienkę 200 nM czynnika X w solance buforowanej Tris uzupełnionej 5 mM CaCl2. Do każdej studzienki dodano 25 pl 0,5 M EDTA i 25 pl (800 pM) chromogenicznego substratu S-2222 (Kabi Pharmacia). Komórki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Chromogeniczną aktywność zanalizowano przy 405 nm jak opisano powyżej.

Tabela 7 pokazuje stymulację chromogenicznej aktywności w studzienkach potraktowanych tylko czynnikiem VIIa, i inhibicję stymulacji, gdy DEGR-czynnik VIIa współinkubowano z czynnikiem VIIa. Wyniki pokazują, że DEGR-czynnik VIIa działa jako współzawodniczący antagonista dla wiązania czynnika VIIa, inhibitując w ten sposób aktywację czynnika X do czynnika Xa i dalsze rozszczepianie chromogenu S-2222.

Tabela 7

Próbka testowana	OD405
Kontrolna	0,035
Czynnik VIIa	0,342
Czynnik VIIa + DEGR-czynnik VIIa	0,073

Przykład VIII

Zależna od dawki inhibicja przez DEGR-czynnik VIIa powierzchniowej aktywności chromogenicznej komórek naczyniowych mięśni gładkich szczura

Komórki naczyniowych mięśni gładkich szczura umieszczono na płytkach w 96-studzienkowych naczyniach do kultur przy 4000 komórek na studzienkę w pożywce wzrostowej uzupełnionej 1% płodowej surowicy cielęcej (jak w tabeli 4 bez 10% płodowej surowicy cielęcej). Po 5 dniach pożywkę usunięto, i dodano do komórek rosnące stężenia samego czynnika VIIa lub 10 nM czynnika VIIa z rosnącymi stężeniami DEGR-czynnika VIIa. Komórki inkubowano z mieszaniną czynnika VII przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji, komórki przemyto i inkubowano 50 pl 200 nM czynnika X w solance buforowanej Tris przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Każda studzienka zawierała dodatkowo 25 pl 0,5 M EDTA i 25 pl 800 pM S-2222 (Kabi Pharmacia), i płytki inkubowano przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Chromogeniczną aktywność analizowano przy 405 nm w czytniku mikropłytkowym, jak opisano powyżej.

Tabela 8 pokazuje zależny od dawki wzrost chromogenicznej aktywności przy rosnącej ilości czynnika VIIa dodanego do studzienek. Gdy do komórki dodano mieszaninę DEGR-czynnik VIIa z 100 nM czynnika VIIa (tabela 9), wystąpiła zależna od dawki inhibicja chromogenicznej aktywności. Przy stosunku molowym 1:1 DEGR-czynnik VIIa:czynnik VIIa występowała inhibicja w przybliżeniu 95% chromogenicznej aktywności. Dane te sugerują że w tym eksperymencie DEGR-czynnik VIIa wykazuje znacząco wyższe powinowactwo do czynnika tkankowego powierzchni komórki niż rodzimy czynnik VIIa na kulturze komórek mięśni gładkich. Gdyby DEGR-czynnik VIIa i czynnik VIIa miały równe powinowactwa wiązania czynnika tkanowego, poziom inhibicji obserwowany po dodaniu dwu cząsteczek do komórki w równym stosunku molowym nie byłby taki wysoki.

Tabela 8

Stężenie czynnika VIIa (nM)	OD405
0,10	0,005
0,39	0,025
1,56	0,058
6,25	0,111
25,00	0,154
100,0	0,208

Tabela 9 pokazuje zależną od dawki inhibicję chromogenicznej aktywności czynnika Xa komórek mięśni gładkich szczura przez DEGR-czynnik VIIa. Rosnące stężenia DEGR-czynnika VIIa współinkubowano ze 100 nM czynnika VIIa, i chromogeniczną aktywność czynnika Xa określono stosując chromogeniczny substrat S-2222.

Tabela 9

Stężenie DEGR-czynnika VIIa (nM)	OD405
0,00	0,208
0,39	0,176
1,56	0,116
6,25	0,073
25,00	0,026
100,00	0,014

Przykład IX

Inhibicja wytwarzania czynnika Xa przez DEGR-czynnik VIIa w próbie rozpuszczalnego czynnika tkankowego

Konwersję czynnika X do czynnika Xa przy użyciu oczyszczonego rekombinacyjnego rozpuszczalnego czynnika tkankowego ustalono w próbie chromogenicznej. Czynnik tkankowy poddano ekspresji i oczyszczono z Saccharomyces cerevisiae (Shigematsu i in., J. Biol. Chem. 267:21329-21337, 1992). Rozpuszczalny czynnik tkankowy oczyścił i zbadał dr W. Kisiel (University of New Mexico). Wytworzono mieszaninę reakcyjną zawierającą 65,9 pl rozpuszczalnego czynnika tkankowego (2,2 pM), 29,0 pl PCPS (1 mM, Sigma, St. Louis, MO), 29,5 pl ludzkiego czynnika X (4,1 pM), 2,77 ml bufora Hanka (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5 mM CaCl2, 0,1% BSA). Dodano 40 pl mieszaniny czynnik tkankowy/czynnik X, 25 pl czynnika VIIa rozcieńczonego TBS i 25 pl DEGR-czynnika VIIa rozcieńczonego TBS do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania. Dołączono kontrolę stosując 40 pl mieszaniny czynnik tkankowy/czynnik X; 25 pl czynnika VIIa rozcieńczonego TBS, i tylko 25 pl TBS. Dodano 10 pl (4 mM) chromogenicznego substratu S-2222 do mieszaniny reakcyjnej w studzienkach i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2-10 minut. Wyniki zanalizowano przy 405 nm na czytniku mikropłytkowym jak opisano powyżej.

Określenia standardowej krzywki dla aktywacji czynnikiem VIIa czynnika X dokonano stosując rosnące stężenia czynnika VIIa dodawanego w nieobecności DEGR-czynnik VIIa. Wyniki, przedstawione w tabeli 10, pokazują, że występuje zależny od dawki wzrost chromogenicznej aktywności z rosnącą ilością czynnika VIIa dodanego do mieszaniny reakcyjnej. Jednoczesne dodawanie zmiennych ilości DEGR-czynnik VIIa i 100 nM czynnika VIIa prowadzi do zależnego od dawki spadku chromogenicznej aktywności (tabela 11). Dane te pokazują, że DEGR-czynnik VIIa działa jako współzawodniczący antagonista dla wiązania ^^-4 114 rodzimego czynnika VIIa z rozpuszczalnym czynnikiem tkankowym, a więc inhibituje wytwarzanie czynnika Xa, jak zmierzono spadkiem chromogenicznej aktywności wobec chromogenicznego substratu S-2222.

Tabela 10

Stymulacja chromogenicznej aktywności czynnika Xa rosnącymi stężeniami czynnika VIIa dodawanego do rozpuszczalnego czynnika tkankowego.

Zmiany optycznej gęstości mierzono stosując chromogeniczny substrat S-2222

Stężenie czynnika VIIa (nM)	OD405
0,78	0,168
1,56	0,288
3,12	0,478
6,25	0,694
12,50	0,764
25,00	0,790
50,00	0,738
100,00	0,770

Tabela 11

Inhibicja chromogenicznej aktywności czynnika Xa przez dodanie DEGR-czynnika VIIa do rozpuszczalnego czynnika tkankowego w obecności rodzimego czynnika VIIa. Zmiany optycznej gęstości mierzono stosując chromogeniczy substrat S-2222

Stężenie DEGR-czynnika VIIa (nM)	OD405
0,00	0,208
0	0,810
50	0,750
100	0,609
200	0,296
400	0,167
800	0,083
1600	0,055

Przykład X

Inhibicja koagulacji przez DEGR-czynnik VIIa

Standardowe próby krzepnięcia do badania wpływu DEGR-czynnika VIIa na czas krzepnięcia wykonano jak następuje: 100 pl normalnego osocza pawiana, zebranego do cytrynianu sodu jako antykoagulanta, dodano do 100 pl zmiennych stężeń DEGR-czynnika VIIa rozcieńczonego w TBS (20 mM Triis, pH 7,4, 150 mM NaCl). Próbki mieszano i krótko inkubowano w temperaturze 37°C. Próbki umieszczono w Automatic Coagulation Timer Electra 800 (Medical Laboratories Automation, P^asan^U, NY). Po inkubacji dodano 200 pl preparatu czynnika tkankowego zawierającego 25 mM CaCl₂ do preparatów DEGR-czynnik VIIa. Preparat czynnika tkankowego wytwarzano jako ekstrakt solankowy z mózgu pawiana ze świeżo zamrożonej tkanki mózgowej i zbadano na jego zdolność do inicjacji koagulacji w osoczu pawiana. Dobrano stężenie czynnika tkankowego dające czas krzepnięcia około 40 s.

Dane przedstawione w tabeli 12 wykazują zależny od dawki wzrost czasu krzepnięcia wskutek dodania DEGR-czynnika VIIa. Dawka tak niska jak 1 pg/ml DEGR-czynnika VIIa w osoczu dała znaczący wzrost czasu krzepnięcia.

Tabela 12

Zależny od dawki wzrost czasu krzepnięcia wskutek dodania DEGR-czynnika VIIa

DEGR-czynnik VIIa pg/ml osocza)	Czas krzepnięcia (s)
0	40,7
0,5	46,2
1,0	50,8
2,5	64,5
5,0	108,1
10,0	158,4

Przykład XI

Inhibicja akumulacji płytek DEGR-czynnikiem VIIa

DEGR-czynnik VIIa analizowano na jego zdolność do inhibicji akumulacji płytek w miejscach arterialnej zakrzepicy wskutek mechanicznego uszkodzenia u nie-ludzkich naczelnych. Model aortowej endarterektomii wykorzystano u pawianów, zgodnie z opisem Lumsdena i in. (Blood 81:1762-1770)). Część aorty pawiana długości 1-2 cm usunięto, wywrócono i zdrapano w celu usunięcia błony wewnętrznej arterii i w przybliżeniu 50% mięśniówki. Arterię wywrócono z powrotem do poprawnej orientacji, kaniulowano na obu końcach i umieszczono w pozaustrojowym przecieku u pawiana, wystawiając mechanicznie uszkodzoną arterię na działanie krwi pawiana przez przeciek. Zaraz przed otwarciem przecieku do cyrkulacji krwi zastrzyknięto dożylnie zwierzęciu znakowane ^1HIn autologiczne płytki. Poziom akumulacji płytek w miejscu uszkodzonej arterii określano z obrazu kamery gamma w czasie rzeczywistym.

Ocenę DEGR-czynnika VIIa pod względem inhibicji akumulacji płytek wykonano stosując zastrzyki DEGR-czynnik VIIa lub solanki kontrolnej dawane tuż przed otwarciem przecieku. Uszkodzone arterie badano w sposób ciągły przez 60 minut. Dawka 0,005 mg/kg DEGR-czynnik VIIa inhibitowała akumulację płytek. Przy zastrzyku 1,0 mg/kg, w przybliżeniu 90% akumulacji płytek zostało inhibitowane w 1 godzinę po podawaniu leku. Wyniki pokazano na fig. 2.

Dane te pokazują, że inhibicja czynnika tkankowego DEGR-czynnik VIIa może znacząco inhibitować rozwój bogatych w płytki skrzepów, w nie-ludzkim modelu z naczelnymi, ostrych naczyniowych uszkodzeń.

Przykład XII

DEGR-F VIIa inhibituje naczyniowy nawrót zwężenia po powietrznej angioplastyce u królików z miażdżycą

DEGR-F VIIa oceniono na jego zdolność do modulacji rozwoju uszkodzeń po powietrznej angioplastyce u królików New Zealand White (NZW) z miażdżycą. Ten model zwierzęcy został dobrze zbadany i udowodniono, że jest to dobry model do oceny antyzakrzepowych związków przy rozwoju uszkodzeń naczyniowych (Gimple i in., Circulation 86:1536-1546 (1992), i Rogosta i in., Circulation 89:1262-1271 (1994)). Zwierzęcy model użyty do oceny DEGR-F VIIa jest zgodny z opisem Ragosty, ibid.

Wywołano anestezję u królików 5 mg/kg ksylazyny i 35 mg/kg ketaminy przez domięśniowy zastrzyk. Bliskie udowe arterie odsłonięto przecinając poniżej wiązadła pachwinowego z podwiązaniem bliskim i dalekim. Wydzielone segmenty kaniulowano igłami 27. Nakłuciem utworzono odprowadzenie. Wydzielone segmenty przemyto solanką w celu usunięcia pozostałej krwi, i osuszono powietrzem tłoczonym 80 ml/min przez 8 minut. Po suszeniu powietrzem wydzielone segmenty znów przemyto solanką i podwiązania usunięto. Hemostazę zachowano nieokludującym lokalnym ciśnieniem. Segmenty oddzielono metalowymi spinkami. Lokalny skurcz potraktowano lokalnie 1% ksylokainą. Dzień po operacji zwierzęta pozostawiono na diecie z 1% cholesterolu i 6% oleju arachidowego na jeden miesiąc do powietrznej angioplastyki. Podawano doustnie tylenol 10 mg/kg dla złagodzenia pooperacyjnego bólu przez 3-5 dni. W dniach 3 do 5 po operacji podano 1 cm3 ambipenu.

Dostarczanie testowanego leku zwierzętom polegało na początkowym zastrzyku bezpośrednio przed powietrzną angioplastyką, następnie ciągłej systemowej infuzji pompą osmotyczną przez wewnętrzną żyłę szyjną. Czas trwania infuzji leku wynosił 3 dni. Kontrolne zwierzęta dostały heparynę, 150 U/kg dożylny zastrzyk, przed powietrzną angioplastyką. po infuzji solanki. Zwierzęta potraktowane DEGR-FVIIa dostawały zastrzyk 1 mg/kg i infuzję 50 pg/kg/godzinę.

W celu umieszczenia pomp osmotycznych do ciągłej systemowej infuzji, indukowano znieczulenie u zwierząt, jak opisano powyżej, i podtrzymywano podczas procedury dodatkowymi zastrzykami domięśniowymi ketaminy i ksylazyny. Poprzez nacięcie środka karku wydobyto prawą wewnętrzną żyłę szyjną metodą tępego rozdzelenia oddalone końce podwiązano. Wprowadzono silastykową rurkę (PE-160) do prawej wewnętrznej żyły szyjnej. Utworzono podskórny tunel do przeprowadzenia silastykowej rurki. Rurkę połączono z pompą osmotyczną. Pompę osmotyczną implantowano podskórnie w kark królika. Prawą wspólną arterie szyjną wydzielono metodą tępego rozdzielenia i oddalone końce podwiązano. Poprzez arteriotomię wprowadzono intubator 5F i przesunięto do rozgałęzienia łuku aorty. Krew pobierano do oceny parametrów hemostatycznych, poziomów leków i cholesterolu. Wprowadzono do arterii 20 mg ksylokainy. Przeprowadzono kontrolny aortobiodroudowy angiogram przez kateter Bermana 5F umieszczony powyżej rozgałęzienia aorty stosując 3-4 ml renografiny wstrzykiwanej w czasie 3 s ręcznie.

Po usunięciu katetera Bermana wprowadzono 0,356 mm drut prowadzący do opadającej aorty i umieszczono powyżej rozgałęzienia aorty. Pod fluoroskopem, wprowadzono właściwych rozmiarów kateter do powietrznej angioplastyki mający 2,0 do 2,5 mm i przesunięto wzdłuż drutu umieszczając w poprzek zwężenia. Balon napełniono do 0,6 MPa na 60 s ręczną pompką. Przeprowadzono 3 napełnienia z 60 s przerwami pomiędzy napełnieniami. Procedurę przeprowadzono w obu udowych arteriach na każdym zwierzęciu.

Po powietrznej dylatacji kateter angioplastyczny usunięto i wprowadzono jeszcze raz kateter Bermana do położenia 3 cm powyżej rozgałęzienia aorty. Dla zmniejszenia skurczu podano do arterii 20 mg lidokainy. Poprocedurowy angiogram przeprowadzono jak opisano powyżej. Siatkę 1 cm umieszczono na poziomie arterii udowej w celu obliczenia rzeczywistej średnicy. Następnie kateter usunięto. Prawą arterią szyjną zaszyto jedwabiem 3-0 i ranę zaszyto warstwowo. Ponadto ambipen i acetaminofen jak powyżej.

Czas protrombiny i stężenie DEGR-FVIIa we krwi określono tuż przed zastrzykiem testowanego związku, godzinę po zastrzyku i po 3 dniach na koniec ciągłej infuzji. Otrzymano 1 do 2 ml osocza z cytrynianem i określono czasy protrombiny i poziomy antygenu.

Zastosowano standardową próbę krzepnięcia do obserwacji czasu protrombiny u kontrolnych i potraktowanych DEGR-FVIIa zwierząt jak poniżej. 25 pl testowanego osocza królika, zebranego z cytrynianem sodu jako antykoagulantem, dodano do 150 pl TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl). Próbki wymieszano i umieszczono w Automated Coagulation Timer Electra 800 (Medical Laboratories Automation, Pleasantville, NY). Po inkubacji do preparatów osocza dodano 200 pl preparatu tromboplastyny (Sigma Chemical) zawierającego 25 mM CaCl,. Wybrano stężenie tromboplastyny dające czas krzepnięcia w przybliżeniu 20 s w kontrolnym osoczu królika.

Użyto próby ELISA dla określenia stężenia DEGR-FVIIa w próbce osocza z kontrolnych i potraktowanych DEGR-FVIIa królików. Próba obejmowała najpierw rozcieńczanie anty-ludzkiego monoklonalnego przeciwciała FVII (dr W. Kisiel, U. of New Mexico) do 2,0 pg/ml w 0,1 M węglanowym buforze o pH 9,6, i dodanie 100 pl/studzienkę do 96-stu26 dzienkowych płytek. Płytki inkubowano następnie w temperaturze 4°C przez noc i następnie przemyto dwukrotnie stosując bufor przemywający (PBS, pH 7,4, zawierający 0,05% Tween 20). Blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania osiągnięto 200 pl bufora blokującego na studzienkę (PBS, pH 7,4, zawierający 0,05% Tween 20 i 1% BSA) inkubowanego w temperaturze 37°C przez 2 godziny, następnie przemywanie z użyciem bufora przemywającego.

Po blokowaniu dodano standardową serię rozcieńczeń DEGR-FVIIa z zakresu 20-0,027 ng/ml, wraz z serią rozcieńczeń testowanego osocza królika (1:100 to 1:4000 w buforze blokującym) w ilości 100 pl/studzienkę. Nieimmunizowane osocze królika użyto jako negatywną kontrolę. Płytki inkubowano następnie przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i przemyto 4x buforem przemywającym.

DeGR-F VIIa wykryto dodając 100 pl/studzienkę rozcieńczenia 1:1000 króliczego anty-ludzkiego poliklonalnego przeciwciała FVII (dr Kisiel, U, New Mexico) w buforze blokującym. Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, następnie przemyto 5x buforem przemywającym. Specyficzne wiązanie przeciwciała wykryto stosując 100 pl/studzienkę rozcieńczenia 1:2000 koniugatu koziego anty-króliczego przeciwciała IgG z peroksydazą (Tago, Inc.). Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i przemyto 6x buforem przemywającym. Na koniec dodano 100 pl roztworu substratu (0,42 mg/ml dichlorowodorku ofenylenodiaminy [OPD] w 0,2 M bufora cytrynianowego, pH 5,0, zawierającego 0,3% H2O2). Po 1-3 minutach w temperaturze pokojowej barwną reakcję zatrzymano dodając 100 J/studzienkę 1N H2SO4 i płytki odczytywano przy 490 nm na spektrofotometrze Microplate. Stężenie DEGR-FVIIa w próbce osocza określono porównując wartości A4₉₀ nieznanych z DEGR-FVIIa standardowej krzywej.

Analizę próbek osocza na czasy protrombiny i poziomy antygenów DEGR-FVIIa pokazuje tabela 13 i tabela 14, odpowiednio. Dane przedstawiono dla każdego indywidualnego zwierzęcia. Tabela 15 pokazuje podsumowanie średnich czasów krzepnięcia. We wszystkich przypadkach, zwierzęta potraktowane DEGR-FVIIa miały podwyższone czasy protrombiny w 1 godzinę po zastrzyku, które powróciły do poziomów sprzed zabiegu 3 dni później. Analiza poziomów antygenów DEGR-FVIIa wykazała także wysokie poziomy DEGR-FVIIa w osoczu po godzinie, wahając się pomiędzy 2-6 pg/ml w osoczu, ze znacznie niższymi krążeniowymi poziomami 3 dni później. Poziomy DEGR-FVIIa mierzone w okresie 1 godziny odpowiadają przewidywanemu wzrostowi czasu protrombiny, jak określono traktując normalne osocze królika DEGR-FVIIa in vitro i ustalając czasy protrombiny w standardowej próbie rozcieńczonej tromboplastyny.

Tabela 13

Pomiar czasów protrombiny

Numer zwierzęcia	Zabieg	Czas krzepnięcia (S)
Przed	1 godzina	3 dni
1	2	3	4	5
73	Kontrolna	24,8	22,3	17,8
74	Kontrolna	24,8	27,9	18,6
75	Kontrolna	24,6	N/D	20,5
76	Kontrolna	22	N/D	17,9
169	Kontrolna	21,2	22,9	22
170	Kontrolna	24,9	23,5	18,6
173	Kontrolna	25,9	21	20,8
174	Kontrolna	25	29,4	20,1
77	DEGR-FVIIa	22,5	40,1	18,3
78	DEGR-FVIIa	24,3	34	20,9

184 114 ciąg dalszy tabeli 13

1	2	3	4	5
80	DEGR-FVIIa	24,7	50	21,7
96	DEGR-FVIIa	N/A	N/A	21
97	DEGR-FVIIa	23,6	33,3	21,2
171	DEGR-FVIIa	20,6	45,8	21,9 -:-
172	DEGR-FVIIa	23,5	41,6	22,4 ___

N/A Dane niedostępne

Tabela 14

Test ELISA wykrywania DEGR-FVIIH w osoczu królika

Numer zwierzęcia	Zabieg	ELISA FVIIa (ng/ml)
Przed	1 godzina	3 dni
73	Kontrolna	0	13	0
74	Kontrolna	36	14	4
75	Kontrolna	0	N/A	9
76	Kontrolna	0	N/A	14
169	Kontrolna	0	0	1
170	Kontrolna 0	0	0	0
173	Kontrolna	36	31	0
174	Kontrolna	87	86	160
77	DEGR-FVIIa	0	3,210	102
78	DEGR-FVIIa	1	4,950	7
80	DEGR-FVIIa	13	4,543	661
96	DEGR-FVIIa	65	4,900	117
97	DEGR-FVIIa	4	4,600	502
171	DEGR-FVIIa	13	2,145	212
172	DEGR-FVIIa	9	2,830	228

N/A Dane niedostępne

Tabela 15

Statystyczne podsumowanie czasów krzepnięcia osocza

Niesparowany test t X	Przed
1	2
DF:	Niesparowana wartość t:	Prawd. (dwustr.):
12	1,12	0,2852
Grupa:	Zliczenie:	Średnia:	Stand.odch.:	Stand. błąd:
Kontrolna	8	24,15	1,64	0,58
DEGR-VIIa	6	23,2	1,48	0,6

18-4114 ciąg dalszy tabeli 15

1	2
Niesparowany test t X:	1 godz. po angioplastyce
DF:	Niesparowana wartość t:	Prawd. (dwustr.):
10	-5,44	0,0003
Grupa:	Zliczenie:	Średnia:	Stand. odch.:	Stand. błąd:
Kontrolna	6	24,5	3,35	1,37
DEGR-VIIa	6	40,8	6,53	2,67
Niesparowany test t X:	3 godz. po angioplastyce
DF	Niesparowana wartość t:	Prawd. (dwustr.):
13	-2,04	0,0622
Grupa:	Zliczenie:	Średnia:	Stand. odch.:	Stand. błąd:
Kontrolna	8	19,54	1,53	0,54
DEGR-VIIa	7	21,06	1,33	0,5

Trzy tygodnie po angioplastyce powtórzono angiogram jak opisano powyżej przez lewą arterię szyjną tuż przed zabiciem. Przez pionowe nacięcie dołu brzucha wydzielono dalszą aortę, zawiązano z przodu i wprowadzono kaniulę do perfuzji powyżej rozgałęzienia aorty. Dalszą aortę przepłukano 50 ml solanki, następnie in vivo utrwalono infuzją 500 ml roztworu Histochoice (AMRESCO, Solon, OH) w czasie 15 minut pod ciśnieniem 16 kPa. Po rozpoczęciu perfuzji zwierzęta zabito dużą dawką nembutalu (3 ml pentobarbitalu sodu IV, 65 mg/ml). 5 cm segment arterii udowej nacięto dwustronnie. Tkankę zachowano w roztworze Histochoice do mikroskopii optycznej.

W celu określenia rozwoju uszkodzeń błony wewnętrznej naczynia w miejscu powietrznej angioplastyki, wycięte udowe arterie pocięto na kolejne 3 mm odcinki, zanurzono w parafinie, i wycięto odcinki z wielu regionów każdej arterii. Odcinki zamocowano na szkiełkach i zabarwiono hematoksyliną i eozyną, oraz barwnikami Van Giemson. Morfometryczną analizę przeprowadzono przy pomocy Bioquant Program otrzymując pomiary pól dla światła, błony wewnętrznej naczynia i mięśniówki. Morfometryczną analizę odcinków tkanki z uszkodzonych arterii wykonano mierząc całkowite pole światła; pole błony wewnętrznej naczynia, określone z pomiaru pola w wewnętrznej elastycznej warstwie i odjęcia odpowiedniego pola światła z każdego odcinka tkanki; i pole mięśniówki, określone z pomiaru pola wewnątrz zewnętrznej elastycznej warstwy i odjęcia pola wewnątrz wewnętrznej elastycznej warstwy. Pomiar uszkodzeń błony wewnętrznej naczynia w udowych arteriach w kontrolnych i potraktowanych DEGR-FVIIa zwierząt pokazał, że występował znaczący spadek rozmiaru błony wewnętrznej naczynia u potraktowanych DEGR-FVIIa zwierząt (tabelka 16). W przeciwieństwie do tego, pomiar pola mięśniówki nie wykazał znaczących różnic pomiędzy dwoma grupami.

Tabela 16

Pomiary błony wewnętrznej i mięśniówki u potraktowanych powietrzną angioplastyką królików

Grupa	N	Błona wewn. (mm2)	Stand. odch.	Prawdopod. (dwustr.)
Kontrolna	13	0,819	0,414	0,0138
DEGR-FVIIa	10	0,438	0,192

Grupa	N	Mięśniówka (mm2)	Stand. odch.	Prawdopod. (dwustr.)
Kontrolna	13	0,389	0,098	0,172
DEGR-FVIIa	10	0,329	0,105

184 114

Dane z angiograficznych pomiarów przedstawiono w tabeli 17 jako średnią średnicę światła (MLD) ± standardowe odchylenie dla kontrolnych i potraktowanych DEGR-FVIIa zwierząt dla wszystkich trzech chwil czasowych: natychmiast przed angioplastyką, natychmiast po angioplastyce, i 21 dni po angioplastyce. Nie było znaczących różnic w MLD pomiędzy kontrolnymi i potraktowanymi DEGR-FVIIa zwierzętami przed lub natychmiast po angioplastyce. Znaczący wzrost MLD zaobserwowano, jednakże, u zwierząt potraktowanych DRGR-FVIIa w dniu 21 po angioplastyce.

Tabela 17

Pomiar minimalnej średnicy światła (MLD)

Pomiar MLD przed PTCA
Grupa	N	Średnica MLD	Stand. odch.	Prawdopod. (dwustr.)
Kontrolna	13	1,202	0,24	0,3883
DEGR-FVIIa	10	1,283	0,19
Pomiar MLD po PTCA
Grupa	N	Średnia MLD	Stand. odch.	Prawdopod. (dwustr.)
Kontrolna	13	1,492	0,551	0,5326
DEGR-FVIIa	10	1,323	0,725
Pomiar MLD po 21 dniach
Grupa	N	Średnia MLD	Stand. odch.	Prawdopod. (dwustr.)
Kontrolna	13	0,889	0,228	0,0001
DEGR-FVIIa	10	1,393	0,242

Przykład XIII

Inhibicja wytwarzania czynnika Xa powierzchni komórki na SMC pawiana przez DEGR-FVIIa

Opracowano próbę chromogeniczną powierzchni komórki, zgodnie z opisem w przykładzie VIII powyżej, do pomiaru skuteczności DEGR-FVIIa w blokowaniu wiązania FVIIa do czynnika tkankowego powierzchni komórki i następnej konwersji czynnika X w czynnik Xa na monowarstwach komórek mięśni gładkich pawiana (SMC). Sposób jest modyfikacją opisanego przez Sakai i in., J. Bio. Chem. 264:9980-9988 (1989) i Wildgoose i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87-7290-7294 (1990). SMC pawiana otrzymano z University of Washington, Seattle, WA, i hodowano z eksplantów aorty. SMC pawiana umieszczono na płytkach w 96-studzienkowych naczyniach do kultur w stężeniu 8000 komórek/studzienkę w 200 pl/studzienkę pożywki do kultur DMEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej, i trzymano w tej pożywce przez 4 dni w temperaturze 37°C w 5% CO2. W czasie próby 110 pl pożywk i usunięto, i rosnące stężenia FVIIa lub FVIIa w połączeniu z DEGR-FVIIa dodano do studzienek. Utworzono standardową krzywą dla stężenia FVIIa, wahającego się od 5 nM do 0,04 nM. W celu zmierzenia aktywności inhibicyjnej DEGR-FVIIa na aktywność FVIIa, rosnące stężenia DEGR-FVIIa dodano do testowanych studzienek wo becności stałej ilości FVIIa (5 nM). FVIIa i DEGR-FVIIa rozcieńczano buforem HEPES (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM Ca^, 11 mM glukozy, 0,1% BSA) i 10 pl 10x roztworu magazynowego dodawano do komórek. Komórki inkubowano z testowymi związkami przez 2 godziny w temperaturze 37°C, następnie przemyto 3x buforem HEPES. 50 pl 200 nM roztworu czynnika X w buforze Tris (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5 mM CaCl2, 0,1% BSA) dodano następnie do każdej studzienki. Po 4 minutach w temperaturze pokojowej, dodano 25 pl 0,5 M EDTA w celu zatrzymania konwersji czynnika X w Xa. Dodano 25 pl na studzienkę 0,8 mM S-2222, specyficznego dla czynnika Xa chromogenicznego substratu, w buforze Tris, i odczytano absorbancję przy 405 nm po 60 minutach w czytniku mikropłytek Thermomax (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA).

Wyniki, pokazane na fig. 3, wykazują zależny od dawki wzrost amidolitycznej aktywności dla potraktowanych FVIIa studzienek (puste kwadraty). Wzrost absorbancji jest bezpośrednią miarą poziomu czynnika Xa wytwarzanego w studzienkach i jego dalszego rozcinania chromogenicznego substratu. Dodanie rosnących ilości DEGR-FVIIa przy stałej ilości FVIIa (5 nM) wykazało zależny od dawki spadek amidolitycznej aktywności z rosnącymi poziomami DEGR-FVIIa (pełne kwadraty). Równy molowy stosunek DEGR-FVIIa do FVIIa mógł prowadzić do inhibicji >90% chromogenicznej aktywności. Nawet przy 10-krotnie niższym poziomie DEGR-FVIIa, wciąż występowała 40% inhibicja wytwarzania chromogenicznej aktywności czynnika Xa. Wyniki wspierają wniosek, że DEGR-FVIIa jest niezwykle silnym antagonistą aktywacji czynnika X do Xa przez FVIIa na powierzchni nietkniętych monowarstw komórek SMC.

Przykład XIV

Wpływ DEGR-czynnika VIIa na tworzenia naczyniowej zakrzepicy i uszkodzeń naczyniowych u pawianów

Ludzki DEGR-czynnik VIIa testowano na zdolność do inhibicji czynnika tkankowego (TF) i mediację aktywowanego czynnika VII (FVIIa) w tworzeniu uszkodzeń naczyniowych (VLF) indukowanych mechanicznymi naczyniowymi uszkodzeniami u nie-ludzkich naczelnych.

Natychmiast po utworzeniu mechanicznego naczyniowego uszkodzenia u pawiana, DEGR-czynnika VIIa wlewano dożylnie przez 7 dni (5 zwierząt) lub 30 dni (1 zwierzę). Przeprowadzono pomiary tworzenia naczyniowych uszkodzeń w dniu 30. Wyniki dla 5 potraktowanych zwierząt porównano ze znalezionymi dla 5 jednocześnie potraktowanych buforem zwierząt kontrolnych.

Pomiary linii podstawowej otrzymano badając zwierzęta na:

a) zliczenia płytek, zliczenia krwinek obojętnochłonnych, zliczenia monocytów i zliczenia czerwonych krwinek; b) poziom fibrynogenu osocza; c) poziomy aktywności czynników koagulacji VII, VIIa, X i V osoczu, wraz z poziomami antygenowymi FVII; i d) próbki osocza dla poziomu przeciwciał anty-czynnik VIIa.

Pod znieczuleniem halotanem i w sterylnych warunkach działania, zwierzęta znakowane autologicznymi płytkami ^1Hln otrzymały dożylne infuzje DEGR-FVIIa przy pomocy układu katetera do ciągłego dożylnego podawania (początkowy zastrzyk 1 mg/kg i dalsza ciągła dożylna infuzja 50 pg/kg/godzinę. Zwierzęta przeszły chirurgiczną endarterektomię szyjnią angioplastykę kateterem powietrznym Fogarty dwustronnej arterii barkowej lub dwustronnej arterii udowej.

DEGR-FVIIa podawano przez 7 lub 30 dni metodą ciągłej infuzji przez żyłowy kateter stosując układ kateterowy. 30 dni po operacji zwierzęta znieczulono halotanem i poddano in situ fiksacji perfuzją ciśnieniową 4% paraformaldehydem zawierającym 0,1% aldehydu glutarowego przez 30 minut. Po tym czasie segmenty naczyń (zawierające poprzednio uszkodzone miejsca) zebrano stosując procedury Harketra i in., Circulation 83:41-44 (1991) i Hansona i in., Hypertension 18:1170-I176 (1991). Próbki fiksowano in vitro (4% paraformaldehydu zawierającego 0,1% aldehydu glutarowego), zamrożono i przetworzono do analizy morfometrycznej stopnia uszkodzeń.

Zbadano 11 normalnych dorosłych pawianów (Paio anubis). 6 zwierząt otrzymało infuzje DEGR-FVII (50 pg/kg/godzinę) i pozostałe pięć było kontrolnymi zwierzętami nie dostającymi DEGR-FVIIa. Zwierzęta odrobaczono i obserwowano, czy nie chorują, przez 3 miesiące przed zabiegami. Wszystkie procedury zatwierdził Institutional Animal Care and Use Committee i były one zgodne z procedurami i sposobami wymienionymi przez NIH Guide for the Care i Use of Laboratory Animals, jak też Animal Welfare Act u podobne instytucyjne wskazania. Inwazyjne procedury prowadzono pod znieczuleniem halotanem po indukcji ketaminą(10 mg/kg domięśniowo) i walium (0,5 mg/kg dożylnie). Do dalszego krótkoterminowego unieruchamiania przy prowadzeniu eksperymentalnych procedur po operacji stosowano chlorowodorek ketaminy (5-20 mg/kg domięśniowo).

18-4114

Endarterektomię szyjną przeprowadzono przez nacięcie środka szyi stosując technikę Hansona i in., Hypertension 18:I170-I176 (1991) i Krupskiego i in., Circulation 84:1749-1757 (1991), dołączane jako odnośniki. Endarterektomii użyto jako modelu uszkodzeń naczyniowych, ponieważ jest odpowiednia klinicznie, i ponieważ VLF indukowane endarterektomią normalnych arterii okazało się reprodukowalne. W skrócie, wspólną arterię szyjną odcięto bliżej od otaczających tkanek obojczyka i dalej od rozgałęzienia arterii. Wspólną arterię szyjną spięto stosując atraumatyczne naczyniowe kleszcze na każdym końcu wyjętego naczynia w 3 minuty po zastrzyku siarczanu heparyny (100 U/kg dożylnie; Elkins-Simm Inc., Cherry Hill, NJ) i podzielono w odległości 1 cm od dalszych kleszczy. Bliższy arteryjny segment przenicowano zakrzywionymi kleszczami. Po całkowitym przenicowaniu parę polipropylenowych szwów (7-0) umieszczono na każdej stronie blisko i drugą parę umieszczono dalej w segmencie z odsłoniętym światłem. Następnie przeprowadzono endarterektomię rozpoczynając 1 cm od podzielonego końca wywiniętego segmentu naczynia i kontynuowano przez odmierzony dystans 1 cm. Procedura obejmuje mechaniczne usuwanie normalnej błony wewnętrznej naczynia i częściowej grubości mięśniówki stosując kleszcze i chirurgiczny mikroskop (powiększenie 32x). Po endarterektomii, naczynie przywrócono do jego normalnej konfiguracji, i przeprowadzono anastomozę koniec-koniec szwem polipropylenowym 7-0 i ciągłej technice pod 2,5-krotnym powiększeniem, i ranę zamknięto warstwami.

Dla morfometrycznej analizy VLF, odcinki osadzono w parafinie i zabarwiono składniki tkanki łącznej (kolagen, elastynę) i hematoksyliną-eozyną, i oceniono stosując Zeiss Photoscope sprzężony z systemem analizy obrazu (Thomas Optical Measurement Systems, Columbus, GA) złożonym z wysokorozdzielczego (580 linii) mikroskopowej kamery CCD sprzężonej z wysokorozdzielczym (700 linii) monitorem, układu IBM 386, 80 MB komputera z wysokorozdzielczym graficznym digitizerem do wczytywania obrazu i przechowywania. Ilościową analizę obrazu przeprowadzono stosując morfometryczny sterownik programowy (Optimas, Bioscan, Unc., Edmonds, WA). Arteryjne przekroje zanalizowano w odniesieniu do łącznej powierzchni uszkodzeń nowej błony wewnętrznej i odpowiedniej powierzchni arterialnej mięśniówki. Do statystycznej analizy dokonano porównań pomiędzy grupami stosując test t Studenta (dwustronny) dla sparowanych i niesparowanych danych.

Wyniki pokazały, że powierzchnia błony wewnętrznej znacząco zmniejszyła się u zwierząt potraktowanych DEGR-czynnikiem VIIa przez 7 dni i po 30 dniach w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi z tymi samymi naczyniowymi uszkodzeniami, ale nie otrzymującymi DEGR-czynnika VIIa (fig. 4). Podobny wynik znaleziono w przypadku zwierzęcia potraktowanego DEGR-czynnik VIIa przez 30 dni i zbadanego 30 dnia.

Wstępne studia modelu powietrznej angiografii ramieniowej arterii sugerują brak mierzalnej korzyści z terapii DEGR-czynnik VIIa. Model ten jednakże nie okazał się u pawianów modelem protrombotycznym, w którym czynnik tkankowy gra kluczową rolę.

Studia powietrznych uszkodzeń arterii udowej u pawiana nie wykazały statystycznie znaczących korzyści z DEGR-czynnika VIIa w porównaniu z kontrolnymi, jak pokazano na fig. 5.

Przykład XV

Wpływ DEGR-czynnika VIIa na indukowaną tPA trombolizę

Następujące tworzenie wieńcowych skrzepów podczas ostrego zawału mięśnia sercowego jest pierwotnie mediowane czynnikiem tkankowym (TF) w kompleksie z czynnikiem VIIa przez zewnętrzną ścieżkę koagulacji. Określono wpływ dodatkowej inhibicji kaskady koagulacji w różnych punktach w zewnętrznej ścieżce na skuteczność trombolizy aktywatora plazminogenu tkanki (TPA).

psów z elektrycznie indukowanym wieńcowym skrzepem przechodzących trombolizę tPA (1 mg/kg) w czasie 20 minut) otrzymało 1 z 4 pomocniczych zabiegów: 9 otrzymało antykoagulacyjny peptyd kleszcza (TAP), selektywny inhibitor czynnika Xa, w ilości 30 pg/kg/min przez 90 minut. Kompleks TF-czynnik VIIa był inhibitowany inhibitorem ścieżki rekombinacyjnego czynnika tkankowego (TFPI) (100-150 pg/kg/min przez 90 minut) u 9 psów, i przez DEGR VIIa (zastrzyk 1-2 mg/kg) jako współzawodniczącego antagonistę aktywowanego czynnika VIIa u 9 psów·'. 9 psów otrzymywało solankę kontrolnie. Psy obserwowano przez 120 minut po trombolizie na reokluzję. Wpływ tych środków na skuteczność trombolizy pokazano poniżej w tabeli 18 (dane jako średnia ± odchylenie standardowe).

Tabela 18

	Solanka	DEGR VIIa	TFPI	TAP
Czas do powrotnego przepływu (min)	32 ± 13	20 ±7*	21 ± 6*	18 ± 10*
Czas powrotnego przepływu (min)	62 ±45	70 ±48	91 ±35*	120
Cykliczne wahania przepływu	70%	89%	56%	0%
Reokluzja	70%	78%	67%	0%

* Wartość różna od kontrolnej solanki na poziomie istotności 0,05

Dane te wskazują, że inhibicja zewnętrznej ścieżki przez blokadę czynnika Xa lub TF-czynnika VIIa przez DEGF VIIa lub TFPI przyspieszała indukowaną tPA trombolizę. Selektywna inhibicja czynnika Xa skuteczniej zachowywała drożność arterii po udanej reperfucji.

Przykład XVI

Zmodyfikowany czynnik VIIa inhibituje tworzenie wewnątrznaczyniowego skrzepu bez wpływania na systemową koagulację

Aby określić, czy inhibicja wiązania czynnika VII z TF spowoduje działanie antytrombotyczne, cykliczne wahania przepływu (CFV) wskutek powtórnego tworzenia skrzepu zainicjowano umieszczając zewnętrzny ściskacz wokół szyjnych arterii królika z uszkodzonym śródbłonkiem (model Fottsa). Przepływ krwi szyjnej mierzono w sposób ciągły sondą przepływową Dopplera umieszczoną obok ściskacza. Po umieszczeniu ściskacza wokół arterii, powstał CFV ze średnią częstością 11±2 cykli/godzinę u 6 z 6 królików, przy szybkości przepływu krwi szyjnej 5±2% podstawowej wartości na dole CFV. Po CFV trwającym przez 30 minut, zwierzęta otrzymały infuzje ludzkiego rekombinacyjnego aktywnego (Phe-Phe-Arg chlorometyloketon) czynnika VIIa z zablokowanym miejscem (FVIIai) (0,1 mg/kg/min przez 10 minut). Czynnik VIIa całkowicie zablokował CFV u 6 z 6 zwierząt (częstość CFV = 0 cykli/godzinę; p < 0,05; szybkość przepływu krwi szyjnej = 106,9% podstawowej wartości; p=NS vs. linia podstawowa). 30 minut po inhibicji CFV, wprowadzono infuzyjnie ludzki rekombinacyjny FVIIa w dawkach 0,1 mg/kg/minutę przez 10 minut. Infuzja czynnika VIIa odtworzyła CFV u wszystkich zwierząt, wskazując, że wiązania czynnika VIIa z TF było współzawodniczące. Czasy protrombiny, czasy aktywowanej częściowo tromboplastyny, i in vitro agregacji płytek w odpowiedzi na ADP i trombinę nie różniły się po infuzji FVIIai w porównaniu z wartościami z linii podstawowej. Tak więc, FVII-VIIa gra ważną rolę w inicjowaniu tworzenia skrzepu in vivo. Podawanie czynnika VIIai wywiera silne antytrombotyczne działanie w tym modelu bez wpływania na systemową koagulację.

W sposób oczywisty wynika z powyższego, że kompozycje czynnika VII lub VIIa mające zmodyfikowane katalityczne miejsca mogą wiązać czynnik tkankowy, jednak nie są zasadniczo w stanie aktywować czynników X i IX. Ponieważ zmodyfikowany czynnik VII działa specyficznie przerywając kaskadę krzepnięcia bez degradacji lub zużywania czynników krzepnięcia, podawaniu preparatów zmodyfikowanego czynnika VII będzie towarzyszyło mniej niepożądanych skutków ubocznych niż w przypadku obecnych terapii. Następnie zmodyfikowany czynnik VII opisany tutaj można łatwo wytwarzać środkami rekombinacyjnymi. Tak więc skuteczność, dogodność i ekonomika niższych dawek i mniej częstego podawania, i względny brak toksyczności znajdują się pośród korzyści płynących z kompozycji według niniejszego wynalazku.

Chociaż wynalazek opisano w pewnych szczegółach ilustracjami i przykładami dla celów lepszej zrozumiałości, oczywiste jest, że pewne zmiany i modyfikacje można stosować w zakresie załączonych zastrzeżeń.

184 114

184 114

FIG. 4

Powierzchnia błony wewnętrznej (mnĄ

FIG.

błona wewnętrzna błona wewnętrzna + mięśniówka

Działanie Degr-FVIIa

Fig. 1

FVIH565+2463)/pDX

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek farmaceutyczny do inhibicji aktywności czynnika tkankowego, inhibicji odkładania płytek, inhibicji naczyniowego nawrotu zwężenia, leczenia ostrego zamykania naczynia wieńcowego, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera zmodyfikowany czynnik VII o obniżonej zdolności do aktywacji X lub IX czynnika osocza, w którym co najmniej jeden aminokwas leżący w centrum katalitycznym określanym przez Ser 344, Asp 242, His 193, został zmodyfikowany, przy czym czynnik aktywny zawarty jest w ilości dawkowej od 50 pg do 500 mg.
2. 2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że zmodyfikowany aminokwas jest derywatyzowany inhibitorem proteazy serynowej będącym związkiem fosforoorganicznym, fluorkiem sulfonylu, chlorowcometyloketonem peptydu lub azapeptydem, korzystnie wybranym spośród dansylo-Phe-Pro-Arg chlorometyloketonu, dansylo-Glu-Gly-Arg chlorometyloketonu, dansylo-Phe-Phe-Arg chlorometyloketonu i Phe-Phe-Arg chlorometyloketonu.
3. 3. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że centrum katalityczne określane przez Ser 344, Asp 242, His 193, zawiera substancję, insercję, lub delecję co najmniej jednego aminokwasu.

   Niniejszy wynalazek dotyczy białek przydatnych jako antykoagulanty. Dokładniej, przedmiotem niniejszego wynalazku są zmodyfikowane formy czynnika VII inhibitującego koagulację krwi i czynnik tkankowy.

   Koagulacja krwi jest procesem złożonym z kompleksowego oddziaływania różnych składników krwi, lub czynników, które na koniec powodują powstanie fibrynowego skrzepu. Ogólnie, składniki krwi biorące udział w tym, co nazywa się „kaskadą” koagulacji, są proenzymami lub zymogenami, enzymatycznie nieaktywnymi białkami przekształcanymi w proteolityczne enzymy pod działaniem aktywatora, będącego aktywowanym czynnikiem krzepnięcia. Czynniki koagulacji poddane takiej konwersji i ogólnie określane jako „aktywne czynniki,” oznacza się dodaniem małego „a” jako przyrostka (np., czynnik VIIa).

   Aktywowany czynnik X („Xa”) jest konieczny do przekształcenia protrombiny w trombinę, która następnie przekształca fibrynogen w fibrynę w końcowym etapie tworzenia fibrynowego skrzepu. Istnieją dwa systemy, lub ścieżki, promujące aktywację czynnika X. „Wewnętrzna ścieżka” odnosi się do tych reakcji, które prowadzą do tworzenia trombiny przez wykorzystanie czynników obecnych tylko w osoczu. Seria mediowanych proteazą aktywacji na koniec generuje czynnik IXa, który w połączeniu z czynnikiem ViIIa, rozcina czynnik X do Xa. Identycznej proteolizy dokonuje czynnik VIIa i jego czynnik współdziałający, czynnik tkankowy, na „wewnętrznej ścieżce” koagulacji krwi. Czynnik tkankowy jest związanym z błoną białkiem i nie krąży normalnie w osoczu. Jednakże po rozerwaniu naczynia może kompleksować czynnik VIIa katalizując aktywację czynnika X lub czynnika IX wo becności Ca++ i fosfolipidu (Nemerson i Gentry, Biochem. 25:4020-4033 (1986)). Chociaż względne znaczenie dwu ścieżek koagulacji w hemostazie jest niejasne, ostatnio stwierdzono istotną rolę czynnika VII i czynnika tkankowego w regulacji koagulacji krwi.

   Czynnik VII jest śladową glikoproteiną osocza krążącą w krwi jako jednołańcuchowy zymogen. Zymogen jest katalitycznie nieaktywny (Williams i in., J. Biol. Chem. 264:7536-7543 (1989); Rao i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6687-6691 (1988)).

   184 114

   Jednołańcuchowy czynnik VII można przekształcić w dwułańcuchowy czynnik VIIa czynnikiem Xa, czynnikiem XIIa, czynnikiem IXa lub trombiną in vitro. Czynnik Xa ma być głównym fizjologicznym aktywatorem czynnika VII. Jak w przypadku kilku innych białek osocza włączonych w hemostazę, aktywność czynnika VII zależy od witaminy K, koniecznej do γ-karboksylacji licznych reszt kwasu glutamowego skupionych na końcu aminowym białka. Te γ-karboksylowane kwasy glutamowe są konieczne do związanego z metalem oddziaływania czynnika VII z fosfolipidami.

   Konwersja zymogenowego czynnika VII w aktywowaną dwułańcuchową cząsteczkę zachodzi przez przecinanie wewnętrznego wiązania peptydowego mieszczącego się w przybliżeniu w środku cząsteczki. W ludzkim czynniku VII, aktywujące miejsce rozcięcia znajduje się Arg₁₅₂-Ile₁₅3 (Hagen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416 (1986); Thim i in., Biochem. 27:7785-7793 (1988) dołączane niniejszym jako odnośniki). Bydlęcy czynnik VII jest aktywowany rozcięciem analogicznego wiązania Arg^-Ile^ (Takeya i in., J. Biol. Chem. 263: 14868-14877, 1988). W obecności czynnika tkankowego, fosfolipidów i jonów wapnia, dwułańcuchowy czynnik VIIa gwałtownie aktywuje czynnik X lub czynnik IX metodą ograniczonej proteolizy.

   Często jest konieczne selektywne blokowanie kaskady koagulacji u pacjenta. Antykoagulanty takie jak heparyna, kumaryna, pochodne kumaryny, pochodne indandionu, lub inne środki można stosować, np. podczas dializy nerek, lub przy leczeniu głębokiej żyłowej zakrzepicy, rozsianej wewnątrznaczyniowej koagulacji (DIC), i wielu innych medycznych zaburzeń. Np., działanie heparyną lub pozaustrojowe działanie jonem cytrynianowym (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4500309) można stosować w dializie do zapobiegania koagulacji podczas zabiegu. Hepatynę stosuje się także do zapobiegania głębokiej żyłowej zakrzepicy u pacjentów operowanych chirurgicznie.

   Traktowanie heparyną i innymi antykoagulantami może jednakże mieć niepożądane skutki uboczne. Dostępne antykoagulanty działają ogólnie na ustrój, a nie specyficznie na miejsce skrzepu. Heparyna, np., może spowodować ciężkie krwotoki. Ponadto, przy czasie póltrwania w przybliżeniu 80 minut, heparyna znika szybko z krwi, wymagając częstego podawania. Ponieważ heparyna działa jako czynnik współdziałający dla antytrombiny III (AT III), a AT III znika szybko w leczeniu DIC, często jest trudne zachowanie właściwego dawkowania heparyny, co zmusza do stałego monitorowania poziomów AT III i heparyny. Heparyna jest także nieskuteczna, jeśli brak AT III jest znaczny. Ponadto dłuższe stosowanie heparyny może także zwiększyć agregację płytek i zredukować zliczenia płytek, a także wiązano je z rozwojem osteoporozy. Pochodne indandionu mogą także wykazywać toksyczne skutki uboczne.

   Poza antykoagulantami krótko opisanymi powyżej, kilka naturalnie występujących białek okazało się wykazywać aktywność antykoagulacyjną. Np., Reutelingsperger (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4736018) wydzielił antykoagulacyjne białka z bydlęcej aorty i ludzkich żył żółciowych. Maki i in. (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4732891) ujawnia ludzkie pochodzące z łożyska białka antykoagulacyjne. Ponadto AT III zaproponowano jako leczniczy antykoagulant (Schipper i in., Lancet 1 (8069): 854-856 (1978); Jordan, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4386025; Bock i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4517294).

   Namnażanie komórek mięśni gładkich (SMC) na ściance naczynia jest ważnym elementem tworzenia naczyniowych ubytków w miażdżycy tętnic, po rekonstrukcji naczyń lub w odpowiedzi na inne naczyniowe uszkodzenia. Np., leczenie miażdżycy tętnic często obejmuje oczyszczenie zablokowanych naczyń przez angioplastykę, endarterektomię lub redukcyjną aterektomię, lub przez wszczepienie przepływu omijającego, procedury chirurgiczne, w których miażdżycowe płytki sprasowuje się lub usuwa przez kateteryzację (angioplastykę), zdziera się ze ścianek naczyń przez nacinanie (endarterektomia) lub omija naturalnymi lub syntetycznymi wszczepami. Te procedury usuwają naczyniowy śródbłonek, zakłócają spodnią błonę i powodują obumieranie przyśrodkowych SMC. Uszkodzenie to powoduje przyśrodkowe

   184 114 namnażanie SMC i migrację do spodu, co charakterystycznie zachodzi podczas pierwszych kilku tygodni i do 6 miesięcy po uszkodzeniu i zatrzymuje się, gdy odtworzy się górna warstwa. U ludzi ubytki te są utworzone z około 20% komórek i 80% masy pozakomórkwej.

   U około 30% lub więcej pacjentów po angioplastyce, endarterektomii lub wszczepach przepływów omijających, zakrzepica i/lub namnażanie SMC w błonie wewnętrznej naczynia powoduje reokluzję naczynia i niepowodzenie chirurgii rekonstrukcyjnej. Takie zamknięcie naczynia po chirurgii jest znane jako nawrót zwężenia.

   Istnieje wciąż zapotrzebowanie na ulepszone kompozycje wykazujące antykoagulacyjną aktywność, które można podawać we względnie niskich dawkach i które nie dają niepożądanych skutków ubocznych z tradycyjnymi kompozycjami antykoagulacyjnymi. Niniejszy wynalazek spełnia te oczekiwania dając antykoagulanty działające specyficznie na miejsca uszkodzeń, a ponadto dające inne podobne korzyści.